CN112080550A - 一种检测基质金属蛋白酶的生物传感器及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种检测基质金属蛋白酶的生物传感器及应用。MMP‑2和MMP‑7与多种疾病的生理活动密切相关，目前常用的蛋白酶检测方法具有成本昂贵、检测灵敏度不足等缺陷。本发明旨在发明一种高灵敏检测多种基质金属蛋白酶(MMPs)的生物传感器，通过蛋白酶特异性裂解反应和切口酶辅助信号放大(NESA)技术实现了特异性、高灵敏度的、同时检测多种基质金属蛋白酶，还能够应用于基质金属蛋白酶的抑制剂筛选等。

Description

一种检测基质金属蛋白酶的生物传感器及应用
技术领域
本发明属于蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种用于检测基质金属蛋白酶的生物传感器、基于所述生物传感器检测蛋白酶的方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
蛋白酶在多种基本生物过程中发挥重要作用，并可能催化特定的裂解反应。蛋白酶的失调与多种生理活动密切相关。因此，蛋白酶是药物设计的有吸引力的目标，并且几种蛋白酶抑制剂已得到批准用于药物的开发，例如，普啉司他(Prinomastat，AG3340)、坦诺司他(Tanomastat，BAY 12-9566)、马立马司他(Marimastat，BB-2516)。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-7(MMP-7)是两种基质金属蛋白酶家族(MMPs)中重要的蛋白酶，已经被证实在肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中高表达，是有价值的肿瘤标志物。
MMP-2和MMP-7的传统检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、基于抗原-抗体相互作用的表面等离子体共振法和凝胶电泳法。这些方法由于涉及昂贵的抗体蛋白，在定量测量中具有局限性。一系列以活性蛋白酶裂解底物肽为基础的方法被研发出，包括质谱法、磁共振成像方法、比色分析法、荧光共振能量转移法等。尽管这些方法由于酶裂解的高特异性而表现出良好的选择性，但它们的灵敏度较为欠缺。
发明内容
针对上述研究现状，本发明旨在发明一种高灵敏检测多种基质金属蛋白酶(MMPs)的生物传感器。单分子检测技术具有高灵敏度、高信噪比、低样品消耗等明显优势，可应用于低丰度的生物分子的灵敏检测。在此，本发明通过结合蛋白酶特异性裂解反应和切口酶辅助信号放大(NESA)技术来构建一个灵敏的蛋白酶传感器，用于检测多种MMPs。该蛋白酶传感器利用DNA-肽偶联物将目标物MMPs信号转化为触发DNA，进而启动切口酶辅助信号放大(NESA)产生放大的荧光信号。该蛋白酶传感器可进一步应用于MMP-2和MMP-7的同时检测、蛋白酶抑制剂的筛选。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种检测蛋白酶的生物传感器，所述生物传感器包括DNA-肽偶联物、报告DNA，链霉亲和素修饰的磁珠及内切酶；
所述DNA-肽偶联物中，多肽的N端连接半胱氨酸巯基修饰的待测蛋白酶的底物序列，其C端具有生物素修饰；
所述报告DNA修饰荧光基团及淬灭基团，其核苷酸序列与DNA-肽偶联物中DNA的序列相对应，两者杂交后形成所述内切酶的识别位点。
本发明提供的蛋白酶传感器，基于蛋白酶特异性裂解反应提供了一种DNA-肽偶联物，所述DNA-肽偶联物中多肽设计为蛋白酶的特异性切割底物，当待测溶液中具有目标蛋白酶时，DNA-肽偶联物被切割从而使DNA核苷酸暴露，成为一种触发DNA，触发DNA与报告DNA核苷酸序列相对应，两者杂交后形成的序列能够被内切酶识别从而成为内切酶的切割位点，当加入内切酶之后，杂交的DNA序列被切断，使原本淬灭的荧光基团发光从而被检测。
基于该原理，本发明提供的蛋白酶生物传感器可适用于多种蛋白酶的含量检测，只需要设计对应的DNA-肽偶联物及报告DNA，基于本领域技术人员所掌握的现有技术即可完成该生物传感器的制备。并且在切割底物序列不重合的、反应体系相适宜的条件下，该蛋白酶生物传感器还能够实现同时检测待测体系中的多种蛋白酶。
本发明第二方面，提供一种蛋白酶检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述检测蛋白酶的生物传感器。
本发明第三方面，提供一种肿瘤诊断试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述检测蛋白酶的生物传感器。
本发明第四方面，提供第一方面所述检测蛋白酶的生物传感器在药物研发领域的应用。
优选的，所述药物研发包括但不限于蛋白酶抑制剂的筛选等。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1.本发明联想到基于蛋白酶特异性裂解反应和NESA构建蛋白酶传感器，通过设计含有蛋白酶切割位点的DNA-肽偶联物作为底物，可以将靶标MMPs的信号转换为DNA信号。蛋白酶切割产生的触发DNA与报告DNA杂交引发NESA反应，释放大量的Cy3/Cy5荧光分子。这种设计思路保证了本发明方法具有良好的特异性及信号放大效果。
2.利用蛋白酶与底物之间的特异性识别，所述蛋白酶传感器中还能够同时存在多种DNA-肽偶联物，同时检测多种蛋白酶。
3.经本发明验证，利用高特异性的蛋白酶切割反应,高效率的循环NESA反应和高灵敏度的单分子检测，该蛋白酶传感器灵敏度高于基于底物肽的检测方法，检测限比常规方法高出3个数量级，是一种显著的提高。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述MMPs的生物传感器的机理图。
图2为实施例1中所述MMPs的生物传感器Cy3和Cy5荧光指示特异性；
其中，图2A为在无MMP-2和有MMP-2时Cy3的荧光发射光谱；
图2B为无MMP-7和有MMP-7的情况下Cy5的荧光发射光谱；
图2C为在MMP-2和MMP-7同时存在和都不存在的情况下，Cy3和Cy5的荧光发射光谱；
图2D为不同实验条件下的凝胶电泳图:DNA-肽偶联物-1+MMP-2(泳道1)、DNA-肽偶联物-1(泳道2)、DNA-肽偶联物-2+MMP-7(泳道3)、DNA-肽偶联物-2(泳道4)；
图2E为直接激发Cy3和Cy5以分析NESA反应的凝胶电泳图；
第4泳道表示MMP-2诱导的Cy3标记的报告DNA-1的裂解，第1泳道表示MMP-7诱导的Cy5标记的报告DNA-2的裂解。
图3为实施例1中荧光分子特异性响应MMPs检测结果图；
其中，图3A,3C,3E,3F为无基质金属蛋白酶、图3B,3D为MMP-2存在时的单分子荧光图像，图3G,3H为MMP-7存在时的单分子荧光图像；比例尺为5微米。
图4为实施例1所述MMPs生物传感器荧光分子数量与蛋白酶数量关系图；
其中，图4A为不同浓度的MMP-2产生的Cy3数，插图中显示了MMP-2浓度从3.8至1200pmol/L，Cy3数与MMP-2浓度对数之间的线性关系；
图4B为不同浓度的MMP-7产生的Cy5数；插图显示了MMP-7浓度从1.8至572pmol/L，Cy5数和MMP-7浓度对数之间的线性关系。
图5为实施例1中30nmol/L MMP-2、14.3nmol/L MMP-7、30nmol/L MMP-9、30nmol/L牛血清白蛋白(BSA)和30nmol/L免疫球蛋白G(IgG)的荧光团计数。
图6为实施例2中所述基质金属蛋白酶生物传感器用于蛋白酶抑制剂可行性验证结果图；
其中图6A为不同浓度Marimastat对MMP-2相对活性的影响；
图6B为不同浓度Marimastat对MMP-7相对活性的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中蛋白酶检测方法检测成本高、检测灵敏度不足的缺陷，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种蛋白酶的生物传感器，结合蛋白酶特异性裂解反应和NESA技术，能够实现多种蛋白酶的灵敏检测。
本发明第一方面，提供一种检测蛋白酶的生物传感器，所述生物传感器包括DNA-肽偶联物、报告DNA，链霉亲和素修饰的磁珠及内切酶；
所述DNA-肽偶联物中，多肽的N端连接半胱氨酸巯基修饰的待测蛋白酶的底物序列，其C端具有生物素修饰；
所述报告DNA修饰荧光基团及淬灭基团，其核苷酸序列与DNA-肽偶联物中DNA的序列相对应，两者杂交后形成所述内切酶的识别位点。
优选的，所述生物传感器中，还包括TCNB缓冲液、磁铁。
优选的，所述内切酶为Nb.BtsI内切酶。
优选的，所述荧光基团包括但不限于Cy5、Cy3、AMC、罗丹明6G、罗丹明B、5-FAM、6-FAM、5-FITC、6-CRAG、6-TET、5-IAF中一种或几种。
优选的，所述蛋白酶包括内肽酶和端肽酶。
进一步优选的，所述蛋白酶为MMPs。
基质金属蛋白酶家族中相关蛋白酶数量众多，并且与多种生理活动密切相关。本发明的一种具体的实施方式中，提供一种用于基质金属蛋白酶检测的生物传感器，所述生物传感器能够同时检测MMP-2及MMP-7；根据目前的研究结论，MMP-2及MMP-7与多种肿瘤相关，其含量变化对于肿瘤诊断及发展进程的判断具有较高价值，同时检测该两种基质金属蛋白酶具有重要的临床意义。
在该系列的实施方式中，所述荧光基团为Cy5、Cy3；所述MMP-2的DNA-肽偶联物序列如下：biotin-KKGRV-GLPGC-5’-CTA CTT ATG GCA GTG CTC GAA T-3’，其对应的报告探针序列为5’-ATT CG(Cy3)A GCA CT(BHQ2)G CCA-3’；
所述MMP-7的DNA-肽偶联物序列如下：biotin-KMTL-SLPVPGC-5’-GGA TCG TCAGCA GTG TAC CTC A-3’，其对应的报告探针序列为5’-TGA GGT(Cy5)ACA CT(BHQ2)G CTG-3’。
该系列的实施方式中，基于该基质金属蛋白酶生物传感器检测MMP-2及MMP-7的方法如下：向待测样品中加入含有DNA-肽偶联物的缓冲溶液，反应一段时间后加温至90～100℃终止反应；向终止后的反应液中加入链霉亲和素包被的磁珠并放置于磁铁上一段时间，获取其上清液部分加入报告DNA及内切酶，检测反应产物中Cy5、Cy3的含量从而确定MMP-2及MMP-7的含量。
本发明第二方面，提供一种蛋白酶检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述检测蛋白酶的生物传感器。
优选的，所述试剂盒中还包括抽提试剂，所述抽提试剂用于从生理样本中分离得到包含所述蛋白酶的待测液。
进一步的，所述生理样本包括但不限于器官、组织、血液、分泌物、精液或尿液等。
本发明第三方面，提供一种肿瘤诊断试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述检测蛋白酶的生物传感器。
本发明第四方面，提供第一方面所述检测蛋白酶的生物传感器在药物研发领域的应用。
优选的，所述药物研发领域的应用包括但不限于蛋白酶抑制剂的筛选等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中，提供一种基质金属蛋白酶生物的传感器及通过所述传感器检测基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-7的方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)基质金属蛋白酶(MMPs)反应和磁分离
首先，制备基质金属蛋白酶的反应液，所述20μL反应液中，包含4μmol/L的DNA-肽偶联物-1和2μmol/L的DNA-肽偶联物-2,1×TCNB缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/LCaCl2，150mmol/LNaCl，0.05％Brij-35，pH7.5)。
向上述反应体系加入不同浓度的MMP-2和MMP-7，在37℃反应2小时，然后升温至95℃加热终止反应。取4μL反应产物，加入15μL链霉亲和素包被的磁珠(浓度为10μg/μL)和11μL的1×PBS缓冲液(pH 7.5)室温下在混匀仪上孵育30分钟。混合物放置在磁铁上3分钟，进行分离，取上清液进行接下来的切口酶辅助信号放大(NESA)反应。
(2)切口酶辅助信号放大(NESA)反应和荧光光谱测量
磁分离后，取30μL的上清液与0.8μL100μmol/L的报告DNA-1、0.6μL100μmol/L的报告DNA-2、10μL10×缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L MgCl2,500mmol/L NaCl,10mmol/L DTT,pH 7.9)、0.8μL10个单位/μL的Nb.BtsI和57.8μL的水混合，在37℃反应2小时，然后在80℃反应20分钟终止反应。通过荧光分光光度计对反应产物中的Cy3、Cy5进行光谱测量，Cy3的激发波长和发射波长分别是535nm和562nm，Cy5的激发波长和发射波长分别是635nm和665nm。
上述步骤(1)和(2)中所涉及的序列如下：
DNA-肽偶联物-1：biotin-KKGRV-GLPGC-5’-CTA CTT ATG GCA GTG CTC GAA T-3’；
DNA-肽偶联物-2：biotin-KMTL-SLPVPGC-5’-GGA TCG TCA GCA GTG TAC CTC A-3’；
报告DNA-1：5’-ATT CG(Cy3)A GCA CT(BHQ2)G CCA-3’；
报告DNA-2：5’-TGA GGT(Cy5)ACA CT(BHQ2)G CTG-3’。
(3)单分子检测
向反应产物中加入缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，1mmol/L水溶性维生素E，pH 8.0)稀释2000倍。然后将10μL稀释后的样品滴加到盖玻片上，通过全内反射荧光显微镜进行单分子成像，设置561nm和640nm激光源用于激发Cy3和Cy5，荧光被二向色镜分离到Cy3通道(573-613nm滤光片)或Cy5通道(661.5-690.5nm滤光片)并在电子倍增电荷耦合摄像机处成像。在数据分析时，选取500×500像素的区域使用Image J软件进行Cy3和Cy5计数。通过计算10张图像得到Cy3和Cy5的总计数。
本实施例中方法的检测原理如附图1所示，本实施例方法包括MMPs诱导的特异性底物的裂解，磁分离，NESA反应，以及随后的单分子检测。本实施例分别为MMP-2和MMP-7设计了两个特异性的DNA-肽偶联物和两个报告DNA。DNA-肽偶联物-1包含在C-端修饰生物素和在N-端修饰半胱氨酸巯基(SH)的MMP-2底物序列(KKGRV-GLPGC)。DNA-肽偶联物-2包含在C-端修饰生物素和在N-端修饰半胱氨酸巯基(SH)的MMP-7底物序列(KMTL-SLPVPGC)。
在本实施例记载的检测方法中，游离巯基可与胺(NH2)修饰的DNA通过马来酰亚胺反应基团在肽和DNA之间形成稳定的化学键(如DNA-肽偶联物-1和DNA-肽偶联物-2)。C-端生物素标记允许DNA-肽偶联物通过生物素-链霉亲和素相互作用在磁珠表面快速自组装。在MMP-2存在时，MMP-2识别DNA-肽偶联物-1中的底物肽，并裂解缬氨酸(V)和甘氨酸(G)之间的酰胺键，导致生物素修饰的肽段和DNA标记肽段(称为触发DNA-1)的生成。磁分离后，链霉亲和素修饰的磁珠可以有效的捕获生物素修饰的肽片段。由此产生的触发DNA-1可以与报告DNA-1杂交，形成Nb.BtsI的完整识别位点(5’-GCAGTG-3’/3’-CGTCAC-5’)。酶切反应后，报告DNA-1被裂解，导致Cy3荧光基团与BHQ2猝灭基团分离，并释放触发DNA-1。释放的触发DNA-1可以与新的未裂解的报告DNA-1再次杂交，诱导循环的杂交-切割-解离反应，产生显著增强Cy3荧光信号。相似的，在MMP-7存在时，识别DNA-肽偶联物-2中的底物肽，切断亮氨酸(L)和丝氨酸(S)之间的酰胺键，从而导致触发DNA-2的释放。产生的触发DNA-2可以与报告DNA-2杂交，启动循环切口酶辅助信号放大(NESA)反应，产生明显增强的Cy5荧光信号。当MMP-2和MMP-7都存在时，会切断DNA-肽偶联物-1和DNA-肽偶联物-2，并引发信号放大反应，同时产生强烈的Cy3和Cy5荧光信号。Cy3和Cy5荧光分子能够简单地通过单分子检测进行定量。在本实施例记载的方法中，只有Cy3能够被561纳米的激光激发，只有Cy5能够被640纳米激光激发。另外，在不存在MMP-2和MMP-7时，DNA-肽偶联物-1和DNA-肽偶联物-2不能被切断，由C-端修饰的生物素连接在磁珠表面，通过磁分离被移除。因而不会引发NESA反应，所以检测不到Cy3和Cy5的荧光信号。
1.可行性验证
本实施例进行了荧光测量来验证提出的MMPs检测方法的可行性(图2)。在没有MMPs的情况下，未观察到明显的Cy3/Cy5荧光信号(图1A-C)。相比之下，MMP-2存在时，检测到明显的Cy3荧光信号(图2A)，MMP-7存在时检测到明显的Cy5荧光信号(图2B)。当MMP-2和MMP-7同时存在，可以观察到Cy3和Cy5的荧光信号(图2C)。这些结果表明，该蛋白酶传感器可用于同时检测MMP-2和MMP-7。
对切口酶辅助信号放大(NESA)反应进行了凝胶电泳验证。图2D显示了MMPs裂解前后DNA-肽偶联物的典型凝胶电泳图像。与DNA-肽偶联物-1在缺乏MMP-2(图2D，泳道2)相比,在存在MMP-2时条带显然发生了位置的迁移(图2D,泳道1)。同样，相比缺乏MMP-7时DNA-肽偶联物-2条带的位置(图2D，泳道4),在存在MMP-7时条带位置显然发生了迁移(图2D，泳道3)。随后的切口酶辅助信号放大(NESA)反应通过直接激发Cy3和Cy5的进行凝胶电泳检测(图2E)。在MMP-2存在时，可以观察到一条由Cy3标记的报告DNA-1切断后产生的7个碱基的条带(图2E，泳道4)。在MMP-7存在时，可以观察到一条由Cy5标记的报告DNA-2切断后产生的7个碱基条带(图2E，泳道1)。在不存在基质金属蛋白酶(MMPs)的情况下，观察不到任何条带。凝胶电泳的结果进一步证明了该蛋白酶传感器可用于同时检测多种基质金属蛋白酶(MMPs)。
为了研究多种MMPs单分子检测方法的可行性，本实施例使用单分子成像同时测量MMP-2和MMP-7。如图3所示，在没有MMPs的情况下，既没有Cy3(图3A)也没有Cy5荧光信号(图3E)。MMP-2存在时有明显的Cy3荧光信号(图3B)，MMP-7存在时Cy5荧光信号明显(图3G)。当MMP-2和MMP-7同时存在时，可以同时观察到明显的Cy3荧光信号(图3D)和Cy5荧光信号(图3H)。这些结果清楚地表明，该蛋白酶传感器可以用于同时检测多种MMPs。
2.灵敏度实验
为了研究此蛋白酶传感器检测蛋白酶活性的灵敏度，本实施例对其进行不同浓度的分析测定。如图4A所示，随着MMP-2浓度增加从3.8pmol/L到30纳摩尔每升，Cy3数量的增加，并且Cy3数量和MMP-2的对数浓度从3.8到1200pmol/L呈良好的线性关系。回归方程为Y＝415.95log10C-215.42(R2＝0.998)。通过计算空白加三倍标准差得到检测限为3.33pmol/L。该检测限比荧光共振能量转移法高约1个数量级(1×10-4单位每微升)。如图4B所示，随着MMP-7浓度的从1.8pmol/L增加到14.3纳摩尔每升，Cy5数量提高。Cy5数量与MMP-7对数浓度从1.8pmol/L到572pmol/L呈线性相关(图4B的插图)，回归方程为Y＝368.66log10C-85.96(R2＝0.997)。通过计算空白加三倍标准差得到检测限为1.71pmol/L。该检测限比比色分析法高约3个数量级(400pmol/L)。
3.特异性实验
通过使用牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)、金属基质蛋白酶-9(MMP-9)(同一家族的蛋白酶)等非特异性蛋白，进一步评估了所提出的蛋白酶传感器的选择性。如图5所示，只有MMP-2存在时才会出现明显的Cy3信号，而BSA、IgG、MMP-9、MMP-7存在时不存在Cy3信号。只有当MMP-7存在时才检测到明显的Cy5信号，而当BSA、IgG、MMP-9和MMP-2存在时则检测不到Cy5信号。当MMP-2和MMP-7同时存在，可以同时检测到高Cy3和Cy5信号。这些结果表明，该蛋白酶传感器可以区分MMP-2和MMP-7以及其他干扰蛋白。
为了进一步验证NESA反应对该检测结果的影响，本实施例还针对不同检测条件获得的Cy3和Cy5的荧光信号进行了电泳分析。
(4)电泳分析
向DNA-peptide偶联物被MMP-2和MMP-7切断前后的产物加入SYBR Gold染料进行染色，然后将混合物加入14％聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶放入1×Tris-硼酸-EDTA缓冲液中，在80V电压下室温电泳50分钟，在成像系统中进行凝胶成像。NESA反应产物加入20％聚丙烯酰胺凝胶中，在1×Tris-硼酸-EDTA缓冲液中电泳，在150V电压下室温电泳90分钟。NESA产物的荧光DNA片段进行了成像分析，使用绿光激发光源(520nm-545nm激发)和577nm-613nm滤光片对Cy3荧光基团标记的片段成像和红光激发光源(625nm-650nm激发)和675nm-725nm滤光片对Cy5荧光基团标记的片段成像。所述电泳分析结果如附图2所示。
实施例2
本实施例中，提供实施例1中所述基质金属蛋白酶的生物传感器在筛选基质金属蛋白酶抑制剂方面的应用，所述实验步骤如下：
不同浓度的马立马司他(Marimastat，BB-2516)与30nmol/L的MMP-2，14.2nmol/LMMP-7，4μmol/L的DNA-肽偶联物-1，2μmol/L的DNA-肽偶联物-1,和1×TCNB缓冲液(50mmol/L的Tris-HCl)，10mmol/LCaCl2,150mmol/LNaCl，0.05％Brij-35，pH 7.5)在37℃反应2小时，并对Cy3和Cy5进行计数。
本实施例中，通过马立马司他(Marimastat，BB-2516)作为模型抑制剂，验证实施例1中所述蛋白酶传感器用于抑制试验的可行性。MMP-2和MMP-7的相对活性随着Marimastat浓度的增加呈下降趋势(图6)。本实施例使用半数抑制浓度(IC50，将D酶活性抑制为原来50％时所使用抑制剂浓度)来验证Marimastat对MMPs的抑制作用。计算出MMP-2的IC50值为7.65nmol/L(图6A)，与报道的IC50值(6nmol/L)一致。计算出MMP-7的IC50值为16.96nmol/L(图6B)，与报道的IC50值(20nmol/L)一致。这些结果表明，蛋白酶传感器可用于筛选MMP-2和MMP-7的抑制剂。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括DNA-肽偶联物、报告DNA，链霉亲和素修饰的磁珠及内切酶；
所述DNA-肽偶联物中，多肽的N端连接半胱氨酸巯基修饰的待测蛋白酶的底物序列，其C端具有生物素修饰；
所述报告DNA修饰荧光基团及淬灭基团，其核苷酸序列与DNA-肽偶联物中DNA的序列相对应，两者杂交后形成所述内切酶的识别位点。
2.如权利要求1所述检测蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器中，还包括TCNB缓冲液、磁铁。
3.如权利要求1所述检测蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述内切酶为Nb.BtsI内切酶；
或，所述荧光基团包括但不限于Cy5、Cy3、AMC、罗丹明6G、罗丹明B、5-FAM、6-FAM、5-FITC、6-CRAG、6-TET、5-IAF中一种或几种。
4.如权利要求1所述检测蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述蛋白酶包括内肽酶和端肽酶；
优选的，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶。
5.如权利要求4所述检测蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器能够同时检测MMP-2及MMP-7；所述MMP-2的DNA-肽偶联物序列如下：biotin-KKGRV-GLPGC-5’-CTACTT ATG GCA GTG CTC GAA T-3’，其对应的报告探针序列为5’-ATT CG(Cy3)A GCA CT(BHQ2)G CCA-3’；
所述MMP-7的DNA-肽偶联物序列如下：biotin-KMTL-SLPVPGC-5’-GGA TCG TCA GCAGTG TAC CTC A-3’，其对应的报告探针序列为5’-TGA GGT(Cy5)ACA CT(BHQ2)G CTG-3’。
6.如权利要求4所述检测蛋白酶的生物传感器，其特征在于，基于该基质金属蛋白酶生物传感器检测MMP-2及MMP-7的方法如下：向待测样品中加入含有DNA-肽偶联物的缓冲溶液，反应一段时间后加温至90～100℃终止反应；向终止后的反应液中加入链霉亲和素包被的磁珠并放置于磁铁上一段时间，获取其上清液部分加入报告DNA及内切酶，检测反应产物中Cy5、Cy3的含量从而确定MMP-2及MMP-7的含量。
7.一种蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述检测蛋白酶的生物传感器。
8.如权利要求7所述蛋白酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括抽提试剂，所述抽提试剂用于从生理样本中分离得到包含所述蛋白酶的待测液；
优选的，所述生理样本包括但不限于器官、组织、血液、分泌物、精液或尿液。
9.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述检测蛋白酶的生物传感器。
10.权利要求1-6任一项所述检测蛋白酶的生物传感器在药物研发领域的应用；
优选的，所述药物研发领域的应用包括但不限于蛋白酶抑制剂的筛选。
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