CN103782175A - 胰腺病标记物的检出方法 - Google Patents

Abstract

提供一种用于检出胰腺病标记物的方法，该检出方法可以抑制偶发症状并且得到可靠性高的结果。提供一种胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，通过检出利用抗原抗体反应被固定到固相上的抗原或抗体的测定方法，对采集自被检者的、含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度进行测定；根据前述的胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，所述胰腺病标记物的浓度为规定的阈值以上的场合，判断为所述被检者罹患胰腺病的可能性高。

Description

胰腺病标记物的检出方法

技术领域

本发明涉及对胰腺排出的胰腺病标记物进行安全且高性能检出的方法。

本申请基于2011年9月13日在日本提出的日本特愿2011-199684号主张优先权，在此引用其内容。

背景技术

胰腺癌5年存活率为5%以下，在癌症中是预后最差的一种。其理由，第一可以列举胰腺癌诊察中没有有效的检查方法。第二可以列举胰腺癌的症状在早期难以显现，多数场合下是在胰腺癌进展之后被发现。因此，如果通过在通常的诊察中也可以实施的微创且便捷的方法，能够检出可以治疗的早期胰腺癌，可以期待胰腺癌的预后会大幅度改善。

体液是用于获知脏器状态的重要的生物试样。胰液也是能够获知胰腺状态的重要的生物试样，可以用于细胞诊断、碳酸氢盐测定、细菌检查等。此外，在研究中，也在广泛进行胰腺癌等胰腺相关疾病的新标记物的探索。

作为血清肿瘤标记物已知的CEA（carcinoembryonic antigen）是存在于癌细胞表面的糖蛋白，已知在胰腺癌细胞也高效表达。据报告在临床检查中，通过测定血清中的CEA浓度，可以对癌症的恶性程度进行把握、对治疗效果进行确认。但是，通过测定血清中的CEA不能确定发生了癌变部位的脏器。此外，肿瘤标记物分子的浓度或许由于被全身性血液稀释，胰腺癌的检测灵敏度低，仅为50%左右。

另一方面，报告了在含有胰腺癌细胞的状态下，对从胰腺排出的胰液中的CEA进行测定的研究。例如，Rolny等按照以下说明的方法，开展希望将健康者和慢性胰腺炎患者和胰腺癌患者进行区分的研究(参照非专利文献1)。在该方法中，首先将胰液和胆汁的分泌刺激剂(胰泌素(secretin)及CCK)静脉注射到检查对象。接下来，在透视下通过插入到十二指肠中的探头(Sonde)采集在静脉注射后经过30分钟及45分钟后排出的胰液(胰泌素测试)。最后对这样操作得到的胰液中的CEA进行测定。据报告，在这样的方法中，健康人的CEA浓度为2.3～25ng/mL，胰腺癌患者为50ng/mL左右。但是，这份报告中的胰腺癌患者仅有很少的几例，难以判断准确的值。此外，患有胰腺病以外疾病的患者也有CEA浓度高的场合，在给予分泌刺激剂之后采集的十二指肠液中的CEA浓度高，未必表示存在胰腺癌。此外，Farini等同样地对通过胰泌素测试方法得到的胰液中的CEA浓度进行测定，结果健康人为59～450ng/mL，胰腺癌患者为320～800ng/mL(参照非专利文献2)。即、尽管进行了同样的胰泌素测试，但是在Rolny等得出的结果与Farini等得出的结果中，CEA浓度相差近10倍，存在这样的胰泌素测试得出的胰液检查性能会根据实施形式而存在大的偏差的问题。

受此影响，在非专利文献3及4中，报告了在内窥镜下逆行胰胆管造影（ERCP）时，在胰管内插入导管后，给予胰液排出刺激剂(胰泌素)后10分钟或15分钟采集从胰腺排出的纯胰液，对得到的胰液中的CEA浓度的进行测定的结果。测定的CEA的浓度如下，在非专利文献3中，健康人(对照)为0.1～10ng/mL、胰腺癌患者为1～500ng/mL，在非专利文献4中，健康人(对照)为56±27ng/mL、胰腺癌患者为138±51ng/mL，几乎都是相同的程度。此外，据据报告在胰腺癌的检出性能中灵敏度、特异度也都是高值，分别为为71.4%、为93.3%。即、表示通过将直接在胰管内插入导管采集到的纯胰液作为测定试样，在其他机构中也能得出同样的CEA检查性能。认为这是由于，与前述的胰泌素测试相比，由于直接在胰管内插入导管采集胰液，因此不受胆汁的影响，另外采集手法引起的差异也少。但是，在这种方法中，需要在内窥镜下将导管插入胰管中的方法，需要医师具有较高的技术。此外，由于存在引发检查的偶发症状即急性胰腺炎这样严重症状的风险，因此仅对高度疑似胰腺病的患者实施。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Rolny,等2人,Scandinavian Journal of Gastroenterology,1977年,第12卷,第759-763页.

非专利文献2：Farini等10人,Hepato-Gastroenterology,1980年、第27卷、第213～216页。

非专利文献3：Pancreas，1994年、第9卷、第6号、第741～747页。

非专利文献4：Hepato-Gastroenterology，1999年、第46卷、第31～37页。发明内容

发明要解决的问题

本发明的方式是一种用于检出胰腺病标记物的方法，目的在于提供一种用于抑制偶发症状的风险且得到可靠性高的结果的检出方法。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题进行了锐意研究，结果得出了以下的见解，完成了本发明。不给予胰液排出刺激剂而对十二指肠液中的CEA浓度进行测定的场合，即对自然排出到十二指肠中的胰液中的CEA浓度进行测定的场合，也可以得到与对进行胰液排出刺激后从插入到胰管中的导管直接采集的纯胰液中的CEA浓度进行测定的场合同等的CEA检查性能。

本发明的方式如下所示。

(1)胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，检出采集自被检者的、含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物。

(2)根据前述(1)所述的胰腺病标记物的检出方法，前述的胰腺病标记物的检出中，测定所述标记物的浓度并判断所述浓度是否超过规定的阈值。

(3)根据前述(1)或(2)所述的胰腺病标记物的检出方法，所述胰腺病标记物为CEA。

(4)根据前述(2)所述的胰腺病标记物的检出方法，所述胰腺病标记物为CEA，

所述胰腺病为胰腺癌，

所述阈值为50～200ng/mL范围内的浓度。

(5)根据前述(1)～(4)中任一项所述胰腺病标记物的检出方法，所述十二指肠液是在添加蛋白水解酶抑制剂的状态下进行保存的十二指肠液。

(6)根据前述(1)～(5)中任一项所述胰腺病标记物的检出方法，所述测定方法是免疫层析法或ELISA法。

(7)胰腺病标记物测定试剂盒，其特征在于，其是含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物测定试剂盒，

具有固定有所述胰腺病标记物的第1抗体的膜。

(8)根据前述(7)所述的胰腺病标记物测定试剂盒，进而具有对所述胰腺病标记物进行标记的第2抗体。

(9)根据前述(7)或(8)所述的胰腺病标记物测定试剂盒，所述膜是免疫层析法用的测试条。

(10)根据前述(7)～(9)中任一项所述胰腺病标记物测定试剂盒，进而具有预先收容了蛋白水解酶抑制剂的十二指肠液的保存容器。

(11)根据前述(7)～(10)中任一项所述胰腺病标记物测定试剂盒，所述胰腺病标记物为CEA。

发明的效果

本发明的一个方式的胰腺病标记物的检出方法，可以以与给予胰液排出刺激剂后直接从胰管采集的纯胰液中的CEA浓度测定的场合同样的高精度，不使用胰液排出刺激剂并且不需要向胰管中插入导管，检出CEA等的胰腺病标记物。即、由于没有伴随向胰管插入导管处理的偶发症状的风险，并且与以往的方法相比简便且低成本，因此通过本发明的胰腺病标记物的检出方法，即使对非疑似胰腺病的患者也可以更安全地实施胰液检查。因此，通过本发明的胰腺病标记物的检出方法，可以期待扩大胰腺癌的检查，使其广泛普及。

附图说明

图1是表示实施例1中自然排出的十二指肠液(胰泌素前)和胰泌素刺激后排出的十二指肠液(胰泌素后)的各十二指肠液中的p-淀粉酶浓度的测定结果的图。

图2是表示在实施例1中按照疾病区分的自然排出的十二指肠液中的CEA浓度的图。

图3是表示在实施例1中按照疾病区分的胰泌素刺激后排出的十二指肠液中的CEA浓度的图。

图4是表示在实施例1中按照疾病区分的自然排出(未给予胰泌素)的十二指肠液中的CEA浓度的图。

图5是表示在实施例1中，将自然排出的十二指肠液中的CEA浓度作为识别胰腺癌和良性肿瘤(SCN)的标记物使用的场合的ROC（Receiver OperatingCharacteristic，观测者操作特征）解析结果的图。

具体实施方式

在本发明及本申请说明书中，胰腺病标记物是胰液中包含的蛋白质、核酸、脂质、细胞等各种生物分子，与非胰腺病患者相比，这些生物分子在胰腺病患者胰液中的浓度显著升高。另外，非胰腺病患者不仅包括健康人，也包含患有胰腺病以外疾病的患者。此外，作为胰腺病，可以列举例如胰腺癌、IPMN(胰管内乳头状黏液性肿瘤)、MCN（黏液性囊性肿瘤）、SCN（浆液性囊腺瘤）、NET（胰腺神经内分泌肿瘤）、慢性胰腺炎（CP）、急性胰腺炎等。

所谓胰液是指从胰管排出到十二指肠的肠管内的体液。在十二指肠液(存在于十二指肠的肠管内的肠管液)中除了胰液以外还含有同样从乳头部排出的胆汁、从十二指肠壁排出的十二指肠分泌液、血液等。此外，在本发明及本申请说明书中，所谓自然排出的胰液是指在未给予胰泌素等胰液排出刺激剂的状态下从胰管排出到十二指肠的肠管内的胰液。

由于胰液是消化液，因此含有各种各样的消化酶。已经知道这些消化酶虽然在胰腺内以非活性状态存在，但是在排出到十二指肠后活化。由于这些各种消化酶的活化，胰液中含有的蛋白质、核酸、脂质、细胞等各种生物分子在排出到十二指肠之后被分解、变性。因此，通常认为：在对胰液中的目的生物分子进行检查时，将排出到十二指肠的胰液作为测定试样时，不能进行准确的测定。

因此，以往为了以临床检查所要求的精度对胰液中的胰腺病标记物进行检查，考虑需要向胰腺的乳头部插入导管，从胰管中直接采集排出到十二指肠的肠管之前的纯胰液(例如，参照非专利文献3及4)。此外，在使用十二指肠液作为测定试样的场合，考虑有必要给予胰泌素等胰液排出刺激剂，通过这些刺激向十二指肠排出充分量的胰液(例如，参照非专利文献1及2)。

不同于以往的发现的是，本发明的发明人们发现含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度与通过胰腺排出刺激剂进行刺激后从胰管中直接采集的纯胰液中的胰腺病标记物的浓度同样地反映出是否患有胰腺病/发病风险的大小。即、含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度与非胰腺病患者相比，在胰腺病患者中更高。因此，通过检出采集自被检者十二指肠液中的胰腺病标记物，并且测定其浓度，可以以与已有方法中精度、可靠性最高的方法(将通过胰液排出刺激剂进行刺激后直接从胰管采集的纯胰液作为测定试样的方法)相同程度的高精度调查这些被检者是否患有胰腺病、以及胰腺病的发病风险。

即、本发明的方式的胰腺病标记物的检出方法(以下，称作本发明的胰腺病标记物的检出方法)的特征在于，对含有采集自被检者的、自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度进行测定。在本发明的胰腺病标记物的检出方法中，由于不需要通过胰液排出刺激剂进行刺激，因此可以以更低成本来实施。此外，采集通过胰液排出刺激剂进行刺激后的胰液的场合，一般在刺激后经过30-45分钟后采集胰液，但是在本发明中由于采集的是滞留在十二指肠的肠管内的十二指肠液，可以在更短的时间(例如几分钟～十几分钟左右)进行采集。进一步地，由于不向乳头部的胰管插入导管，因此可以非侵入性且简便地采集作为检出胰腺病标记物用的测定试样的体液。即、本发明的胰腺病标记物的检出方法，由于不存在急性胰腺炎等检查的偶发症状的发病风险，因此从这样的风险考虑，即使对不清楚是否存在胰腺病发病的被检者，也可以更安全地实施此前只能对已经确诊患有胰腺病的患者实施的胰腺病标记物检查。

在本发明的胰腺病标记物的检出方法中使用的十二指肠液是指从未给予胰液排出刺激剂的被检者的十二指肠的肠管内采集的液体。只要是从十二指肠的肠管内的某一位置采集的十二指肠液即可，优选存在于十二指肠的第二部分或第三部分的十二指肠液。这是由于十二指肠的第一部分是直接连接胃幽门的部位，有可能混入胃液，此外难以固定用于采样的内窥镜，有时难以采样等。

十二指肠液的采集方法只要是能够采集十二指肠的肠管内的积液的方法就没有特别的限制。例如，可以通过连接到内窥镜导管的注射器、真空泵等的抽吸手段采集十二指肠液。具体而言，从口腔将内窥镜插入到十二指肠，使用贯穿监视通道而插入的导管抽吸并且采集存在于十二指肠的第二部分、第三部分的十二指肠液。例如，也可以在进行作为所谓胃镜的胃/十二指肠的内窥镜检查(上部内窥镜检查)时，顺便采集积存在十二指肠的肠管内的十二指肠液，对得到的十二指肠液中的胰腺病标记物进行检查。

对于采集到的十二指肠液，优选在采集后随即或在数小时以内实施胰腺病标记物的测定试验，但是也可以将采集后按照规定时间保存的十二指肠液用于疾病标记物的浓度测定试验。关于采集的十二指肠液，可以冷藏或冷冻保存，也可以室温下保存，还可以进行冷冻干燥，作为冷冻粉末进行保存。此外，也可以在将抑制十二指肠液中的消化酶分解那样的物质混合到十二指肠液中的状态下进行保存。具体而言，优选混合与将胰腺病标记物蛋白质分解的蛋白水解酶对应的蛋白水解酶抑制剂，特别优选混合胰液所富含的丝氨酸蛋白酶抑制剂。蛋白水解酶抑制剂等可以在从活体采集十二指肠液之后进行混合，也可以将十二指肠液采集到预先装入蛋白水解酶抑制剂等的容器中。

采集的十二指肠液，可以原样用于胰腺病标记物的测定试验，也可以通过离心分离处理等将细胞等固态成分分离去除之后使用。此外，也可以将用适当缓冲液等对采集的十二指肠液进行稀释后的稀释液、十二指肠液或在其稀释液中添加各种添加剂的物质用于胰腺病标记物的测定试验。作为添加剂，可以列举表面活性剂、蛋白水解酶抑制剂、核酸酶抑制剂、pH调整剂、pH指示剂等。

在本发明的胰腺病标记物的检出方法中检出的胰腺病标记物，只要是与非胰腺病患者相比，在胰腺病患者的胰液中的浓度显著升高的生物分子，就没有特别的限制。在本发明中，胰腺病标记物优选糖蛋白、酶等难以受到十二指肠液中含有的消化酶影响的生物分子。作为在本发明的胰腺病标记物的检出方法中能够检出的胰腺病标记物，可以列举糖蛋白中的CEA、CA19-9（例如，参照非专利文献3等）、MUC-1（KL-6）（例如，参照日本特开2006-308576号公报等）、酶中的MMP2（MatrixMetalloproteinase-2）（例如，参照Pancreas,2002,vol.24,No.4,p344-347。）、MMP7（MatrixMetalloproteinase-7）等此外，还可以列举S100P等在患有胰腺病的患者的胰液中显著升高的物质。

在本发明的胰腺病标记物的检出方法中检出的胰腺病标记物优选为CEA。通过以含有自然排出的胰液的十二指肠液中的CEA浓度为指标，可以调查胰腺癌、IPMN、MCN、慢性胰腺炎及急性胰腺炎等是否存发病、以及发病风险等。

在本发明的胰腺病标记物的检出方法中，利用抗原抗体反应检出十二指肠液中的胰腺病标记物。在利用抗原抗体反应进行检出的场合，使被固定到固相的即胰腺病标记物的抗体(胰腺病标记物为抗体的场合则为抗原)与十二指肠液相接处，形成抗原抗体复合体并且在固相上检出。例如，预先使胰腺病标记物的抗体(胰腺病标记物为抗体的场合则为抗原)固定到固相，使十二指肠液与该固相接触，使固定化的抗体(或抗原)与胰腺病标记物相结合，检出所形成的复合体。相反，预先使十二指肠液中的生物分子固定到固相，使胰腺病标记物的抗体(胰腺病标记物为抗体的场合则为抗原)与该固相接触，使其与被固定化的胰腺病标记物相结合，检出所形成的复合体。

作为将抗原或抗体进行固定的固相，可以列举例如硝酸纤维素膜等高分子膜、琼脂糖凝胶、SDS-PAGE凝胶等凝胶、塑料管、微孔板等容器的内表面、乳胶珠、磁珠等。作为被固定到固相的抗原或抗体所形成的抗原抗体复合体的检出方法，可以列举例如免疫层析法、蛋白质印迹法、斑点印迹法、狭线印迹法（slot blotting）、免疫电泳法、免疫扩散法、ELISA法、使用乳胶珠等的免疫凝集法、使用磁珠的免疫测定法、SPR等。抗原或抗体的固定化方法及这些方法，除了使用十二指肠液作为测定对象、使用胰腺病标记物的抗体(胰腺病标记物为抗体的场合则为抗原)以外，可以按照通用方法实施。

也可以利用抗原抗体反应在液相中检出。在液相中检出的场合，也可以通过FCS、FRET等对已经标记过的抗体与抗原的结合进行测定。

此外，也可以通过TOF-MS等的分子量测定对抗原的存在进行测定。

在本发明的实施形式中，由于迅速且便捷且易于进行定量性检出而优选通过免疫层析法或ELISA法检出胰腺病标记物，更优选通过免疫层析法进行检出。例如，在预先于膜表面上固定有胰腺病标记物的抗体的硝酸纤维素膜上滴加十二指肠液，使该十二指肠液中的胰腺病标记物与被固定化的抗体结合，检出形成的复合体。作为与该复合体进行结合的抗体，通过使用预先以荧光物质、金胶体、酶等进行标记的已标记抗体，可以将该复合体作为条带进行检出。

关于十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度，通过将使用十二指肠液检出的条带浓度与使用已知浓度的胰腺病标记物做成的校准用标准色样进行目视比较，可以进行定性测定。此外，对条带浓度进行光学性测定，通过与使用已知浓度的胰腺病标记物同样地检出的条带浓度进行比较，也可以简便地求出。进一步地，预先做成表示条带浓度与胰腺病标记物浓度之间关系的标准曲线，对使用十二指肠液检出的条带浓度进行光学性测定，通过标准曲线进行换算，也可以求出十二指肠液中的胰腺病标记物浓度。

含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度，存在在胰腺病患者中高于非胰腺病患者的倾向。因此，可以利用被检者的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度，判断该被检者罹患胰腺病的可能性。预先设定区分胰腺病患者和非患病者的阈值，测定被检者的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度，判定该浓度是否为规定阈值以上。该浓度为规定阈值以上的场合，可以判断前述被检者患有胰腺病的可能性高。这样一来，通过对含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度进行测定，与规定的阈值进行比较可以检出胰腺病。

关于区分胰腺病患者和非患病者的阈值，可以考虑胰腺病标记物的种类、胰腺病标记物的检出方法等通过实验进行设定。例如，对从已确认未患有胰腺病的集团采集的十二指肠液和从已确认患有该疾病的集团采集的十二指肠液，应用本发明的检出方法对自然排出的十二指肠液中的胰腺病标记物的浓度进行测定，通过比较这两个集团的测定值，可以进行适当的设定。

例如，以CEA为胰腺病标记物的场合，区分胰腺癌患者和非患病者(良性肿瘤SCN患者)的阈值优选为50～200ng/mL范围的浓度，更优选为100～150ng/mL范围的浓度。通过将阈值设定在这个范围内，以本发明的胰腺病标记物的检出方法，可以以临床上充分的灵敏度及特异度识别被检者是否患有胰腺癌。特别是，不仅能够准确地检出胰腺癌，也能检出成为胰腺癌的风险高的IPMN、成为治疗对象的MCN等，可以广泛地检出无自觉症状的胰腺病。此外，如果CEA浓度为高浓度，则表示是已经进展的胰腺癌的可能性高，因此也可以判断为需要迅速进行精密检查和开始治疗。

具体而言，胰腺病标记物为CEA的场合，在预先在膜表面固定了抗CEA抗体的硝酸纤维素膜(免疫层析)上，将十二指肠液和与被固定化到膜上的抗体的表位部位不同的已经标记过的抗CEA抗体一起滴加，使其在此硝酸纤维素膜的膜表面上形成由被固定化的抗CEA抗体、CEA和已经标记过的抗CEA抗体构成的复合体。形成的条带，可以通过该已标记的抗CEA抗体中的标记，并检出条带。关于免疫层析法中的CEA浓度，也可以与添加了规定浓度CEA的场合下得到的条带所记载的标准色样的条带浓度进行目视比较，通过条带浓度进行定量。此外，对条带浓度进行光学性测定，通过规定的标准曲线等进行换算，也可以换算CEA浓度。例如，将免疫层析上的条带浓度与50ng/mL和200ng/mL的CEA浓度的条带所记载的标准色样进行比较，如果是处于这两个条带之间的浓度，或者比200ng/mL的条带更浓的场合，可以判断为阳性(采集用于测定的十二指肠液的被检者患有胰腺癌、IPMN、MCN、慢性胰腺炎、及急性胰腺炎等胰腺病，特别是患有胰腺癌的可能性高)。

此外，假定在IPMN、MCN等多数为良性疾病的场合CEA浓度比较低，在已经进展的胰腺癌、慢性胰腺炎中CEA浓度高。因此，通过设定适当的阈值，也可以期待对患有胰腺癌以外的特定胰腺病的可能性大小进行判断。

这样一来，通过以免疫层析法这样的快速试剂盒对自然排出的十二指肠液中的CEA浓度进行测定，可以在采集十二指肠液的内窥镜室内迅速且简便地判断阴性、阳性(判断被检者是否患有胰腺病)。因此，通过应用本发明的胰腺病标记物的检出方法，可以安全且高性能地迅速实施胰腺癌筛查，因而，可以在采集十二指肠液之后迅速对进展快、数月致死的胰腺癌的可能性进行判断，可以通过迅速地驱使进行精密检查、进行预约，迅速开始胰腺癌的治疗。

通过将用于检出十二指肠液中的胰腺病标记物的方法中使用的试剂/装置等进行试剂盒化，可以更简便地实施本发明的胰腺病标记物的检出方法。作为本发明的其他方式的、含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物测定试剂盒(以下，称作本发明的胰腺病标记物测定试剂盒)，优选包含：预先固定有胰腺病标记物的抗体的固相，例如胰腺病标记物的第1抗体固相化而成的膜。作为这样的膜，可以列举例如，免疫层析用测试条。作为该测定试剂盒，也优选具有对胰腺病标记物进行标记的第2抗体。此外，作为该测定试剂盒，进而也可以具有预先收容有蛋白水解酶的十二指肠液保存容器。

实施例

接下来，示出实施例等对本发明进一步进行说明，但是本发明并不限定于以下的实施例。

实施例1

从疑似患有胰腺病的73例患者中采集十二指肠液，测定CEA浓度。

对整晚禁食的患者，将内窥镜插入到十二指肠的第二部分，使用胰管造影用导管(奥林巴斯公司产品、产品名：PR-130Q)采集第二部分、第三部分的全部十二指肠壁薄薄残留的十二指肠液。通过抽动连接到导管的内窥镜外的近身侧的注射器进行采集。2-3分钟左右可以采集平均1mL左右的十二指肠液。在十二指肠的第一部分，内窥镜脱落向胃侧，不能进行稳定地采集。

采集自然排出的十二指肠液之后，对73例中的47例进一步静脉注射胰泌素(ChiRhoClin公司产品)，在2-3分钟后，同样采集在第二部分、第三部分的全部十二指肠壁薄薄残留的十二指肠液。在胰泌素刺激后，可以在2-3分钟左右采集约1.5mL-约2mL的十二指肠液。

然后，对各患者进一步实施影像诊断或病理检查，进行最终诊断。最终诊断的结果如下，73例中胰腺癌41例，IPMN17例，MCN2例，SCN6例，NET3例，慢性胰腺炎（CP）4例。在73例中，可以采集到自然排出的十二指肠液和胰泌素刺激后的十二指肠液的47例患者中，胰腺癌29例、IPMN7例、MCN2例、SCN3例、NET1例、慢性胰腺炎（CP）1例。

对采集自可以采集到自然排出的十二指肠液和胰泌素刺激后的十二指肠液的47例患者的2种十二指肠液(自然排出的十二指肠液和胰泌素刺激后的十二指肠液)中的p-淀粉酶浓度及CEA浓度分别进行测定。p-淀粉酶浓度可以通过酶法(Gal-G2-CNP底物法)进行测定。此外，CEA浓度可以使用市售的试剂盒(IBL公司产品)通过ELISA法进行测定。

图1是表示对可以采集自然排出的十二指肠液(胰泌素前)和胰泌素刺激后排出的十二指肠液(胰泌素后)的47例患者的各十二指肠液中的p-淀粉酶浓度进行测定的结果图。发现即使是给予胰泌素之前的十二指肠液，也含有与给予胰泌素后的十二指肠液几乎相同程度的p-淀粉酶。p-淀粉酶是来自胰液的物质，来自胰腺的胰液自然排出到十二指肠液中，因此包含该物质，确认了从自然排出的十二指肠液中也可以检出来自胰液的成分。

图2、图3及表1是表示按照疾病区分的可以采集到自然排出的十二指肠液和胰泌素刺激后的十二指肠液的47例患者的十二指肠液中的CEA浓度。图2是表示自然排出的十二指肠液中的CEA浓度，图3是表示胰泌素刺激后排出的十二指肠液中的CEA浓度。结果，按照疾病区分的十二指肠液中的CEA浓度，在自然排出(未给予胰泌素)的十二指肠液与胰泌素刺激后排出的十二指肠液中的浓度几乎是同等程度。此外，即使与非专利文献4等此前的报告进行比较，在本实施例中的自然排出(未给予胰泌素)的十二指肠液中的CEA浓度也与在乳头部实施套管插入术采集的纯胰液的CEA浓度为同样的浓度范围。根据这些结果，发现即使对自然排出的十二指肠液中的CEA浓度进行测定的场合，也能得到与测定纯胰液的CEA浓度的场合同样的胰腺病识别效果。

表1

对于73例自然排出(未给予胰泌素)的十二指肠液中的CEA浓度，将十二指肠液中的CEA浓度按照疾病区分而示于图4及表2。

此外，几乎与图2同样，十二指肠液的CEA浓度因胰腺癌而升高，作为胰腺病治疗对象的IPMN、慢性胰腺病（CP）也显示为高值。关于NET，结果是与良性NET的数据相比恶性NET的CEA浓度高。作为进展检测对象的良性肿瘤的SCN为低值，结果几乎与图2一致。因此，为了调查自然排出的十二指肠液中的CEA浓度是否可以用作用于区别胰腺癌与良性肿瘤(本发明中SCN)的标记物，进行ROC（Receiver Operating Characteristic）解析。ROC解析，使用PASWstatistics ver.18（IBM产品）作图。解析结果如图5所示。结果，用于将胰腺癌区别为良性肿瘤的截断值(阈值)与纯胰液中的CEA浓度、给予胰泌素后采集的十二指肠液中的CEA浓度几乎相同。本实施例中的胰腺癌的检出灵敏度为71％、特异度为100％，这些值更优于过去报告中以纯胰液的CEA浓度为指标的场合。

表2

接下来，把用于区别胰腺癌和良性肿瘤的截断值设定为30-250ng/mL的范围内，计算出各个截断值对应的灵敏度及特异度。计算结果如表3所示。结果，在将截断值设定为100-150ng/mL的场合，即使特异度为80%以上，灵敏度也为70%以上，能得到作为检查来说具有利用价值的灵敏度。此外，在设定该截断值的场合，从MCN等疾病检出胰腺癌也成为可能，可以期待胰腺癌特异度更高的检查。此外，不仅是胰腺癌，对于NET也可以期待能进行良性恶性的判断。另一方面，如果将截断值设定为50ng/mL，则特异度为50％，虽然这比设定为100-150ng/mL的场合减半，但是敏感度为93%，可以实施敏感度非常高的胰腺癌检查。

表3

实施例2

使用市售的CEA免疫层析试剂盒(产品名：Rana Manmo Card CEA、日本化药公司产品)，检出实施例1中使用的自然排出的十二指肠液被检体中的CEA。关于CEA浓度，将从各十二指肠液被检体检出的免疫层析的条带浓度与该试剂盒附带的条带的标准色样进行比较，目视判定。

结果，发现与标准色样的100ng/mL及400ng/mL进行比较的场合的十二指肠液被检体的条带浓度，与通过ELISA得到的CEA浓度的测定值存在相关性，确认十二指肠液中的CEA浓度也可以通过免疫层析法进行测定。

实施例3

在连接到导管的内窥镜外的近身侧的注射器中预先置入蛋白水解酶抑制剂(产品名：Complete、Roche公司产品)，通过该导管从实施例1的47例患者中抽吸十二指肠液。被抽吸的十二指肠液在注射器内与蛋白水解酶抑制剂混合后，转移到管中并且冷冻保存。作为对照，将通过未预先在注射器内置入蛋白水解酶抑制剂的导管采集的十二指肠液同样地转移到管中并且冷冻保存。

对保存后的各十二指肠液的CEA浓度及S100P浓度进行测定。与实施例1同样对CEA浓度进行测定。此外，关于S100P浓度，可以使用市售的试剂盒(CycLex公司产品)通过ELISA法对进行测定。

表4

表5

按照疾病区分的十二指肠液中的CEA浓度及S100P浓度的测定结果如表4及5所示。结果，发现CEA浓度在添加蛋白水解酶抑制剂进行保存的十二指肠液(表4中，“有抑制剂”)和未添加蛋白水解酶抑制剂进行保存的十二指肠液(表4中，“无抑制剂”)中几乎没有差异。另一方面，S100P浓度在添加蛋白水解酶抑制剂进行保存的十二指肠液(表5中，“有抑制剂”)中显著高于在未添加蛋白水解酶抑制剂进行保存的十二指肠液(表5中，“无抑制剂”)中的浓度。如果对各个病例进行确认，因无抑制剂而不能测定的被检体有很多变成可以进行测定的病例。根据这些结果，可以确认以S100P作为胰腺病标记物的场合，通过在从活体采集的十二指肠液中预先混合蛋白水解酶抑制剂，由于在测定S100P的浓度之前能够抑制该十二指肠液中的S100P的消化，因此提高了S100P的检出精度。

产业上的可利用性

本发明的胰腺病标记物的检出方法，除了没有急性胰腺炎发病的风险等、具有安全性以外，可以与对进行胰液排出刺激之后通过插入胰管中的导管直接采集的纯胰液中的CEA浓度进行测定的场合时的同等精度检出胰腺病标记物，因此，可以用于对胰液进行解析的领域，特别是可以用于临床检查等领域。

Claims (11)

1.胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，检出采集自被检者的、含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物。

2.根据权利要求1所述胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，所述胰腺病标记物的检出中，测定所述标记物的浓度并判断所述浓度是否为规定的阈值以上。

3.根据权利要求1或2所述胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，所述胰腺病标记物为CEA。

4.根据权利要求2所述胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，所述胰腺病标记物为CEA，

所述胰腺病为胰腺癌，

所述阈值为50～200ng/mL范围内的浓度。

5.根据权利要求1～4中任一项所述胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，所述十二指肠液是在添加蛋白水解酶抑制剂的状态下进行保存的十二指肠液。

6.根据权利要求1～5中任一项所述胰腺病标记物的检出方法，其特征在于，所述测定方法是免疫层析法或ELISA法。

7.胰腺病标记物测定试剂盒，其特征在于，其是一种含有自然排出的胰液的十二指肠液中的胰腺病标记物测定试剂盒，

具有固定有所述胰腺病标记物的第1抗体的膜。

8.根据权利要求7所述胰腺病标记物测定试剂盒，其特征在于，进而具有对所述胰腺病标记物进行标记的第2抗体。

9.根据权利要求7或8所述胰腺病标记物测定试剂盒，其特征在于，所述膜是免疫层析法用的测试条。

10.根据权利要求7～9中任一项所述胰腺病标记物测定试剂盒，其特征在于，进而具有预先收容了蛋白水解酶抑制剂的十二指肠液的保存容器。

11.根据权利要求7～10中任一项所述胰腺病标记物测定试剂盒，其特征在于，所述胰腺病标记物为CEA。

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