JP6793290B2 - 被験物質の皮膚感作性の評価方法、及び樹脂固定ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、被験物質の皮膚感作性の評価方法、及び樹脂固定ペプチドに関する。

皮膚感作性物質は、生体の感受性によっては重篤なアレルギー反応を誘発する。したがって、医薬品、農薬、食料品、化粧品、及び洗剤等の開発において、その原料や添加剤、最終製品等からは皮膚感作性物質が排除されている必要があり、その確認方法として種々の皮膚感作性試験が報告されている。

これらの皮膚感作性試験としては、被験物質を実験動物に適用する試験である、Maximization試験、Buehler試験、及びLocal Lymph Node Assay等が挙げられる。しかしながら、この様な試験においては、実験動物の飼育及び管理等の必要があるだけでなく、皮膚観察等の作業が煩雑である等の問題があった。また、動物愛護の観点からも代替し得る方法を見出すことが求められていた。

この様な問題を解決する方法として、DPRA（Direct Peptide Reactivity Assay）等のペプチド結合性を指標にするin vitroの試験系が開発されている（非特許文献１〜３）。この試験法は、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドを評価試薬として用い、ペプチドのみを含む溶液と、ペプチドと被験物質とを混合した溶液とを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて比較し、ペプチドの減少率を算出することで、被験物質に含まれる皮膚感作性物質の有無を評価するものである。

G.F.Gerberick et al., Development of a Peptide Reactivity Assay for Screening. Toxicol. Sci., 81, 332-343:2004. G.F.Gerberick et al., Quantification of Chemical Peptide Reaction for Screening Contact Allergens: A Classification Tree Model Approach. Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007. EURL ECVAM Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for Skin Sensitisation Testing. European Commission, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection (IHCP), EU Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM), November 2013.

しかしながら、これらの試験系では、水に対する溶解性が低い被験物質については試験そのものが実施できないといった問題があった。また、評価試薬として用いられるペプチドにはシステイン残基を含むものがあり、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することにより皮膚感作性物質との結合能が消失するため、皮膚感作性試験の精度が低下するといった問題があった。さらに、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて混合前後のペプチド減少率を算出する際、被験物質（の一部）がペプチドと溶出時間が重なることがあり、正確なペプチド減少率を算出することができないといった問題があった。また、そもそもＨＰＬＣクロマトグラフィーはその測定に長い時間と手間が必要となるといった問題があった。

したがって、本発明の目的は、種々の被験物質に対して適用可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価することが可能な方法を提供することである。また、該方法に用いる評価試薬を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の樹脂固定ペプチドを用いて被験物質の皮膚感作性の評価を行った場合、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の工程を含む被験物質の皮膚感作性の評価方法を提供する。
工程Ａ：皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程
工程Ｃ：工程Ａの後、樹脂固定ペプチドに、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程
工程Ｄ：工程Ｃの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程

また、本発明は、以下の工程Ｂをさらに含むことが好ましい。
工程Ｂ：工程Ｃの前に、工程Ａで得られた混合物から樹脂固定ペプチドを分離する工程

また、本発明は、分光法により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価することが好ましい。

また、前記の樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質は、チオール基検出試薬又はアミノ基検出試薬であることが好ましい。

また、前記の樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質は１，２−インダンジオン又は５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）であることが好ましい。

また、前記の樹脂固定ペプチドは後述の式（１）又は（２）で示される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。

なお、本発明では、後述の式（１）又は（２）で示される樹脂固定ペプチドについても提供する。

また、前記の樹脂固定ペプチドは被験物質の皮膚感作性の評価方法に用いられることが好ましい。

なお、本発明では、前記の樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性評価試薬についても提供する。

また、前記の樹脂固定ペプチドは皮膚感作性物質の除去剤として用いられることが好ましい。

なお、本発明では、前記の樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性物質除去剤についても提供する。

本発明によれば、種々の被験物質に対して適用可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価することができる。

本発明の被験物質の皮膚感作性の評価方法（以下、「本発明の評価方法」と称することがある）は、以下の工程を含むことを特徴とする。
工程Ａ：皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程
工程Ｃ：工程Ａの後、樹脂固定ペプチドに、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程
工程Ｄ：工程Ｃの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程
なお、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドを、単に「樹脂固定ペプチド」と称することがある。また、前記樹脂固定ペプチドは本発明の評価方法における試薬（以下、「本発明の評価試薬」と称することがある）として用いることができる。

＜被験物質の皮膚感作性の評価方法＞
本発明の評価方法は、樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程（工程Ａ）、工程Ａの後、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）に、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程（工程Ｃ）、及び、工程Ｃの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程（工程Ｄ）を含むことを特徴とする。また、本発明の評価方法では、工程Ｃの前に、工程Ａで得られた混合物から樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）を分離する工程（工程Ｂ）を設けてもよい。なお、工程Ａで得られた混合物とは、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触することにより得られる混合物を指す。また、「樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）」とは、樹脂固定ペプチドのみ、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物のみ、又は樹脂固定ペプチド及び樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物の両方を意味する。

本発明の評価方法において、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させることで、被験物質に含まれる皮膚感作性物質が樹脂固定ペプチドのペプチド部位と反応・結合し、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物が生じる。一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれない場合は、前記の結合物は生じない。本発明はこの様な結合の有無（結合物の有無）を、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を利用することにより、被験物質に皮膚感作性物質が含まれるか否かを判断するものである。

［工程Ａ］
本発明の評価方法における工程Ａは、樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程である。工程Ａにおいて、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質との結合物が生じる。接触させる方法としては特に限定されないが、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを溶媒中で混合する方法が挙げられる。具体的には、樹脂固定ペプチドを含む溶液に、被験物質又は被験物質を含む溶液を加えて混合する方法や、被験物質を含む溶液に、樹脂固定ペプチド又は樹脂固定ペプチドを含む溶液を加えることで混合する方法が挙げられる。なお、工程Ａには樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後に静置する工程を含んでいてもよい。

工程Ａにおける樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる時間（接触時間）は特に限定されないが、１分〜１２０時間程度が好ましく、より好ましくは５分〜４８時間程度、さらに好ましくは１０分〜３６時間程度である。工程Ａにおける温度（反応温度）は０〜１００℃程度が好ましく、より好ましくは１０〜６０℃程度、さらに好ましくは２０〜４０℃程度である。なお、前記の接触時間とは、樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、他の工程に進むまでの時間を意味し、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを溶媒中で混合してから工程Ｃ（本発明の評価方法が工程Ｂを含む場合は工程Ｂ）に進むまでの時間を意味する。

工程Ａにおいて使用される溶媒としては、樹脂固定ペプチドや被験物質を溶解又は分散することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、水、リン酸ナトリウム、又は酢酸アンモニウムを含む水性緩衝液、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、２−ピロリドン、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ヘキサン、シクロヘキサン、オリーブ油等植物油、炭素数１〜４の一価のアルコール等が挙げられる。炭素数１〜４の一価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等が挙げられる。これらの有機溶媒は１種又は２種以上を選択して使用することもできる。

工程Ａにおける樹脂固定ペプチドの濃度は、使用する溶媒や、被験物質の前記溶媒への溶解度により適宜調節することができるが、例えば、溶媒１ｍｌに対して０．００１〜５０ｍｇが好ましく、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇである。樹脂固定ペプチドの濃度が上記の範囲内にあることで高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価することが可能となる。なお、前記の樹脂固定ペプチドの濃度とは、使用する溶液（１ｍｌ）に対する樹脂固定ペプチドの重量（樹脂部位とペプチド部位を含む総重量）（ｍｇ）を意味する。

［工程Ｂ］
本発明の評価方法は工程Ｂを含んでいてもよい。工程Ｂは、工程Ｃの前に、工程Ａで得られた混合物から樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）を分離する工程である。被験物質に皮膚感作性物質が含まれない場合は、工程Ａで得られた混合物に樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物が含まれないため、本工程は樹脂固定ペプチドを分離する工程となる。一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、本工程は混合物から樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物を分離する工程となる。なお、前記混合物に皮膚感作性物質に結合していない樹脂固定ペプチドが存在する場合は、該樹脂固定ペプチドも樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物と同時に分離することが可能となる。

工程Ｂにおける分離方法としては、例えば、遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等が挙げられる。なお、工程Ｂには分離後の樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）を溶媒にて洗浄する工程を含んでいてもよい。なお、工程Ｂにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。

遠心分離は、工程Ａで得られた混合物を遠心分離に付すことで、混合物中の樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）と、被験物質（樹脂固定ペプチドに結合した皮膚感作性物質を除く）とを分離する方法である。例えば、前記の混合物を遠心分離に付した後に上清を取り除くことで、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）を高い純度で得ることができる。

フィルターろ過による分離は、工程Ａで得られた混合物をフィルターろ過に付すことで、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）と、被験物質（樹脂固定ペプチドに結合した皮膚感作性物質を除く）とをサイズの大小によって分離する方法であり、これらのサイズの差が大きい場合に特に有効である。例えば、前記の混合物をフィルターろ過に付すことにより、サイズの大きい樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）がフィルター上に残ることとなる。

磁性ビーズを利用した分離は、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）の樹脂部分に磁性ビーズを使用した場合に有効な分離方法であり、磁性ビーズと磁石の磁力を利用した分離方法である。具体的には、工程Ａを経て得られた混合物に磁石を接触させることで、磁石に樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）を付着させ、被験物質（樹脂固定ペプチドに結合した皮膚感作性物質を除く）と分離する方法である。なお、磁石から樹脂固定ペプチドを解離させる方法としては、例えば、磁石の磁力を失わせる方法（例えば、磁石として電磁石を用いる方法）が挙げられる。

本発明の評価方法が工程Ｂを含む場合、工程Ａを経て得られた混合物から樹脂固定ペプチドとは結合能の無い被験物質を除去できるため、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）のみが得られることとなる。その結果、工程Ｂを含まない場合と比較して、被験物質と樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質との接触により生じる偽陽性及び偽陰性を低減することができるため、皮膚感作性の評価精度がさらに向上する。

［工程Ｃ］
本発明の評価方法における工程Ｃは、工程Ａの後、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）に、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程である。

工程Ｃにおける樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質（以下、「物質Ｘ」と称することがある）とは、樹脂固定ペプチドと反応することにより光学的応答を与える物質を指す。なお、光学的応答とは、視覚的に認識可能なものであっても、後述の分光法によって測定可能なものであってもよい。

光学的応答が生じる機構は特に限定されないが、例えば、［１］樹脂固定ペプチドと、物質（Ｘ）とが反応することにより、発色性又は発光性を有する反応物が生じる機構、［２］樹脂固定ペプチドと物質（Ｘ）との反応により、物質（Ｘ）が減色又は減光する機構が挙げられる。

前記の機構［１］としては、［１−１］樹脂固定ペプチドと、物質（Ｘ）との反応物が発色性又は発光性を有する物質となる機構や、［１−２］樹脂固定ペプチドと、物質（Ｘ）とが反応することにより、発色性又は発光性を有する物質（物質（Ｘ）の一部が）物質（Ｘ）から遊離する機構が例示される。

前記の機構［１−１］を応用した本発明の評価方法の一例を以下に説明する。なお、本例示は、樹脂固定ペプチドとして、リジン残基を１個以上含むペプチドを含む樹脂固定ペプチドを用い、且つ、物質（Ｘ）として１，２−インダンジオンを用いたものである。

被験物質に皮膚感作性物質が含まれていない場合、工程Ａでは樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物は生じない。次に、工程Ｃでは、樹脂固定ペプチドのペプチド部位のアミノ基と１，２−インダンジオンが反応し、発光性（蛍光性）を有するこれらの反応物が得られる。

一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれている場合、工程Ａを経ることで樹脂固定ペプチドの一部又は全部のペプチド部位において、アミノ基を介してペプチド部位と皮膚感作性物質が結合する。次に、工程Ｃでは、皮膚感作性物質が結合していない樹脂固定ペプチドでは、発光性（蛍光性）を有するこれらの反応物が得られるものの、皮膚感作性物質が結合している樹脂固定ペプチドのペプチド部位は、１，２−インダンジオンと反応しない。

この様に、被験物質に皮膚感作性物質が含まれていない場合と、被験物質に皮膚感作性物質が含まれている場合とを比較すると、工程Ｃを経て得られる混合物において発光性（蛍光性）に強弱が生じることとなる。この様な機構を応用し、後述の工程Ｄにて、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価するものである。

前記の機構［１−２］を応用した本発明の評価方法の一例を以下に説明する。なお、本例示は、樹脂固定ペプチドとして、システイン残基を１個以上含むペプチドを含む樹脂固定ペプチドを用い、且つ、物質（Ｘ）として５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）を用いたものである。

被験物質に皮膚感作性物質が含まれていない場合、工程Ａでは樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物は生じない。次に、工程Ｃでは、樹脂固定ペプチドのチオール基と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）が反応し、発色性を有する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸が生成する。

一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれている場合、工程Ａを経ることで樹脂固定ペプチドの一部又は全部のペプチド部位において、チオール基を介してペプチド部位と皮膚感作性物質が結合する。次に、工程Ｃでは、皮膚感作性物質が結合していない樹脂固定ペプチドでは、発色性を有する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸が得られるものの、皮膚感作性物質が結合している樹脂固定ペプチドのペプチド部位は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応しない。

この様に、被験物質に皮膚感作性物質が含まれていない場合と、被験物質に皮膚感作性物質が含まれている場合とを比較すると、工程Ｃを経て得られる混合物において発色性に強弱が生じることとなる。この様な機構を応用し、後述の工程Ｄにて、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価するものである。

工程Ｃにおける樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質（物質（Ｘ））は、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質とが結合することにより、樹脂固定ペプチドとの反応性が消失する物質であることが望ましい。この様な機構としては、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質とが結合することにより、樹脂固定ペプチドと物質（Ｘ）との反応部位が不活性化される機構が挙げられる。その一例としては、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合部位が、樹脂固定ペプチドと物質（Ｘ）との反応部位と同一であり、先に樹脂固定ペプチドが皮膚感作性物質と結合することで、樹脂固定ペプチドと物質（Ｘ）との反応性が消失する様な機構が挙げられる。

つまり、物質（Ｘ）は、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合部位（すなわち、皮膚感作性物質が結合し得る樹脂固定ペプチドの部位）と反応することが好ましく、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合部位に結合するものであることがより好ましく、樹脂固定ペプチドのペプチド部位におけるリジン残基の側鎖アミノ基や、システイン残基の側鎖チオール基を介して結合するものであることが特に好ましい。この様な物質（Ｘ）としては、例えば、一般的にチオール基検出試薬やアミノ基検出試薬として知られる化合物が挙げられ、具体的には５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロール、２，２’−ジチオジピリジン、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）、６，６’−ジチオビスニコチン酸等のチオール基検出試薬；１，２−インダンジオン、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、ニンヒドリン、１，８−ジアザフルオレン−９−オン等のアミノ基検出試薬が挙げられる。

工程Ｃにおいて、物質（Ｘ）と樹脂固定ペプチド（被験物質との結合物を含む）とを接触させる方法としては特に限定されないが、例えば、物質（Ｘ）と樹脂固定ペプチド（被験物質との結合物を含む）とを溶媒中で混合する方法が挙げられ、より具体的には、樹脂固定ペプチド（被験物質との結合物を含む）を含む溶液に、物質（Ｘ）又は物質（Ｘ）を含む溶液を加えて混合する方法が挙げられる。なお、工程Ｃには混合した後に静置する工程を含んでいてもよい。工程Ｃでは工程Ａにて得られた混合物を含む溶液をそのまま用いてもよいが、他の溶媒に置換して得られた溶液を用いてもよい。また、本発明の評価方法が工程Ｂを含む場合は、工程Ｂにて得られた溶液をそのまま用いてもよいが、他の溶媒に置換して得られた溶液を用いてもよい。これらの場合に用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。

工程Ｃにおける樹脂固定ペプチドに物質（Ｘ）を接触させる時間（接触時間）は特に限定されないが、５秒〜７２時間程度が好ましく、より好ましくは３０秒〜４８時間程度、さらに好ましくは１分〜３６時間程度である。工程Ａにおける温度（反応温度）は０〜１００℃程度が好ましく、より好ましくは１０〜６０℃程度、さらに好ましくは２０〜４０℃程度である。なお、前記の接触時間とは、樹脂固定ペプチドに物質（Ｘ）を接触させた後、他の工程に進むまでの時間を意味し、例えば、物質（Ｘ）と樹脂固定ペプチドとを溶媒中で混合してから工程Ｄに進むまでの時間を意味する。

工程Ｃにおける物質（Ｘ）の濃度は、使用する溶媒により適宜調節することができるが、例えば、０．００１〜１００ｍＭが好ましく、より好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍＭである。物質（Ｘ）の濃度が上記の範囲内にあることで高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価することが可能となる。なお、前記の物質（Ｘ）の濃度とは、樹脂固定ペプチドに物質（Ｘ）を接触させることにより得られる混合溶液における物質（Ｘ）の濃度を意味する。

［工程Ｄ］
本発明の評価方法における工程Ｄは、工程Ｃの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程である。光学的応答の観測とは、具体的には、工程Ｃにより生じた、発光（例えば、蛍光による発光）、発色、減光、及び減色等の光学的応答を観測することを意味し、工程Ｄではこれらの光学的応答により、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程である。

例えば、前記の機構［１］により光学的応答を発揮する物質（Ｘ）（例えば、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）等）を使用する際、工程Ａにおいて被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質とが反応して樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物が生じるため、工程Ｃにおいて樹脂固定ペプチドと物質（Ｘ）との反応が減り、工程Ｄにおいて光学的応答（発光）が減少する。一方、工程Ａにおいて、被験物質に皮膚感作性物質が含まれない場合は、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物が生じず、工程Ｃにおいて樹脂固定ペプチドと物質（Ｘ）との反応が進行するため、工程Ｄにおいては光学的応答（発光）が観測される。この様に、光学的応答の有無又はその大小を観測することにより、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無、つまり、被験物質に皮膚感作性物質が含まれるか否かを評価することが可能となる。

また、特定の被験物質を用いて本発明の評価方法を実施することで光学的応答の絶対量（例えば、吸収度や蛍光強度）を計測するとともに、被験物質を使用することなく工程Ａを実施すること以外は同様の操作を行うことで光学的応答の絶対量を計測し、これらの差を算出することにより、被験物質に含まれる皮膚感作物質の量を概算することも可能である。また、工程Ｃにおいて使用する物質（Ｘ）が本来有する光学的応答の絶対量を考慮して上記の概算を行うことも可能である。したがって、本発明の評価方法は高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価することが可能であるといえる。

光学的応答の観測方法としては特に限定されないが、簡便性や迅速性の観点からは分光法により評価することが好ましい。つまり、工程Ｄは分光法により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程であることが好ましい。

分光法としては、例えば、紫外・可視・近赤外分光法、赤外分光法、蛍光分光法、核磁気共鳴分光法、ラマン分光法、及び質量分析が挙げられるが、工程Ｃにおける物質（Ｘ）による発光（例えば、蛍光による発光）・発色・減光・減色等の光学的応答を利用する観点から、紫外・可視・近赤外分光法及び蛍光分光法が好ましい。なお、紫外・可視・近赤外分光法とは、紫外、可視、及び近赤外領域のうち少なくとも１つの領域の光吸収を測定することを特徴とする分光法である。ここで、工程Ｄにおける光学的応答の観測を視認で行う場合も上記の分光法に含まれるものとする。

工程Ｄにおいて使用される分光光度計は使用される物質（Ｘ）等によって適宜選択可能であり、特に限定されないが、例えば、紫外可視分光光度計や分光蛍光光度計等が挙げられる。

工程Ｄでは、樹脂固定ペプチドは皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド（以下、単に「ペプチド」と称することがある）と樹脂とが結合した状態あってもよいし、ペプチドと樹脂とを切断した状態であってもよいが、ペプチドと樹脂とが結合した状態であることが好ましい。つまり、工程Ｄは、工程Ｃの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程であって、前記の樹脂固定ペプチドが、ペプチドと樹脂とが結合した状態であることを特徴とする工程であることが好ましい。その理由としては、（１）樹脂固定ペプチドのペプチドと樹脂とを切断することを前提とすると、その切断工程が必要となり、簡便性や迅速性といった観点から不利であること、（２）樹脂固定ペプチドのペプチドと樹脂とを切断する方法（例えば、アルカリ溶液による化学的切断）により、光学的応答に悪影響がおよぶ可能性があり、精度の向上の観点から不利であること、（３）樹脂固定ペプチドのペプチドと樹脂とを切断すると、後述の工程Ｄ’を行うことができないため、偽陽性及び偽陰性の低減の観点から不利であること等が挙げられる。一方、ペプチドと樹脂とが結合した状態である場合はペプチドと樹脂とを切断する工程が必要でないため、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を評価することが可能である。

［その他の工程］
本発明の評価方法は、工程Ａ〜Ｄ以外にも種々の工程を含んでいてもよく、例えば、工程Ａの前工程として、溶媒を用いて樹脂固定ペプチドを洗浄及び活性化する工程（工程Ａ’）や、工程Ｄの前に、工程Ｃにて得られた混合物（反応生成物）から、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）と物質（Ｘ）とを分離する工程（工程Ｄ’）等が挙げられる。工程Ａ’にて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。また、工程Ｄ’における分離方法としては、例えば、工程Ｂにて説明した遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等が挙げられる。また、工程Ｄ’にて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。本発明の評価方法が工程Ｄ’を含む場合、工程Ｃを経て得られた混合物（反応生成物）から樹脂固定ペプチド又は結合物から反応しなかった物質（Ｘ）を除去できる。その結果、工程Ｄ’を含まない場合と比較して、被験物質と物質（Ｘ）との接触（反応）により生じる偽陽性及び偽陰性を低減することができるため、皮膚感作性の評価精度が向上する。

＜樹脂固定ペプチド＞
本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドである。

前記のペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドであれば特に限定されない。また、前記のペプチドは保護基を有していてもよい。この様なペプチドとしては、例えば、リジン残基を１個以上含むペプチドや、システイン残基を１個以上含むペプチドが挙げられる。これらのペプチドは、皮膚感作性物質とリジン残基やシステイン残基を介して結合する。より具体的には、皮膚感作性物質はリジン残基の側鎖アミノ基や、システイン残基の側鎖チオール基を介して結合する。前記のペプチドにおけるアミノ酸の重合度は特に限定されないが、例えば３〜２０であることが好ましく、より好ましくは４〜１５、さらに好ましくは５〜１０である。

本発明の樹脂固定ペプチドがリンカーを有している場合、リンカーはペプチドに含まれる何れかのアミノ酸と結合していてもよいが、皮膚感作性物質との結合能の観点からは、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸と結合していることが好ましい。なお、前記のリンカーがペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸と結合している場合、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸の側鎖を介して結合していてもよいし、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基又はＮ末端のアミノ基を介して結合していてもよい。この中でも、皮膚感作性物質との結合能の観点から、前記のリンカーがペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸の側鎖を介して結合していることが好ましい。

前記のリジン残基を１個以上含むペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドであれば特に限定されないが、例えば、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＫＡＤやＲＦＡＡＫＡＡを含むペプチドであることが好ましい。なお、前記のペプチド配列はアミノ酸一文字表記により示しており、以下のペプチド配列の表記も同様である。また、前記のシステイン残基を１個以上含むペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドであれば特に限定されないが、例えば、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＣＡＤやＲＦＡＡＣＡＡを含むペプチドであることが好ましい。なお、これらのペプチドはＮ末端及び／又はＣ末端に保護基を有していてもよいし、その側鎖に保護基を有していてもよい。保護基としては、ペプチド合成において通常用いられる保護基を用いることができ、例えば、Ｎ末端保護基（例えば、Ａｃ（アセチル）基、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）基、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）基、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基、Ｃ末端保護基（例えば、ＯＢｚｌ（ベンジルエステル）基、ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル）基）、およびアミノ酸側鎖の保護基（Ｔｏｓ（トシル）基、Ｐｂｆ（４−メトキシトリチル）基、ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル）基、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基）が挙げられる。前記のリジン残基を１個以上含むペプチドであって保護基を有するものとしては、Ａｃ−ＲＦＡＡＫＡＤ−ＯＨ等が例示され、前記のシステイン残基を１個以上含むペプチドであって保護基を有するものとしては、Ａｃ−ＲＦＡＡＣＡＤ−ＯＨ等が例示される。

前記のペプチドが、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＫＡＤを含むペプチドである場合、前記のペプチドと樹脂は、皮膚感作性物質との結合能の観点から、アスパラギン酸（Ｄ）の側鎖のカルボキシル基を介して結合することが好ましい。なお、前記のペプチドが、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＣＡＤを含むペプチドである場合も同様である。

本発明の樹脂固定ペプチドにおける樹脂としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシアルキレンポリオール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリブチレンナフタレート等）、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレン共重合体等）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、及びこれらを２種以上組み合わせた樹脂（例えば、これらの共重合体）が挙げられる。また、磁性ビーズとして使用可能な樹脂を用いることができる。本発明の評価方法では、上記の樹脂を用いることで樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）と皮膚感作性物質を除く被験物質の分離（例えば、遠心分離、フィルターろ過による分離）が容易となる。また、溶媒が水系溶媒又は有機溶媒（特に非プロトン性極性溶媒）であることに関わらず、樹脂固定ペプチドが溶媒によくなじむため、本発明の評価方法では様々な種類の溶媒を用いることができる。なお、これらの樹脂は、ペプチドやリンカーを導入する観点から、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を有する樹脂が好ましい。この様な樹脂としては、Fmoc-NH-PEG樹脂（渡辺化学工業株式会社製）、Amino PEGA resin、NovaPEG amino resin、NovaSyn TG amino resin（以上、メルク株式会社製）等が挙げられる。

本発明の樹脂固定ペプチドは、ペプチド部位がシステイン残基を含むペプチドである場合であっても、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することが無く、長期間に亘って安定である。これは、ペプチドを樹脂に固定することにより、ペプチドそのものを評価試薬として用いる場合と比べて、ペプチドが有するシステイン残基が反応する機会が少なくなることが一つの要因であると考えられる。

本発明の樹脂固定ペプチドは、例えば、下記式（Ａ）で表すことができる。式（Ａ）中のＰは皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド（ペプチド部位）、Ｌはリンカー（リンカー部位）、Ｒは樹脂（樹脂部位）を示す。なお、式（Ａ）ではＲに結合するＰ及びＬは１つでも２つ以上であってもよい。また、ＲはＰ及びＬ（ペプチド部位）以外の置換基を有していても良い。

前記式（Ａ）で表される樹脂固定ペプチドとしては、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドであることが好ましい。また、Ｌは、例えば、２価の炭化水素基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、カルボニル基、及びこれらの２以上が結合した２価の基が挙げられる。なお、前記の２価の炭化水素基としては、例えば、２価の脂肪族炭化水素基（例えば、２価の直鎖状炭化水素基、又は２価の分岐鎖状炭化水素基）、２価の脂環式炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基、及びこれらの２以上が結合した２価の炭化水素基であって、炭素数１〜２０（好ましくは炭素数２〜１０）の炭化水素基が挙げられる。Ｌとしては、例えば、アミノ酸やβ−アミノ酸に由来する２価の基、及びこれらの２以上が結合した２価の基が挙げられる。なお、Ｌは光、アルカリ、熱、酸、及び酵素等の切断方法により切断することが容易なリンカー（「切断リンカー」と称することがある）であっても良いが、簡便性、迅速性、及び精度の向上の観点から前記の切断方法によっては切断することが困難なリンカーであることが好ましい。

また、前記の樹脂固定ペプチドは、下記式（１）又は（２）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式中のＲは式（Ａ）におけるものと同様である。下記式（１）又は（２）で表される樹脂固定ペプチドにおいて、Ｒに結合するペプチド部位やリンカー部位は１つでも２つ以上であってもよい。また、Ｒはペプチド部位やリンカー部位以外の置換基を有していてもよい。

本発明の樹脂固定ペプチドの製造方法は特に限定されないが、例えばペプチド固相合成法等を用いて製造することができる。具体的には、表面をアミノ基等で修飾した樹脂を固相として用い、必要に応じてリンカー剤と反応させた後、脱水反応によって１つずつアミノ酸鎖を伸長していくことでペプチド部位を作製する方法が挙げられる。

本発明の評価試薬は樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、本発明の評価試薬は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。

本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質の除去剤としても用いることができる。つまり、医薬品、農薬、食料品、化粧品、及び洗剤等の開発において、その原料や添加剤、最終製品等に本発明の樹脂固定ペプチドを添加した後、例えば、工程Ｂにて説明した分離方法を用いることにより、これらに含まれる皮膚感作性物質を除去することも可能である。なお、皮膚感作性物質除去剤は樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。つまり、皮膚感作性物質除去剤は本発明の樹脂固定ペプチドを含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、皮膚感作性物質除去剤は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。

本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質濃縮剤としても用いることができる。つまり、皮膚感作性物質が含まれている可能性がある原料やその混合物等の被濃縮物質に本発明の樹脂固定ペプチドを添加した後、例えば、工程Ｂにて説明した分離方法を用いることにより、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）を得ることができる。このため、被濃縮物質中の皮膚感作性物質を選択的に単離・濃縮することが可能である。さらに、樹脂固定ペプチド（皮膚感作性物質との結合物を含む）において、皮膚感作性物質と樹脂固定ペプチドとの結合を化学的に切断することにより、皮膚感作性物質を回収することも可能である。そして、皮膚感作性物質が一定濃度以上に濃縮されている場合は、構造決定も可能である。なお、皮膚感作性物質濃縮剤は樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。つまり、皮膚感作性物質濃縮剤は本発明の樹脂固定ペプチドを含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、皮膚感作性物質濃縮剤は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

［樹脂固定ペプチド（Ｉ）の作製］
ＮＨ₂−ＰＥＧ樹脂（官能基導入率０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上のアミノ基とＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基と、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液（水：トリイソプロピルシラン：ＴＦＡ（体積比）＝０．１：０．１：５）で２時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド（Ｉ）を作製した。なお、カップリング時間はそれぞれ３０分であり、無水酢酸の反応時間は２０分であった。

［樹脂固定ペプチド（ＩＩ）の作製］
ＮＨ₂−ＰＥＧ樹脂（官能基導入率０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上のアミノ基とＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基と、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液（水：トリイソプロピルシラン：ＴＦＡ（体積比）＝０．１：０．１：５）で２時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を作製した。なお、カップリング時間はそれぞれ３０分であり、無水酢酸の反応時間は２０分であった。

なお、樹脂固定ペプチド（Ｉ）及び（ＩＩ）の作製にて用いたＮＨ₂−ＰＥＧ樹脂、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨは全て渡辺化学工業株式会社の製品である。

［実施例１（１−ブロモヘキサンの皮膚感作性の評価）］
以下の操作手順で１−ブロモヘキサンの皮膚感作性を評価した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（Ｉ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（Ｉ）を８００μｌのＤＭＦにて膨潤した後、５００ｍＭの１−ブロモヘキサンのＤＭＦ溶液を２００μｌ加え、１−ブロモヘキサンの濃度が１００ｍＭ、溶液の全量が１ｍｌとなるよう調製した後、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を１ｍｌ添加し、２４℃にて１０分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清をフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ｍＣ−ＨＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ−ＰＶＤＦ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）を用い、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して測定サンプルを得た。この測定サンプルについて、紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

［実施例２（Ｎ，Ｎ−ジブチルアニリンの皮膚感作性の評価）］
１−ブロモヘキサンの代わりにＮ，Ｎ−ジブチルアニリンを用いたこと以外は実施例１と同様の操作を行った。

（実施例１及び２のリファレンス１）
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（Ｉ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（Ｉ）を１ｍｌのＤＭＦにて膨潤し、２４℃、暗室にて２４時間静置した。静置後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を１ｍｌ添加し、２４℃にて１０分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心した後、その上清をフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ｍＣ−ＨＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ−ＰＶＤＦ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）を用い、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して測定サンプルを得た。この反応溶液について、紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例１及び２のリファレンス２）
２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例１における減少率）
以下の計算式を用いて実施例１の減少率を算出したところ、３５．４％となった。
減少率（％）＝［１−｛実施例１の吸光度−実施例１のリファレンス２の吸光度｝÷｛実施例１のリファレンス１の吸光度−実施例１のリファレンス２の吸光度｝］×１００

（実施例２における減少率）
実施例１と同様に実施例２の減少率を算出したところ、２８．０％となった。

［実施例３（ベンジリデンアセトンの皮膚感作性の評価１）］
以下の操作手順でベンジリデンアセトンの皮膚感作性を評価した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（Ｉ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（Ｉ）を８００μｌのＤＭＦにて膨潤した後、５００ｍＭのベンジリデンアセトンのＤＭＦ溶液を２００μｌ加え、ベンジリデンアセトンの濃度が１００ｍＭ、溶液の全量が１ｍｌとなるよう調製した後、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を１ｍｌ添加し、２４℃にて１０分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心した後、その上清をフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ｍＣ−ＨＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ−ＰＶＤＦ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）を用い、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して測定サンプルを得た。この測定サンプルについて、紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例３のリファレンス１）
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（Ｉ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（Ｉ）を１ｍｌのＤＭＦにて膨潤し、２４℃、暗室にて２４時間静置した。静置後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物を８００μｌのリン酸バッファー（ＰＨ＝７．５）にて膨潤した後、２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を２００μｌ加え、２４℃にて１０分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心した後、その上清をフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ｍＣ−ＨＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ−ＰＶＤＦ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）を用い、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して測定サンプルを得た。この反応溶液について、紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例３のリファレンス２）
２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例３における減少率）
実施例１と同様に実施例３の減少率を算出したところ、２８．６％となった。

［実施例４（サリチル酸ベンジルの皮膚感作性の評価）］
以下の操作手順でサリチル酸ベンジルの皮膚感作性を評価した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（Ｉ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（Ｉ）を８００μｌの水にて膨潤した後、５００ｍＭのサリチル酸ベンジルのアセトニトリル溶液を２００μｌ加え、サリチル酸ベンジルの濃度が１００ｍＭ、溶液の全量が１ｍｌとなるよう調製した後、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物を８００μｌのリン酸バッファー（ＰＨ＝７．５）にて膨潤した後、２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を２００μｌ加え、２４℃にて１０分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心した後、その上清をフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ｍＣ−ＨＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ−ＰＶＤＦ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）を用い、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して測定サンプルを得た。この測定サンプルについて、紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

［実施例５（ベンジリデンアセトンの皮膚感作性の評価２）］
サリチル酸ベンジルの代わりにベンジリデンアセトンを用いたこと以外は実施例４と同様の操作を行った。

（実施例４及び５のリファレンス１）
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（Ｉ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（Ｉ）を８００μｌの水にて膨潤した後、アセトニトリルを２００μｌ加え、２４℃、暗室にて２４時間静置した。静置後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を１ｍｌ添加し、２４℃にて１０分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心した後、その上清をフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ｍＣ−ＨＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ−ＰＶＤＦ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）を用い、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して測定サンプルを得た。この反応溶液について、紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例４及び５のリファレンス２）
２０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のリン酸バッファー溶液（ＰＨ＝７．５）を紫外可視分光光度計（装置名：ＵＶ‐１８００，（株）島津製作所製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例４及び５における減少率）
実施例１と同様に実施例４及び５の減少率を算出したところ、それぞれ９９．０％、６５．８％となった。

［実施例６（ｐ−ベンゾキノンの皮膚感作性の評価１）］
以下の操作手順でｐ−ベンゾキノンの皮膚感作性を評価した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を８００μｌのＤＭＦに膨潤させた後、５００ｍＭのｐ−ベンゾキノンのＤＭＦ溶液を２００μｌ加え、ｐ−ベンゾキノンの濃度が１００ｍＭ、溶液の全量が１ｍｌとなるよう調製した後、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの１，２−インダンジオンのアセトニトリル溶液を１ｍｌ添加し、２４℃にて２４時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計（装置名：ＦＰ−８０００ＤＳ，ＪＡＳＣＯ）を用いて５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。

［実施例７（ｐ−ベンゾキノンの皮膚感作性の評価２）］
以下の操作手順でｐ−ベンゾキノンの皮膚感作性を評価した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を８００μｌの水に膨潤させた後、５００ｍＭのｐ−ベンゾキノンのアセトニトリル溶液を２００μｌ加え、ｐ−ベンゾキノンの濃度が１００ｍＭ、溶液の全量が１ｍｌとなるよう調製した後、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの１，２−インダンジオンのアセトニトリル溶液を１ｍｌ添加し、２４℃にて２４時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計（装置名：ＦＰ−８０００ＤＳ，ＪＡＳＣＯ）を用いて５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。

［実施例６のリファレンス１］
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を１ｍｌのＤＭＦに膨潤させた後、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの１，２−インダンジオンのアセトニトリル溶液を１ｍｌ添加し、２４℃にて２４時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計（装置名：ＦＰ−８０００ＤＳ，ＪＡＳＣＯ）を用いて５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。

［実施例７のリファレンス１］
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を、５ｍｌのカラム（オープンチップカラム、Ａｒｔ．Ｎｏ．ＣＣ．０７、ザルスタット社製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド（ＩＩ）を８００μｌの水に膨潤させた後、アセトニトリルを２００μｌ加え、２４℃、暗室にて２４時間反応させた。反応後の溶液を５００μｌのＤＭＦで５回、さらに５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。得られた洗浄物に２０ｍＭの１，２−インダンジオンのアセトニトリル溶液を１ｍｌ添加し、２４℃にて２４時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計（装置名：ＦＰ−８０００ＤＳ，ＪＡＳＣＯ）を用いて５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。

［実施例６及び７のリファレンス２］
２０ｍＭの１，２−インダンジオンのアセトニトリル溶液を、分光蛍光光度計（装置名：ＦＰ−８０００ＤＳ，ＪＡＳＣＯ）５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。

（実施例６における減少率）
以下の計算式を用いて実施例６の減少率を算出したところ、９８．８％となった。
減少率（％）＝［１−｛実施例６の蛍光強度−実施例６のリファレンス２の蛍光強度｝÷｛実施例６のリファレンス１の蛍光強度−実施例６のリファレンス２の蛍光強度｝］×１００

（実施例７における減少率）
実施例６と同様に実施例７の減少率を算出したところ、８０．３％となった。

＜評価＞
実施例１〜５とそのリファレンスとの比較より、１−ブロモヘキサン等の感作性物質において、４１２ｎｍにおける吸光度の減少が見られた。このことから、実施例１〜５において樹脂固定ペプチドのペプチド部位に感作性物質が結合したこと、さらに、感作性物質と結合していない樹脂固定ペプチドのペプチド部位に物質（Ｘ）である５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）が結合したことが示唆された。また、有機系溶媒においても、水系溶媒においても樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を測定可能であることが示された。さらに、実施例６及び７においては、樹脂固定ペプチドとしてリジン残基を含む樹脂固定ペプチドを用いても、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を測定可能であることが示された。また、有機系溶媒においても、水系溶媒においても樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を測定可能であることが示された。

Claims (6)

1. 以下の工程を含む被験物質の皮膚感作性の評価方法。
   工程Ａ：皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程
   工程Ｃ：工程Ａの後、樹脂固定ペプチドに、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程
   工程Ｄ：工程Ｃの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程
2. 以下の工程Ｂをさらに含む請求項１に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
   工程Ｂ：工程Ｃの前に、工程Ａで得られた混合物から樹脂固定ペプチドを分離する工程
3. 分光法により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する請求項１又は２に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
4. 樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質がチオール基検出試薬又はアミノ基検出試薬である請求項１〜３の何れか１項に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
5. 樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質が１，２−インダンジオン又は５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）である請求項１〜４の何れか１項に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
6. 樹脂固定ペプチドが下記式（１）又は（２）で示される請求項１〜５の何れか１項に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
   

   

   

   （式（１）及び（２）中、Ｒは樹脂を示す。）