CN114062678A - 一种mmp-7检测试剂盒、制备方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种MMP‑7检测试剂盒、制备方法及检测方法。MMP‑7检测试剂盒包括磁分离试剂、捕获试剂、发光试剂,所述磁分离试剂含有表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒,所述捕获试剂含有生物素化单克隆MMP‑7抗体,所述发光试剂含有吖啶酯标记的多克隆MMP‑7抗体。本发明的试剂盒可用于仪器自动检测,并且可以更为快速精准测量体外样本中MMP‑7蛋白浓度。试剂盒性能稳定、灵敏度高、线性范围宽,操作便捷,检测时间短,临床实用性强。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域,具体涉及MMP-7检测试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术
MMP-7蛋白,也称为基质溶解素,是一种钙离子和锌离子依赖性的内肽酶,由267个氨基酸组成,分子量为28KD。MMP-7的表达受Wnt/β联蛋白信号途径调控,受转化生长因子β(TGF-β)介导。裂解/激活的MMP-7的主要作用是通过降解大分子(包括酪蛋白、I、II、IV和V型明胶、纤连蛋白和蛋白多糖)来分解细胞外基质。MMP-7通常在上皮细胞中表达。MMP-7的异常表达与肝脏的纤维化有关,MMP-7可用于胆道闭锁的非入侵性诊断。MMP7被发现可能参与肿瘤转移和炎症过程。上调的MMP-7与许多恶性肿瘤有关。
目前,MMP-7的检测主要采用酶联免疫吸附法。向预先包被了抗人基质金属蛋白酶7抗体的酶标孔中,加入标准品和样本,温育后,加入生物素标记的抗基质金属蛋白酶7抗体。再与HRP 标记的亲和素结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入显色底物 TMB,产生蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后,在450nm处测定反应孔样品吸光度(OD)值,样本中的人基质金属蛋白酶7浓度与OD值成正比,通过绘制标准曲线计算出样本中人基质金属蛋白酶7的浓度。
酶联免疫吸附法通常依靠手工操作,比较耗费人力和时间。检测结果的准确性和重复性与操作者的操作规范程度和熟练程度有很大关系。不规范的操作很容易引起结果的不准确。同时酶联免疫吸附法的检测灵敏度和线性范围也较低,主要应用于科研场景,在临床检测上的应用具有一定的局限性,限制了MMP-7检测在临床上的应用和推广。
目前市场上仍缺乏快速、便捷、稳定性好、可在仪器上进行自动化操作的MMP-7检测试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明提供了一种MMP-7检测试剂盒,试剂盒的制备方法及检测方法。试剂盒可用于仪器自动检测,并且可以更为快速精准测量体外样本中MMP-7蛋白浓度。试剂盒性能稳定、灵敏度高、线性范围宽,操作便捷,检测时间短,临床实用性强。
为解决上述技术问题,本发明提供以下技术方案:
一种MMP-7检测试剂盒,所述试剂盒包括磁分离试剂、捕获试剂、发光试剂,所述磁分离试剂含有表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒,所述捕获试剂含有生物素化单克隆MMP-7抗体,所述发光试剂含有吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体。
所述试剂盒还包括校准品、质控品。
所述磁分离试剂中包含表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒和磁分离试剂缓冲液。
所述磁分离试剂中表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒的浓度为0.2-2mg/mL,优选为0.5-1mg/mL。
优选地,表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒上的表面链霉亲和素载量为500-1000 pmoL/mg。优选地,表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒上的表面链霉亲和素载量为600-800 pmoL/mg。
磁微粒的粒径为1-5μm。优选地,磁微粒的粒径为1.5-3μm。
优选地,磁微粒可以为表面包被有官能团的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒,优选表面包被有链霉亲和素官能团。
磁分离试剂缓冲液包括PB缓冲液、氯化钠、表面活性剂、防腐剂、牛血清白蛋白和免疫阻断剂。
优选地,磁分离试剂缓冲液包括PB缓冲液、0.1-0.5M的氯化钠、0.01%-0.1%的表面活性剂、0.1%-0.6%的防腐剂、0.5%-3%的牛血清白蛋白和0.005%-0.2%的免疫阻断剂。
优选地,磁分离试剂缓冲液包括PB缓冲液、0.2M的氯化钠、0.05%的表面活性剂、0.2%的防腐剂、1%的牛血清白蛋白和0.01%的免疫阻断剂。
优选地,PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
优选地,磁分离试剂缓冲液中的防腐剂为Proclin300。
优选地,磁分离试剂缓冲液中的表面活性剂为Tween20。
优选地,磁分离试剂缓冲液中的免疫阻断剂为MAK-33-IgG poly。
所述捕获试剂中包含捕获试剂缓冲液及生物素化单克隆MMP-7抗体。优选地,捕获试剂缓冲液对生物素化单克隆MMP-7抗体的稀释比例为100-1000。
优选地,捕获试剂缓冲液对生物素化单克隆MMP-7抗体的稀释比例为600-1000。
捕获试剂缓冲液包括PB缓冲液、氯化钠、表面活性剂、防腐剂、牛血清白蛋白、免疫阻断剂。
优选地,捕获试剂缓冲液包括PB缓冲液、0.1-0.3M的氯化钠、0.01%-0.1%的表面活性剂、0.1%-1%的防腐剂、0.1%-2%的牛血清白蛋白、0.005%-0.02%的免疫阻断剂。
优选地,捕获试剂缓冲液包括PB缓冲液、0.2M的氯化钠、0.05%的表面活性剂、0.2%的防腐剂、1%的牛血清白蛋白、0.01%的免疫阻断剂。
优选地,防腐剂为Proclin300。
优选地,表面活性剂为Tween20。
优选地,免疫阻断剂为MAK-33-IgG poly。
所述发光试剂中包含发光试剂缓冲液及吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体。优选地,发光试剂缓冲液对吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体的稀释比例为500-800。
发光试剂缓冲液包括PB缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、防腐剂。
优选地,发光试剂缓冲液包括PB缓冲液、0.5%-1.2%的氯化钠、0.2%-0.8%的牛血清白蛋白、0.1%-1%的防腐剂。
优选地,发光试剂缓冲液包括PB缓冲液、0.9%的氯化钠、0.5%的牛血清白蛋白、0.4%的防腐剂。
优选地,发光试剂中防腐剂为泊洛沙姆和Proclin300。优选地,防腐剂中泊洛沙姆和Proclin300的比例为3:1。
本发明单克隆MMP-7抗体为小鼠单克隆MMP-7抗体,多克隆MMP-7抗体为IgG型多克隆MMP-7抗体。
本发明单克隆MMP-7抗体可以为小鼠IgG1型、小鼠IgG2b型的单克隆MMP-7抗体,多克隆MMP-7抗体可以为小鼠IgG型、兔IgG型、羊IgG型多克隆MMP-7抗体。
优选地,本发明单克隆MMP-7抗体为小鼠IgG1型单克隆MMP-7抗体,多克隆MMP-7抗体为IgG型多克隆MMP-7抗体。
优选地,本发明单克隆MMP-7抗体为小鼠IgG1型单克隆MMP-7抗体,多克隆MMP-7抗体为羊IgG型多克隆MMP-7抗体。
优选地,本发明单克隆MMP-7抗体为由小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞株产生的IgG1同种型单克隆MMP-7抗体,多克隆MMP-7抗体为羊IgG型多克隆MMP-7抗体。
所述校准品包括MMP-7蛋白和校准品缓冲液,MMP-7蛋白的浓度为15-18ng/mL、30-35ng/mL、60-70ng/mL、100-150ng/mL、200-300ng/mL,校准品缓冲液包含MES缓冲液、氯化钙、氯化钠、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂。
优选地,校准品包括MMP-7蛋白和校准品缓冲液,MMP-7蛋白的浓度为16-17ng/mL、32-34ng/mL、60-65ng/mL、110-130ng/mL、220-260ng/mL。
优选地,校准品缓冲液包含10-50mM的MES缓冲液(pH为5-6)、5-20mM的氯化钙、50-200mM的氯化钠、0.05%-2%的牛血清白蛋白、0.01%-0.2%的表面活性剂和0.01%-0.1%的防腐剂。
优选地,校准品缓冲液的表面活性剂为Tween20,防腐剂为Proclin300。
所述质控品包括MMP-7蛋白和质控品缓冲液。
优选地,质控品包括MMP-7蛋白和质控品缓冲液,MMP-7蛋白的浓度为15-17ng/mL、32-37ng/mL、59-64ng/mL、120-160ng/mL、250-280ng/mL。
优选地,质控品缓冲液包含20-50mM的MES缓冲液(pH为5-6)、10-20mM的氯化钙、100-150mM的氯化钠、0.5%-1%的牛血清白蛋白、0. 1%-0.15%的表面活性剂和0.05%-0.1%的防腐剂。
优选地,质控品缓冲液的表面活性剂为Tween20,防腐剂为Proclin300。
本发明提供了MMP-7检测试剂盒的制备方法,使用单克隆MMP-7抗体作为捕获抗体,使用多克隆MMP-7抗体作为检测抗体。
本发明MMP-7检测试剂盒的制备方法具体包括磁分离试剂的制备方法、捕获试剂的制备方法、发光试剂的制备方法。
磁分离试剂的制备方法包括:将链霉亲和素磁微粒原液置于磁分离器上静置,弃去上清液,用磁分离试剂缓冲液清洗磁微粒,清洗后的磁微粒加入磁分离试剂缓冲液,得到磁分离试剂。
所述磁分离试剂缓冲液包括PB缓冲液、氯化钠、表面活性剂、防腐剂、牛血清白蛋白和免疫阻断剂。
用磁分离试剂缓冲液清洗磁微粒的步骤具体为:用磁分离试剂缓冲液将磁微粒重悬、颠倒混匀、静置弃去上清液。
清洗步骤可以重复一次或多次。
链霉亲和素磁微粒原液在磁分离器上的静置时间为1至20分钟。
捕获试剂的制备方法包括:用生物素标记用缓冲液将单克隆MMP-7抗体复溶、稀释,然后超滤离心,加入生物素分子溶液,混匀;去除未结合的生物素小分子,然后将生物素化单克隆MMP-7抗体用捕获试剂缓冲液进行稀释,得到捕获试剂。
所述生物素标记用缓冲液包括PB缓冲液和氯化钠。
优选地,所述生物素标记用缓冲液包括pH为7.4的PB缓冲液和0.1-0.3M的氯化钠。
所述捕获试剂缓冲液包括PB缓冲液、氯化钠、表面活性剂、防腐剂、牛血清白蛋白、免疫阻断剂。
单克隆MMP-7抗体用生物素标记用缓冲液稀释后的单克隆MMP-7抗体溶液浓度为0.2mg/mL~2mg/mL。
超滤离心在超滤离心管中进行,超滤离心的条件为6000至10000rpm,2至5℃,重复2至3次。
生物素与单克隆MMP-7抗体结合时,控制生物素与单克隆MMP-7抗体的摩尔比为(5-50):1。
混匀可以采用置于振荡器上震荡混匀的方式,混匀时间为0.5~2h。
混匀后的生物素化单克隆MMP-7抗体可以用脱盐柱进行纯化,通过脱盐处理去除未结合的生物素小分子。
发光试剂的制备方法包括:用吖啶酯标记用缓冲液将多克隆MMP-7抗体复溶、稀释,然后超滤离心,加入吖啶酯分子溶液,混匀;继续加入赖氨酸缓冲液,混匀;去除未结合的吖啶酯分子,然后将吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体用发光试剂缓冲液进行稀释,得到发光试剂。
所述吖啶酯标记用缓冲液包括浓度为0.02M-0.2M的碳酸氢钠缓冲液,pH为8.5。
所述吖啶酯分子溶液为吖啶酯DMF溶液。
所述发光试剂缓冲液包括PB缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、防腐剂。
多克隆MMP-7抗体用吖啶酯标记用缓冲液稀释后的多克隆MMP-7抗体溶液浓度为0.1mg/mL~2mg/mL。
超滤离心在超滤离心管中进行,超滤离心的条件为6000至10000rpm,2至5℃,重复2至3次。
吖啶酯与多克隆MMP-7抗体结合时,控制吖啶酯与多克隆MMP-7抗体的摩尔比为(5-50):1。
所述混匀为置于混匀器上混匀0.5~2h。
所述赖氨酸缓冲液用吖啶酯标记用缓冲液配置,赖氨酸浓度为0.01%至0.1%。赖氨酸缓冲液的加入量与多克隆MMP-7抗体质量相同。
混匀后的吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体可以用脱盐柱进行纯化,通过脱盐处理去除未结合的吖啶酯分子。
采用本发明试剂盒检测MMP-7的方法,将捕获试剂、发光试剂、磁分离试剂放入全自动化学发光免疫分析仪,全自动化学发光免疫分析仪对样本中的MMP-7蛋白浓度进行自动检测。
本发明试剂盒检测MMP-7的方法中,将捕获试剂、发光试剂、磁分离试剂依次放入全自动化学发光免疫分析仪,全自动化学发光免疫分析仪对样本中的MMP-7蛋白浓度进行自动检测,捕获试剂、发光试剂、磁分离试剂的加入顺序为在加入样本后,先加入捕获试剂、发光试剂,再加入磁分离试剂。
优选地,磁分离试剂在捕获试剂和发光试剂加入15-30分钟后加入。
优选地,激发液及预激发液在磁分离试剂加入5-10分钟后加入。
本发明涉及的百分比中,固体物质为质量百分比;液体物质为体积百分比。
本发明MMP-7检测试剂盒采用了特定的组分、浓度、配比,使得试剂盒无需手动加样,全部检测过程在仪器内完成。
试剂盒采用生物素-链霉亲和素级联放大体系,使用表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒作为固相载体,通过链霉亲和素和生物素的超强结合力起到固定免疫复合物的作用,目前市场上尚未有厂家开发出针对MMP-7蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒。
本试剂盒采用双抗体夹心法,以标记有生物素的MMP-7单抗作为捕获试剂,以标记有吖啶酯的MMP-7多抗作为发光试剂,以表面连接有链霉亲和素官能团的磁微粒作为固相载体。
反应包括以下步骤,第一步将样本与捕获试剂及发光试剂进行孵育,MMP-7抗体能够特异性识别样本中的MMP-7抗原,形成抗体-抗原-抗体的三明治样免疫复合物。第二步加入磁分离试剂,借助生物素和链霉亲和素之间的强大亲和力将免疫复合物固定在固相载体表面,通过清洗去除其余未反应物质。最后加入预激发液和激发液,使吖啶酯产生光子,其光子数与样本中的MMP-7蛋白含量呈线性相关。将光子数代入校准曲线内即可计算出样本内MMP-7的浓度。
本发明磁分离试剂采用自配的磁分离试剂缓冲液稀释磁微粒,具有良好的分散性及稳定性,本底低且信噪比好,与检测项目有着良好的适配性。加入的免疫阻断剂减少了非特异性吸附,避免了内源性干扰,提高了检测的特异性和灵敏性。免疫阻断剂MAK-33-IgGpoly的加入增加了磁微粒化学发光法检测MMP-7的信噪比。
吖啶酯分子作为发光试剂在加入激发液后生成极不稳定的N-甲基吖啶酮,释放光子回到基态,其释放的光子作为反应信号被收集。
本发明加入吖啶酯分子溶液混匀后,继续加入0.01%至0.1%的赖氨酸缓冲液有效地封闭了未占据的结合位点,提高了检测的灵敏度。
本发明检测MMP-7蛋白时,使用特定的单克隆MMP-7抗体作为捕获抗体,使用特定的多克隆MMP-7抗体作为检测抗体,抗原抗体结合的空间位阻小,检测灵敏度高。
本发明试剂盒测定样本时,不需要对样本进行手动稀释,患儿的真空采血管可直接上机进行检测,进一步的避免了人工稀释样本造成的误差。
本发明试剂盒性能稳定、灵敏度高、线性范围宽,操作便捷,临床实用性强,能够帮助检验科人员迅速的测定体外血清样本中MMP-7蛋白的浓度,有力的推广了该标志物在临床上的检测。检测过程只需要27分钟即可得到检测报告,全程无需人员操作,且数据无需人工处理。
附图说明
图1为本发明试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪上的校准曲线。
图2为本发明试剂盒的性能评估曲线。
图3为本发明试剂盒临床符合率曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1 本发明试剂盒的组成与制备
磁分离试剂的制备步骤:
(1)配制磁分离试剂缓冲液,包括pH为7.4的PB缓冲液、0.2M的氯化钠、0.05%的表面活性剂(Tween20)、0.2%的防腐剂(Proclin300)、1%牛血清白蛋白、0.01%的免疫阻断剂MAK-33-IgG poly;
(2)取0.5mL链霉亲和素磁珠原液(粒径为1.5μm,表面链霉亲和素载量为800pmoL/mg)于离心管内,置于磁分离器上静置3分钟,随后弃去上清液,加入2mL磁分离试剂缓冲液将磁珠重悬,并反复颠倒混匀20次,再次静置混匀后弃去上清,重复清洗步骤一次;
(3)加入磁分离试剂缓冲液稀释到0.3mg/mL的工作浓度,即得到磁分离试剂。
捕获试剂的制备步骤:
(1)配制生物素标记用缓冲液,包括pH为7.4的PB缓冲液、0.2M的氯化钠;
(2)配制捕获试剂缓冲液,包括pH为7.4的PB缓冲液、0.2M的氯化钠、0.05%的表面活性剂(Tween20)、0.2%的防腐剂(Proclin300)、1%牛血清白蛋白、0.01%的免疫阻断剂MAK-33-IgG poly;
(3)用生物素标记用缓冲液将单克隆MMP-7抗体(小鼠IgG1型抗体,由NS0细胞株产生)复溶、稀释至单克隆MMP-7抗体溶液浓度为0.7mg/mL,将单克隆MMP-7抗体溶液用超滤离心管进行超滤离心,超滤离心条件设定为:8000rpm,4℃,超滤离心次数为2次;
(4)随后将单克隆MMP-7抗体转移至离心管内,按照生物素20倍于单克隆MMP-7抗体的摩尔比向其中加入适宜浓度的生物素分子溶液(10mM的水溶液),置于振荡器上震荡混匀1h;
(5)将标记好的生物素化单克隆MMP-7抗体用脱盐柱进行纯化,通过脱盐处理除去未结合的生物素小分子;
(6)将生物素化单克隆MMP-7抗体用捕获试剂缓冲液进行稀释,稀释比例为1000,即得到捕获试剂。
发光试剂的制备步骤:
(1)配制吖啶酯标记用缓冲液(浓度为0.15M的碳酸氢钠缓冲液,pH为8.5);
(2)配制发光试剂缓冲液,包括pH为7.4的PB缓冲液、0.9%的氯化钠、0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的防腐剂泊洛沙姆及0.1%的防腐剂Proclin300;
(3)用吖啶酯标记用缓冲液将多克隆MMP-7抗体(羊IgG抗体)复溶、稀释至多克隆MMP-7抗体溶液浓度为0.7mg/mL,将多克隆MMP-7抗体溶液用超滤离心管进行超滤离心,超滤离心条件设定为:8000rpm,4℃,超滤离心次数为2次;
(4)随后将多克隆MMP-7抗体转移至离心管内,按照吖啶酯10倍于多克隆MMP-7抗体的摩尔比向其中加入5mM的吖啶酯分子溶液(吖啶酯DMF溶液),置于混匀器上混匀0.5小时;
(5)用吖啶酯标记用缓冲液配置浓度为0.05%的赖氨酸缓冲液,将浓度为0.05%的赖氨酸缓冲液加入离心管,继续震荡混匀0.5h;浓度为0.05%的赖氨酸缓冲液的加入量与多克隆MMP-7抗体质量相同;
(6)将标记好的吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体用脱盐柱进行纯化,通过脱盐处理除去未结合的吖啶酯分子,然后回收抗体;
(7)将吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体用发光试剂缓冲液进行稀释,稀释比例600倍,即得到发光试剂。
校准品的制备步骤:
校准品由校准品缓冲液中添加MMP-7蛋白制备而成。配制校准品缓冲液,该缓冲液为20mM的MES缓冲液,pH在5.5左右,包含10mM氯化钙,150mM氯化钠,1%的牛血清白蛋白,0.1%的Tween20及0.05%的Proclin300,使用该缓冲液溶解MMP-7蛋白并配制成不同浓度的溶液,信号值丰富,信号值与MMP-7蛋白的实际浓度呈线性,基质效应小,是校准品配制的理想缓冲液。
用校准品缓冲液将MMP-7蛋白进行稀释,稀释浓度为16.88ng/mL、32.53ng/mL、63.83ng/mL、126.43ng/mL、251.63ng /mL。使用企业工作校准品对配好的校准品进行赋值,得到产品校准品,以该校准品校准用户测量程序,给临床样本赋值。
质控品的制备步骤:
质控品由质控品缓冲液中添加MMP-7蛋白制备而成。配制质控品缓冲液,该缓冲液为20mM的MES缓冲液,pH在6.0左右,包含10mM氯化钙,150mM氯化钠,1%的牛血清白蛋白,0.1%的Tween20及0.05%的Proclin300,使用该缓冲液溶解MMP-7蛋白并配制成不同浓度的溶液,信号值丰富,信号值与MMP-7蛋白的实际浓度呈线性,基质效应小,是质控品配制的理想缓冲液。
用质控品缓冲液将MMP-7蛋白进行稀释,稀释浓度为16.88ng/mL、32.53ng/mL、63.83ng/mL、126.43ng/mL、251.63ng /mL。
将本发明的试剂盒装入重庆科斯迈生物技术有限公司生产的SMART 500S全自动化学发光免疫分析仪。
检测步骤为:
1)将配制好的捕获试剂、发光试剂、磁分离试剂依次放入与检测仪器配套的试剂容器内,将试剂装载到仪器中,输入项目编号(该编号可自行设定)。样本加样量设置为10μL,加样顺序依次为样本→捕获试剂→发光试剂,孵育15分钟后,再加入磁分离试剂,孵育5分钟后,通过清洗去除其余未反应物质,加入激发液及预激发液;
2)将校准品和质控品放入试剂架内,进行校准质控;
3)校准通过质控合格后,将待测样本放入试剂架内,编辑检测指令后点击确定即可进行检测;
4)选择数据导出或是直接打印检测报告,即可对结果进行分析。
图1中X轴为MMP-7浓度(单位:ng/mL),Y轴为发光值(RLU)。校准曲线与主曲线完全重合。
下表为本发明试剂盒的线性范围。使用零浓度样本对高浓度样本进行梯度稀释,每个浓度样本重复测定3次,对稀释比例和测定结果之间进行多项式拟合,计算相关系数。由结果可知,在0~200ng/mL范围内,分析物浓度与检测信号值之间线性相关。
下表为本发明试剂盒的精密度评估结果。使用本试剂盒分别检测低值和高值样本10次,计算变异系数CV均≤5%,表明产品具有优异的精密度。
下表为本发明试剂盒的抗干扰评估。采用本试剂盒分别检测添加上述干扰物的样本及对照未添加干扰物的样本,计算测定结果的偏倚是否小于产品准确度,由结果可知本产品在上述干扰物的存在下对测定结果无影响。
下表为本发明试剂盒的稳定性评估。将本发明试剂盒置于37℃条件下加速老化7天,取出后与在4℃条件下保存的试剂同时上机检测校准品,计算信号保留率。由结果可知试剂稳定性优越,37℃加速7天后信号值未出现明显下降,平均信号保留率达101.45%。
由图3可知,使用本产品对临床样本进行检测,并与临床诊断结果进行比较。共检测300份临床样本(均有明确临床诊断结果),当取CUTOFF值10-25 ng/mL时,灵敏度达93.66%,特异性达93.67%,AUC为0.960。
采用本发明试剂盒与采用酶联免疫标记法检测MMP-7的试剂盒进行性能比对,结果如下表所示,本发明试剂盒的性能优于酶联免疫吸附法试剂盒。
对比例1
对比例1试剂盒与实施例1基本相同,区别在于:将发光试剂中的多克隆MMP-7抗体替换为兔IgG多克隆MMP-7抗体。
对比例2
对比例2试剂盒与实施例1基本相同,区别在于:将捕获试剂中的单克隆MMP-7抗体替换为小鼠IgG2b型的单克隆MMP-7抗体。
对比例3
对比例3试剂盒与实施例1基本相同,区别在于:将捕获试剂中的单克隆MMP-7抗体替换为小鼠IgG2b型的单克隆MMP-7抗体,将发光试剂中的多克隆MMP-7抗体替换为兔IgG多克隆MMP-7抗体。
对比例4
对比例4试剂盒与实施例1基本相同,区别在于:将发光试剂中的多克隆MMP-7抗体替换为鼠IgG多克隆MMP-7抗体。
本发明抗体对与其他抗体对同时检测临床样本,比较反应性。检测结果表明本发明抗体对在检测临床样本时具有优异的反应性。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括磁分离试剂、捕获试剂、发光试剂,所述磁分离试剂含有表面包被有链霉亲和素官能团的磁微粒,所述捕获试剂含有生物素化单克隆MMP-7抗体,所述发光试剂含有吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体。
2.根据权利要求1所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括校准品、质控品。
3.根据权利要求1所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述多克隆MMP-7抗体为IgG型多克隆MMP-7抗体。
4.根据权利要求1所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述单克隆MMP-7抗体为小鼠IgG1型、小鼠IgG2b型的单克隆MMP-7抗体,所述多克隆MMP-7抗体为小鼠IgG型、兔IgG型、羊IgG型多克隆MMP-7抗体。
5.根据权利要求1所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述捕获试剂中包含捕获试剂缓冲液及生物素化单克隆MMP-7抗体,所述发光试剂中包含发光试剂缓冲液及吖啶酯标记的多克隆MMP-7抗体。
6.根据权利要求5所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述单克隆MMP-7抗体为小鼠IgG1型单克隆MMP-7抗体,所述多克隆MMP-7抗体为羊IgG型多克隆MMP-7抗体。
7.根据权利要求2所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述校准品包括MMP-7蛋白和校准品缓冲液,MMP-7蛋白的浓度为15-18ng/mL、30-35ng/mL、60-70ng/mL、100-150ng/mL、200-300ng/mL,校准品缓冲液包含MES缓冲液、氯化钙、氯化钠、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂。
8.根据权利要求2所述的MMP-7检测试剂盒,其特征在于:所述质控品包括MMP-7蛋白和质控品缓冲液。
9.权利要求1所述的MMP-7检测试剂盒的制备方法,其特征在于:使用单克隆MMP-7抗体作为捕获抗体,使用多克隆MMP-7抗体作为检测抗体。
10.采用权利要求1所述的试剂盒检测MMP-7的方法,其特征在于:将捕获试剂、发光试剂、磁分离试剂放入全自动化学发光免疫分析仪,全自动化学发光免疫分析仪对样本中的MMP-7蛋白浓度进行自动检测。
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Citations (5)
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---|---|---|---|---|
US20100227335A1 (en) * | 2009-03-05 | 2010-09-09 | Becton, Dickinson And Company | Matrix metalloproteinase-7 (mmp-7) monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer |
CN110579609A (zh) * | 2019-07-06 | 2019-12-17 | 湖南莱拓福生物科技有限公司 | Akr1b10化学发光定量检测试剂盒及其应用 |
CN111679086A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-09-18 | 苏州康和顺医疗技术有限公司 | 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法 |
CN112080550A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-12-15 | 山东师范大学 | 一种检测基质金属蛋白酶的生物传感器及应用 |
CN112505319A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-03-16 | 绍兴梅奥心磁医疗科技有限公司 | 一种待检标志物免疫定量检测装置、检测方法及用途 |
-
2022
- 2022-01-11 CN CN202210024013.7A patent/CN114062678A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100227335A1 (en) * | 2009-03-05 | 2010-09-09 | Becton, Dickinson And Company | Matrix metalloproteinase-7 (mmp-7) monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer |
CN110579609A (zh) * | 2019-07-06 | 2019-12-17 | 湖南莱拓福生物科技有限公司 | Akr1b10化学发光定量检测试剂盒及其应用 |
CN111679086A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-09-18 | 苏州康和顺医疗技术有限公司 | 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法 |
CN112080550A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-12-15 | 山东师范大学 | 一种检测基质金属蛋白酶的生物传感器及应用 |
CN112505319A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-03-16 | 绍兴梅奥心磁医疗科技有限公司 | 一种待检标志物免疫定量检测装置、检测方法及用途 |
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