JPH08160047A - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
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- JPH08160047A JPH08160047A JP29760994A JP29760994A JPH08160047A JP H08160047 A JPH08160047 A JP H08160047A JP 29760994 A JP29760994 A JP 29760994A JP 29760994 A JP29760994 A JP 29760994A JP H08160047 A JPH08160047 A JP H08160047A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】膵疾患に対する、より精度の高い新たな免疫学
的測定方法を見つけることを目的とした。 【構成】胎児性膵蛋白質と反応する単一のモノクローナ
ル抗体Ｍ128-Ｆを利用することにより、感度、特異度共
に優れた免疫学的膵疾患測定方法を提供する。
的測定方法を見つけることを目的とした。 【構成】胎児性膵蛋白質と反応する単一のモノクローナ
ル抗体Ｍ128-Ｆを利用することにより、感度、特異度共
に優れた免疫学的膵疾患測定方法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は胎児性膵蛋白質(Feto ac
iner Pancreatic protein)(以下ＦＡＰと称す）に対す
るモノクローナル抗体を利用する、免疫学的膵疾患測定
方法に関する。
iner Pancreatic protein)(以下ＦＡＰと称す）に対す
るモノクローナル抗体を利用する、免疫学的膵疾患測定
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】膵癌の予後は極めて悪く、種々の画像診
断の発達にもかかわらず、今日なお、消化器癌の中でも最
も診断困難な疾患である。 確定診断時には手遅れのこと
が多く、70％以上が切除不能例であり、根治手術例ですら
生存率は不良である。 従って早期診断が不可欠であり良
質の膵腫瘍マーカーに対する期待大なるものがある。
断の発達にもかかわらず、今日なお、消化器癌の中でも最
も診断困難な疾患である。 確定診断時には手遅れのこと
が多く、70％以上が切除不能例であり、根治手術例ですら
生存率は不良である。 従って早期診断が不可欠であり良
質の膵腫瘍マーカーに対する期待大なるものがある。
【０００３】KoprowskiらによるCA19.9をはじめとして
数多くの腫瘍マーカーが発表されてきている。 1984年に
Benediらが、syrian qolden hamsterで膵に特異的な胎児
抗原を発見し、続いてEscribanoらはヒトにも同様な抗原
が存在することを確認し、ヒト胎児膵抽出物を免疫原と
してマウスモノクローナル抗体(Ｊ−２８）を作製した
(Int.J.Cancer,38:155,1986)。
数多くの腫瘍マーカーが発表されてきている。 1984年に
Benediらが、syrian qolden hamsterで膵に特異的な胎児
抗原を発見し、続いてEscribanoらはヒトにも同様な抗原
が存在することを確認し、ヒト胎児膵抽出物を免疫原と
してマウスモノクローナル抗体(Ｊ−２８）を作製した
(Int.J.Cancer,38:155,1986)。
【０００４】この抗体により認識される分子量110K.Da
の糖蛋白をFeto aciner Pancreaticprotein(ＦＡＰ)と
呼び、今まで諸家により報告されているＰＯＡとは分子
量においても、免疫組織学的検索においても全く異なる
新しい抗原である。 ＦＡＰの特徴は次の通りである。
(1)膵以外の臓器には認められず、膵特異性が非常に強
い。(2)胎児膵20-24週をピークとして発現し、それ以降漸
減し、成人の膵ではラ氏島周囲の腺房細胞を除きほとん
ど存在しない。 (3)膵病変時、特に膵癌において癌に隣接
する腺房細胞に強く再発現してくるもので、血清、膵液中
にも流出する。 従って、ＦＡＰは膵疾患、特に膵癌の新
しい腫瘍マーカーとして期待されている。
の糖蛋白をFeto aciner Pancreaticprotein(ＦＡＰ)と
呼び、今まで諸家により報告されているＰＯＡとは分子
量においても、免疫組織学的検索においても全く異なる
新しい抗原である。 ＦＡＰの特徴は次の通りである。
(1)膵以外の臓器には認められず、膵特異性が非常に強
い。(2)胎児膵20-24週をピークとして発現し、それ以降漸
減し、成人の膵ではラ氏島周囲の腺房細胞を除きほとん
ど存在しない。 (3)膵病変時、特に膵癌において癌に隣接
する腺房細胞に強く再発現してくるもので、血清、膵液中
にも流出する。 従って、ＦＡＰは膵疾患、特に膵癌の新
しい腫瘍マーカーとして期待されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】血清、膵液中のＦＡＰ
の測定は、従来、モノクローナル抗体Ｊ−２８による、ラ
ジオイムノアッセイ競合法によって行われていた(Briti
sh J.Cancer,56:495,1987)。 ラジオイムノアッセイ競合
法はラジオアイソトープを用いる方法であるため、特定
の試験施設、設備を使用しなければならず、また廃棄等も
自由に行えないという問題点があった。又、競合法は感
度が低く、感度が高いサンドイッチ法が好ましい。
の測定は、従来、モノクローナル抗体Ｊ−２８による、ラ
ジオイムノアッセイ競合法によって行われていた(Briti
sh J.Cancer,56:495,1987)。 ラジオイムノアッセイ競合
法はラジオアイソトープを用いる方法であるため、特定
の試験施設、設備を使用しなければならず、また廃棄等も
自由に行えないという問題点があった。又、競合法は感
度が低く、感度が高いサンドイッチ法が好ましい。
【０００６】ラジオイムノアッセイ法や酵素免疫法は操
作が煩雑でしかも試薬は高価である。そこで免疫法の中
でも操作が簡便で試薬価格が安い、凝集法が広く用いら
れている。そのためには、いずれの場合もエピトープの
異なる抗体２種以上を用いることが必要であった。
作が煩雑でしかも試薬は高価である。そこで免疫法の中
でも操作が簡便で試薬価格が安い、凝集法が広く用いら
れている。そのためには、いずれの場合もエピトープの
異なる抗体２種以上を用いることが必要であった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、サンドイッチ酵素免疫法又は免疫凝集
反応法によるＦＡＰの測定が可能な新たなモノクローナ
ル抗体の作製と該モノクローナル抗体を用いたＦＡＰ測
定法を鋭意研究し、本発明を完成した。
解決するために、サンドイッチ酵素免疫法又は免疫凝集
反応法によるＦＡＰの測定が可能な新たなモノクローナ
ル抗体の作製と該モノクローナル抗体を用いたＦＡＰ測
定法を鋭意研究し、本発明を完成した。
【０００８】先ずＦＡＰに対するモノクローナル抗体を
作成することから始めた。 Lymphocyto hybridomas in C
urrent Topics in Microbiology and Immunology 81,27
-36,1976 に示される方法により調整したＦＡＰを免疫
原として、Balb/Cマウスに免疫し、その脾細胞とマウス骨
髓腫細胞(X63-Ag-8-653)を細胞融合し、ＦＡＰと特異的
に反応するモノクローナル抗体Ｍ128-Ｆを産生するセル
ライン(ハイブリドーマＭ128-Ｆ)を確立した。 ハイブリ
ドーマＭ128-Ｆは工業技術院生命工学工業技術研究所に
FERM P-12135として寄託されている。
作成することから始めた。 Lymphocyto hybridomas in C
urrent Topics in Microbiology and Immunology 81,27
-36,1976 に示される方法により調整したＦＡＰを免疫
原として、Balb/Cマウスに免疫し、その脾細胞とマウス骨
髓腫細胞(X63-Ag-8-653)を細胞融合し、ＦＡＰと特異的
に反応するモノクローナル抗体Ｍ128-Ｆを産生するセル
ライン(ハイブリドーマＭ128-Ｆ)を確立した。 ハイブリ
ドーマＭ128-Ｆは工業技術院生命工学工業技術研究所に
FERM P-12135として寄託されている。
【０００９】そのモノクローナル抗体の免疫学的性状に
ついては、SDS-PAGE(免疫実験法、西村書店、1985)、ウェス
タン・ブロッティング(免疫実験法、西村書店、1985)及び
免疫組織染色(検査室ルーチンとしての免疫組織学、モダ
ンメデア、32(11):586-596,1986)にて検索した。
ついては、SDS-PAGE(免疫実験法、西村書店、1985)、ウェス
タン・ブロッティング(免疫実験法、西村書店、1985)及び
免疫組織染色(検査室ルーチンとしての免疫組織学、モダ
ンメデア、32(11):586-596,1986)にて検索した。
【００１０】モノクローナル抗体Ｍ128-Ｆの性質は以下
に示すとおりである。 (1)IgG1サブクラスに属す。(2)膵
疾患者膵液を抗原として、還元条件下でのSDS-PAGE、ウェ
スタンブロッティングを行ったところ、 モノクローナル
抗体Ｍ128-Ｆは、分子量110キロダルトンの分子を認識し
た。 (3)過ヨウ素酸、プロテアーゼ、あるいはトリプシン
処理を施し、エピトープの性状を検討した。 対応抗原の
エピトープの性状は、トリプシン、プロテアーゼにて減弱
し、過ヨウ素酸に抵抗性を示すところから、ＦＡＰの蛋白
部分と考えられる。
に示すとおりである。 (1)IgG1サブクラスに属す。(2)膵
疾患者膵液を抗原として、還元条件下でのSDS-PAGE、ウェ
スタンブロッティングを行ったところ、 モノクローナル
抗体Ｍ128-Ｆは、分子量110キロダルトンの分子を認識し
た。 (3)過ヨウ素酸、プロテアーゼ、あるいはトリプシン
処理を施し、エピトープの性状を検討した。 対応抗原の
エピトープの性状は、トリプシン、プロテアーゼにて減弱
し、過ヨウ素酸に抵抗性を示すところから、ＦＡＰの蛋白
部分と考えられる。
【００１１】後述するように、Ｍ128-Ｆ抗体はサンドイ
ッチ酵素免疫測定法に使用する場合、固定化抗体と標識
抗体の両方にＭ128-Ｆ抗体を利用しＦＡＰを実用的に測
定できることが判明した。これはＦＡＰ分子内にＭ128-
Ｆ抗体が認識する同一エピトープが複数存在することを
示唆しており、ラテックス（Latex）などの担体を用い
た凝集反応に適したモノクローナル抗体である。
ッチ酵素免疫測定法に使用する場合、固定化抗体と標識
抗体の両方にＭ128-Ｆ抗体を利用しＦＡＰを実用的に測
定できることが判明した。これはＦＡＰ分子内にＭ128-
Ｆ抗体が認識する同一エピトープが複数存在することを
示唆しており、ラテックス（Latex）などの担体を用い
た凝集反応に適したモノクローナル抗体である。
【００１２】
実施例１ ＦＡＰの測定は、ＦＡＰを認識するモノクローナル抗体
Ｍ128-Ｆを用いたSandwich EIAとした。 96穴プレート
(ヌンク社EIA用)に精製Ｍ128-Ｆ抗体を固定し、20％ＦＣ
Ｓを含むＰＢＳでブロッキングして抗体結合プレートを
作製した。 次に検体(ヒト血清)100μlを入れ、室温2時間
反応させた。 洗浄後、peroxidase標識Ｍ128-Ｆ抗体100μ
l加え、4℃で一晩反応させる。洗浄後、o-phenylenediami
neにて発色後、490ｎｍにて吸光度を測定した。 標準ＦＡ
Ｐ溶液は、膵癌患者より得られた膵液を用い、希釈して標
準曲線を作製した。 ２16倍希釈液中に含まれるＦＡＰ量
を５Ｕ/mlとした。 結果を表１及び表２に示す。
Ｍ128-Ｆを用いたSandwich EIAとした。 96穴プレート
(ヌンク社EIA用)に精製Ｍ128-Ｆ抗体を固定し、20％ＦＣ
Ｓを含むＰＢＳでブロッキングして抗体結合プレートを
作製した。 次に検体(ヒト血清)100μlを入れ、室温2時間
反応させた。 洗浄後、peroxidase標識Ｍ128-Ｆ抗体100μ
l加え、4℃で一晩反応させる。洗浄後、o-phenylenediami
neにて発色後、490ｎｍにて吸光度を測定した。 標準ＦＡ
Ｐ溶液は、膵癌患者より得られた膵液を用い、希釈して標
準曲線を作製した。 ２16倍希釈液中に含まれるＦＡＰ量
を５Ｕ/mlとした。 結果を表１及び表２に示す。
【００１３】同一検体中のＣＡ19-9、ＣＥＡは市販のEIA
キット(IMNOCLON E19-9,INZYMECEA;富士レビオ)を用い
測定した。 測定値は癌を含む膵疾患の病理診断をゴー
ルドスタンダードとし、 各々のマーカーの特異度、感度
を比較した。
キット(IMNOCLON E19-9,INZYMECEA;富士レビオ)を用い
測定した。 測定値は癌を含む膵疾患の病理診断をゴー
ルドスタンダードとし、 各々のマーカーの特異度、感度
を比較した。
【００１４】
【表１】 疾患に対する各マーカーの測定による陽性数 ＦＡＰ ＣＡ１９−９ ＣＥＡ Cut-off値(U/ml) 5 11 20 50 37 50 2.5 5.0 例数 膵癌 35 27 25 21 18 24 24 18 15 胆管癌 8 7 6 6 2 6 5 3 2 乳頭部癌 5 3 3 2 1 3 3 2 1 大腸癌 24(1) 3(1) 3(1) 1(1) 1(1) 9(1) 7(1) 14(1) 11(1) 胃癌 17 1 0 0 0 3 2 3 2 乳癌 23 4 3 2 1 4 3 7 5 肺癌 17 3 2 1 1 4 3 11 10 肝癌 13 4 2 1 0 7 4 3 1 子宮癌 17 3 2 1 0 1 0 2 1 前立腺癌 10 2 2 1 1 3 1 2 1 卵巣癌 3(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 0 0 0 0 膀胱癌 4 0 0 0 0 1 1 0 0 食道癌 3 2 1 1 0 0 0 0 0 腎臓癌 1 0 0 0 0 0 0 1 0 甲状腺癌 3 1 1 1 1 2 2 1 0 慢性膵炎 18 11 9 8 8 7 6 6 3 ＣＭＬ 2 1 1 1 0 0 0 0 0 糖尿病 35 8 4 1 0 10 8 8 2 肝硬変 15 6 5 5 3 4 3 4 0 肝炎 21 8 6 6 2 3 2 0 0 ＲＡ 23 9 7 3 3 1 0 0 1 その他 27 6 4 1 1 3 1 0 1 健常者 23 1 0 0 0 2 0 3 2 計 347 111 87 64 44 97 75 78 58 （ ）：膵臓への浸潤が認められたもの。
【００１５】
【表２】 Cut off値 陽性率 感度 特異度 陽性反応適中度 尤度比TPR/FPR ＦＡＰ ≧5 32.0 72.7 75.7 36.0 2.99 ≧11 25.1 65.5 82.5 41.4 3.75 ≧20 18.4 56.4 87.3 45.5 4.45 ≧50 12.7 50.9 94.5 63.6 9.29 CA19-9 ≧37 28.0 58.2 77.7 33.0 2.61 ≧50 21.6 56.4 84.9 41.3 3.73 ＣＥＡ ≧2.5 22.5 45.5 77.7 27.8 1.98 ≧5.0 16.7 34.5 87.3 33.9 2.72 感度：実際に疾患を有する者のうち検査陽性者の割合。 特異度：疾患の無い人に対する検査が陰性とでた人の割
合。 陽性反応適中度：検査結果陽性とでた者の中で真に疾患
を有する者の割合。 尤度比(Likelihood ratio;LR): 疾患の無い者の陽性率
に対し、疾患の有る者の陽性となる確率の大きさ。
合。 陽性反応適中度：検査結果陽性とでた者の中で真に疾患
を有する者の割合。 尤度比(Likelihood ratio;LR): 疾患の無い者の陽性率
に対し、疾患の有る者の陽性となる確率の大きさ。
【００１６】実施例２ １）２種のモノクローナル抗体Ｊ−２８とＭ１２８−Ｆ
を用いたサンドイッチＥＩＡ。ポリスチレンビーズに精
製Ｊ−２８抗体（２０μｇ／ｍｌ）をcoatingし、２０
％ＦＣＳを含むＰＢＳにてbrockingして抗体結合ビーズ
を作製した。次に検体（血清）１００μｌとＰＢＳ１０
０μｌを入れ４℃、一夜ビーズと反応させた。洗浄後、
peroxidase標識Ｍ１２８−Ｆ抗体にて６０分反応させ、
o-phenylenediamineにて発色後、４９０ｎｍにて吸光度
を測定した。標準ＦＡＰ溶液は、膵癌患者より得られた
膵液を用い、倍々希釈して標準曲線を作製した。
を用いたサンドイッチＥＩＡ。ポリスチレンビーズに精
製Ｊ−２８抗体（２０μｇ／ｍｌ）をcoatingし、２０
％ＦＣＳを含むＰＢＳにてbrockingして抗体結合ビーズ
を作製した。次に検体（血清）１００μｌとＰＢＳ１０
０μｌを入れ４℃、一夜ビーズと反応させた。洗浄後、
peroxidase標識Ｍ１２８−Ｆ抗体にて６０分反応させ、
o-phenylenediamineにて発色後、４９０ｎｍにて吸光度
を測定した。標準ＦＡＰ溶液は、膵癌患者より得られた
膵液を用い、倍々希釈して標準曲線を作製した。
【００１７】２）モノクローナル抗体Ｊ−２８の代わり
にＭ１２８−Ｆを使う以外（即ちＭ１２８−Ｆ抗体単一
使用）は実施例２の１）と同様の方法によりサンドイッ
チＥＩＡを行った。その結果、Ｍ１２８−Ｆ抗体を単一
で用いたサンドイッチＥＩＡは、Ｊ−２８抗体及びＭ１
２８−Ｆ抗体を用いたサンドイッチＥＩＡより同等以上
の感度を示した。実施例２の１）及び２）において作製
した標準曲線を
にＭ１２８−Ｆを使う以外（即ちＭ１２８−Ｆ抗体単一
使用）は実施例２の１）と同様の方法によりサンドイッ
チＥＩＡを行った。その結果、Ｍ１２８−Ｆ抗体を単一
で用いたサンドイッチＥＩＡは、Ｊ−２８抗体及びＭ１
２８−Ｆ抗体を用いたサンドイッチＥＩＡより同等以上
の感度を示した。実施例２の１）及び２）において作製
した標準曲線を
【図１】に示す。
【００１８】
【発明の効果】本発明により胎児性膵蛋白質(ＦＡＰ）
と反応する単一のモノクローナル抗体を利用することが
できるため、免疫学的膵疾患測定試薬を作るうえで簡便
かつ安いコストでできる。ＦＡＰを膵疾患測定のマーカ
ーとすることは従来のマーカーであるCA19-9やＣＥＡよ
りも総合的に優れていると考える。又、ＦＡＰとCA19-9
を膵癌に対するcombination assayは臨床上極めて有用
である。
と反応する単一のモノクローナル抗体を利用することが
できるため、免疫学的膵疾患測定試薬を作るうえで簡便
かつ安いコストでできる。ＦＡＰを膵疾患測定のマーカ
ーとすることは従来のマーカーであるCA19-9やＣＥＡよ
りも総合的に優れていると考える。又、ＦＡＰとCA19-9
を膵癌に対するcombination assayは臨床上極めて有用
である。
【図１】：実施例２の標準曲線を示す。４９０ｎｍで標
準ＦＡＰ溶液の吸光度を測定。 −○−：実施例２の２）の標準曲線を示す。 −×−：実施例２の１）の標準曲線を示す。
準ＦＡＰ溶液の吸光度を測定。 −○−：実施例２の２）の標準曲線を示す。 −×−：実施例２の１）の標準曲線を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 胎児性膵蛋白質と反応する単一のモノク
ローナル抗体を利用することを特徴とする、免疫学的膵
疾患測定方法。 - 【請求項２】 モノクローナル抗体がＭ128-Ｆ抗体であ
り、免疫学的測定方法がサンドイッチ酵素免疫法又は免
疫凝集反応法である請求項１記載の免疫学的膵疾患測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29760994A JPH08160047A (ja) | 1994-11-30 | 1994-11-30 | 免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29760994A JPH08160047A (ja) | 1994-11-30 | 1994-11-30 | 免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08160047A true JPH08160047A (ja) | 1996-06-21 |
Family
ID=17848775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29760994A Pending JPH08160047A (ja) | 1994-11-30 | 1994-11-30 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08160047A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013038981A1 (ja) * | 2011-09-13 | 2013-03-21 | オリンパス株式会社 | 膵疾患マーカーの検出方法 |
| WO2014054729A1 (ja) * | 2012-10-03 | 2014-04-10 | オリンパス株式会社 | 肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法 |
-
1994
- 1994-11-30 JP JP29760994A patent/JPH08160047A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013038981A1 (ja) * | 2011-09-13 | 2013-03-21 | オリンパス株式会社 | 膵疾患マーカーの検出方法 |
| CN103782175A (zh) * | 2011-09-13 | 2014-05-07 | 奥林巴斯株式会社 | 胰腺病标记物的检出方法 |
| JPWO2013038981A1 (ja) * | 2011-09-13 | 2015-03-26 | オリンパス株式会社 | 膵疾患マーカーの検出方法 |
| WO2014054729A1 (ja) * | 2012-10-03 | 2014-04-10 | オリンパス株式会社 | 肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法 |
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