JP2002131232A - ヒドロキシプロリンの検出方法および検出用キット - Google Patents

ヒドロキシプロリンの検出方法および検出用キット

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Katsu Motosawa
克 本澤
Yukiko Ito
由紀子 伊藤
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒドロキシプロリンの検出方法および検出用
キットを提供する。 【解決手段】 ヒドロキシプロリンを含む試料を、固相
に４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−フ
ルオロ−７−ニトロベンゾフラザンを固定化させてな
り、緩衝剤等を含むヒドロキシプロリンの検出用キット
を用いて、反応させ、生成した反応生成物の特徴的な蛍
光（または吸収）を測定して、ヒドロキシプロリンを高
感度、迅速、簡便に検出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的にアミノ化
合物の検出方法およびそのために使用する検出用キット
に関し、さらに詳しくは、試料中の特定のアミノ化合物
（例えば、ヒドロキシプロリン）を検出する方法および
そのために使用する検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】試料中のアミノ化合物を検出すること
は、様々な分野において、必要とされている。例えば、
食品の加工現場（食品加工工場等）では、食品の製造設
備、および製造機具を製造ロット毎に洗浄するのが普通
であるが、アミノ酸等の残留物を検査することにより、
洗浄度の判定が可能であり、汚染状況の確認もできる。
また、食品中のアミノ酸の検出、および定量は、栄養的
評価のため、或いは該食品の品質検査の目的で行われて
いる。
【０００３】アミノ化合物の検出には、古くから呈色反
応が用いられており、アミノ酸については一般的呈色反
応試薬としてニンヒドリンがよく知られている。ニンヒ
ドリンによる呈色反応は、簡便であるが、この反応はア
ミノ酸以外にも、ペプチド、タンパク質に陽性であり、
さらにアミン類、アンモニア、尿素誘導体にも発色す
る。そこで、特定のアミノ化合物を発色させる、呈色反
応試薬として、エーリッヒ試薬（トリプトファン）、ミ
ロン試薬（チロシン）等も知られている。これらの試薬
は、通常、供試液（試料）に添加した上で、加温または
加熱し、特有の発色が見られるかどうかで、その特定の
アミノ化合物を検出する。
【０００４】その他に、特定のアミノ化合物を試料（生
体試料）から検出し、疾病の診断または治療に、いわゆ
るマーカーとして利用することもなされてきた。そのよ
うな特定のアミノ化合物の一例がヒドロキシプロリンで
あった。
【０００５】ヒドロキシプロリンの異性体の１つであ
る、３−ヒドロキシプロリンは、コラーゲン代謝の面か
ら注目され、特に悪性新生物との関連において、乳癌、
前立腺癌、肺癌などの骨転移症において尿中、３−ヒド
ロキシプロリン排泄量が増加することが既に知られてい
る。これは３−ヒドロキシプロリンが、細胞を包む基底
膜を構成するコラーゲンに特異的なアミノ酸であり、癌
が増殖して基底膜が破れると尿中に排泄されるからであ
る。このように、３−ヒドロキシプロリンは、臓器毎に
違う検査を必要とする他の腫瘍マーカーと異なり、臓器
非特異的であるという特徴を有している。そこで、３−
ヒドロキシプロリンの尿中への排泄量を調べることによ
り、癌の一次スクリーニングとして、臓器を問わず検査
が可能となる。
【０００６】また、ヒドロキシプロリンの別の異性体で
ある４−ヒドロキシプロリンは、骨吸収を示すマーカー
として骨代謝の判定に使用でき、ＤＰＡ、ＤＥＸＡ、Ｑ
ＣＴ等の骨量の測定とともに、骨粗しょう症の診断およ
び治療剤の選択に有用である。
【０００７】このように、ヒドロキシプロリンは、各種
癌および骨粗しょう症等の診断において重要な生化学的
マーカーであり、生体試料中でのその簡便な検出の確立
は急務である。
【０００８】従来から知られている３−ヒドロキシプロ
リンの検出方法は、直接その吸収スペクトルを測定する
こと、または前述のニンヒドリン反応等により着色物質
へ誘導して吸収スペクトルを測定することにより検出す
る方法が知られている。しかしながら、上記方法は３−
ヒドロキシプロリンのみを選択的に測定するものではな
く、通常の蛋白質構成アミノ酸も同時に検出可能とする
ものである。
【０００９】従って、試料中に３−ヒドロキシプロリン
以外の他のアミノ化合物（例えば、アミノ酸類）が共存
する場合においては、適当な手段により前もって３−ヒ
ドロキシプロリンを分離することが必要となる。係る分
離手段には、例えば高速液体クロマトグラフのような装
置が必要となり、試料中の３−ヒドロキシプロリンを選
択的にかつ迅速簡便に検出することが困難であるという
問題点があった。しかも、高速液体クロマトグラフィー
法は、分離とカラムの洗浄に時間がかかるため、一度に
多数の検体を処理することが難しく、同一のカラムを様
々な試料が通過するので汚染や再現性に問題が生じやす
い。
【００１０】従って、試料溶液中の３−ヒドロキシプロ
リンまたは４−ヒドロキシプロリン（本明細書中では、
これらを集合的にヒドロキシプロリンともいう）を、分
離等の前処理を行うことなく、選択的に、かつ迅速、簡
便に検出（定量をも含めて）する方法が強く望まれてい
る。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
で正確な、特定のアミノ化合物の検出方法および検出用
キットを提供することにある。さらに、試料の検体が多
数ある場合でも、簡便で正確な、特定のアミノ化合物の
検出を同時に行える方法およびそのために使用する検出
用キットを提供することが本発明の目的である。
【００１２】本発明は、試料中のヒドロキシプロリン
（３−ヒドロキシプロリンまたは４−ヒドロキシプロリ
ン）のみを、選択的に、かつ迅速、簡便に、さらに高感
度で検出する方法および検出用キットを提供することを
より具体的な目的とする。特に、試料の検体が多数ある
場合でも、そのような検出が可能な方法および検出用キ
ットを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来技術
の様々な問題点に鑑みて、上記目的を達成すべく鋭意研
究を重ねた結果、ヒドロキシプロリンを含む試料を、固
相に固定化した４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン
（以下、ＮＢＤ−Ｃｌともいう）または４−フルオロ−
７−ニトロベンゾフラザン（以下、ＮＢＤ−Ｆともい
う）に添加し、反応させることにより、ヒドロキシプロ
リンのみが反応生成物に誘導され、この生成物の蛍光ま
たは吸収スペクトルを測定するとヒドロキシプロリンの
存在が判定でき、さらに所望ならば、その含量をも決定
できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】すなわち、本発明は、試料中のアミノ化合
物を、該アミノ化合物を特異的に検出する検出用試薬を
用いて検出する方法であって、前記検出用試薬が固相に
固定化されていることを特徴とする検出方法を提供す
る。
【００１５】また、本発明は、前記アミノ化合物がヒド
ロキシプロリンであり、前記検出用試薬が４−クロロ−
７−ニトロベンゾフラザンまたは４−フルオロ−７−ニ
トロベンゾフラザンであることを特徴とする、上記の検
出方法を提供する。
【００１６】また、本発明は、前記特異的検出が、ヒド
ロキシプロリンと４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザ
ンまたは４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンとの
反応生成物の蛍光、或いは吸収を測定することによって
行われることを特徴とする、上記の検出方法を提供す
る。
【００１７】また、本発明は、固相に固定化された、ア
ミノ化合物を特異的に検出する検出用試薬と、緩衝剤と
を少なくとも含むことを特徴とするアミノ化合物検出用
キットを提供する。
【００１８】さらに、本発明は、少なくとも以下のａ〜
ｃの工程を行なうことを特徴とする試料中のヒドロキシ
プロリンの検出方法を提供する。 ａ）検出用試薬である４−クロロ−７−ニトロベンゾフ
ラザンを固相に固定化する工程、 ｂ）ヒドロキシプロリンを前記固相に固定化された４−
クロロ−７−ニトロベンゾフラザンと反応させる工程、 ｃ）工程ｂ）で生成した反応生成物の蛍光または吸収を
測定する工程。
【００１９】また、本発明は、前記工程ａ）において、
界面活性剤および／または分散補助剤の存在下、固定化
を行なうことを特徴とする、上記の試料中のヒドロキシ
プロリンの検出方法を提供する。
【００２０】さらに、本発明は、試料中にヒドロキシプ
ロリン以外のアミノ化合物が存在する場合、工程ｂ）に
おいて、ヒドロキシプロリンと、４−クロロ−７−ニト
ロベンゾフラザンとのみが反応するのに十分な時間だけ
反応させることを特徴とする、上記の試料中のヒドロキ
シプロリンの検出方法を提供する。
【００２１】加えて、本発明は、固相に固定化された４
−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンと、緩衝剤と、酸
溶液とを少なくとも含むことを特徴とするヒドロキシプ
ロリンの検出用キットを提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明に従えば、試料中のアミノ
化合物を、該アミノ化合物を特異的に検出する検出用試
薬を用いて検出する方法であって、前記検出用試薬が固
相に固定化されていることを特徴とする検出方法が提供
される。
【００２３】さらに、本発明に従えば、前記の検出方法
を実施するのに適した、固相に固定化された、アミノ化
合物を特異的に検出する検出用試薬と、緩衝剤とを少な
くとも含むことを特徴とするアミノ化合物検出用キット
が提供される。
【００２４】本発明の検出方法或いは検出用キットで検
出できる（本明細書中、有無の判別および定量の両方を
意味し、アッセイと同義で使用する）アミノ化合物は、
その検出用試薬との組み合わせにおいて、検出が可能な
アミノ化合物であれば、特に限定されないが、例えば、
グリシン、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、グル
タミン酸、プロリン、ヒドロキシプロリンが挙げられ
る。以下、ヒドロキシプロリンを具体例として、本発明
の実施の形態に即し、本発明を詳細に説明する。
【００２５】（ヒドロキシプロリン）本発明に従い検出
可能なヒドロキシプロリンには、水酸基の位置に関する
異性体が含まれる。これらは、３−ヒドロキシプロリ
ン、４−ヒドロキシプロリンおよび５−ヒドロキシプロ
リンであり、検出対象として、特定の疾患の生化学的マ
ーカーである３−ヒドロキシプロリンおよび４−ヒドロ
キシプロリンが重要である。これらのうち、本発明にお
いて、腫瘍マーカーである３−ヒドロキシプロリンが特
に重要である。それぞれのヒドロキシプロリンには、２
個の不斉炭素が存在する。従って、本発明に係わるヒド
ロキシプロリンは、これら全ての可能な光学異性体を包
含し、またそれらの任意の混合物をも包含する。さら
に、本発明に係るヒドロキシプロリンとは、通常Ｌ−体
を意味するが、本発明の検出方法或いは検出用キット
は、Ｄ−体のヒドロキシプロリンの検出にも適用可能で
ある。
【００２６】（試料）本発明の検出方法或いは検出用キ
ットに供される、ヒドロキシプロリンを含む試料（以
下、本発明に係わる試料ともいう）は、溶液状態であり
この性質には、特に制限はない。水溶液、有機溶媒溶
液、または水と有機溶媒との混合溶液が使用可能であ
る。ここで、有機溶媒としては、特に水と混合可能なも
のが好ましく、具体的には、ジメチルスルホキシド(Ｄ
ＭＳＯ)、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノー
ル等が挙げられる。試料が生体試料である場合、特に、
水溶液による試料調製が好ましい。
【００２７】また、本発明に係わる試料中のヒドロキシ
プロリンの濃度も特に制限はなく、蛍光または吸収スペ
クトル測定に適する濃度であればよい。また、該測定に
おいて濃度が高すぎる場合は、適当な溶媒（緩衝液およ
び水を含んでよい）を用いて希釈することで最適の濃度
に調製可能である。さらに、試料中の濃度がスペクトル
測定条件では低い場合には、適当な濃度に濃縮すること
が可能である。具体的には、濃縮の手段として溶媒の除
去、クロマトグラフ等が挙げられる。
【００２８】本発明に係る試料は、ヒドロキシプロリン
を含むと想定されるか、疑われる（特に、生体試料の場
合）ものであり、本発明の検出方法を実施した結果、前
記試料が実質的にヒドロキシプロリンを含まない（すな
わち、ヒドロキシプロリンが検出されない）こともあり
える。
【００２９】また、本発明に係わる試料中に蛍光性物質
が混在する場合には、ヒドロキシプロリンから生成する
蛍光性反応物の蛍光と、前記蛍光性物質からの蛍光とが
重なる可能性がある。このような場合、あらかじめ試料
から混在する蛍光性物質を除去する前処理を行うことが
好ましい。具体的には、前記蛍光性物質を適当な溶媒で
抽出して除去する方法、適当な吸着剤で吸着して除去す
る方法等が挙げられる。または、前処理を施さない場合
には、重なった蛍光スペクトルからヒドロキシプロリン
に基づくスペクトルを波形分離する方法、又は励起波長
の選択によりヒドロキシプロリンに基づくスペクトルの
みを測定する方法等が挙げられる。また、本発明の検出
方法で、検出に蛍光スペクトルの代わりに、吸収スペク
トルを使用する場合も、全く同様である。
【００３０】なお、本発明に係る試料中にヒドロキシプ
ロリンの異性体が２種以上（例えば、３−ヒドロキシプ
ロリンと４−ヒドロキシプロリン）混在する場合、蛍光
または吸収の測定の際、これらの異性体を判別できない
可能性がある。このような場合も、あらかじめ高速クロ
マトグラフィー法等の分離手段で、目的のヒドロキシプ
ロリンを分離し、本発明の検出方法を実施すればよい。
【００３１】上記いずれかの処理を併用することによ
り、尿を含む、或いは、タンパク質等の混合物を含む生
体試料中のヒドロキシプロリンを測定することが可能と
なる。
【００３２】（検出用試薬）本発明の検出方法および検
出用キットでは、ヒドロキシプロリンの検出用試薬とし
て、ＮＢＤ−ＣｌまたはＮＢＤ−Ｆを使用する。アミノ
化合物およびアミノ酸の蛍光検出にこれらの化合物を用
いることは、公知である。例えば、特開平７−３１３１
７９号には、Ｌ−プロリンの酵素触媒水酸化反応による
４−ヒドロキシプロリンの製造法が開示されている。こ
こでは、プロリン類を含む反応生成物は、一旦高速液体
クロマトグラフィーで分離された後、生成した４−ヒド
ロキシプロリンが、ＮＢＤ−Ｃｌで検出されている。ま
た、ＮＢＤ−Ｆについては、試料中のＬ−プロリンの蛍
光検出、定量への使用が、特公昭６３−２２２６１号に
開示されている。しかしながら、ＮＢＤ−ＣｌまたはＮ
ＢＤ−Ｆを用いて、アミノ化合物（例えば、アミノ酸）
およびタンパク質等の混合物中のヒドロキシプロリンが
選択的に検出できることは、これらの従来技術から明ら
かでなかった。まして、固定化したＮＢＤ−Ｃｌおよび
ＮＢＤ−Ｆをアミノ化合物検出に用いることは、開示も
示唆もなく、全く想到できないことであった。
【００３３】ＮＢＤ−ＣｌおよびＮＢＤ−Ｆは、ヒドロ
キシプロリンを対象とした場合の好ましい検出用試薬で
あり、ヒドロキシプロリン以外の特定のアミノ化合物が
与えられれば、それを特異的に検出できる検出用試薬
は、当業者に公知の場合が多い。好ましくは、前記検出
用試薬は、発色基、蛍光基、リン光基、化学発光基等で
標識されているものである。
【００３４】（固相）本発明の特徴は、上記ＮＢＤ−Ｃ
ｌ（またはＮＢＤ−Ｆ）を一例とするアミノ化合物の検
出用試薬が固相に固定化されていることである。適当な
固相としては、従来用いられている、マイクロチューブ
を含むチューブ（ガラスまたはプラスチック製）、プレ
ート（例えば、９６／３８４プレート）、ピペットチッ
プ、ポリスチレンビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子等
が使用可能であり、その材質や形状に何等制限はない。
固定化する方法も、物理吸着、共有結合、その他公知の
方法を利用することができる。物理吸着により検出用試
薬を固相に固定化するとき、好ましくは、該試薬をより
均一に分散して固定化させるために分散補助剤および／
または界面活性剤を使用する。適当な分散補助剤として
は、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、デ
キストラン等が挙げられる。また、適当な界面活性剤と
しては、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等が挙げられる。
【００３５】（反応条件）本発明に従う好適な実施の形
態であるヒドロキシプロリンの検出方法は、少なくとも
以下のａ〜ｃの工程を行なうことを特徴とする。 ａ）検出用試薬であるＮＢＤ−Ｃｌを固相に固定化する
工程、 ｂ）ヒドロキシプロリンを前記固相に固定化されたＮＢ
Ｄ−Ｃｌと反応させる工程、 ｃ）工程ｂ）で生成した反応生成物の蛍光または吸収を
測定する工程。
【００３６】工程ａ）は、既述のとおり固相にＮＢＤ−
Ｃｌを固定化することからなる。工程ｂ）は、固定化さ
れたＮＢＤ−Ｃｌに試料（ヒドロキシシプロリンを含
む）を添加し、ＮＢＤ−Ｃｌと試料中のヒドロキシシプ
ロリンとを反応させることからなる。
【００３７】ヒドロキシプロリンを含む試料の調製につ
いては、既に説明した通り、適当な溶媒を用いて適当な
濃度に調製する。この際、反応系のｐＨを一定に保つ
（好ましくは、ｐＨ、約４．０〜８．５の範囲）に維持
するために、溶媒として緩衝液を使用するのが好まし
い。具体的には、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス
緩衝液が挙げられる。別法として、緩衝剤が検出用キッ
トに備えられていてもよい。緩衝剤は、固体または液体
（すなわち、緩衝液）のいずれでもよく、前者の場合、
顆粒剤、散剤、錠剤等の形態を採り、使用時に精製水等
に溶かして緩衝液を調製する。
【００３８】上記のような条件設定のもと、反応は、室
温（約２０〜５０℃）で所定時間、インキュベートする
ことにより進行する。好ましくは、ヒドロキシプロリン
とＮＢＤ−Ｃｌ（またはＮＢＤ−Ｆ）とのみが反応する
のに十分な時間だけ反応させる。これは、試料中に存在
するかもしれない、他のアミノ化合物（例えば、アミノ
酸）は、設定反応条件下、ＮＢＤ−Ｃｌとの反応性が低
く、ヒドロキシプロリンとＮＢＤ−Ｃｌとの反応が実質
的に終了した時点で、反応を停止すると、前記他のアミ
ノ化合物に由来する反応生成物は、ほとんど生成しない
からである。このような理由から、反応時間は、約１〜
２分間に設定することが好ましい。
【００３９】工程ｃ）は、工程ｂ）で生成した反応生成
物の蛍光または吸収を測定する工程からなる。
【００４０】工程ｂ）終了後、反応系を直ちに蛍光また
は吸収測定に供することもできるが、本発明の検出方法
において、検出の感度を上げるために、前記反応系を酸
性にした後に測定することが好ましい。この目的で使用
する酸としては、無機酸、または有機酸が可能である。
具体的には、塩酸、硫酸等の鉱酸が好ましい。
【００４１】（反応生成物）反応系が中和されるか、否
かにかかわらず、得られた反応溶液中にヒドロキシプロ
リンとＮＢＤ−Ｃｌ（またはＮＢＤ−Ｆ）との反応生成
物が生成する。反応生成物は、ヒドロキシプロリンから
のみ生成すること、およびヒドロキシプロリンとＮＢＤ
−Ｃｌとが約１対１で反応すると考えられることから、
使用した（または存在する）ヒドロキシプロリンが３−
ヒドロキシプロリンで検出試薬がＮＢＤ−Ｃｌのとき、
図１に示す構造を有するものと推定される。しかしなが
ら、この推定構造の正誤は、本発明の実施になんら影響
を及ぼさない。
【００４２】（蛍光または吸収測定）前記反応生成物
は、３−ヒドロキシプロリン（そしてＮＢＤ−Ｃｌ）に
由来する場合、約５５０ｎｍ付近に発光（蛍光）波長ピ
ークを有する。また、約５００ｎｍ付近に吸収ピークを
有する。従って、係る蛍光または吸収を測定可能な装
置、方法であれば特に制限されず、本発明に用いること
が可能である。具体的には、約３５０〜約６００ｎｍの
範囲の可視部吸収スペクトルを測定できる装置であれば
よい。また、蛍光スペク励起波長としては約２５０〜約
５５０ｎｍが使用でき、さらに約３５０〜約６００ｎｍ
の範囲の蛍光スペクトルを測定できる装置であればよ
い。
【００４３】有意のレベルで上記特徴的蛍光スペクトル
（或いは、吸収スペクトル）が観測されたとき、試料中
にヒドロキシプロリンが存在すると判断される。さら
に、予め既知のヒドロキシプロリンを用いて、濃度対蛍
光強度または濃度対吸収強度の検量線を作成することが
可能であり、該検量線を用いることにより、試料中のヒ
ドロキシプロリンを定量することができる。この定量方
法は、生体試料、例えば尿を本発明に係わる検出に供す
る場合、有用であり、尿中のヒドロキシプロリンの含量
を求めることもできる。
【００４４】なお、本発明の検出方法において、蛍光お
よび吸収の測定と二通りの測定手法が可能であるが、検
出感度の点から、ごく微量のヒドロキシプロリンが含ま
れる生体試料等の場合、蛍光測定がより好ましい。
【００４５】（検出用キット）本発明のアミノ化合物検
出用キットは、固相に固定化された、アミノ化合物を特
異的に検出する検出用試薬と、緩衝剤とを少なくとも含
むことを特徴とする。その好適な実施の形態をなす、本
発明のヒドロキシプロリン検出用キットは、固相に固定
化された４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンと、緩
衝剤と、酸溶液（好ましくは、塩酸溶液）とを少なくと
も含み、これらが検出に際して、一式となっているもの
をいい、具体的には実施例に開示するものである。さら
に、検出用キットは、必要に応じて、保存剤、安定剤、
崩壊剤等のその他の添加剤を含んでもよい。
【００４６】以下、実施例を挙げてこの発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例によって限定される
ものではない。
【００４７】
【実施例】１．固定化ＮＢＤ−Ｃｌの調製 ９６ウェルプレートの各ウェルに０．０１％のＴｒｉｔ
ｏｎ−Ｘと０．５％のポリエチレングリコールとを含む
１０ｍＭのＮＢＤ−Ｃｌアセトニトリル溶液１００μｌ
を入れ、３０℃のオーブンで２時間、乾燥させた。この
固定化ＮＢＤ−Ｃｌを有する固相（９６ウェルプレー
ト）は、窒素雰囲気下でシールすると、冷暗所で保存で
きる。 ２．試料溶液の調製 各種アミノ酸をホウ酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し
て、それぞれが１ｍＭとなるように混合試料溶液を調製
した。使用したアミノ酸は、３−ヒドロキシプロリンの
他、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、システイン（塩酸塩）、グルタミン酸、グルタミ
ン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、
リシン（塩酸塩）、メチオニン、フェニルアラニン、プ
ロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシ
ン、およびバリンの２１種類であった。これらのアミノ
酸は、すべてＬ−体であった。 ３．対照試料溶液の調製 ３−ヒドロキシプロリンを除き、上記２において、使用
したアミノ酸を用いて同様に、２０種類のアミノ酸の混
合試料溶液（アミノ酸各１ｍＭ、ホウ酸緩衝液（ｐＨ
６．８））を調製した。 ４．検出反応および蛍光スペクトル測定 上記２で調製した試料溶液１００μｌを上記１でＮＢＤ
−Ｃｌを固定化した９６ウェルプレートに添加し、室温
で１分間、反応させた。その後、１００μｌの１００ｍ
Ｍ ＨＣｌを添加した。
【００４８】同様に、上記３で調製した対照試料溶液１
００μｌを上記１でＮＢＤ−Ｃｌを固定化した９６ウェ
ルプレートに添加し、室温で１分間、反応させた。その
後、１００μｌの０．５Ｍ ＨＣｌを添加した。
【００４９】反応溶液（試料および対照）について、そ
れぞれの９６ウェルプレートを蛍光プレートリーダー
（テカン社製：フルオスターＰＲＯ）にセットして、励
起波長５０５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。測定結
果を図２に示す。３−ヒドロキシプロリンを含む試料溶
液から得られた反応溶液の蛍光スペクトルは、その他の
アミノ酸の混合物のみを含む対照試料から得られた反応
溶液の蛍光スペクトルと大きく異なっていた。すなわ
ち、３−ヒドロキシプロリンを含む試料では、反応後、
５５０ｎｍ付近に強い蛍光が観測された。これは、該蛍
光を有する３−ヒドロキシプロリンとＮＢＤ−Ｃｌとの
反応生成物が生じたことを示す。
【００５０】以上、蛍光スペクトル測定の結果から、本
発明の検出方法によれば、２０種類の様々なアミノ酸
が、しかも３−ヒドロキシプロリンと等濃度で共存する
試料でも、３−ヒドロキシプロリンのみが検出されうる
ことが明らかとなった。この結果は、係るアミノ酸の混
合物中の３−ヒドロキシプロリンのみを分離操作を行う
ことなく、選択的に検出できることを示すものである。
【００５１】
【発明の効果】本発明の検出方法および検出用キットに
よれば、試料中のアミノ化合物を、固相に固定化されて
いる、該アミノ化合物を特異的に検出する検出用試薬を
用いて検出するので、試料の前処理の工程を省略するこ
とができ、迅速に多数の試料検体を検査することができ
る。また、検出の操作方法も非常に簡便である。
【００５２】本発明の検出方法および検出用キットによ
れば、ヒドロキシプロリンを含む試料を、検出用試薬と
してのＮＢＤ−ＣｌまたはＮＢＤ−Ｆが固相に固定化さ
れている仕様の検出用キットを用いて、ヒドロキシプロ
リンとＮＢＤ−ＣｌまたはＮＢＤ−Ｆを反応させ、生成
した反応生成物の蛍光または吸収を測定するので、ヒド
ロキシプロリンのみを高感度、迅速、簡便に検出するこ
とが可能となる。
【００５３】また、本発明の検出方法および検出用キッ
トの好適な実施の形態によれば、検出用試薬としてのＮ
ＢＤ−Ｃｌを固相に固定化し、ヒドロキシプロリンを含
む試料を、固定化されたＮＢＤ−Ｃｌと反応させ、生成
した反応生成物の蛍光または吸収を測定するので、分離
操作が不要であり、ヒドロキシプロリンを高感度、迅
速、簡便、選択的に検出することが可能となる。さら
に、前記試料検体を多数、一度に検査することも可能と
なる。
【００５４】また、本発明の検出方法および検出用キッ
トの特定の実施の形態によれば、ヒドロキシプロリンお
よびその他のアミノ化合物（例えば、アミノ酸）を含む
試料を、検出用試薬としてのＮＢＤ−Ｃｌを固相に固定
化し、ヒドロキシプロリンとＮＢＤ−Ｃｌとのみが反応
するのに十分な時間だけ反応させ、生成した反応生成物
の蛍光または吸収を測定するので、他のアミノ化合物を
含む混合物試料であっても、分離操作が不要であり、ヒ
ドロキシプロリンを高感度、迅速、簡便、選択的に検出
することが可能となる。さらに、前記試料検体を多数、
一度に検査することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の検出方法がそれに基づく、３−ヒドロ
キシプロリンとＮＢＤ−Ｃｌとの反応式、およびそれか
らの生成物の推定構造を示す図である。
【図２】３−ヒドロキシプロリンおよび他の２０種類の
アミノ酸を含む混合試料、ならびに対照試料を本発明の
検出用キットで処理し、蛍光を測定したときのペクトル
を示す図である。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中のアミノ化合物を、該アミノ化合
    物を特異的に検出する検出用試薬を用いて検出する方法
    であって、前記検出用試薬が固相に固定化されているこ
    とを特徴とする検出方法。
  2. 【請求項２】 前記アミノ化合物がヒドロキシプロリン
    であり、前記検出用試薬が４−クロロ−７−ニトロベン
    ゾフラザンまたは４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラ
    ザンであることを特徴とする、請求項１に記載の検出方
    法。
  3. 【請求項３】 前記特異的検出が、ヒドロキシプロリン
    と、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−
    クロロ−７−ニトロベンゾフラザンとの反応生成物の蛍
    光、或いは吸収を測定することによって行われることを
    特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
  4. 【請求項４】 固相に固定化された、アミノ化合物を特
    異的に検出する検出用試薬と、緩衝剤とを少なくとも含
    むことを特徴とするアミノ化合物検出用キット。
  5. 【請求項５】 少なくとも以下のａ〜ｃの工程を行なう
    ことを特徴とする試料中のヒドロキシプロリンの検出方
    法。 ａ）検出用試薬である４−クロロ−７−ニトロベンゾフ
    ラザンを固相に固定化する工程、 ｂ）ヒドロキシプロリンを前記固相に固定化された４−
    クロロ−７−ニトロベンゾフラザンと反応させる工程、 ｃ）工程ｂ）で生成した反応生成物の蛍光または吸収を
    測定する工程。
  6. 【請求項６】 工程ａ）において、界面活性剤および／
    または分散補助剤の存在下、固定化を行なうことを特徴
    とする、請求項５に記載の試料中のヒドロキシプロリン
    の検出方法。
  7. 【請求項７】 試料中にヒドロキシプロリン以外のアミ
    ノ化合物が存在する場合、工程ｂ）において、ヒドロキ
    シプロリンと４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンと
    のみが反応するのに十分な時間だけ反応させることを特
    徴とする、請求項５に記載の試料中のヒドロキシプロリ
    ンの検出方法。
  8. 【請求項８】 固相に固定化された４−クロロ−７−ニ
    トロベンゾフラザンと、緩衝剤と、酸溶液とを少なくと
    も含むことを特徴とするヒドロキシプロリンの検出用キ
    ット。
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