JP6749685B2

JP6749685B2 - 被験物質の皮膚感作性の検定方法

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Publication number: JP6749685B2
Application number: JP2016092093A
Authority: JP
Inventors: 健二臼井; 目片　秀明; 秀明目片; 洋宮▲崎▼; 邦彦山下
Original assignee: Daicel Corp; Mandom Corp
Current assignee: Daicel Corp; Mandom Corp
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2020-09-02
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: JP2017198637A

Description

本発明は、被験物質の皮膚感作性の検定方法に関する。

皮膚感作性物質は生体の感受性によっては重篤なアレルギー反応を誘発する。したがって、医薬品、農薬、食料品、化粧品、及び洗剤等の開発において、その原料や添加剤、最終製品等には皮膚感作性物質が含まれていないことが要求されており、これを確認する方法として種々の皮膚感作性試験が報告されている。

これらの皮膚感作性試験としては、被験物質を実験動物に適用する試験である、Maximization試験、Buehler試験、Local Lymph Node Assay等が挙げられる。しかし、この様な試験においては、実験動物の飼育及び管理等の必要があるだけでなく、皮膚観察等の作業が煩雑である等の問題があった。また、動物愛護の観点からも代替し得る方法を見出すことが求められていた。

この様な問題を解決する方法として、DPRA（Direct Peptide Reactivity Assay）等のペプチド結合性を指標にするin vitroの試験系が開発されている（非特許文献１〜３）。この試験法は、皮膚感作性物質との結合性を有するペプチドを試薬として用い、被験物質と混合した後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて混合前後のペプチド減少率を算出することで、被験物質に含まれる皮膚感作性物質の有無を評価するものである。

G.F.Gerberick et al., Development of a Peptide Reactivity Assay for Screening. Toxicol. Sci., 81, 332-343:2004. G.F.Gerberick et al., Quantification of Chemical Peptide Reaction for Screening Contact Allergens: A Classification Tree Model Approach. Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007. EURL ECVAM Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for Skin Sensitisation Testing. European Commission, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection (IHCP), EU Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM), November 2013.

しかしながら、これらの試験系では、水に対する溶解性が低い被験物質は試験そのものが実施できないといった問題があった。また、検定試薬（ペプチド）にはシステイン残基を含むものがあり、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することにより皮膚感作性物質との結合性が消失するため、皮膚感作性試験の精度が低下するといった問題があった。さらに、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて混合前後のペプチド減少率を算出する際、被験物質（の一部）がペプチドと溶出時間が重なることがあり、正確なペプチド減少率を算出する事ができないといった問題があった。

従って、本発明の目的は、種々の被験物質に対して適応可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定する方法を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の樹脂固定ペプチドを用いて被験物質の皮膚感作性の検定を行った場合、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法を提供する。

また、前記の樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、前記の樹脂固定ペプチドのリンカー部を切断し、生成したペプチド部位を含む化合物について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴とする前記の検定方法を提供する。

また、前記のペプチドは、リジン残基を１個以上含むペプチドであるか、又はシステイン残基を１個以上含むペプチドであることが好ましい。

また、ペプチドと被験物質との結合の有無を、クロマトグラフィー法を用いて測定する前記の検定方法についても提供する。

また、本発明では皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する被験物質の皮膚感作性の検定方法であって、前記の樹脂固定ペプチドが、下記式（２）で表されることを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法についても提供する。

（式中、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドを示す。Ｌ’は２価の炭化水素基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、カルボニル基、又はこれらの２以上が結合した２価の基を示す。Ｒは樹脂を示す。）

また、本発明では皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する被験物質の皮膚感作性の検定方法であって、前記の樹脂固定ペプチドが、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されることを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法についても提供する。

（式中、Ｒは樹脂を示す。）

本発明により、種々の被験物質に対して適応可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定する方法を提供することができる。

本発明の被験物質の皮膚感作性の検定方法（以下、「本発明の検定方法」と称する場合がある）は、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチド（以下、「樹脂固定ペプチド」と称する場合がある）に被験物質を接触させた後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴とする。なお、樹脂固定ペプチドは本発明の検定方法における試薬（以下、「本発明の検定試薬」と称する場合がある）として用いることができる。

＜被験物質の皮膚感作性の検定方法＞
本発明の検定方法は、特定の樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴とする。被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させることで、被験物質に含まれる皮膚感作性物質が樹脂固定ペプチドのペプチド部位と反応・結合し、結合物が生じる。一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれない場合は、前記の結合物は生じない。本発明は、この様な結合の有無（結合物の有無）を測定することで、被験物質に皮膚感作性物質が含まれるか否かを判断するものである。

なお、前記の樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、前記の樹脂固定ペプチドのリンカー部を切断し、生成したペプチド部位を含む化合物について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定してもよい。また、ペプチドと被験物質との結合の有無を、クロマトグラフィー法を用いて測定してもよい。

本発明の検定方法は、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させた後、その混合物から、樹脂固定ペプチド及び／又は樹脂固定ペプチドと被験物質（皮膚感作性物質）との結合物を分離し、得られた樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）のリンカー部を切断し、切断により生じたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離した後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴としてもよい。

つまり、本発明の検定方法では、下記の工程Ａ〜工程Ｅを含んでいてもよい。
工程Ａ：樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させる工程
工程Ｂ：工程Ａにより得られた混合物から、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程
工程Ｃ：工程Ｂで分離した樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）のリンカー部を切断する工程
工程Ｄ：工程Ｃにて生じたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程
工程Ｅ：工程Ｄにて分離されたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する工程

［工程Ａ］
本発明の検定方法における工程Ａは、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させる工程である。本工程において、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させることにより、樹脂固定ペプチドのペプチド部位と皮膚感作性物質とが結合することとなる。接触させる方法としては、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを溶媒中で混合させる方法が挙げられる。また、混合した後に静置する工程を有していても良い。

工程Ａにおける接触時間は特に限定されないが、１分〜１２０時間程度が好ましく、より好ましくは５分〜４８時間程度、さらに好ましくは１０分〜３６時間程度である。工程Ａにおける温度（反応温度）は０〜１００℃程度が好ましく、より好ましくは１０〜６０℃程度、さらに好ましくは２０〜４０℃程度である。

工程Ａにおいて使用される溶媒としては、被験物質を溶解することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、水、リン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等の水性緩衝液、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、２−ピロリドン、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ヘキサン、シクロヘキサン、オリーブ油等植物油、炭素数１〜４の一価のアルコール等が挙げられる。炭素数１〜４の一価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等が挙げられる。これらの溶媒は１種又は２種以上を選択して使用することもできる。

［工程Ｂ］
本発明の検定方法における工程Ｂは、工程Ａにて得られた混合物から、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程である。工程Ｂにおける分離方法としては、例えば、遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等が挙げられる。なお、工程Ｂにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。

遠心分離は、工程Ａを経て得られた混合物を遠心分離に付すことで、混合物中の樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）と、樹脂固定ペプチドとは結合していない被験物質とを分離する方法である。例えば、前記の混合物を遠心分離に付した後に上清を取り除くことで、前記の樹脂固定ペプチドを高い純度で得ることができる。

フィルターろ過による分離は、工程Ａを経て得られた混合物をフィルターろ過に付すことで、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）と、樹脂固定ペプチドとは結合していない被験物質とをサイズの大小によって分離する方法であり、これらのサイズの差が大きい場合に特に有効である。例えば、前記の混合物をフィルターろ過に付すことにより、前記の樹脂固定ペプチドを高い純度で得ることができる。

磁性ビーズを利用した分離は、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）の樹脂部分に磁性ビーズを使用した場合に有効な分離方法であり、磁性ビーズと磁石の磁力を利用した分離方法である。具体的には、工程Ａを経て得られた混合物に磁石を接触させることで、磁石に樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を付着させ、樹脂固定ペプチドとは結合していない被験物質と分離する方法である。なお、磁石から樹脂固定ペプチドを解離させる方法としては、例えば、磁石の磁力を失わせる方法（例えば、磁石として電磁石を用いる方法）が挙げられる。また、磁石に樹脂固定ペプチドが付着した状態において、後述の工程Ｃ及びＤを行うことにより、切断リンカーの一部を含むペプチド（被験物質と結合したものを含む）を得る方法も挙げられる。これにより、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）や、切断リンカーの一部を含むペプチド（被験物質と結合したものを含む）を高い純度で得ることができる。

本発明の検定方法が工程Ｂを含む場合、工程Ａを経て得られた混合物から樹脂固定ペプチドとは結合能の無い被験物質を除去できるため、樹脂固定ペプチドと被験物質（皮膚感作性物質）とが結合した樹脂固定ペプチドのみが得られることとなり、その結果、皮膚感作性の検定精度が向上する。

［工程Ｃ］
本発明の検定方法における工程Ｃは、工程Ｂで分離した樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）のリンカー部を切断する工程である。これにより、切断リンカーの一部を含むペプチド（被験物質と結合したものを含む）と、切断リンカーの一部を含む樹脂が得られる。なお、切断リンカーの一部を含むペプチドを、「ペプチド部位を含む化合物」と称する場合がある。なお、工程Ｃにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。

工程Ｃにおいて、光により切断する場合、その切断方法は特に限定されないが、例えば、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）に対して光を照射する方法が挙げられる。照射する光の種類は特に限定されないが、例えば、紫外線（波長３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ）が挙げられる。また、光源としては特に限定されないが、低圧水銀灯、中圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、ケミカルランプ、ブラックライトランプ、マイクロウェーブ励起水銀灯、メタルハライドランプ等が好ましく用いられる。

工程Ｃにおいて、アルカリにより切断する場合、その切断方法は特に限定されないが、例えば、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を含む溶液に、アルカリ溶液を混合すること等が挙げられる。使用されるアルカリとしては特に限定されないが、例えば、アンモニア、ヒドラジン、トリエチルアミン、水素化ホウ素ナトリウム、水酸化ナトリウムを用いることができる。アルカリ溶液は、これらのアルカリを溶媒（例えば、水、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒等）に溶解させることで調製することができる。

工程Ｃにおいて、光、又はアルカリ以外の切断方法としては、加熱によるもの、酸によるもの、酵素反応によるもの等が挙げられる。

本発明の検定方法が工程Ｃを含む場合、ペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）と、切断リンカーの一部を含む樹脂とが得られる。これらは、その物性（例えば分子量や、サイズ等）が異なるため、種々の分離方法（例えば、工程Ｄにおける分離方法）により分離することができる。

［工程Ｄ］
本発明の検定方法における工程Ｄは、工程Ｃにて生じたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程である。より具体的には、工程Ｂにおける分離方法として例示した、遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等により、工程Ｃにて生じるペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離し、切断リンカーの一部を含む樹脂を除去する工程である。なお、工程Ｄにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。

本発明の検定方法が工程Ｄを含む場合、純度の高いペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）が得られるため、より皮膚感作性の検定精度が向上する。

［工程Ｅ］
本発明の検定方法における工程Ｅは、工程Ｄにて分離されたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する工程である。具体的な測定方法としては特に限定されないが、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ）等のクロマトグラフィー法を用いた方法が挙げられる。具体的には、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させて得られるサンプル（溶液）と、樹脂固定ペプチドのみを含むリファレンス（溶液）とを用意し、必要に応じて上記の工程Ｂ〜Ｄを行った後にそれぞれをクロマトグラフィー法にて測定し、得られる量比（例えばＨＰＬＣにて得られるピークの面積）の差から、ペプチドと被験物質との結合物が生じているか否かを判断する方法が挙げられる。

本発明の検定方法におけるクロマトグラフィー法以外の測定方法としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法や、マトリクス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、電子衝撃イオン化（ＥＩ）法、高速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）法等を用いた質量分析法、赤外分光法（ＩＲ法）等の本分野において公知乃至慣用の方法を用いることができる。なお、これらの測定方法は２以上を組み合わせて用いることもできる。

＜樹脂固定ペプチド＞
本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド（以下、「ペプチド」と称する場合がある）と樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドである。なお、本発明の樹脂固定ペプチドは下記式（１）で表すことができ、式中のＰは皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド（ペプチド部位）、Ｌは切断リンカー（リンカー部位）、Ｒは樹脂（樹脂部位）を示す。
Ｐ−Ｌ−Ｒ（１）

前記のペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドであれば特に限定されない。また、前記のペプチドは保護基を有していても良い。この様なペプチドとしては、例えば、リジン残基を１個以上含むペプチドや、システイン残基を１個以上含むペプチドが挙げられる。これらのペプチドは、皮膚感作性物質とリジン残基やシステイン残基を介して結合する。皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドにおけるアミノ酸の重合度は特に限定されないが、例えば３〜２０であることが好ましく、より好ましくは４〜１５、さらに好ましくは５〜１０である。

切断リンカーはペプチドに含まれる何れかのアミノ酸と結合していてもよいが、皮膚感作性物質との結合能の観点からは、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸と結合していることが好ましい。なお、前記の切断リンカーがペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸と結合している場合、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸の側鎖を介して結合していてもよいし、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基又はＮ末端のアミノ基を介して結合していてもよい。この中でも、皮膚感作性物質との結合能の観点から、前記の切断リンカーがペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸の側鎖を介して結合していることが好ましい。

切断リンカーがペプチドのアミノ酸の側鎖を介して結合している場合のアミノ酸としては、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、システイン（Ｃ）等の側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸であることが好ましい。

前記のリジン残基を１個以上含むペプチドは、例えば、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＫＡＤやＲＦＡＡＫＡＡを含むペプチドであることが好ましく、より好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端に保護基を有していてもよいＨ−ＲＦＡＡＫＡＤ−ＯＨやＨ−ＲＦＡＡＫＡＡ−ＯＨである。また、前記のシステイン残基を１個以上含むペプチドは、例えば、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＣＡＤやＲＦＡＡＣＡＡを含むペプチドであることが好ましく、より好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端に保護基を有していてもよいＨ−ＲＦＡＡＣＡＤ−ＯＨやＨ−ＲＦＡＡＣＡＡ―ＯＨである。なお、これらのペプチドは保護基を有していても良い。保護基としては、ペプチド合成において通常用いられる保護基を用いることができ、例えば、Ｎ末端保護基（例えば、Ａｃ（アセチル）基、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）基、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）基、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基、Ｃ末端保護基（例えば、ＯＢｚｌ（ベンジルエステル）基、ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル）基）、およびアミノ酸側鎖の保護基（Ｔｏｓ（トシル）基、Ｐｂｆ（４−メトキシトリチル）基、ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル）基、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基）が挙げられる。なお、前記のリジン残基を１個以上含むペプチドであって保護基を有するものとしては、Ａｃ−ＲＦＡＡＫＡＤ−ＯＨ等が例示され、前記のシステイン残基を１個以上含むペプチドであって保護基を有するものとしては、Ａｃ−ＲＦＡＡＣＡＤ−ＯＨ等が例示される。

前記のペプチドが、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＫＡＤを含むペプチドである場合、切断リンカーは、皮膚感作性物質との結合能の観点から、アスパラギン酸（Ｄ）の側鎖のカルボキシル基を介して結合することがさらに好ましい。なお、前記のペプチドが、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＣＡＤを含むペプチドである場合も同様である。

前記の切断リンカーとしては、例えば、光切断リンカー（光により切断することが可能なリンカー）、アルカリ切断リンカー（アルカリにより切断することが可能なリンカー）、熱切断リンカー（熱により切断することが可能なリンカー）、酸切断リンカー（酸により切断することが可能なリンカー）、酵素切断リンカー（酵素により切断することが可能なリンカー）が挙げられ、光切断リンカーやアルカリ切断リンカーが好ましく用いられる。これらのリンカーの分子量は特に限定されないが、６０〜１０００程度であることが好ましく、より好ましくは１００〜４００である。

光切断リンカーとしては、公知の光切断リンカーを適宜選択して使用することができ、特に限定されないが、２−ニトロベンゼン骨格、５−ニトロフェノール骨格、ニトロインドール骨格、又はクマリン骨格を有する光切断リンカー等を挙げることができ、この中でも２−ニトロベンゼン骨格、５−ニトロフェノール骨格を有する光切断リンカーが好ましい。

光切断リンカーは、例えば光切断リンカー剤により導入することができる。この様な光切断リンカー剤としては、例えば、Fmoc-Phg(2-NO2)-(C#CH2)OH（渡辺化学工業株式会社製：２−ニトロベンゼン骨格を有する光切断リンカー剤）等を挙げることができる。

アルカリ切断リンカーとしては、公知のアルカリ切断リンカーを適宜選択して使用することができ、特に限定されないが、例えば、４−ヒドロキシメチル安息香酸を含むアルカリ切断リンカー等を挙げることができる。なお、アルカリ切断リンカーは、アルカリ切断リンカー剤により導入することができるが、アルカリ切断リンカー剤としては、４−ヒドロキシメチル安息香酸を含むリンカー剤が挙げられる。

樹脂としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシアルキレンポリオール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリブチレンナフタレート等）、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレン共重合体等）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、及びこれらを２種以上組み合わせた樹脂（例えば、これらの共重合体）が挙げられる。また、磁性ビーズとして使用可能な樹脂を用いることができる。なお、本発明の検定方法において、使用する溶媒に対して不溶の樹脂を用いた場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質の分離（例えば、遠心分離、フィルターろ過による分離）が容易となる。なお、これらの樹脂は、切断リンカーを導入する観点から、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を有する樹脂が好ましい。この様な樹脂としては、Fmoc-NH-PEG樹脂（渡辺化学工業株式会社製）、Amino PEGA resin、NovaPEG amino resin、NovaSyn TG amino resin（以上、メルク株式会社製）等が挙げられる。また、樹脂としては、切断リンカー（光、又はアルカリ切断リンカー等）を有する樹脂を用いることもできる。この様な樹脂としては、4-[4-(1-Fmoc-aminoethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butyramidomethyl-polystyrene（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）、ＨＭＢＡ−ＰＥＧ樹脂（渡辺化学工業株式会社製）等が挙げられる。

本発明の樹脂固定ペプチドは、ペプチド部位がシステイン残基を含むペプチドである場合であっても、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することが無く、長期間に渡って安定である。これは、ペプチドを樹脂に固定することにより、ペプチドそのものを検定試薬として用いる場合と比べて、ペプチドが有するシステイン残基が反応する機会が少なくなることが一つの要因であると考えられる。

本発明の樹脂固定ペプチドは、下記式（２）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式（２）中のＰは皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド部位を示す。なお、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドであることが好ましい。Ｌ’はリンカーの一部を示し、例えば、２価の炭化水素基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、カルボニル基、及びこれらの２以上が結合した２価の基が挙げられる。なお、前記の２価の炭化水素基としては、例えば、２価の脂肪族炭化水素基（例えば、２価の直鎖状炭化水素基、又は２価の分岐鎖状炭化水素基）、２価の脂環式炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基、及びこれらの２以上が結合した２価の炭化水素基であって、炭素数１〜２０（好ましくは炭素数２〜１０）の炭化水素基が挙げられる。Ｒは樹脂を示す。

また、樹脂固定ペプチドは、下記式（３）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式中のＰ及びＲは式（２）におけるものと同様である。

さらにまた、前記の樹脂固定ペプチドは、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式中のＲは式（２）におけるものと同様である。

本発明の樹脂固定ペプチドの製造方法は特に限定されないが、例えばペプチド固相合成法等を用いて製造することができる。具体的には、表面をアミノ基等で修飾した樹脂を固相として用い、光、又はアルカリ切断リンカー剤と反応させた後、脱水反応によって１つずつアミノ酸鎖を伸長していくことでペプチド部位を作製する方法が挙げられる。なお、切断リンカーを有する樹脂を用い、脱水反応によって１つずつアミノ酸鎖を伸長していくことでペプチド部位を作製する方法であってもよい。

本発明の検定試薬は前記の樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、本発明の検定試薬は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。

本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質除去剤としても用いることができる。つまり、医薬品、農薬、食料品、化粧品、及び洗剤等の開発において、その原料や添加剤、最終製品等に本発明の樹脂固定ペプチドを添加した後、適切に除去することによって、これらに含まれる皮膚感作性物質を除去することも可能である。なお、前記の皮膚感作性物質除去剤は前記の樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、皮膚感作性物質除去剤は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

［樹脂固定ペプチド（１）の作製］
ＮＨ₂−ＰＥＧ樹脂（官能基導入率０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上のアミノ基とＦｍｏｃ−Ｐｈｇ（２−ＮＯ２）−（Ｃ＃ＣＨ２）ＯＨをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のＦｍｏｃ基をピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基とＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液（水：トリイソプロピルシラン：ＴＦＡ（体積比）＝０．０２：０．０２：１）で２時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド（１）を作製した。

［樹脂固定ペプチド（２）の作製］
ＮＨ₂−ＰＥＧ樹脂（官能基導入率０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上のアミノ基とＦｍｏｃ−Ｐｈｇ（２−ＮＯ２）−（Ｃ＃ＣＨ２）ＯＨをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のＦｍｏｃ基をピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基とＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液（水：トリイソプロピルシラン：ＴＦＡ（体積比）＝０．０２：０．０２：１）で２時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド（２）を作製した。

なお、樹脂固定ペプチド（１）及び（２）の作製にて用いたＮＨ₂−ＰＥＧ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｇ（２−ＮＯ２）−（Ｃ＃ＣＨ２）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨは全て渡辺化学工業株式会社の製品である。

［実施例１（エチルアクリレートの皮膚感作性の検定１）］
以下の操作手順でエチルアクリレートの皮膚感作性を検定した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（１）を、５ｍｌのチューブ（株式会社ハイペップ研究所製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回洗浄した後、５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。次に、１ｍｌの０．１重量％トリエチルアミンを含むＤＭＦにエチルアクリレートの濃度が１００ｍＭになるように添加して調製したものに樹脂固定ペプチド（１）を添加し、２４時間反応させた。次に、５００μｌのＤＭＦで５回洗浄した後、５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。次に、Ａ溶媒を５００μｌ加えて撹拌した後、ピペットを使用してエッペンドルフチューブに回収した。次に、１５０００ｒｐｍ×１ｍｉｎの条件で遠心し、上清を廃棄した後、再度Ａ溶媒を５００μｌ加えて撹拌する操作を４回繰り返した。次に、４００μｌのＡ溶媒を投入し、紫外−可視ファイバ光源（浜松ホトニクス、ＬＥＤ光源用コントローラ(C11924)）を用い、光量８０％、照射距離：５ｃｍの条件で、２０分間、光（波長：約３６５ｎｍ）を照射した。次に、光照射後の試料を遠心（１５０００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）し、その上清をフィルター（ミリポア０．４５μｍ１００／ｐｋ：メルク社製）へ移すと共に、遠心（１５０００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）し、１００μｌとなった所でＨＰＬＣ測定（カラム；zorbax社製ＳＢ−Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）、Ａ溶媒；水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１、Ｂ溶媒；アセトニトリル：ＴＦＡ＝１００：０．０８、グラジエント；０分／Ｂ溶媒１０％、１１分／Ｂ溶媒９０％；流速：０．３５ｍｌ／分）を行った。以下に、樹脂固定ペプチド（１）に光を照射して得られる切断物のモデルを示す。

［実施例２（シクラメンアルデヒドの皮膚感作性の検定１）］
エチルアクリレートの代わりにシクラメンアルデヒドを用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。

（実施例１及び２のリファレンス）
皮膚感作性物質（エチルアクリレート）を用いないこと以外は実施例１と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。

［実施例３（エチルアクリレートの皮膚感作性の検定２）］
樹脂固定ペプチド（１）の代わりに樹脂固定ペプチド（２）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。

［実施例４（シクラメンアルデヒドの皮膚感作性の検定２）］
樹脂固定ペプチド（１）の代わりに樹脂固定ペプチド（２）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。

（実施例３及び４のリファレンス）
皮膚感作性物質を用いないこと以外は実施例３と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。

＜評価＞
実施例１にて得られたＨＰＬＣのチャートと、そのリファレンスにて得られたＨＰＬＣのチャートとを比較することで、樹脂固定ペプチドのペプチド部位に由来する溶出ピーク面積が減少することを確認した。このことから、実施例１において、樹脂固定ペプチドのペプチド部位にエチルアクリレートが結合したことが示唆された。さらに、樹脂固定ペプチド（１）から切断されたペプチド部分とエチルアクリレートとの結合物に由来すると考えられる溶出ピークが見られた。また、実施例２〜４においても同様の結果が得られた。

Claims

皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、
ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する被験物質の皮膚感作性の検定方法であって、
前記の樹脂固定ペプチドが、下記式（３）で表されることを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法。

（式中、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドであって、アミノ酸の重合度が１〜１０であるペプチドを示す。Ｒはポリオキシアルキレンポリオールを含む樹脂を示す。）
前記の樹脂固定ペプチドが、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されることを特徴とする請求項１に記載の被験物質の皮膚感作性の検定方法。

（式中、Ｒはポリオキシアルキレンポリオールを含む樹脂を示す。）
前記の樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、前記の樹脂固定ペプチドのリンカー部を切断し、生成したペプチド部位を含む化合物について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の被験物質の皮膚感作性の検定方法。
ペプチドと被験物質との結合の有無を、クロマトグラフィー法を用いて測定する請求項１〜３の何れか１項に記載の被験物質の皮膚感作性の検定方法。