CN106661608A - 十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法 - Google Patents

十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法 Download PDF

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Abstract

提供对于由动物采集的十二指肠液试样评价该十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样的方法。即，提供十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其具有：(a)将十二指肠液试样与糜蛋白酶特异性底物混合，测定利用前述十二指肠液试样的前述糜蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；(b)将前述十二指肠液试样与胃蛋白酶特异性底物混合，测定利用前述十二指肠液试样的前述胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；以及(c)基于前述十二指肠液试样的前述糜蛋白酶特异性底物的分解活性和前述十二指肠液试样的前述胃蛋白酶特异性底物的分解活性，评价前述十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样的工序。

Description

十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价 方法
技术领域
本发明涉及对于由动物采集的十二指肠液试样评价是否适合于来自胰液的成分检测、即，通过将该十二指肠液试样供于来自胰液的成分的检测来得到可靠性高的结果的方法。
背景技术
胰液(由胰管排出的体液)是用于知晓胰脏状态的重要的活体试样，用于细胞诊断、重碳酸盐测定、细菌检查、包含蛋白质、核酸等的标记物的检查等胰脏病的检查。特别是，通过对胰液中所包含的细胞、各种活体成分进行解析，可以期待能够实现不仅早期发现难且预后非常差的胰癌的早期发现。
胰液通常经内窥镜地由十二指肠乳头部向胰脏的胰管插入导管而采集。但是，该方法存在对患者的侵袭性高、另外，需要获得医师高度的技术等问题。因此，报告了代替由胰管采集的胰液而使用十二指肠液(由十二指肠内采集的体液)，从而检查胰脏病的方法(例如专利文献1参照。)。胰液是从胰脏向十二指肠排出的，所以能够通过检测十二指肠液中的胰液成分来检查胰脏病。十二指肠液在采集工序中不需要向胰管的途径，将内窥镜插入至十二指肠，在该情况下能够仅靠吸引来进行采集。即，十二指肠液的采集与由胰管的胰液采集相比较，能够以低侵袭且更简便的技术实施。
十二指肠液中，除了由胰脏排出的胰液之外，还含有由肝脏生成、经胆嚢排出的胆汁、由十二指肠分泌的粘液、由胃排出的胃液。即，十二指肠液是由胰液、胆汁、十二指肠分泌的粘液和胃液混合而成的体液，各成分的含量是多种多样的。因此，由被检者采集的十二指肠液中，被认为带有对于检查胰脏病最重要信息的胰液是否一定混入是不明确的。假设，由同一被检者采集多种级分的情况下，可以认为胰液的分布不均匀，采集的十二指肠液中不一定会含有胰液。
另一方面，蛋白质等活体成分容易引起分解、失活等。因此，为了得到可靠性高的结果，重要的是调查活体试样的质量。例如，专利文献2中公开了：为了监测血清、血浆、全血等活体试样中的肽或蛋白质样品的变化、变动，将具备利用蛋白酶的切断位点的被标记的肽或蛋白质作为标准物质，向活体试样中添加该标准物质，从而监测其经时的浓度变化的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/038981号
专利文献2：日本特开2008-506373号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明涉及对于由动物采集的十二指肠液试样评价该十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样的方法；以及采集利用该方法的、适合于作为来自胰液的成分的检测用试样的十二指肠液试样的练习方法。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究的结果发现，胰液含量多且胃液含量少的十二指肠液试样适合作为来自胰液的成分检测；十二指肠液试样的胰液含量和胃液含量的多寡可以分别基于对于对糜蛋白酶特异性的底物和对胃蛋白酶特异性的底物的分解活性来判断，至此完成本发明。
即，本发明的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法、以及采集十二指肠液试样的练习方法为下述[1]～[10]。
[1]一种十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其具有：
(a)将十二指肠液试样与糜蛋白酶特异性底物混合，测定利用所述十二指肠液试样的所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；
(b)将所述十二指肠液试样与胃蛋白酶特异性底物混合，测定利用所述十二指肠液试样的所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；以及
(c)基于所述十二指肠液试样的所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性和所述十二指肠液试样的所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性，评价所述十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样的工序。
[2]根据前述[1]的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，前述糜蛋白酶特异性底物的利用糜蛋白酶的切断位点为下述通式(1)所表示的结构：
-(Y1)n1-(X1)-Pro-(Y2)n2-···(1)
[式(1)中，Y1和Y2分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X1表示Phe、Trp或Tyr；n1和n2分别独立地表示1～10的整数。]前述胃蛋白酶特异性底物的利用胃蛋白酶的切断位点为下述通式(2)所表示的结构。
-(Y3)n3-Pro-(X2)-(Y4)n4-···(2)
[式(2)中，Y3和Y4分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X2表示Phe、Trp或Tyr；n3和n4分别独立地表示1～10的整数。]
[3]根据前述[1]或[2]所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，所述糜蛋白酶特异性底物和所述胃蛋白酶特异性底物用相互同种或异种的标记物质标记。
[4]根据前述[3]的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，基于前述糜蛋白酶特异性底物的分解物量确定前述糜蛋白酶特异性底物的分解活性；基于前述胃蛋白酶特异性底物的分解物量确定前述胃蛋白酶特异性底物的分解活性；以所述标记物质作为指标，确定前述糜蛋白酶特异性底物的分解物量以及前述胃蛋白酶特异性底物的分解物量。
[5]根据前述[3]或[4]的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，前述标记物质为荧光物质。
[6]根据前述[1]的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，基于前述十二指肠液试样的糜蛋白酶含量确定前述糜蛋白酶特异性底物的分解活性；基于前述十二指肠液试样的胃蛋白酶含量确定前述胃蛋白酶特异性底物的分解活性。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，对于从同一被检者的消化管中的2个以上不同的部位采集的多个十二指肠液试样，分别进行所述工序(a)～(b)，作为所述工序(c)，
(c’)将所述多个十二指肠液试样中的、所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性高且所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性低的物质评价为适合作为来自胰液的成分的检测用试样的工序。
[8]一种十二指肠液试样采集的练习方法，其为使用消化管模拟装置，练习采集适合于作为来自胰液成分的检测用试样的十二指肠液试样的方法，前述消化管模拟装置至少具备：模拟口、模拟食道、投入了模拟胃液的模拟胃、通过模拟乳头部投入了模拟胰液的模拟十二指肠；前述模拟胃液是含有胃蛋白酶的pH1～2的溶液，前述模拟胰液是含有糜蛋白酶的pH8～9的溶液，重复进行1次或2次以上下述工序(1)和(2)，下述工序(1)中，进行练习以便能够采集糜蛋白酶特异性底物的分解活性高于规定阈值且胃蛋白酶特异性底物的分解活性低于规定阈值的模拟十二指肠液试样；
(1)由所述消化管模拟装置的所述模拟口至所述模拟十二指肠插入带有液体采集用导管的内窥镜，由所述模拟十二指肠的1个或2个以上不同的位点采集模拟十二指肠液试样的工序；
(2)对于所述(1)中采集的各模拟十二指肠液试样，分别测定糜蛋白酶特异性底物的分解活性和胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序。
[9]根据前述[8]的十二指肠液试样采集的练习方法，其中，前述糜蛋白酶特异性底物的利用糜蛋白酶的切断位点为下述通式(1)所表示的结构：
-(Y1)n1-(X1)-Pro-(Y2)n2-···(1)
[式(1)中，Y1和Y2分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X1表示Phe、Trp或Tyr；n1和n2分别独立地表示1～10的整数。]
前述胃蛋白酶特异性底物的利用胃蛋白酶的切断位点为下述通式(2)所表示的结构。
-(Y3)n3-Pro-(X2)-(Y4)n4-···(2)
[式(2)中，Y3和Y4分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X2表示Phe、Trp或Tyr；n3和n4分别独立地表示1～10的整数。]
[10]根据前述[8]或[9]的十二指肠液试样采集的练习方法，其中，前述糜蛋白酶特异性底物和前述胃蛋白酶特异性底物用相互同种或异种的标记物质标记，基于前述糜蛋白酶特异性底物的分解物量确定前述糜蛋白酶特异性底物的分解活性；基于前述胃蛋白酶特异性底物的分解物量确定前述胃蛋白酶特异性底物的分解活性；以前述标记物质作为指标，确定前述糜蛋白酶特异性底物的分解物量和前述胃蛋白酶特异性底物的分解物量。
发明的效果
对于供检查的前述十二指肠液试样进行本发明的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，选择具有适性且可以期待可靠性高的结果的试样，由此能够供于用于来自胰液的成分检测的检查。另外，通过对供于用于来自胰液的成分检测的检查后的十二指肠液试样进行该适性评价方法，能够通过该检查评价得到的结果的可靠性。
另外，通过本发明的十二指肠液试样采集的练习方法，能够利用带有液体采集用导管的内窥镜练习适合于来自胰液的成分检测用试样的十二指肠液试样的采集。
具体实施方式
＜十二指肠液试样的作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法＞
本发明的十二指肠液试样的作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法(以下，有时称为“本发明的适性评价方法”。)具有下述工序(a)～(c)。
(a)将十二指肠液试样与糜蛋白酶特异性底物混合，测定利用所述十二指肠液试样的所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；
(b)将所述十二指肠液试样与胃蛋白酶特异性底物混合，测定利用所述十二指肠液试样的所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；以及
(c)基于所述十二指肠液试样的所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性以及所述十二指肠液试样的所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性，评价所述十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样的工序。
将胰液含量低或者不包含胰液的十二指肠液试样供于检查的情况下，即便胰液中含有目标的胰脏病标记物，在检查中也检测不到该胰脏病标记物而成为假阴性。另外，在十二指肠液试样中混入有胃液的情况下，存在pH偏酸性、由于来自胃液的各种蛋白酶该十二指肠液试样的来自胰液的成分分解、变性、失活的情况。因此，将胃液的混入量多的十二指肠液试样供于检查时，即便在含有胰液的情况下，在检查中成为假阴性的可能性也高。即，在使用十二指肠液试样进行来自胰液的成分检查时，为了得到能够相信的检查结果，需要供试的十二指肠液试样中含有胰液且胃液的混入量少。
因此，本发明的适性评价方法中，对于由动物采集的十二指肠液试样，以胰液的含量和胃液的含量作为指标，评价该十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样。胰液含量多且胃液含量少的十二指肠液试样被评价为作为来自胰液的成分检测用试样的适性(以下，有时简单地称为“试样适性”。)高，且胰液的含量少的十二指肠液试样、胃液含量多的十二指肠液试样被评价为试样适性低。
本发明中，十二指肠液试样中的胰液含量和胃液含量的多寡分别根据对于对糜蛋白酶特异的底物和对胃蛋白酶特异的底物的分解活性来研究。消化液有脏器特异性，胰液和胃液包含各种各样的消化酶；胰液主要的消化酶为糜蛋白酶和胰蛋白酶，胃液的主要消化酶为胃蛋白酶。即，可以推定，糜蛋白酶特异性底物的分解活性高的十二指肠液试样的糜蛋白酶含量高而胰液含量高。可以推定，胃蛋白酶特异性底物的分解活性高的十二指肠液试样的胃蛋白酶含量高而胃液含量高。
糜蛋白酶为丝氨酸蛋白酶的一种，pH8时表现出最大的活性。糜蛋白酶切断不位于肽中的脯氨酸残基(Pro)之后的苯丙氨酸残基(Phe)、色氨酸残基(Trp)或酪氨酸残基(Tyr)的C末端侧。胰蛋白酶为丝氨酸蛋白酶的1种，在pH5～6时表现出最大的活性。胰蛋白酶切断不位于肽中的脯氨酸残基之后的精氨酸残基(Arg)或赖氨酸残基(Lys)的C末端。胃蛋白酶是酸性蛋白酶，在pH2时表现出最大的活性。胃蛋白酶切断不位于肽中的脯氨酸残基之前的亮氨酸残基(Leu)、苯丙氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基的N末端侧。
胃液是酸性的，因此可以说pH低的十二指肠液试样的胃液含量高。即，十二指肠液试样的pH成为胃液含量的指标。其中，十二指肠液试样中也包含具有缓冲作用的胆汁，因此十二指肠液试样的pH不低不意味着一定没有胃液的混入。这样，十二指肠液试样的pH作为胃液的含量的指标不仅灵敏度低而且也受到胆汁含量的影响。另外，将采集的十二指肠液试样直接在缓冲液或保存液中混合时，pH无法成为胃液混入的指标。本发明中，作为胃液含量的指标使用胃蛋白酶特异性底物的分解活性，因此相比于以pH作为指标的情况，能够以更高灵敏度检测有无胃液混入。
本发明的适性评价方法中，工序(a)中，测定作为评价对象的十二指肠液试样的糜蛋白酶特异性底物的分解活性。糜蛋白酶特异性底物的分解活性基于糜蛋白酶特异性底物的分解物量来确定。即，糜蛋白酶特异性底物的分解物量越多则十二指肠液试样的糜蛋白酶特异性底物的分解活性高。具体而言，在十二指肠液试样中混合糜蛋白酶特异性底物，孵育规定时间来进行酶反应之后，测定该糜蛋白酶特异性底物的分解物的量。需要说明的是，该工序中，十二指肠液试样中混合的糜蛋白酶特异性底物可以仅有一种也可以为两种以上。
本发明的适性评价方法中，工序(b)中，测定作为评价对象的十二指肠液试样的胃蛋白酶特异性底物的分解活性。胃蛋白酶特异性底物的分解活性基于胃蛋白酶特异性底物的分解物量来确定。即，胃蛋白酶特异性底物的分解物的量越多则十二指肠液试样的胃蛋白酶特异性底物的分解活性越高。具体而言，在十二指肠液试样中混合胃蛋白酶特异性底物，孵育规定时间进行酶反应之后，测定该胃蛋白酶特异性底物的分解物的量。需要说明的是，该工序中，十二指肠液试样中所混合的胃蛋白酶特异性底物可以仅有一种也可以为两种以上。
本发明中使用的糜蛋白酶特异性底物被糜蛋白酶分解，但只要是不被胃液所包含的消化酶分解的物质，则没有特别的限定，优选为仅被糜蛋白酶分解的物质，也可以为不仅被糜蛋白酶还被胃液中不包含的酶分解的物质。同样地，本发明中所使用的胃蛋白酶特异性底物被胃蛋白酶分解，但只要是不被胰液中所包含的消化酶分解的物质则没有特别的限定，优选为仅被胃蛋白酶分解的物质。也可以为除了胃蛋白酶之外还被胰液中不包含的酶分解的物质。
作为本发明中使用的糜蛋白酶特异性底物，被糜蛋白酶识别且切断的位点(糜蛋白酶识别位点)优选为下述通式(1)所表示的结构的物质。糜蛋白酶识别位点为下述通式(1)所标示的结构，从而不会被以胃蛋白酶为代表的胃液中所包含的消化酶切断而被糜蛋白酶特异性地切断。下述通式(1)中，Y1和Y2分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X1表示Phe、Trp或Tyr；n1和n2分别独立地表示1～10的整数。
-(Y1)n1-(X1)-Pro-(Y2)n2-···(1)
作为本发明中所使用的糜蛋白酶特异性底物，可以为仅包含糜蛋白酶识别位点的物质，也可以为包含糜蛋白酶识别位点以外区域的物质。糜蛋白酶特异性底物中，作为糜蛋白酶识别位点以外的区域，必要的是，由不被以胃蛋白酶为代表的胃液所包含的消化酶分解的结构构成。例如糜蛋白酶识别位点为前述通式(1)所表示的结构的情况下，作为糜蛋白酶特异性底物，可以为前述通式(1)所表示结构的两端与氢原子结合的物质；也可以为前述通式(1)所表示结构的两端或任一端与氢原子以外的不被胃液所包含的消化酶分解的结构结合的物质。
作为本发明中所使用的胃蛋白酶特异性底物，优选为被胃蛋白酶识别而切断的位点(胃蛋白酶识别位点)为下述通式(2)所表示的结构的物质。由于胃蛋白酶识别位点为下述通式(2)所表示的结构，不会被以糜蛋白酶为代表的胰液所包含的消化酶切断而被胃蛋白酶特异地切断。下述通式(2)中，Y3和Y4分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X2表示Phe、Trp或Tyr；n3和n4分别独立地表示1～10的整数。
-(Y3)n3-Pro-(X2)-(Y4)n4-···(2)
通式(1)中，n1和n2优选分别独立地为1～5的整数，更优选为1～3的整数。通式(2)中，n3和n4优选分别独立地为1～5的整数，更优选为1～3的整数。
通式(1)中的Y1和Y2以及通式(2)中的Y3和Y4为氨基酸残基的情况下，对于该氨基酸残基没有特别的限定，可以为动物基因所编码的20种所谓的天然型氨基酸残基(包含脯氨酸)也可以为非天然型的氨基酸残基。另外，为具有光学异构体的氨基酸残基的情况下，可以为D体也可以为L体。为了使通式(1)和通式(2)所表示的结构的物质对水性溶剂具有充分的溶解度，作为天然型的氨基酸残基，优选侧链为极性的氨基酸残基；其中，更优选为赖氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基等碱性氨基酸残基；从结构稳定性的观点出发，更优选赖氨酸残基或精氨酸残基。作为非天然型的氨基酸残基，可列举出ε－氨基酸己酸(ε－Acp)、羟基赖氨酸、吡咯烷类、乙酰基赖氨酸、乙基丙氨酸等，优选为ε－Acp。需要说明的是，n1为2以上的整数时，一分子中多个存在的Y1任选全部为同种或异种。n2、n3和n4为2以上的整数时，也同样地，一分子中多个存在的Y2、Y3和Y4任选全部为同种或异种。
作为通式(1)所表示结构的物质，优选的是，Y1为ε－Acp、Y2为碱性氨基酸残基、n1和n2分别独立地为1～3的整数的物质(其中，n2为2或3的情况下，多个Y2可以均为同种的氨基酸残基，也可以为相互不同种的氨基酸残基。)。同样地，作为通式(2)所表示结构的物质，优选的是，Y3为ε－Acp、Y4为碱性氨基酸残基、n3和n4分别独立地为1～3的整数的物质(其中，n4为2或3的情况下，多个Y4可以均为同种的氨基酸残基，也可以为相互不同种的氨基酸残基。)。
作为本发明中使用的胃蛋白酶特异性底物，可以为仅包含胃蛋白酶识别位点的物质，也可以为包含胃蛋白酶识别位点以外区域的物质。胃蛋白酶特异性底物中，作为以胃蛋白酶识别位点以外的区域，必要的是，由不会被以糜蛋白酶为代表的胰液所包含的消化酶分解的结构构成。例如，胃蛋白酶识别位点为前述通式(2)所表示的结构的情况下，作为胃蛋白酶特异性底物，可以为前述通式(2)所表示结构的两端与氢原子结合的物质；也可以为前述通式(2)所表示的结构的两端或任一端与氢原子以外的不被胰液所包含的消化酶分解的结构结合的物质。
本发明中使用的糜蛋白酶特异性底物优选以能够区别地检测出被糜蛋白酶分解了的分解物和未分解的物质的方式，被一种或两种以上的标记物质标记。同样地，本发明中使用的胃蛋白酶特异性底物以能够区别地检测出被胃蛋白酶分解了的分解物和未分解的物质的方式被一种或两种以上的标记物质标记。作为该标记物质，可以从肽等生物分子的标记中通常使用的标记物质中适宜选择而使用。标记糜蛋白酶特异性底物的标记物质和标记胃蛋白酶特异性底物的标记物质既可以为同种也可以为异种。作为这样的标记物质，可列举出例如：发光物质、磁性颗粒、放射性同位素、非放射性同位素、同量异位素(isobar)、核酸、肽标记物(peptide tag)、低分子化合物等。作为发光物质，典型地为荧光物质，也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发光的物质。从高灵敏度且安全性高的观点出发，优选至少使用荧光物质作为标记物质。
作为糜蛋白酶特异性底物等的标记物质而使用的荧光物质，只要是通过放射特定波长的光而发出荧光的物质则没有特别的限定，可以从蛋白质、核酸等标记中通常使用的荧光物质、量子点等中适宜选择而使用。具体而言，作为荧光物质，可列举出：FITC(异硫氰酸荧光素)、荧光素、罗丹明(Rhodamine)、TAMRA、NBD、TMR(四甲基罗丹明)、Nma(2－(N－甲基氨基)苯甲酰[ex 340nm/em 440nm])、CAL Fluor(注册商标)系列(BiosearchTechnologies公司制)、Cy(注册商标)系列(GE Healthcare Japan制)、HiLyte Fluor(注册商标)系列(AnaSpec社制)、Alexa Fluor(注册商标)系列(Invitrogen制)、ATTO(注册商标)dye系列(ATTO－TEC公司制)、Dnp(2,4-二硝基苯酚)、BHQ2C等。作为量子点，可列举出CdSe等。
本发明中使用的糜蛋白酶特异性底物和胃蛋白酶特异性底物(以下，有时将两者总称为“本发明中使用的蛋白酶底物”。)的分解物量可以以标记物质作为指标而确定。该分解物量的测定方法可以根据标记各底物的标记物质而使用各种各样的方法。作为测定方法，可列举出例如：荧光强度测定法、使用分光光度计测定对应于特定波长的光的透射光量变化的方法、发光测定法、放射活性测定法、显微镜法、免疫学的方法、分子生物学的方法、质谱分析、SELDI(表面增强激光解吸/离子化)、核磁共振、等离子体共振等。
例如，在分解前的蛋白酶底物与分解后的分解物的大小差异很大的情况下，可以利用根据物质的大小来区別检测的方法，从而测定分解了的蛋白酶底物的量。作为该检测方法，可以例如，将孵育后的反应溶液施加在SDS－PAGE而从未分解的蛋白酶底物分离的分解物可以利用CBB染色、银染色(Silver Stain)等检测。分解物的量根据染色强度而求出。另外，也可以根据将孵育后的反应溶液施加于高效液相色谱(HPLC)、然后由从未分解的蛋白酶底物分离的分解物在色谱上的峰，求出分解物的量。
另外，例如：使作为供体的荧光物质与作为受体的猝灭物质以夹着蛋白酶识别位点的方式结合而成的物质作为蛋白酶底物，利用荧光共振能量转移(Fluorescenceresonance energy transfer：FRET)来将蛋白酶底物的分解物与未分解的蛋白酶底物区別来检测。该情况下，未分解的蛋白酶底物中，由于FRET几乎不会产生荧光，但被蛋白酶在蛋白酶识别位点切断时，荧光物质与猝灭物质的距离拉开，变得不会产生FRET，能够强烈地检测到由荧光物质发出的荧光。即，分解的蛋白酶底物的量通过孵育后的反应溶液中发出荧光的荧光物质的量来表示。
另外，使固相载体或者能够与固相载体直接或间接地结合的物质(以下，称为“连接物质”。)与荧光物质以夹着蛋白酶识别位点的方式结合而成的物质作为蛋白酶底物，利用使用了固相载体的固液分离处理，能够将蛋白酶底物的分解物与未分解的蛋白酶底物区別地检测。来自于未分解的蛋白酶底物的荧光物质与固相载体直接或间接地结合，但来自于被蛋白酶分解的蛋白酶底物的荧光物质从固相载体游离。因此，对将蛋白酶底物与十二指肠液试样混合而成的混合物(反应液)孵育之后进行固液分离处理时，来自于未分解的蛋白酶底物的荧光物质与固相载体一起被分离，液相中来自于被分解了的蛋白酶底物的荧光物质被回收。即，蛋白酶底物的分解物的量通过该液相中的荧光物质的量来表示。蛋白酶底物通过连接物质与固相载体的情况下，固相载体可以与蛋白酶底物一起向十二指肠液试样中添加而进行孵育，也可以将蛋白酶底物与十二指肠液试样孵育之后，使孵育后的反应溶液与固相载体接触。
作为该固相载体，只要是具备与蛋白酶识别位点或者与连接物质直接或间接结合的位点的固体，则对于其形状、材质等没有特别的限定。例如，可以为珠等能够悬浮于水中且通过通常的固液分离处理能够与液体分离的颗粒，既可以为膜，也可以为容器、芯片基板等。作为固相载体，具体而言，可列举出例如：磁珠、二氧化硅珠、琼脂糖凝胶珠、聚丙烯酰胺树脂珠、胶乳珠、聚苯乙烯珠等塑料珠、陶瓷珠、氧化锆珠、二氧化硅膜、二氧化硅滤器、塑料板等。
作为该连接体物质，可列举出：生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、谷胱甘肽、Dnp、地高辛配基、地高辛、由2种以上糖形成的糖链、His标签、Flag标签、Myc标签等由4个以上氨基酸形成的多肽、生长素、赤霉素、类固醇、蛋白质、亲水性有机化合物以及它们的类似物等。例如,连接体物质为生物素的情况下,可以使用表面结合有抗生物素蛋白或链霉亲和素的珠、滤器作为固相载体。同样地，连接物质为谷胱甘肽、地高辛配基、地高辛、His标签、Flag标签、Myc标签等的情况下，可以使用表面结合有针对这些的抗体的珠、滤器作为固相载体。
作为固液分离处理，只要是能够将溶液中的固相载体与液体成分分离而回收的方法，则没有特别的限定，可以从固液分离处理中使用的公知的处理中适宜选择而使用。例如，固相载体为珠等颗粒的情况下，可以对包含固相载体的悬浊液进行静置或离心分离处理，从而使固相载体沉淀、去除上清；也可以对该溶液使用滤纸或过滤滤器进行过滤，从而回收残留于滤纸等表面的固相载体。另外，固相载体为磁珠的情况下，可以使加入了该溶液的容器与磁石接近，使固相载体在该容器与该磁石最接近的面集束之后，去除上清。需要说明的是，固相载体为膜、滤器的情况下，使孵育后的反应溶液透过该固相载体，由此能够从该反应溶液中分离去除未分解的蛋白酶底物。
来自于分解的蛋白酶底物的荧光物质的量可以通过通常的荧光测定法来测定。例如，可以为测定由溶液中的全部荧光分子发出的荧光强度的方法，也可以为对每一分子测定荧光强度的方法。
溶液的荧光强度可以使用荧光微孔板检测仪(Plate reader)等荧光分光光度计等通过常规方法进行测定。溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的量相关。因此，例如，预先制作表示作为检测对象的荧光物质的浓度与荧光强度的关系的标准曲线，能够对溶液中荧光物质的量即，来自于分解的蛋白酶底物的荧光物质的量进行定量。
作为对试样溶液中的每一分子测定荧光强度的方法，可列举出：荧光相关光谱法(Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS)(参照例如日本特开2005-098876号公报。)、荧光强度分布解析法(Fluorecscence Intensity Distribution Analysis，FIDA)(参照例如专利第4023523号公报。)、扫描分子计数法((Scanning Single－MoleculeCounting，SSMC)(参照例如专利05250152号公报。)。除此之外，也可以使用日本特表2011－508219号公报中记载的单一分子检测扫描分析器、日本特开2012－73032号公报中公开的荧光1颗粒检测装置等进行测定。本发明中，由于可以由更微量的试样高灵敏度且定量地检测荧光物质，来自于分解的蛋白酶底物的荧光物质优选通过SSMC法进行测定。
例如，通过FCS对存在于共焦光学系统中的焦点区域的分子荧光强度的波动进行检测之后，进行统计分析，由此能够计算出溶液中来自分解的蛋白酶底物的荧光物质的分子数。
另外，通过FIDA对存在于共焦光学系统中的焦点区域的分子荧光强度的波动进行检测之后，进行统计分析，由此能够计算出溶液中来自分解的蛋白酶底物的荧光物质的分子数。
另外，通过SSMC，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在溶液内一边移动前述光学系统的光检测区域的位置一边检测由该光检测区域发出的荧光，从而能够计算出溶液中游离的来自于分解的蛋白酶底物的荧光物质的分子数。
需要说明的是，FCS、FIDA、SSMC可以使用例如MF20(Olympus Corporation制)等公知的单一分子荧光分析系统等、按照常规方法进行。
利用荧光信号测定来自于蛋白酶底物的荧光物质的量时，可以将测定的荧光信号直接作为该荧光物质的量；测定背景水平不能无视的情况下，优选将减去背景的信号作为该荧光物质的量。
工序(a)和工序(b)在工序(c)之前进行即可，哪一个先进行都可以，也可以同时进行。另外，工序(a)中检测糜蛋白酶特异性底物的分解活性的十二指肠液试样和工序(b)中检测胃蛋白酶特异性底物的分解活性的十二指肠液试样只要相同即可。例如，也可以对于分注了一份十二指肠液试样的一部分的样品进行工序(a)、对于分注了该十二指肠液试样的另一部分的样品进行工序(b)；也可以对于工序(a)中检测了糜蛋白酶特异性底物的分解活性之后的反应液添加胃蛋白酶特异性底物进行工序(b)；还可以对于工序(b)中检测了胃蛋白酶特异性底物的分解活性之后的反应液添加糜蛋白酶特异性底物进行工序(a)。另外，也可以向一份十二指肠液试样中添加糜蛋白酶特异性底物和胃蛋白酶特异性底物，同时进行工序(a)和工序(b)中的消化反应，在反应后(反应液的孵育后)依次测定糜蛋白酶特异性底物的分解物量和胃蛋白酶特异性底物的分解物量。
糜蛋白酶特异性底物和胃蛋白酶特异性底物被荧光物质标记，基于分别标记了各蛋白酶底物的荧光物质确定糜蛋白酶特异性底物的分解物量和胃蛋白酶特异性底物的分解物量时，标记两者的荧光物质的荧光特性相互不同。此处，荧光特性不同是指，如FITC和罗丹明那样，通过激发光照射发出的荧光得波长以能够区別检测的程度而不同。
工序(a)和(b)中，对将十二指肠液试样和蛋白酶底物混合而成的混合物(反应液)进行孵育时，也可以向该反应液中混合水或者各种缓冲液。利用水或缓冲液能够调节该反应液的浓度、pH。作为该缓冲液，可以从该技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液，可列举出例如：PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、Hunks缓冲液等。
工序(a)中，为了达到糜蛋白酶的最适pH附近，优选向该反应液中混合pH7～9的缓冲液。另外，工序(b)中，为了达到胃蛋白酶的最适pH附近，优选向该反应液中混合pH1～4的缓冲液。
进而，工序(a)和(b)中的将十二指肠液试样和蛋白酶底物混合而成的反应液中，只要不阻碍利用糜蛋白酶、胃蛋白酶的消化反应，也可以混合其他的物质。作为该其他的物质，可列举出表面活性剂、核酸酶抑制剂等。
工序(a)和(b)中，对于将十二指肠液试样和蛋白酶底物混合而成的反应液进行孵育的时间，只要是用于引起蛋白酶反应的充分的时间，则没有特别的限定，可以考虑反应液的pH、量、孵育温度等而适宜调节。例如，通过对该反应液进行5分钟～2小时孵育，能够利用糜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶反应。另外，该孵育的温度只要是能够进行蛋白酶反应的温度即可，可以是室温(1～30℃)，也可以是动物的体温附近(例如30～38℃)。另外，该孵育可以在恒温条件下进行，也可以不进行温度控制。
对多个十二指肠液试样进行本发明的适性评价方法时、或者独立地进行了或进行本发明的适性评价方法来评价的其他十二指肠液试样的评价结果相比较时，由于能够防止测定试样间的偏差，优选将孵育的反应液的组成、时间和温度在测定试样之间设为同一条件。
在工序(a)和工序(b)之后，作为工序(c)，对供于测定的十二指肠液试样的试样适性进行评价。糜蛋白酶特异性底物的分解活性高且胃蛋白酶特异性底物的分解活性低的十二指肠液试样评价为试样适性高。即，糜蛋白酶特异性底物的分解物量多且胃蛋白酶特异性底物的分解物量为测定界限值以下的十二指肠液试样的试样适性最高。另外，糜蛋白酶特异性底物的分解活性低且胃蛋白酶特异性底物的分解活性高的十二指肠液试样评价为试样适性低。对于糜蛋白酶特异性底物的分解活性为相同程度的2个以上的十二指肠液试样，胃蛋白酶特异性底物的分解活性低者评价为试样适性高。即，糜蛋白酶特异性底物的分解活性高且胃蛋白酶特异性底物的分解活性也高的十二指肠液试样尽管具有试样适性，但相比于糜蛋白酶特异性底物的分解活性高且胃蛋白酶特异性底物的分解活性低的十二指肠液试样，评价为试样适性低。糜蛋白酶特异性底物的分解活性低且胃蛋白酶特异性底物的分解活性也低的十二指肠液试样的试样适性低，但相比于糜蛋白酶特异性底物的分解活性低而胃蛋白酶特异性底物的分解活性高的十二指肠液试样，评价为试样适性高。
在相同条件下进行了工序(a)的2个以上的十二指肠液试样的糜蛋白酶特异性底物的分解活性高低可以通过比较糜蛋白酶特异性底物的分解物量的测定值来确定。同样地，在相同条件下进行了工序(b)的2个以上的十二指肠液试样的胃蛋白酶特异性底物的分解活性的高低可以通过比较胃蛋白酶特异性底物的分解物量的测定值来确定。
除此之外，预先确定阈值，糜蛋白酶特异性底物的分解物量高于规定阈值的十二指肠液试样被评价为试样适性高；低于规定阈值的十二指肠液试样被评价为试样适性低。另外，胃蛋白酶特异性底物的分解物量低于规定阈值的十二指肠液试样被评价为试样适性高、高于规定阈值的十二指肠液试样被评价为试样适性低。
本发明的适性评价方法中，十二指肠液试样的糜蛋白酶特异性底物的分解活性可以基于十二指肠液试样的糜蛋白酶含量来确定；十二指肠液试样的胃蛋白酶特异性底物的分解活性可以基于十二指肠液试样的胃蛋白酶含量来确定。十二指肠液试样的糜蛋白酶含量和胃蛋白酶含量可以利用使用了对糜蛋白酶、胃蛋白酶特异的抗体的抗原抗体反应来测定；也可以使用利用了ELISA法的市售的测定试剂盒。例如，作为用于测定糜蛋白酶浓度的试剂盒，有“Trypsin(E)[S]”(KYOWA MEDEX CO.,LTD.制)；作为用于测定胃蛋白酶浓度的试剂盒，有“Human Pepsin,PG ELISA Kit”(CUSABIO公司制)。
本发明的适性评价方法中，作为评价对象的十二指肠液试样可以为从十二指肠的肠管内的某处采集的十二指肠液；优选为存在于十二指肠的第二段或第三段的十二指肠液。因为，十二指肠的第一段是与胃的幽门部直接连接的部位，有混入胃液的可能性；另外，用于采集的内窥镜的固定比较难而存在难以采集的情况等。
需要说明的是，十二指肠液可以通过常规方法采集。例如，可以通过与内窥镜中设置的液体采集用导管连接的注射器、真空泵等吸引单元采集十二指肠液。具体而言，从口腔至十二指肠插入内窥镜，使用贯穿钳子沟道而插入的导管，吸引并采集存在于十二指肠的第二·第三段中存在的十二指肠液。例如，对于作为所谓的胃镜的胃·十二指肠的内窥镜检查(上部内窥镜检查)，也可以采集贮存于十二指肠的肠管内的十二指肠液。
十二指肠液组成的个体差别大，另外，即便是同一被检者，一天内的变化和不同日期的变化也大。进而，根据十二指肠中的采集部位不同，十二指肠液的组成也不同。因此，从同一被检者同一天采集的十二指肠液试样之间，根据采集十二指肠液试样的部位、采集时机的不同，胰液含量和胃液含量也是多种多样的。因此，对于由同一被检者的十二指肠的各部位独立采集的多个十二指肠液试样，分别进行本发明的适性评价方法的工序(a)和(b)，比较测定的各蛋白酶底物的分解活性，优选将试样适性最高的试样实际上供于来自于胰液的成分的检查。通过选择试样适性高的十二指肠液试样供于来自胰液的成分的检查，能够抑制由假阴性导致的检查精度降低而提高检查的效率。
需要说明的是，本发明和本说明书中，来自胰液的成分是指胰液中所包含的蛋白质、核酸、脂质、细胞等各种生物分子。本发明的适性评价方法优选用于供于胰脏病标记物检查的十二指肠液试样的试样适性的评价。胰脏病标记物为与胰脏病的非罹患者相比较，罹患胰脏病的患者在胰液中浓度显著变高的生物分子。需要说明的是，胰脏病的非罹患者并不限定于健康者，也包括胰脏病以外疾病的罹患者。另外，作为胰脏病，可列举出例如：胰癌、IPMN(胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤)、MCN(粘液性囊性肿瘤)、SCN(浆液性囊性肿瘤)、NET(胰腺内分泌肿瘤)、慢性胰腺炎(CP)、急性胰腺炎等。
＜十二指肠液试样采集的练习方法＞
十二指肠液试样有在十二指肠中接近胃的幽门部分采集的试样的胃液的混入量高、在接近乳头部的部位采集的试样的胰液含量高的倾向。即，十二指肠液试样的试样适性很大地受到采集部位的影响。本发明的十二指肠液试样采集的练习方法(以下，有时称为“本发明的采集练习方法”。)是使用消化管模拟装置、以能够采集试样适性高的模拟十二指肠液试样的方式练习的方法。
本发明的采集练习方法中使用的消化管模拟装置是模拟从动物的口至十二指肠为止的消化管的结构，至少具备模拟口、模拟食道、投入了模拟胃液的模拟胃、通过模拟乳头部投入了模拟胰液、模拟胆汁的模拟十二指肠。模拟十二指肠内包含有从模拟胃缓缓漏出至模拟十二指肠中的模拟胃液、由模拟乳头部投入的模拟胰液、模拟胆汁。模拟十二指肠液内的模拟胃液的含量距离模拟胃越远越低；模拟胰液的含量距离模拟乳头部越远越低。模拟胃液是含有胃蛋白酶的pH1～2的溶液；模拟胰液是含有糜蛋白酶的pH7～9的溶液。模拟胆汁是含有胆红素的pH8～9的溶液。
本发明的采集练习方法中使用的消化管模拟装置只要是模拟了动物消化管的结构、并且在模拟十二指肠内填充了与模拟胃距离越长则胃蛋白酶浓度越低且与模拟乳头部的距离越长则糜蛋白酶浓度越低的液体即可。例如，本发明的采集练习方法中，也可以适宜改变内窥镜操作练习中使用的消化管模拟装置而使用。
本发明的采集练习方法中，重复进行下述工序(1)和(2)1次或2次以上。
(1)由所述消化管模拟装置的所述模拟口至所述模拟十二指肠插入带有液体采集用导管的内窥镜，由所述模拟十二指肠的1个或2个以上不同的位点采集模拟十二指肠液试样的工序；
(2)对于所述(1)中采集的各模拟十二指肠液试样，分别测定糜蛋白酶特异性底物的分解活性和胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序。
工序(2)中的各模拟十二指肠液试样的糜蛋白酶特异性底物的分解活性以及胃蛋白酶特异性底物的分解活性的测定可以通过本发明的适性评价方法中的工序(a)和(b)来进行。作为本发明的采集练习方法中使用的糜蛋白酶特异性底物，优选具有前述通式(1)所表示结构的糜蛋白酶识别位点的物质；更优选在前述通式(1)所表示结构的糜蛋白酶识别位点结合有1或2种标记物质的物质；进而优选在前述通式(1)所表示结构的糜蛋白酶识别位点结合有1或2种荧光物质的物质。作为本发明的采集练习方法中使用的胃蛋白酶特异性底物，优选为具有前述通式(2)所表示结构的胃蛋白酶识别位点的物质；更优选在前述通式(2)所标示结构的胃蛋白酶识别位点结合有1或2种标记物质的物质；进而优选在前述通式(2)所标示结构的胃蛋白酶识别位点结合有1或2种荧光物质的物质。
本发明的采集练习方法中，下述工序(1)中，以能够采集糜蛋白酶特异性底物的分解活性高于规定阈值并且胃蛋白酶特异性底物的分解活性低于规定阈值的模拟十二指肠液试样的方式，重复练习下述工序(1)和(2)。该阈值可以基于消化管模拟装置中的、由乳头部附近采集的模拟十二指肠液的糜蛋白酶特异性底物的分解活性以及胃蛋白酶特异性底物的分解活性来确定。
本发明的采集练习方法中，使用消化管模拟装置，但也可以通过使用活着的动物，以能够采集试样适性高的模拟十二指肠液试样的方式进行练习。该动物只要是插入带有液体采集用导管的内窥镜采集十二指肠液试样的动物即可，可列举出人、猿、牛、马、羊等。
使用活着的动物的情况下，首先，从被检动物的口插入上部内窥镜，到达十二指肠之后，由钳子口插入液体采集用导管，由十二指肠内胃的幽门部附近至乳头部为止的多个部位采集十二指肠液试样，测定采集的十二指肠液试样的糜蛋白酶特异性底物的分解活性以及胃蛋白酶特异性底物的分解活性。将采集的十二指肠液试样中的糜蛋白酶特异性底物的分解活性最高且胃蛋白酶特异性底物的分解活性低的十二指肠液试样确定为试样适性高的试样。接着，对该被检动物插入内窥镜，在达到十二指肠之后，将液体采集用导管从钳子口插入，以能够采集试样适性高的十二指肠液试样的方式进行重复练习。练习可以与本发明的采集练习方法中的工序(1)和(2)同样地进行。
实施例
接着,示出实施例等对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1]
对于从一被检者的十二指肠中的各个部位独立采集的10种十二指肠液试样(待检体A～J)，利用本发明的适性评价方法评价试样适性。
作为糜蛋白酶特异性底物，使用通过前述通式(1)所表示的结构连结了荧光物质CFRed590(CAL Fluor Red590[ex569nm/em591nm])和猝灭物质BHQ2C的化合物；作为胃蛋白酶特异性底物，使用通过前述通式(2)所表示的结构连结了荧光物质Nma和猝灭物质Dnp的化合物。具体而言，作为糜蛋白酶特异性底物使用通式(1a)所表示的化合物，作为胃蛋白酶特异性底物使用通式(2a)所表示的化合物。
CFRed590-ε-Acp-Phe-Pro-D-Lys(BHQ2C)-D-Arg-D-Arg-NH2 (1a)
Nma-ε-Acp-Pro-Phe-D-Lys(Dnp)-NH2 (2a)
对于采集的各十二指肠液试样，检测糜蛋白酶特异性底物和胃蛋白酶特异性底物的分解活性。具体而言，在96孔板的各孔中，在50μL的十二指肠液试样中将糜蛋白酶特异性底物和胃蛋白酶特异性底物以使糜蛋白酶特异性底物的最终浓度成为10μM、胃蛋白酶特异性底物的最终浓度成为50μM的方式混合，用Tris缓冲液(10mMTris-HCl、pH＝8.5)或盐酸(10mMHCl、pH＝2.0)制备最终容量100μL的反应液。另外，将代替十二指肠液试样而使用了1mg/mL胰酶(和光纯药株式会社制)溶液的物质作为糜蛋白酶特异性底物的阳性对照；将代替十二指肠液试样而使用了人工胃液(日本药局方的溶出试验法第I液：每1L含有2g的氯化钠和7mL盐酸的、pH1.2的水溶液)的物质作为胃蛋白酶特异性底物的阳性对照；将不添加十二指肠液试样而用Tris缓冲液调节为最终容量100μL的物质作为糜蛋白酶特异性底物的阴性对照；将不添加十二指肠液试样而用盐酸调节为最终容量100μL的物质作为胃蛋白酶特异性底物的阴性对照。
将该96孔板在37℃下反应10分钟之后，设置于微孔板检测仪，对于各孔内的反应液，测定激发波长为569nm、荧光波长为591nm的荧光强度[Ex/Em＝569/591]以及激发波长为340nm、荧光波长为440nm的荧光强度[Ex/Em＝340/440]。
将各十二指肠液试样的荧光强度的测定结果示于表1。荧光强度(Ex/Em＝569/591)表示糜蛋白酶特异性底物的分解物量；荧光强度(Ex/Em＝340/440)表示胃蛋白酶特异性底物的分解物量。表1中，分别地“NC”表示阴性对照；“PC”表示阳性对照。另外，分别地，“荧光强度[Ex/Em＝569/591]”表示通过糜蛋白酶特异性底物的分解而产生的荧光强度；“荧光强度[Ex/Em＝340/440]”表示通过胃蛋白酶特异性底物的分解而产生的荧光的强度。
[表1]
十二指肠液试样 荧光强度[Ex/Em＝569/591] 荧光强度[Ex/Em＝340/440]
待检体A 142.2 60.26
待检体B 132.4 41.98
待检体C 152.6 39.43
待检体D 173.8 46.09
待检体E 140.6 29.86
待检体F 160.1 21
待检体G 156.8 21.9
待检体H 134.71 32.5
待检体I 173.55 83.28
待检体J 98.14 127.23
NC 15.81 1.429
PC 804.4 218.5
其结果，在所有10种待检体中，确认到了糜蛋白酶活性和胃蛋白酶活性。荧光强度[Ex/Em＝569/591]只有待检体J小于100；荧光强度[Ex/Em＝340/440]只有待检体A、I和J大于50。即，对于糜蛋白酶活性，待检体J低，但其他的待检体高。另外，胃蛋白酶活性是待检体A、I和J高、其他的待检体低。将各待检体的糜蛋白酶活性和胃蛋白酶活性的高低和基于其的十二指肠液试样的作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价结果，示于表2。表2中，分别地，“○”表示十二指肠液试样的作为来自胰液的成分检测用试样的试样适性高；“△”表示试样适性稍高；“×”表示试样适性低。由这些结果，待检体B、C、D、E、F、G和H评价为作为十二指肠液试样的作为来自胰液的成分检测用试样的试样适性高。
[表2]
产业上的可利用性
通过本发明的适性评价方法，能够评价十二指肠液试样的试样适性、选定供于检查的试样、评价检查结果的可靠性。另外，通过本发明的采集练习方法，能够提高十二指肠液试样采集者的具有试样适性的十二指肠液试样的采集手技。即，本发明的方案，能够通过抑制试样采集和检查的浪费并且减少来自胰液的成分检测中的假阴性，能够提高检查性能，能够在分析胰脏病标记物等来自胰液的成分的领域、特别是临床检查等领域中利用。

Claims (10)

1.一种十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其具有：
(a)将十二指肠液试样与糜蛋白酶特异性底物混合，测定利用所述十二指肠液试样的所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；
(b)将所述十二指肠液试样与胃蛋白酶特异性底物混合，测定利用所述十二指肠液试样的所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序；以及
(c)基于所述十二指肠液试样的所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性和所述十二指肠液试样的所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性，评价所述十二指肠液试样是否适合作为来自胰液的成分的检测用试样的工序。
2.根据权利要求1所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，
所述糜蛋白酶特异性底物的利用糜蛋白酶的切断位点为下述通式(1)所表示的结构：
-(Y1)n1-(X1)-Pro-(Y2)n2-…(1)
式(1)中，Y1和Y2分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X1表示Phe、Trp或Tyr；n1和n2分别独立地表示1～10的整数；
所述胃蛋白酶特异性底物的利用胃蛋白酶的切断位点为下述通式(2)所表示的结构：
-(Y3)n3-Pro-(X2)-(Y4)n4-…(2)
式(2)中，Y3和Y4分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X2表示Phe、Trp或Tyr；n3和n4分别独立地表示1～10的整数。
3.根据权利要求1或2所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，所述糜蛋白酶特异性底物和所述胃蛋白酶特异性底物用相互同种或异种的标记物质标记。
4.根据权利要求3所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，
基于所述糜蛋白酶特异性底物的分解物量确定所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性，
基于所述胃蛋白酶特异性底物的分解物量确定所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性，
将所述标记物质作为指标确定所述糜蛋白酶特异性底物的分解物量和所述胃蛋白酶特异性底物的分解物量。
5.根据权利要求3或4所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，所述标记物质为荧光物质。
6.根据权利要求1所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，
基于所述十二指肠液试样的糜蛋白酶含量确定所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性，
基于所述十二指肠液试样的胃蛋白酶含量确定所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的十二指肠液试样作为来自胰液的成分检测用试样的适性评价方法，其中，
对于从同一被检者的消化管中的2个以上不同的部位采集的多个十二指肠液试样，分别进行所述工序(a)～(b)，作为所述工序(c)，
(c’)将所述多个十二指肠液试样中的、所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性高且所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性低的物质评价为适合作为来自胰液的成分的检测用试样的工序。
8.一种十二指肠液试样采集的练习方法，其为使用消化管模拟装置，练习采集适合于作为来自胰液成分的检测用试样的十二指肠液试样的方法，
所述消化管模拟装置至少具备：模拟口、模拟食道、投入了模拟胃液的模拟胃、通过模拟乳头部投入了模拟胰液的模拟十二指肠；
所述模拟胃液为含有胃蛋白酶的pH1～2的溶液，
所述模拟胰液为含有糜蛋白酶的pH8～9的溶液，
重复进行1次或2次以上下述工序(1)和(2)，下述工序(1)中，进行练习以便能够采集糜蛋白酶特异性底物的分解活性高于规定阈值且胃蛋白酶特异性底物的分解活性低于规定阈值的模拟十二指肠液试样；
(1)由所述消化管模拟装置的所述模拟口至所述模拟十二指肠插入带有液体采集用导管的内窥镜，由所述模拟十二指肠的1个或2个以上不同的位点采集模拟十二指肠液试样的工序；
(2)对于所述(1)中采集的各模拟十二指肠液试样，分别测定糜蛋白酶特异性底物的分解活性和胃蛋白酶特异性底物的分解活性的工序。
9.根据权利要求8所述的十二指肠液试样采集的练习方法，其中，
所述糜蛋白酶特异性底物的利用糜蛋白酶的切断位点为下述通式(1)所表示的结构：
-(Y1)n1-(X1)-Pro-(Y2)n2-…(1)
式(1)中，Y1和Y2分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X1表示Phe、Trp或Tyr；n1和n2分别独立地表示1～10的整数；
所述胃蛋白酶特异性底物的利用胃蛋白酶的切断位点为下述通式(2)所表示的结构：
-(Y3)n3-Pro-(X2)-(Y4)n4-…(2)
式(2)中，Y3和Y4分别独立地表示氨基酸残基或－CH2－NH－；X2表示Phe、Trp或Tyr；n3和n4分别独立地表示1～10的整数。
10.根据权利要求8或9所述的十二指肠液试样采集的练习方法，其中，
所述糜蛋白酶特异性底物和所述胃蛋白酶特异性底物用相互同种或不同种的标记物质标记，
基于所述糜蛋白酶特异性底物的分解物量确定所述糜蛋白酶特异性底物的分解活性，
基于所述胃蛋白酶特异性底物的分解物量确定所述胃蛋白酶特异性底物的分解活性，
以所述标记物质作为指标确定所述糜蛋白酶特异性底物的分解物量和所述胃蛋白酶特异性底物的分解物量。
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