JP4750035B2 - 光切断型リンカーを利用したリガンド固定化固相担体 - Google Patents
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Description
本発明の目的は、より高純度で選択的なタンパク質の精製を可能にする方法を提供することである。より具体的には、高濃度のリガンド化合物や塩を使用することなく、アフィニティー樹脂からのタンパク質の遊離溶出を可能にする技術の提供を目的とする。
また、リガンドを固定化したアフィニティー樹脂で、リガンドに選択的に結合するタンパク質以外のタンパク質を含むタンパク質混合物を処理した場合、アフィニティー樹脂上には、リガンドに結合した選択的結合タンパク質と、リガンド以外の部分に結合した非特異的結合タンパク質が存在する。従来の溶出法である、高濃度の塩や、タンパク質を変性させて溶出させる界面活性剤などで溶出した場合、選択的結合タンパク質と非選択的タンパク質が、同時に溶出され、選択的結合タンパク質のみを溶出・回収することが困難であった。本発明者らは、光照射によって特異的に切断されるリンカーをリガンド分子と樹脂固相担体との間に介在させることにより、選択的結合タンパク質のみを溶出・回収することができる、新たな方法を開発することができた。
即ち本発明は下記の通りである。
〔1〕光照射により切断されるリンカーを介してリガンドが固定化されている、リガンドとターゲット分子との特異的相互作用を解析する為の固相担体。
〔2〕ターゲット分子探索用である、上記〔1〕記載の固相担体。
〔3〕ターゲット分子精製用である、上記〔1〕記載の固相担体。
〔4〕下記式(I)または(II)で示される、上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の固相担体。
(式中、Xはリガンドであり、光照射により切断され;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;Zは固相担体であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
〔5〕R2が、水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R3が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R4が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R5が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基である、上記〔4〕記載の固相担体。
〔6〕下記式で表される、上記〔4〕記載の固相担体。
(式中の記号は前記と同義である)
〔7〕下記式(I’)または(II’)で示される化合物。
(式中、P1は水素原子、又はアミノ基、水酸基もしくはスルフヒドリル基の保護基であり;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;P2は水素原子、又はアミノ基、水酸基、スルフヒドリル基、カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
〔8〕下記式(I’)または(II’)で示される、リガンドを固相担体に固定化する際に用いられるリンカー。
(式中、P1は水素原子、又はアミノ基、水酸基もしくはスルフヒドリル基の保護基であり;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;P2は水素原子、又はアミノ基、水酸基、スルフヒドリル基、カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
〔9〕光照射により切断されることを特徴とする上記〔8〕記載のリンカー。
〔10〕上記〔9〕記載のリンカーを介してリガンドが固定化されている、リガンドとターゲット分子との特異的相互作用を解析する為の固相担体。
〔11〕(1)光照射により切断されるリンカーを介してリガンドを固相担体上に固定化する工程、(2)上記(1)で得られたリガンドが固定化された固相担体と、該リガンドのターゲット分子を含むか含まない試料とを混合する工程、(3)光を照射してリガンドを固相担体から切断する工程、および(4)リガンドにターゲット分子が結合しているかどうか確認する工程を含む、ターゲット分子の探索方法。
〔12〕リガンドが固定化された固相担体が、下記式(I)または(II)で示される、上記〔11〕記載の方法。
(式中、Xはリガンドであり、光照射により切断され;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;Zは固相担体であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
〔13〕R2が、水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R3が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R4が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R5が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基である、上記〔12〕記載の方法。
〔14〕該固相担体が下記式で表される、上記〔12〕記載の方法。
(式中の記号は前記と同義である)
〔15〕(1)光照射により切断されるリンカーを介してリガンドを固相担体上に固定化する工程、(2)上記(1)で得られたリガンドが固定化された固相担体と、該リガンドのターゲット分子を含む試料とを混合する工程、(3)光を照射してリガンドを固相担体から切断する工程、および(4)リガンドに結合したターゲット分子を回収する工程を含む、ターゲット分子の精製方法。
〔16〕リガンドが固定化された固相担体が、下記式(I)または(II)で示される、上記〔15〕記載の方法。
(式中、Xはリガンドであり、光照射により切断され;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;Zは固相担体であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
〔17〕R2が、水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R3が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R4が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R5が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基である、上記〔16〕記載の方法。
〔18〕該固相担体が下記式で表される、上記〔16〕記載の方法。
(式中の記号は前記と同義である)
図2は、光切断型リンカーを介してFK506を固相担体に固定化し、ラット脳ライゼートからFK506特異的結合タンパク質FKBP12を高純度に取得できることを示す図である。
発明の詳細な説明
光切断型リンカーを用いた本願発明の固相担体および当該固相担体を利用したターゲット分子の探索方法並びに精製方法を従来法(高濃度のリガンドや塩により溶出する方法)と比較して模式的に図1に示す。
本発明において、「光照射により切断されるリンカー」とは、光を照射することによって切断されるリンカーであれば特に限定されず、リガンドと固相担体とを結ぶ化合物(若しくは基)である(以下光切断型リンカーともいう)。例えば、コンビナトリアル合成において使用されるo−ニトロベンジルリンカー(JOC 1995,60,2318−2319)およびニトロベンジル基を有する各種誘導体が挙げられる。
光照射により切断されるリンカーとして下記式(I’)または(II’)で示される化合物もまた好適である。
(式中、P1は水素原子、又はアミノ基、水酸基もしくはスルフヒドリル基の保護基であり;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;P2は水素原子、又はアミノ基、水酸基、スルフヒドリル基、カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
光切断型リンカーにおける光照射により切断される部位は、リンカーとリガンドとの結合部位であって、用いるリンカー、並びにリンカーとリガンドとの結合様式に応じて異なる。例えば後述する式(I)又は式(II)で示される固相担体においてはQとXとの結合が光照射により切断される。
該リンカーに照射する光の光源ならびに光量は、リガンドが放出されるようリンカーの種類に応じて適宜検討され決定されるが、o−ニトロベンジルリンカーを用いる場合には波長300〜400nm、好ましくは350〜370nmの近紫外光を0〜40℃、好ましくは4〜25℃で数秒〜3時間、好ましくは数秒〜1時間、特に好ましくは30秒〜1時間照射する。
リンカーを光切断する際、用いるリンカーの種類にもよるが光切断により産生される産物とリンカーとが再び反応するのを回避する為に適当な添加剤を用いることができる。添加剤の種類や使用濃度は使用するリンカーの種類に応じて適宜設定される。o−ニトロベンジルリンカーを用いる場合には2−メルカプトエタノール、ヒドラジン及びイミダゾールから選ばれる少なくとも1種を添加することが好ましい。添加剤として2−メルカプトエタノール、ヒドラジン又はイミダゾールを用いる場合にはそれぞれ0.01〜1000mM、好ましくは0.1〜500mMの濃度で使用する。複数種の添加剤を用いる場合には合計量が上記範囲内になるように設定する。
本発明の固相担体は、リガンドが上記リンカーを介して固相担体上に固定化されていることを特徴とするが、その固定方法は特に限定されない。リガンドとリンカーを結合させた後得られた結合体を固相担体に固定化してもよいし、リンカーをまず固相担体に固定化した後、そのリンカーとリガンドを結合させてもよい。
具体的にはリンカーを水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に溶解し、得られたリンカー溶液と固相担体(固相担体についても予め水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に懸濁しておくことが好ましい)とを混合することによって、あるいはリンカーと固相担体とのアミド結合や、シッフ塩基形成による結合、C−C結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等の共有結合あるいは非共有結合に付すことによってリンカーを固相担体に固定化する。リンカーおよび固相担体を溶解または懸濁しておく水性または有機性の溶媒としては、同じものであっても異なるものであってもよく、例えば水、緩衝液等の水性溶媒、アルコール(メタノール、エタノール等)、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、アセトニトリル等の有機性溶媒が挙げられる。これらの混合溶媒もまた好適に使用できる。固定化するリンカー上の官能基の種類等に応じてリンカーの固相担体への固定化に利用する反応が設定され、適宜公知の手法によりリンカーを固相担体に固定化する。
一連の反応や処理を行う際の温度は、設定した固定化反応に好適で且つリンカーが安定な温度であれば特に限定されないが、通常0℃〜100℃、好ましくは室温〜70℃で実施される。また、固相担体とリンカーとを混合する時間も、固相担体にリンカーが固定化されれば特に限定されず、設定した固定化反応や固定化を意図するリンカー、使用する固相担体の種類等に応じて適宜設定される。通常1時間から数日間、好ましくは2時間から一晩程度である。結合反応には、利用する固定化反応に応じて適宜設定されるが、一般に固相担体に対して過剰量のリンカーを用いる。しかしながら、固相担体上、あるいはリンカーの全ての結合可能部位が反応に供せられる必要はなく、固相担体にリンカーが部分的に固定化されるものであっても、本願発明の目的を達成することができるので、必ずしも過剰量である必要はない。
アミド結合や、シッフ塩基、C−C結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等のリンカーの固相担体への固定化に利用する反応は当分野では公知の技術であり、反応試薬や反応条件等は従来実施されている方法に準じて行うことができ、また必要に応じて適宜変更してもよい。
リガンドが光切断型リンカーを介して固定化された固相担体の具体例をその出典とともに以下に挙げる。いずれの固相担体もリガンドとターゲットとの相互作用の解析用、あるいはターゲット分子探索・精製用としての用途は知られていない。これらの固相担体は既知の文献、あるいは公知技術を適宜組み合わせて製造することができる。リンカーに相当する部分を便宜上囲いで示す。
また、ニトロベンジル基を有するリンカーを介してリガンドを固定化した下記式(I)または(II)で示される固相担体も好ましい。
(式中、Xはリガンドであり、光照射により切断され;Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり;Aは固相担体との結合に用いられる基であり;Zは固相担体であり;Qは、NH、OまたはSであり;R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基;R2は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R3は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R4は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基であり;R5は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基である)
尚、式中、固相担体Zは、リンカーやリガンドが結合する前の状態の固相担体を意図する。
式(I’)および式(II’)の化合物は、たとえば、文献(J.Org.Chem 1995,60,2318−2319)に記載の方法で合成される。具体的には、アルキル基が結合したベンゼン誘導体に、リガンドが結合しうる基(Q)、ニトロ基、および固相担体との結合に用いられる基(A)を導入する。ここでこれらの置換基が導入される順序、および、用いられる導入反応は特に限定されず、合成されるリンカーの構造に応じて適宜設定される。一般に知られる置換基導入反応、たとえば、Advanced Organic Chemistry(Jerry March,1992,John Wiley & Sons)に記載される反応などが用いられる。
上記方法により得られる化合物(I’)および(II’)は、リガンドを固相担体に固定化する際に用いられるリンカー、好ましくは光照射により切断されるリンカーとして用いることができる。リガンドを該リンカーを介して固相担体に固定化することによって本発明の固相担体(I)ならびに(II)を得ることができる。
本発明において、光切断型リンカーを介して固相担体に固定化される「リガンド」、例えば式(I)および式(II)で表される固相担体中のXは特に限定されず、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。また、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量1000未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量1000以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられ、望ましくはタンパク質である。これらの低分子化合物あるいは高分子化合物は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
リガンドとリンカーとの結合は、アミド結合や、シッフ塩基、C−C結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等の共有結合あるいは非共有結合であり、いずれも当分野で公知の材料ならびに反応により形成される。式(I)または式(II)で表される固相担体の場合、リガンドはリンカー部分のNH、SまたはOとのアミド、チオアミド、エステル結合によって結合している。
本発明において用いられる固相担体ならびに式(I)および式(II)中の固相担体Zは、その上でリガンド(リンカーを介して該固相担体上に固定化されている)とターゲット分子との特異的相互作用が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用できる。材質としては、例えば、樹脂(ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等)、ガラス、金属(金、銀、鉄、シリコン等)等が用いられる。これらの固相は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後にターゲット分子との相互作用の解析、ターゲット分子の探索、精製の工程の為に利用される方法に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にする。またガラスプレートを用いることも好適である。
Aの「固相担体との結合に用いられる基」は、ニトロベンジル基を有するリンカー部分(光切断型リンカー)を固相担体(Z)に結合させる為に必要な連結基であって、例えば、O、S、NH、カルボニル基等の基が挙げられ、これらの基をアルキレン基等を介して2つ以上組み合わせたもの(例えば−O−(CH2)3−CO−等)、もしくはポリエチレングリコールのような繰り返し構造(例えば −O−(CH2CH2−O)4−CH2CH2−CO− 等)を持っていてもよい。Aの「固相担体との結合に用いられる基」と固相担体(Z)との結合としては、固相担体上のアミノ基とAとのアミド結合、チオアミド結合、カルバメート結合、ウレア結合、チオカルバメート結合、チオウレア結合、固相担体上のカルボキシル基とAとのアミド結合、エステル結合、固相担体上のヒドロキシル基とAとのエステル結合、エーテル結合等が挙げられる。いずれも当分野で公知の材料ならびに反応により形成される。
本明細書中、ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
本明細書中、「置換されていてもよいアルキル基」とは1乃至2以上の置換基を有していてもよい炭素数1〜3の直鎖状または分枝状のアルキル基を意味する。
「炭素数1〜3の直鎖状または分枝状のアルキル基」としては、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル等が挙げられる。置換基としてはハロゲン原子、(前述と同義)、水酸基、アルコキシ基(炭素数1乃至6の直鎖状、分枝状または環状のアルコキシ基)等が挙げられ、置換されたアルキル基としては、例えばトリフルオロメチル、2−ヒドロキシエチル、2−メトキシエチル等が挙げられる。
本明細書中、「置換されていてもよいアリール基」とは1乃至2以上の置換基を有していてもよい炭素数6乃至14のアリール基を意味する。「炭素数6乃至14のアリール基」としては、具体的にはフェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、2−インデニル、2−アンスリル等が挙げられる。置換基としてはニトロ基、ハロゲン原子(前述と同義)、アルキル基(炭素数1〜3の直鎖状または分枝状のアルキル基)、アルコキシ基(前述と同義)等が挙げられ、置換されたアリール基としては、2−ニトロフェニル、2−クロロフェニル、2,4−ジメトキシフェニル等が挙げられる。
本明細書中、「置換されていてもよいアルコキシ基」とは1乃至2以上の置換基を有していてもよい炭素数1乃至6の直鎖状、分枝状または環状のアルコキシ基を意味する。「炭素数1乃至6の直鎖状、分枝状または環状のアルコキシ基」としては、具体的にはメトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ等が挙げられる。置換基としては、ハロゲン原子(前述と同義)、水酸基、アルコキシ基(前述と同義)、ポリエチレングリコール基等が挙げられ、置換されたアルコキシ基としては、トリフルオロメトキシ、2−ヒドロキシメトキシ、2−メトキシエトキシ、ポリエチレングリコールオキシ等が挙げられる。
本明細書中、「置換されていてもよいアルキレン基」とは、炭素数1〜3の直鎖状または分枝状のアルキレン基を意味する。「炭素数1〜3の直鎖状または分枝状のアルキレン基」としては、具体的にはメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン等が挙げられる。置換基としてはハロゲン原子(前述同義)、水酸基、アルコキシ基(前述と同義)等が挙げられる。
Yとして好ましくは単結合であり、Aとして好ましくは−O−(CH2)3−CO−であり、Qとして好ましくはNHであり、R1として好ましくは置換されていてもよいアルキル基(特に好ましくはメチル基)であり、R2〜R5として好ましくは水素原子、置換されていてもよいアルキル基(特に好ましくはメチル基)または置換されていてもよいアルコキシ基(特に好ましくはメトキシ基)である。
本明細書中、P1の「アミノ基、水酸基もしくはスルフヒドリル基の保護基」ならびにP2の「アミノ基、水酸基、スルフヒドリル基、カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基」としては通常当分野で用いられるものが利用でき、「Protective Groups in Organic Synthesis,Green and Wuts著、John Wiley & Sons,Inc.1999」等に記載の一般的に用いられる保護基が利用できる。具体的には「アミノ基の保護基」としては、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル、tert−ブチルオキシカルボニル等が、「水酸基の保護基」としては、トリチル、tert−ブチル、ベンジル等が、「スルフヒドリル基の保護基」としては、ベンジル、トリチル、アセタミドメチル等がそれぞれ挙げられる。「カルボキシル基の保護基」としてはアルキル基(前述と同義、好ましくはメチル、tert−ブチル)、アラルキル基(炭素数7乃至10であり、具体的には、ベンジル、メチルベンジル、フェネチル等が挙げられ、好ましくはベンジル基である)等が挙げられる。また、Aの「固相担体との結合に用いられる基」がカルボニル基の場合、P2はカルボニル基の保護基であり、Aと一緒になってカルボニル基の保護基であるジメチルアセタールを形成する。
特に好ましい固相担体としては式(II)で表されるものであり、例えば下記式で表される固相担体が好ましい。
(式中の記号は前記と同義である)
当該固相担体は、下記式で表されるo−ニトロベンジルリンカーを介してリガンド(X)を固相担体(Z)に固定化することによって調製される。具体的な手順は実施例にて後述する。
(式中の記号は前記と同義である)
本発明では、上記リガンドを固定化した固相担体上で該リガンドとの特異的な相互作用に基づいてターゲット分子を探索あるいは精製する過程を要する。従ってターゲット分子は、リガンドと特異的に相互作用するものであれば特に限定されるものではなく、公知化合物である場合もあれば新規物質である場合も予想される。ターゲット分子としては低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ターゲット分子が低分子化合物の場合には、低分子化合物であるリガンドとの低分子化合物と低分子化合物との特異的相互作用に基づき、あるいは高分子化合物であるリガンドとの高分子化合物と低分子化合物との特異的相互作用に基づき、ターゲット分子が選別され得る。またターゲット分子が高分子化合物の場合には、低分子化合物であるリガンドとの低分子化合物と高分子化合物との特異的相互作用に基づき、あるいは高分子化合物であるリガンドとの高分子化合物と高分子化合物との特異的相互作用に基づき、ターゲット分子が選別され得る。好ましいリガンドとターゲット分子の組み合わせは低分子化合物と高分子化合物、あるいは高分子化合物と高分子化合物という組み合わせである。
ターゲット分子との相互作用の解析、ならびにターゲット分子の選別は簡便には固相上で行う。ターゲット分子として予め候補物質が予測される場合には、候補物質を単独で上記固相担体上に固定化されたリガンドと接触させ両者の相互作用を測定し、候補物質がターゲット分子であるか否かを判断すればよいが、通常、複数の物質(高分子化合物および/または低分子化合物)を含む試料をリガンドと接触させ、複数の物質(高分子化合物および/または低分子化合物)の各々とリガンドとの相互作用の有無ならびにその相互作用の程度を測定することによりターゲット分子であるか否かを判断し、選別する。ここで複数の物質を含む試料としては、全て公知化合物から構成されるものであっても、一部新規な化合物を含むものであっても、さらには全て新規な化合物から構成されるものであってもよい。しかしながら、リガンドのターゲット分子の探索、あるいは昨今のプロテオーム解析の進歩によれば、全てその構造が公知な化合物の混合物であることが望ましい。全て公知な化合物から構成される試料としては、大腸菌等によって遺伝子工学的に調製されたタンパク質の混合物等であり、一部新規な化合物を含むものとしては、細胞や組織の抽出物(ライゼート)であり、また全て新規な化合物から構成されるものとしては、まだその機能や構造が知られていない新規なタンパク質や新しく合成された化合物等の混合物が挙げられる。試料が混合物の場合、特に公知化合物を含む場合には、任意にこれらの化合物の試料中の含有量を所望の値に設定しておくこともできる。リガンドのターゲット分子の探索という見地にたてば、低分子化合物ならびに高分子化合物であるのが好ましく、ヒト等の動物体内でのターゲット分子の探索についていえば高分子化合物であることが好ましい。
本明細書中、リガンドならびにターゲット分子という用語は、互いに特異的な分子間相互作用を有する組み合わせを意図するものであって、当該組み合わせのうち、片方をリガンドとして固相に固定化すれば他方がターゲット分子となり、すなわちどちらを固相に固定化するかによって、それらの呼称は変更され得る。リガンドに特異的な相互作用を有するターゲット分子は1種類とは限らず、また同様にターゲット分子に特異的な相互作用を有するリガンドも1種類とは限らない。本明細書ではリガンドならびにターゲット分子という用語は、ある特定の分子を指すものではなく特異的な相互作用を有する分子同士の各々を意図するものである。
「特異的な相互作用」とは、特定のリガンド(特定のターゲット分子)のみを特異的に認識して結合するような特性を発揮する作用であり、アゴニストあるいはアンタゴニストに対する特異的受容体、基質に対する酵素、そして例えばFK506(リガンド)に対するFK506結合タンパク質(ターゲット分子)や、ステロイドホルモンに対するステロイドホルモン受容体(例;dexamethasoneとglucocorticoid receptor)、抗がん剤trapoxinに対するHDAC等の関係が「特異的相互作用」に該当する。一方、「非特異的な相互作用」とは、それによる結合の対象が広範にわたり且つ特定分子に限定されず、反応条件によって種々変化するような状況を生じる作用をいい、本発明においては、固相上のリガンドや固相担体自体の表面に、結合・吸着するような不特定の分子間の作用を意味する。「非特異的相互作用」は、「特異的相互作用」に基づくリガンドとターゲット分子の結合の障害となるか、あるいは混同されることにより「特異的な相互作用」による結合を見落としてしまう危険性がある。
本発明において「特異的相互作用を解析する」とは、リガンドとターゲット分子との間の相互作用の特異性の程度を、相互作用情報として得ることであって、例えばKd(解離速度定数)、Ka(結合速度定数)等の数値として得ることができる。上記相互作用情報に基づき、リガンドと特異的な相互作用を有するか否かを判定することによってターゲット分子を同定することができる本願発明の固相担体はターゲット分子探索用であり得、また、リガンドとターゲット分子との特異的相互作用を利用して本願発明の固相担体を用いてターゲット分子を精製することもできる。
略語一覧
DMF:ジメチルホルムアミド
NMP:N−メチル−2−ピロリドン
EDC:1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミド
Fmoc:9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
HoBt:1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
2−ME:2−メルカプトエタノール
実施例1:光切断型リンカーを介してFK506を固定化した樹脂の合成
光切断型リンカー(4−{4−[1−(Fmoc−アミノ)−エチル]−2−メトキシ−5−ニトロフェノキシ}酪酸,Fluka)(124mg,0.24mmol)、TOYOパール樹脂(TSKgel AF−amino,600μl,遊離アミノ基(available amino group)は0.06mmol)、EDC(44mg,0.28mmol)、HOBt(39mg,0.28mmol)およびDMF(6ml)の混合物を室温で15時間撹拌した。反応の終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。この時の反応率を換算すると約88%であった。反応終了確認後、DMFで樹脂を5回洗浄した。ここに、20%ピペリジン−DMF溶液(6ml)を加え、2時間室温で攪拌した。DMFで樹脂を5回洗浄後、200μlをとりわけ、文献(Bioconjugate Chemistry,2003,14(6),1222−1230)記載の方法で調製した17−アリル−1,14−ジ−ヒドロキシ−12−{2−[4−(7−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ)−3−メトキシ−シクロヘキシル]−1−メチル−ビニル}−23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザ−トリシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン(FK506;77mg,0.08mmol)、EDC(14.9mg,0.096mmol)、HOBt(12.8mg,0.096mmol)およびDMF(1ml)の混合物を室温で20時間撹拌した。反応の終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。この時の反応率を換算すると約94%であった。反応終了確認後、DMFで樹脂を5回洗浄した。ここに無水酢酸(200μl)およびDMF(800μl)を加え1時間室温で撹拌した。その後DMFで十分洗浄し、得られた光切断型リンカーを介してFK506を固定化した樹脂は後述する結合実験に用いた。
実施例2
(1)ラット脳ライゼートの調製
ラットの脳(2.2g)を混合液A(0.25Mシュクロース,25mM Trisバッファー(pH7.4),22ml)に混ぜ、ホモジネートを作成後、9500rpmで10分間遠心分離した。遠心分離上清を取り、50000rpmでさらに30分間遠心分離した。こうして得られた上清をライゼートとして使用した。なお、実験はすべて4℃あるいは氷上で行った。
(2)結合実験及び標的タンパク質の精製
実施例1で調製した、FK506を、光切断型リンカー(4−{4−[1−(Fmoc−アミノ)−エチル]−2−メトキシ−5−ニトロフェノキシ}酪酸,Fluka)を介して固定化した樹脂(TOYOPEARL AF)を、上記(1)で調製したラット脳ライゼートと混合し、付着物をバッファーB(25mM トリスバッファー(pH7.4),0.25Mシュクロース,500mMヒドラジン,500mM 2−ME)で洗浄し、その後溶出のためバッファーB中にて、1時間大型UV照射ランプ(365nm,Model B100AP,Long Wave Ultraviolet Lamp,115V−2.5A,UVP,Upland,CA)での光照射を行った。照射後、バッファー溶液をサンプルとして回収し、樹脂上に残った残存タンパク質を、溶出試薬(Sample Buffer Solution with 2ME(x2)for SDS−page,code 30566−22,Nakalai tesque)にて溶出した。樹脂上に残った残存タンパク質を溶出して得られたサンプルと光照射にて溶出したサンプルとを電気泳動によって比較した(図2)。
光照射による溶出では、光切断型リンカーを介してFK506を固定化した樹脂からFK506の結合タンパク質であるFKBP12が高純度で溶出されることが確認された(図2レーン3)。光照射後の樹脂上のタンパク質を、溶出試薬を用いて溶出すると、FKBP12以外の非選択的結合タンパク質を含むタンパク質が溶出した(図2レーン2)。一方、光照射を行わず当初のFK506固定化樹脂に結合したタンパク質を全溶出した結果を図2レーン1に示す。
これらの結果から本発明により特異的結合タンパク質のみが高純度で精製されることが明らかである。
実施例3:光切断型リンカーを介してクロモグリク酸を固定化した樹脂の合成
実施例1に記載の方法にしたがって作製した、光切断型リンカーを結合した樹脂(500μl)と、クロモグリク酸(93mg,0.2mmol)、EDC(37mg,0.24mmol)、HOBt(32mg,0.24mmol)およびNMP(5ml)の混合物を室温で20時間撹拌した。反応の終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。この時の反応率を換算すると約76%であった。反応終了確認後、NMPで樹脂を5回洗浄した。ここに無水酢酸(1ml)およびNMP(4ml)を加え1時間室温で撹拌した。その後NMPで十分洗浄し、得られた光切断型リンカーを介してクロモグリク酸を固定化した樹脂を後述する結合実験に用いた。
実施例4
(1)E.coliライゼートの調製
定法にしたがってクロモグリク酸結合タンパクを発現したE.coli(0.52g)を混合液C(0.25Mシュクロース,25mM Trisバッファー(pH7.4),1%Chaps,4ml)に混ぜ、ホモジネートを作成後、10000rpmで60分間遠心分離した。こうして得られた上清をライゼートとして使用した。なお、実験はすべて4℃あるいは氷上で行った。
(2)結合実験および標的タンパク質の精製
実施例3で調製した、クロモグリク酸を、光切断型リンカー(4−{4−[1−(Fmoc−アミノ)−エチル]−2−メトキシ−5−ニトロフェノキシ}酪酸,Fluka)を介して固定化した樹脂(TOYOPEARL AF)を、上記(1)で調製したクロモグリク酸結合タンパク発現E.coliライゼートと混合し、付着物をバッファーD(25mM トリスバッファー(pH7.4),0.25Mシュクロース,1%Chaps,500mMイミダゾール,500mM 2−ME)で洗浄し、その後溶出のためバッファーD中にて、1時間大型UV照射ランプ(365nm,Model B100AP,Long Wave Ultraviolet Lamp,115V−2.5A,UVP,Upland,CA)での光照射を行った。照射後、バッファー溶液をサンプルとして回収することにより、高純度のクロモグリク酸結合タンパク(分子量:約80K)溶液を得ることができた。
本出願は、日本で出願された特願2004−224634を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (10)
- (1)光照射により切断されるリンカーを介してリガンドを固相担体上に固定化する工程、(2)上記(1)で得られたリガンドが固定化された固相担体と、該リガンドのターゲット分子を含むか含まない試料とを混合する工程、(3)2−メルカプトエタノールおよび/またはヒドラジンの存在下、光を照射してリガンドを固相担体から切断する工程、および(4)リガンドにターゲット分子が結合しているかどうか確認する工程を含む、ターゲット分子の探索方法。
- (1)光照射により切断されるリンカーを介してリガンドを固相担体上に固定化する工程、(2)上記(1)で得られたリガンドが固定化された固相担体と、該リガンドのターゲット分子を含むか含まない試料とを混合する工程、(3)2−メルカプトエタノールおよびヒドラジンの存在下、光を照射してリガンドを固相担体から切断する工程、および(4)リガンドにターゲット分子が結合しているかどうか確認する工程を含む、ターゲット分子の探索方法。
- リガンドが固定化された固相担体が、下記式(I)または(II)で示される、請求項1または2記載の方法。
- R2が、水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R3が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R4が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R5が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基である、請求項3記載の方法。
- (1)光照射により切断されるリンカーを介してリガンドを固相担体上に固定化する工程、(2)上記(1)で得られたリガンドが固定化された固相担体と、該リガンドのターゲット分子を含む試料とを混合する工程、(3)2−メルカプトエタノールおよび/またはヒドラジンの存在下、光を照射してリガンドを固相担体から切断する工程、および(4)リガンドに結合したターゲット分子を回収する工程を含む、ターゲット分子の精製方法。
- (1)光照射により切断されるリンカーを介してリガンドを固相担体上に固定化する工程、(2)上記(1)で得られたリガンドが固定化された固相担体と、該リガンドのターゲット分子を含む試料とを混合する工程、(3)2−メルカプトエタノールおよびヒドラジンの存在下、光を照射してリガンドを固相担体から切断する工程、および(4)リガンドに結合したターゲット分子を回収する工程を含む、ターゲット分子の精製方法。
- リガンドが固定化された固相担体が、下記式(I)または(II)で示される、請求項6または7記載の方法。
- R2が、水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R3が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R4が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり;R5が水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基である、請求項8記載の方法。
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