JP2018054579A - 被験物質の皮膚感作性の評価方法、及び樹脂固定ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
工程A:皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程
工程C:工程Aの後、樹脂固定ペプチドに、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程
工程D:工程Cの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程
工程B:工程Cの前に、工程Aで得られた混合物から樹脂固定ペプチドを分離する工程
工程A:皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程
工程C:工程Aの後、樹脂固定ペプチドに、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程
工程D:工程Cの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程
なお、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドを、単に「樹脂固定ペプチド」と称することがある。また、前記樹脂固定ペプチドは本発明の評価方法における試薬(以下、「本発明の評価試薬」と称することがある)として用いることができる。
本発明の評価方法は、樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程(工程A)、工程Aの後、樹脂固定ペプチド(皮膚感作性物質との結合物を含む)に、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程(工程C)、及び、工程Cの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程(工程D)を含むことを特徴とする。また、本発明の評価方法では、工程Cの前に、工程Aで得られた混合物から樹脂固定ペプチド(皮膚感作性物質との結合物を含む)を分離する工程(工程B)を設けてもよい。なお、工程Aで得られた混合物とは、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触することにより得られる混合物を指す。また、「樹脂固定ペプチド(皮膚感作性物質との結合物を含む)」とは、樹脂固定ペプチドのみ、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物のみ、又は樹脂固定ペプチド及び樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物の両方を意味する。
本発明の評価方法における工程Aは、樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程である。工程Aにおいて、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質との結合物が生じる。接触させる方法としては特に限定されないが、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを溶媒中で混合する方法が挙げられる。具体的には、樹脂固定ペプチドを含む溶液に、被験物質又は被験物質を含む溶液を加えて混合する方法や、被験物質を含む溶液に、樹脂固定ペプチド又は樹脂固定ペプチドを含む溶液を加えることで混合する方法が挙げられる。なお、工程Aには樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後に静置する工程を含んでいてもよい。
本発明の評価方法は工程Bを含んでいてもよい。工程Bは、工程Cの前に、工程Aで得られた混合物から樹脂固定ペプチド(皮膚感作性物質との結合物を含む)を分離する工程である。被験物質に皮膚感作性物質が含まれない場合は、工程Aで得られた混合物に樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物が含まれないため、本工程は樹脂固定ペプチドを分離する工程となる。一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、本工程は混合物から樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物を分離する工程となる。なお、前記混合物に皮膚感作性物質に結合していない樹脂固定ペプチドが存在する場合は、該樹脂固定ペプチドも樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合物と同時に分離することが可能となる。
本発明の評価方法における工程Cは、工程Aの後、樹脂固定ペプチド(皮膚感作性物質との結合物を含む)に、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程である。
本発明の評価方法における工程Dは、工程Cの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程である。光学的応答の観測とは、具体的には、工程Cにより生じた、発光(例えば、蛍光による発光)、発色、減光、及び減色等の光学的応答を観測することを意味し、工程Dではこれらの光学的応答により、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程である。
本発明の評価方法は、工程A〜D以外にも種々の工程を含んでいてもよく、例えば、工程Aの前工程として、溶媒を用いて樹脂固定ペプチドを洗浄及び活性化する工程(工程A’)や、工程Dの前に、工程Cにて得られた混合物(反応生成物)から、樹脂固定ペプチド(皮膚感作性物質との結合物を含む)と物質(X)とを分離する工程(工程D’)等が挙げられる。工程A’にて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Aにて例示したものを用いることができる。また、工程D’における分離方法としては、例えば、工程Bにて説明した遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等が挙げられる。また、工程D’にて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Aにて例示したものを用いることができる。本発明の評価方法が工程D’を含む場合、工程Cを経て得られた混合物(反応生成物)から樹脂固定ペプチド又は結合物から反応しなかった物質(X)を除去できる。その結果、工程D’を含まない場合と比較して、被験物質と物質(X)との接触(反応)により生じる偽陽性及び偽陰性を低減することができるため、皮膚感作性の評価精度が向上する。
本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドである。
NH2−PEG樹脂(官能基導入率0.2mmol/g)上のアミノ基とFmoc−Ala−OHとをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のFmoc基を20%ピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基と、Fmoc−βAla−OHとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Fmoc−Asp−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Cys(Trt)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OHの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液(水:トリイソプロピルシラン:TFA(体積比)=0.1:0.1:5)で2時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド(I)を作製した。なお、カップリング時間はそれぞれ30分であり、無水酢酸の反応時間は20分であった。
NH2−PEG樹脂(官能基導入率0.2mmol/g)上のアミノ基とFmoc−Ala−OHとをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のFmoc基を20%ピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基と、Fmoc−βAla−OHとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Fmoc−Asp−Otbu、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OHの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液(水:トリイソプロピルシラン:TFA(体積比)=0.1:0.1:5)で2時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド(II)を作製した。なお、カップリング時間はそれぞれ30分であり、無水酢酸の反応時間は20分であった。
以下の操作手順で1−ブロモヘキサンの皮膚感作性を評価した。
1mgの樹脂固定ペプチド(I)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(I)を800μlのDMFにて膨潤した後、500mMの1−ブロモヘキサンのDMF溶液を200μl加え、1−ブロモヘキサンの濃度が100mM、溶液の全量が1mlとなるよう調製した後、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を1ml添加し、24℃にて10分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を15000rpmで1分間遠心し、その上清をフィルター(Ultrafree−mC−HV Durapore−PVDF、孔径:0.45μm、ミリポア社製)を用い、15000rpmで1分間遠心して測定サンプルを得た。この測定サンプルについて、紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
1−ブロモヘキサンの代わりにN,N−ジブチルアニリンを用いたこと以外は実施例1と同様の操作を行った。
1mgの樹脂固定ペプチド(I)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(I)を1mlのDMFにて膨潤し、24℃、暗室にて24時間静置した。静置後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を1ml添加し、24℃にて10分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を15000rpmで1分間遠心した後、その上清をフィルター(Ultrafree−mC−HV Durapore−PVDF、孔径:0.45μm、ミリポア社製)を用い、15000rpmで1分間遠心して測定サンプルを得た。この反応溶液について、紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
以下の計算式を用いて実施例1の減少率を算出したところ、35.4%となった。
減少率(%)=[1−{実施例1の吸光度−実施例1のリファレンス2の吸光度}÷{実施例1のリファレンス1の吸光度−実施例1のリファレンス2の吸光度}]×100
実施例1と同様に実施例2の減少率を算出したところ、28.0%となった。
以下の操作手順でベンジリデンアセトンの皮膚感作性を評価した。
1mgの樹脂固定ペプチド(I)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(I)を800μlのDMFにて膨潤した後、500mMのベンジリデンアセトンのDMF溶液を200μl加え、ベンジリデンアセトンの濃度が100mM、溶液の全量が1mlとなるよう調製した後、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を1ml添加し、24℃にて10分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を15000rpmで1分間遠心した後、その上清をフィルター(Ultrafree−mC−HV Durapore−PVDF、孔径:0.45μm、ミリポア社製)を用い、15000rpmで1分間遠心して測定サンプルを得た。この測定サンプルについて、紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
1mgの樹脂固定ペプチド(I)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(I)を1mlのDMFにて膨潤し、24℃、暗室にて24時間静置した。静置後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物を800μlのリン酸バッファー(PH=7.5)にて膨潤した後、20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を200μl加え、24℃にて10分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を15000rpmで1分間遠心した後、その上清をフィルター(Ultrafree−mC−HV Durapore−PVDF、孔径:0.45μm、ミリポア社製)を用い、15000rpmで1分間遠心して測定サンプルを得た。この反応溶液について、紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
実施例1と同様に実施例3の減少率を算出したところ、28.6%となった。
以下の操作手順でサリチル酸ベンジルの皮膚感作性を評価した。
1mgの樹脂固定ペプチド(I)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(I)を800μlの水にて膨潤した後、500mMのサリチル酸ベンジルのアセトニトリル溶液を200μl加え、サリチル酸ベンジルの濃度が100mM、溶液の全量が1mlとなるよう調製した後、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物を800μlのリン酸バッファー(PH=7.5)にて膨潤した後、20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を200μl加え、24℃にて10分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を15000rpmで1分間遠心した後、その上清をフィルター(Ultrafree−mC−HV Durapore−PVDF、孔径:0.45μm、ミリポア社製)を用い、15000rpmで1分間遠心して測定サンプルを得た。この測定サンプルについて、紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
サリチル酸ベンジルの代わりにベンジリデンアセトンを用いたこと以外は実施例4と同様の操作を行った。
1mgの樹脂固定ペプチド(I)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(I)を800μlの水にて膨潤した後、アセトニトリルを200μl加え、24℃、暗室にて24時間静置した。静置後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を1ml添加し、24℃にて10分間反応させることで反応溶液を得た。その後、反応溶液を15000rpmで1分間遠心した後、その上清をフィルター(Ultrafree−mC−HV Durapore−PVDF、孔径:0.45μm、ミリポア社製)を用い、15000rpmで1分間遠心して測定サンプルを得た。この反応溶液について、紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
20mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)のリン酸バッファー溶液(PH=7.5)を紫外可視分光光度計(装置名:UV‐1800,(株)島津製作所製)を用いて412nmの吸光度を測定した。
実施例1と同様に実施例4及び5の減少率を算出したところ、それぞれ99.0%、65.8%となった。
以下の操作手順でp−ベンゾキノンの皮膚感作性を評価した。
1mgの樹脂固定ペプチド(II)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(II)を800μlのDMFに膨潤させた後、500mMのp−ベンゾキノンのDMF溶液を200μl加え、p−ベンゾキノンの濃度が100mM、溶液の全量が1mlとなるよう調製した後、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの1,2−インダンジオンのアセトニトリル溶液を1ml添加し、24℃にて24時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計(装置名:FP−8000DS,JASCO)を用いて550nmにおける蛍光強度を測定した。
以下の操作手順でp−ベンゾキノンの皮膚感作性を評価した。
1mgの樹脂固定ペプチド(II)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(II)を800μlの水に膨潤させた後、500mMのp−ベンゾキノンのアセトニトリル溶液を200μl加え、p−ベンゾキノンの濃度が100mM、溶液の全量が1mlとなるよう調製した後、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの1,2−インダンジオンのアセトニトリル溶液を1ml添加し、24℃にて24時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計(装置名:FP−8000DS,JASCO)を用いて550nmにおける蛍光強度を測定した。
1mgの樹脂固定ペプチド(II)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(II)を1mlのDMFに膨潤させた後、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの1,2−インダンジオンのアセトニトリル溶液を1ml添加し、24℃にて24時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計(装置名:FP−8000DS,JASCO)を用いて550nmにおける蛍光強度を測定した。
1mgの樹脂固定ペプチド(II)を、5mlのカラム(オープンチップカラム、Art.No.CC.07、ザルスタット社製)に入れ、500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒(水:TFA(体積比)=100:0.1)で5回洗浄した。洗浄後の樹脂固定ペプチド(II)を800μlの水に膨潤させた後、アセトニトリルを200μl加え、24℃、暗室にて24時間反応させた。反応後の溶液を500μlのDMFで5回、さらに500μlのA溶媒で5回洗浄した。得られた洗浄物に20mMの1,2−インダンジオンのアセトニトリル溶液を1ml添加し、24℃にて24時間反応させることで反応溶液を得た。この反応用液について、分光蛍光光度計(装置名:FP−8000DS,JASCO)を用いて550nmにおける蛍光強度を測定した。
20mMの1,2−インダンジオンのアセトニトリル溶液を、分光蛍光光度計(装置名:FP−8000DS,JASCO)550nmにおける蛍光強度を測定した。
以下の計算式を用いて実施例6の減少率を算出したところ、98.8%となった。
減少率(%)=[1−{実施例6の蛍光強度−実施例6のリファレンス2の蛍光強度}÷{実施例6のリファレンス1の蛍光強度−実施例6のリファレンス2の蛍光強度}]×100
実施例6と同様に実施例7の減少率を算出したところ、80.3%となった。
実施例1〜5とそのリファレンスとの比較より、1−ブロモヘキサン等の感作性物質において、412nmにおける吸光度の減少が見られた。このことから、実施例1〜5において樹脂固定ペプチドのペプチド部位に感作性物質が結合したこと、さらに、感作性物質と結合していない樹脂固定ペプチドのペプチド部位に物質(X)である5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)が結合したことが示唆された。また、有機系溶媒においても、水系溶媒においても樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を測定可能であることが示された。さらに、実施例6及び7においては、樹脂固定ペプチドとしてリジン残基を含む樹脂固定ペプチドを用いても、樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を測定可能であることが示された。また、有機系溶媒においても、水系溶媒においても樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を測定可能であることが示された。
Claims (11)
- 以下の工程を含む被験物質の皮膚感作性の評価方法。
工程A:皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが結合した樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させる工程
工程C:工程Aの後、樹脂固定ペプチドに、樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質を接触させる工程
工程D:工程Cの後、光学的応答の観測により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する工程 - 以下の工程Bをさらに含む請求項1に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
工程B:工程Cの前に、工程Aで得られた混合物から樹脂固定ペプチドを分離する工程 - 分光法により樹脂固定ペプチドと皮膚感作性物質との結合の有無を評価する請求項1又は2に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
- 樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質がチオール基検出試薬又はアミノ基検出試薬である請求項1〜3の何れか1項に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
- 樹脂固定ペプチドと反応して光学的応答を与える物質が1,2−インダンジオン又は5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)である請求項1〜4の何れか1項に記載の被験物質の皮膚感作性の評価方法。
- 被験物質の皮膚感作性の評価方法に用いられる、請求項7に記載の樹脂固定ペプチド。
- 請求項7又は8に記載の樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性評価試薬。
- 皮膚感作性物質の除去剤として用いられる、請求項7に記載の樹脂固定ペプチド。
- 請求項7又は10に記載の樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性物質除去剤。
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