WO2014054729A1 - 肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法 - Google Patents

肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法 Download PDF

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liver
cea
tract disease
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博美 佐貫
奈緒 守屋
理惠 片岡
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オリンパス株式会社
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a liver / biliary tract disease marker excreted from the liver / biliary tract safely and with high performance.
  • This application claims the priority based on Japanese Patent Application No. 2012-212227 for which it applied to Japan on October 3, 2012, and uses the content here.
  • Biliary tract cancer has a 5-year survival rate of 5% or less, and is one of the cancers with the worst prognosis. The reason for this is that there is no effective test method for screening, and it is difficult to get symptoms at an early stage. Therefore, a method that can detect a treatable early biliary tract cancer by a minimally invasive and simple method that can be carried out as a medical checkup can greatly contribute to the improvement of the prognosis of liver / biliary tract cancer.
  • Body fluid is an important biological sample for knowing the state of an organ.
  • Bile is also an important biological sample for knowing the state of the liver and biliary tract, and is used for cytodiagnosis, bacterial tests, and the like. Also, in academic research, search for new markers for liver / biliary tract related diseases such as liver / biliary tract cancer is widely performed.
  • CEA cancerembryonic antigen
  • serum tumor marker is a glycoprotein present on the surface of cancer cells and is known to be highly expressed in liver and biliary tract cancer cells.
  • the degree of cancer malignancy and the effect of treatment can be confirmed by measuring the CEA concentration in serum.
  • the measurement of CEA in serum it is unclear which organ is cancerous, and it may be because the concentration decreases in systemic blood, but the sensitivity in liver / biliary tract cancer is about 50%. It was low.
  • the bile CEA concentration was significantly increased in biliary tract cancer compared to benign disease of the biliary tract. These results suggest that by using the CEA concentration in bile as an index, biliary tract cancer can be detected with higher accuracy than the conventional method of measuring serum CEA. In addition, it has been reported that liver metastasis of colorectal cancer is detected by measuring CEA concentration in bile obtained by gallbladder puncture (see Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Document 1 it is necessary to insert a catheter into the biliary tract endoscopically, and in the methods described in Non-Patent Documents 2 and 3, it is necessary to puncture the gallbladder percutaneously. . That is, each method has a problem that it is highly invasive in addition to requiring a high level of skill for a doctor. In particular, the catheter insertion method also has a risk of developing a serious symptom of cholangitis as an accident. For this reason, these methods could only be performed on patients who were strongly suspected of biliary tract disease.
  • An object of the present invention is to provide a detection method for detecting a liver / biliary tract disease marker, which can reduce the risk of accidents and obtain a highly reliable result.
  • the present inventors measured CEA concentration in duodenal juice, that is, CEA concentration in bile naturally discharged into the duodenum, using CEA as a liver / biliary tract marker.
  • CEA test performance equivalent to that obtained by measuring CEA concentration in bile collected directly from the bile duct or gallbladder can be obtained.
  • the liver / biliary tract disease marker detection method and liver / biliary tract disease marker measurement kit according to the present invention are the following (1) to (7).
  • CEA as a liver / biliary tract marker
  • a method for detecting a liver / biliary tract disease marker comprising measuring CEA concentration in duodenal juice.
  • liver / biliary tract disease marker measurement kit according to (6), further comprising a second antibody that labels CEA.
  • the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention can be used to insert a catheter into the bile duct or percutaneously puncture the gallbladder with high accuracy, as in the case of measuring the CEA concentration in bile collected directly from the bile duct or gallbladder.
  • CEA which is a marker for liver / biliary tract diseases, can be detected.
  • the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention can be used.
  • a liver / biliary tract disease marker test can be more safely performed on a patient who is not suspected of having a disease. Therefore, it can be expected that the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention allows a widespread use of a liver / biliary tract cancer test.
  • a liver / biliary tract disease marker refers to various biomolecules such as proteins, nucleic acids, lipids, cells, etc. contained in bile, as compared with non-affected individuals of liver / biliary tract diseases. Thus, it is a biomolecule whose concentration in bile is significantly higher in patients suffering from liver / biliary tract diseases.
  • Non-affected individuals with liver / biliary tract diseases are not limited to healthy individuals, but also include those with diseases other than liver / biliary tract diseases. Examples of liver / biliary tract diseases include biliary tract cancer, cholangitis, liver cancer and the like.
  • Bile is a bodily fluid that drains from the biliary tract into the intestine of the duodenum.
  • the duodenal juice (intestinal fluid present in the intestinal tract of the duodenum) includes pancreatic juice that is also discharged from the nipple, duodenal secretion and blood that are discharged from the duodenal wall.
  • bile discharged naturally means bile discharged from the biliary tract into the intestinal tract of the duodenum without administration of a bile discharge stimulant such as cholecystokinin. .
  • duodenal juice is a mixture of bile, pancreatic juice, duodenal secretion, etc.
  • the concentration of liver / biliary tract disease marker in duodenal fluid is considered not to reflect the original concentration of liver / biliary tract disease marker in bile. It was.
  • the duodenal juice contains digestive enzymes, the liver / biliary tract disease markers excreted in the duodenal juice are highly likely to be decomposed. When the bile excreted in the duodenum is used as a measurement sample, It was thought that the concentration of the disease marker could not be measured accurately.
  • the concentration of liver and biliary tract disease markers in duodenal fluid was collected directly from the bile duct after stimulation with a bile excretion stimulator, and the liver in pure bile
  • the present inventors have revealed that the presence / absence of morbidity in the liver / biliary tract disease and the magnitude of the onset risk, as well as the concentration of the biliary tract disease marker, are reflected. That is, the concentration of the liver / biliary tract disease marker in the duodenal fluid containing the naturally excreted bile is higher in those suffering from liver / biliary tract disease than in those not affected by liver / biliary tract disease.
  • liver / biliary tract disease marker in the duodenal fluid collected from the subject and measuring its concentration, whether the subject is suffering from liver / biliary tract disease, With the same level of accuracy and reliability as the most accurate and reliable method (ie, using pure bile collected directly from the bile duct after stimulation with a bile excretion stimulator) You can investigate.
  • the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention is characterized by measuring the concentration of a liver / biliary tract disease marker in duodenal juice.
  • duodenal fluid accumulated in the intestinal tract of the duodenum is used as a measurement sample. That is, in the present invention, the body fluid used as the measurement sample for detecting the liver / biliary tract disease marker can be collected more non-invasively and easily because the catheter is not inserted into the bile duct of the nipple during collection.
  • the method for detecting a marker for liver / biliary tract disease has no risk of accidental onset of a test such as cholangitis in the preparation of a measurement sample.
  • the liver / biliary tract disease marker test which could only be performed for a certain patient, can be performed more safely for a subject whose liver / biliary tract disease is unknown.
  • the duodenal fluid provided in the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention is preferably a fluid collected from the intestinal tract of the duodenum of a subject who has not been administered a bile excretion stimulant.
  • duodenal juice as a measurement sample can be collected in a shorter time (for example, about several minutes to about 10 minutes) than when stimulation with a bile excretion stimulator is required.
  • emission stimulating agent is unnecessary, the detection method of the liver and biliary tract disease marker which concerns on this invention can be implemented at lower cost.
  • the duodenal fluid provided in the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention may be duodenal fluid collected from any site in the intestinal tract of the duodenum, but the second or third portion of the duodenum. It is preferably a duodenal juice collected from.
  • the first portion of the duodenum is directly connected from the pyloric part of the stomach, and there is a possibility of gastric juice contamination, and it is relatively difficult to fix the endoscope for collection and it may be difficult to collect Is for etc.
  • the method for collecting the duodenal juice is not particularly limited as long as it is a method capable of collecting the stored liquid in the intestinal tract of the duodenum.
  • duodenal fluid can be collected by suction means such as a syringe or vacuum pump connected to an endoscopic catheter.
  • suction means such as a syringe or vacuum pump connected to an endoscopic catheter.
  • the endoscope is inserted from the oral cavity to the duodenum, and the duodenal fluid present in the second and third portions of the duodenum is aspirated and collected using a catheter inserted through the canal channel.
  • duodenal juice collected in the intestinal tract of the duodenum is collected, and the liver and biliary tract in the obtained duodenal juice are collected.
  • Disease markers may be examined.
  • the collected duodenal juice is preferably subjected to a liver / biliary tract disease marker measurement test immediately after collection or within a few hours. You may use for the density
  • the collected duodenal juice may be stored refrigerated or frozen, may be stored at room temperature, may be lyophilized, and stored as a frozen powder.
  • the collected duodenal juice may be used as it is in a measurement test for liver / biliary tract disease markers, or may be used after separating and removing solids such as cells by centrifugation.
  • a diluted solution obtained by diluting the collected duodenal juice with an appropriate buffer or the like, or a solution obtained by adding various additives to the duodenal fluid or a diluted solution thereof may be used for a measurement test of a liver / biliary tract disease marker.
  • the additive include a surfactant, a proteolytic enzyme inhibitor, a nucleolytic enzyme inhibitor, a pH adjuster, and a pH indicator.
  • the liver / biliary tract disease marker detected in the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention is CEA, which is a glycoprotein.
  • CEA concentration in the duodenal juice as an index, it is possible to examine whether or not biliary tract cancer and cholangitis have developed, and the risk of onset.
  • the results obtained by the liver / biliary tract disease marker detection method according to the present invention are preferably used for the evaluation of the presence or risk of development of malignant liver / biliary tract diseases such as biliary tract cancer and liver cancer. it can.
  • CEA can be detected by using an anti-CEA antibody and detecting the antigen-antibody complex formed by the antigen-antibody reaction on a solid phase or in a liquid phase.
  • an anti-CEA antibody is immobilized on a solid phase in advance, a duodenal fluid is brought into contact with the solid phase, and the immobilized anti-CEA antibody is bound to CEA in the duodenal fluid. Can be detected.
  • CEA in duodenal juice may be immobilized in advance on a solid phase, and anti-CEA antibody may be brought into contact with the solid phase to bind to the immobilized CEA to detect the formed complex.
  • Examples of the solid phase for immobilizing CEA or anti-CEA antibody include, for example, polymer membranes such as nitrocellulose membranes, gels such as agarose gels and SDS-PAGE gels, inner surfaces of containers such as plastic tubes and microplates, latex beads, Examples thereof include beads such as magnetic beads.
  • Examples of a method for detecting an antigen-antibody complex formed against CEA or anti-CEA antibody immobilized on a solid phase include, for example, immunochromatography, Western blot, dot plot, slot blot, immunoelectrophoresis , Immunodiffusion method, ELISA method, immunoagglutination method, method for detecting antigen-antibody complex bound to beads, and the like.
  • the method for immobilizing CEA or anti-CEA antibody and the method for detecting these antigen-antibody complexes can be carried out by conventional methods except that duodenal fluid is used as the measurement target and anti-CEA antibody is used.
  • a method of detecting CEA in duodenal juice a method of detecting an antigen-antibody complex in a liquid phase without using a solid phase may be used.
  • an anti-CEA antibody labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance is used, and a complex formed by this labeled anti-CEA antibody and CEA in duodenal juice is bound to the anti-CEA antibody in the complex.
  • the labeling substance can be detected as an index.
  • FRET fluorescence energy transfer phenomenon
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FIDA fluorescence intensity distribution analysis
  • CEA in duodenal juice may be detected directly without using antigen-antibody reaction.
  • CEA in duodenal juice can also be detected by molecular weight measurement such as time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS).
  • TOF-MS time-of-flight mass spectrometry
  • CEA is preferably detected by an immunochromatography method or an ELISA method, more preferably by an immunochromatography method because it is quick and simple and easy to quantitatively detect.
  • a duodenal fluid is dropped onto a nitrocellulose membrane in which an anti-CEA antibody is immobilized on the membrane surface in advance, and CEA in the duodenal fluid is bound to the immobilized anti-CEA antibody to form a complex.
  • the complex can be detected as a band.
  • the concentration of CEA in the duodenal juice is measured qualitatively by visually comparing the density of the band detected using the duodenal juice with a color sample for calibration prepared using a known concentration of CEA. be able to. It can also be easily obtained by optically measuring the band density and comparing it with the band density detected in the same manner using CEA having a known density. Furthermore, by preparing in advance a calibration curve representing the relationship between the density of the band and the concentration of CEA, optically measuring the density of the band detected using duodenal juice, and converting from the calibration curve, The concentration of CEA in duodenal juice can also be determined.
  • the concentration of CEA in duodenal fluid containing naturally excreted bile tends to be higher in affected individuals with liver / biliary tract disease than in non-affected individuals with liver / biliary tract disease. For this reason, the possibility of suffering from the subject's liver / biliary tract disease can be determined using the concentration of CEA in the duodenal juice of the subject.
  • a threshold is set in advance to separate affected and non-affected patients with liver and biliary tract diseases, the CEA concentration in the duodenal juice of the subject is measured, and it is determined whether or not the concentration is greater than or equal to a predetermined threshold .
  • the concentration is equal to or higher than a predetermined threshold, it can be determined that the subject is likely to have liver / biliary tract disease.
  • the concentration of CEA in duodenal juice containing naturally excreted bile can be measured and compared with a predetermined threshold value to detect a liver / biliary tract disease.
  • Threshold values for separating affected and unaffected individuals with liver / biliary tract diseases can be set experimentally in consideration of the CEA detection method and the like. For example, for duodenal juice collected from a population known not to have liver / biliary tract disease and duodenal fluid collected from a population known to have the disease It can be set as appropriate by measuring the concentration of CEA in duodenal juice naturally discharged by the detection method according to the invention and comparing the measured values of both groups.
  • nitrocellulose membrane on which anti-CEA antibody has been immobilized on the membrane surface
  • duodenal juice together with labeled anti-CEA antibody having a different epitope site from the antibody immobilized on the membrane
  • the solution is dropped to form a complex composed of the immobilized anti-CEA antibody, CEA and labeled anti-CEA antibody on the surface of the nitrocellulose membrane.
  • the formed band is detected as a band by the label in the labeled anti-CEA antibody.
  • the CEA concentration on the immunochromatography can be quantified from the density of the band by visual comparison with the band concentration of a color sample in which a band obtained when a predetermined concentration of CEA is added.
  • the CEA concentration can be converted by optically measuring the density of the band and converting it from a predetermined calibration curve or the like. For example, if the intensity of the band on the immunochromatography is compared to the color swatch described for the 50 ng / mL and 200 ng / mL CEA concentration bands, or the intensity between these two bands, or If it is higher than the band of 200 ng / mL, it is positive (the subject from whom the duodenal fluid used for the measurement was collected is likely to have liver / biliary tract diseases such as biliary tract cancer and cholangitis). Judgment can be made.
  • CEA concentration is high in advanced biliary tract cancer and advanced cholangitis. For this reason, by setting an appropriate threshold value, it can also be expected to determine the degree of morbidity of a specific liver / biliary tract disease other than biliary tract cancer.
  • a positive / negative judgment can be made quickly and easily in an endoscopic room where duodenal juice is collected (the subject has a liver ⁇ Determining if there is a biliary tract disease). That is, by using the method for detecting a marker for liver / biliary tract disease according to the present invention, a screening test for biliary tract cancer that is safe, high-performance, and quick can be performed. The possibility can be judged promptly after collection of duodenal juice, and treatment for biliary tract cancer can be started promptly by promptly motivating and making a reservation for a close examination.
  • kits for measuring a liver / biliary tract disease marker in duodenal fluid containing naturally excreted bile includes a solid phase in which an antibody against CEA (anti-CEA antibody), which is a liver / biliary tract disease marker, is immobilized in advance, for example, against CEA It is preferable to include a membrane on which the first antibody is solid-phased. Examples of the membrane include immunochromatographic test strips.
  • the measurement kit preferably also has a second antibody that labels CEA.
  • Example 1 From 7 patients suspected of having liver / biliary tract disease, duodenal juice was collected and the CEA concentration was measured. Insert the endoscope into the second portion of the duodenum in a patient who has fasted overnight, and use the catheter for the cholangiography (manufactured by Olympus, product name: PR-130Q) to complete the second and third portions of the duodenum. The duodenal juice collected in the wall was collected. Collection was performed by aspirating a syringe connected to the proximal side of the catheter outside the endoscope. An average of about 1 mL of duodenal juice could be collected in about 2 to 3 minutes.
  • the CEA concentration in each collected duodenal juice was measured by ELISA using a commercially available kit (manufactured by IBL). Table 1 shows the measurement results of the CEA concentration in each duodenal juice for each disease.
  • the CEA concentration in the duodenal juice excreted naturally was 190 ng / mL (patient 1), 141 ng / mL (patient 2), 15 ng / mL (patient 3), and liver cancer patients in 3 patients with biliary tract cancer, respectively.
  • the CEA concentration in the naturally excreted duodenal juice in this example is similar to the CEA concentration of pure bile collected by cannulation in the nipple. Concentration range.
  • the CEA concentration in duodenal juice was clearly higher in malignant biliary tract cancer and liver cancer than in benign gallbladder polyps and cholecystitis and common bile duct stones. From this result, the detection method of liver / biliary tract disease marker according to the present invention can detect CEA of bile with sufficient accuracy, and the same liver / biliary tract disease as in the case of measuring CEA concentration of pure bile It is clear that a discrimination effect is obtained.
  • Example 2 Using a commercially available CEA immunochromatography kit (product name: Lana Mammo Card CEA, manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd.), CEA in the naturally excreted duodenal fluid sample used in Example 1 was detected. The CEA concentration was determined visually by comparing the color sample of the band attached to the kit with the intensity of the immunochromatographic band detected from each duodenal juice specimen. As a result, there was a correlation between the band density of the duodenal fluid specimen when compared with 100 ng / mL and 400 ng / mL of the color sample and the measured value of CEA concentration by ELISA, and the CEA concentration in the duodenal juice was determined by immunochromatography. It was confirmed that it could be measured by the method.
  • a commercially available CEA immunochromatography kit product name: Lana Mammo Card CEA, manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd.
  • the method for detecting a liver / biliary tract disease marker according to the present invention is safe without risk of cholangitis and the like, and CEA in pure bile collected directly from a catheter inserted into the bile duct after stimulating bile discharge Since the liver / biliary tract disease marker can be detected with the same accuracy as when the concentration is measured, it can be used in the field of analyzing bile, particularly in the field of clinical examination and the like.

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Abstract

肝臓・胆道疾患マーカーを検出するための方法であって、偶発症のリスクを抑え、かつ信頼性の高い結果を得るための検出方法を提供する。すなわち、ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定することを特徴とする、肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法、並びに自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの測定キットであって、ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、ＣＥＡに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする肝臓・胆道疾患マーカー測定キットを提供する。

Description

肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法
　本発明は、肝臓・胆道から排出された肝臓・胆道疾患マーカーを、安全かつ高性能に検出する方法に関する。
　本願は、２０１２年１０月３日に日本国に出願された特願２０１２－２２１２２７号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　胆道癌は５年生存率が５％以下であり、癌の中でも最も予後の悪い癌の１つである。その理由としては、検診で有効な検査法がないこと、早期では症状がでにくいため、進行してからの発見となることがある。そのため、検診としても実施できるような低侵襲かつ簡便な方法で、治療可能な早期胆道癌を検出できる方法は、肝臓・胆道癌の予後改善に大きく貢献できる。
　体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。胆汁も肝臓・胆道の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診、細菌検査等に用いられている。また、学術研究においても、肝臓・胆道癌等の肝臓・胆道関連疾患についての新たなマーカーの探索が広く行われている。
　血清腫瘍マーカーとして知られているＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）は、癌細胞の表面に存在する糖タンパク質であり、肝臓・胆道癌細胞でも高発現していることが知られている。臨床検査においては、血清中のＣＥＡ濃度を測定することにより、癌の悪性度の把握や治療の効果の確認ができることが報告されている。しかしながら、血清中のＣＥＡの測定では、どの臓器が癌であるのかが不明であり、また、全身性の血液で濃度が薄まるためかもしれないが、肝臓・胆道癌での感度は５０％程度と低いものであった。
　一方でＣＥＡを、肝臓・胆道癌細胞を含んで排出される胆汁で測定する研究が報告されている。例えばクワンらによって、胆管ドレナージによって得られた胆汁中のＣＥＡ濃度を、免疫学的な方法で測定し、胆道癌と胆道の良性疾患を識別する研究が報告されている（非特許文献１参照。）。当該報告によれば、胆汁中のＣＥＡ濃度の平均値は、胆道の良性疾患患者では２９．３±５６．３ｎｇ／ｍＬであったのに対して、胆道癌患者では１２０．６±１５６．９ｎｇ／ｍＬであり、胆汁ＣＥＡ濃度は、胆道の良性疾患と比較し、胆道癌で有意に上昇していた。これらの結果から、胆汁中のＣＥＡ濃度を指標とすることにより、従来法の血清ＣＥＡ測定と比較して高い精度で胆道癌を検出できる可能性が示唆されている。また、胆嚢穿刺により得られた胆汁中のＣＥＡ濃度測定により、大腸癌の肝転移を検出する報告もされている（非特許文献２及び３参照。）。
　非特許文献１に記載の方法では、内視鏡的に胆道にカテーテルを挿入する必要があり、非特許文献２及び３に記載の方法では、経皮的に胆嚢を穿刺することが必要である。つまり、いずれの方法も、医師に高い技術が必要とされることに加えて、侵襲性が高いという問題がある。特にカテーテル挿入法は、偶発症として胆管炎という重篤な症状を発症するリスクもある。このため、これらの方法は、胆道疾患を強く疑われた患者にのみしか実施することができなかった。
Kwang、他６名、ジャーナル・オブ・コーリャン・メディカル・サイエンス（Journal of Korean Medical Science）、２００３年、第１８巻、第８５５～８５８ページ。 Waisberg、他７名、ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology）、２００３年、第９巻、第７号、第１５８９～１５９３ページ。 Tuech、他６名、ジャーナル・オブ・サージカル・オンコロジー（Journal of Surgical Oncology）、２００４年、第８８巻、第１号、第２７～３１ページ。
　本発明は、肝臓・胆道疾患マーカーを検出するための方法であって、偶発症のリスクを抑え、かつ信頼性の高い結果を得るための検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、十二指腸液中のＣＥＡ濃度、すなわち自然に十二指腸に排出された胆汁中のＣＥＡ濃度を測定した場合でも、胆管や胆嚢から直接採取した胆汁中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同等のＣＥＡの検査性能を得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法及び肝臓・胆道疾患マーカー測定キットは、下記（１）～（７）である。
（１）　ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、
　十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定することを特徴とする、肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
（２）　十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定し、当該濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する、前記（１）の肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
（３）　前記肝臓・胆道疾患が胆道癌である、前記（１）又は（２）の肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
（４）　前記測定方法がイムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法である、前記（１）～（３）のいずれかの肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
（５）　前記十二指腸液が、自然に排出された胆汁を含む、前記（１）～（４）のいずれかの肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
（６）　自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの測定キットであって、
　ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、
　ＣＥＡに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする肝臓・胆道疾患マーカー測定キット。
（７）　さらに、ＣＥＡを標識する第２の抗体を有する、前記（６）の肝臓・胆道疾患マーカー測定キット。
（８）　前記膜が、イムノクロマトグラフィー用テストストリップである、前記（６）又は（７）の肝臓・胆道疾患マーカー測定キット。
　本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法は、胆管や胆嚢から直接採取した胆汁中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同様に高い精度で、胆管へのカテーテル挿入や胆嚢への経皮穿刺を要することなく、肝臓・胆道疾患マーカーであるＣＥＡを検出することができる。つまり、胆管へのカテーテル挿入処理に伴う偶発症のリスクがない上に、従来法と比較して簡便かつ低コストであるため、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法によって、肝臓・胆道疾患の疑いのない患者に対しても、より安全に肝臓・胆道疾患マーカー検査を実施することができる。したがって、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法により、肝臓・胆道癌の検査を広く一般的に普及させられることが期待できる。
　本発明及び本願明細書において、肝臓・胆道疾患マーカーとは、胆汁中に含まれているタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子であって、肝臓・胆道疾患の非罹患者と比較して、肝臓・胆道疾患の罹患者において、胆汁中の濃度が有意に高くなる生体分子である。肝臓・胆道疾患の非罹患者は、健常者に限らず、肝臓・胆道疾患以外の疾患の罹患者をも含む。また、肝臓・胆道疾患としては、例えば、胆道癌、胆管炎、肝癌等が挙げられる。
　胆汁とは、胆道から十二指腸の腸管内に排出される体液である。十二指腸液（十二指腸の腸管内に存在する腸管液）には、胆汁に加えて、同じく乳頭部より排出された膵液や、十二指腸壁から排出される十二指腸分泌液、血液等も含まれている。また、本発明及び本願明細書において、自然に排出された胆汁とは、コレシストキニン等の胆汁排出刺激剤が投与されていない状態で、胆道から十二指腸の腸管内に排出された胆汁を意味する。
　十二指腸液は、胆汁、膵液、十二指腸分泌液等の混合物であるため、十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの濃度は、もともとの胆汁中の肝臓・胆道疾患マーカー濃度を反映していないと考えられていた。また、十二指腸液中は消化酵素を含むため、十二指腸液に排出された肝臓・胆道疾患マーカーは分解される可能性が高く、十二指腸へ排出された胆汁を測定試料とした場合には、肝臓・胆道疾患マーカーの濃度を正確に測定することはできないと考えられていた。このため、従来は、胆汁中の肝臓・胆道疾患マーカーを、臨床検査に要求される精度で検査するためには、十二指腸の腸管内に排出される前の純粋な胆汁を、乳頭部へカテーテルを挿入し胆管から直接採取することが必要であると考えられていた（例えば、非特許文献１参照。）。
　これらの従来の知見にもかかわらず、自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの濃度が、胆汁排出刺激剤による刺激後に胆管から直接採取された純粋な胆汁中の肝臓・胆道疾患マーカーの濃度と同様に、肝臓・胆道疾患への罹患の有無・発症リスクの大小を反映していることが、本発明者らによって明らかにされた。つまり、自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの濃度は、肝臓・胆道疾患の非罹患者に比べて、肝臓・胆道疾患の罹患者において高い。このため、被験者から採取された十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーを検出し、その濃度を測定することによって、当該被験者が肝臓・胆道疾患に罹患しているか否かや、肝臓・胆道疾患の発症リスクを、従来法のなかで最も精度・信頼性の高い方法（すなわち、胆汁排出刺激剤による刺激後に胆管から直接採取された純粋な胆汁を測定試料とする方法）と同程度に高い精度で調べることができる。
　すなわち、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法は、十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの濃度を測定することを特徴とする。本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法では、十二指腸の腸管内に溜まっている十二指腸液を測定試料とする。つまり、本発明において肝臓・胆道疾患マーカー検出のための測定試料とする体液は、採取に際して乳頭部の胆管へのカテーテル挿入を行わないため、より非侵襲的かつ簡便に採取することができる。このように、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法は、測定試料の調製において胆管炎等の検査の偶発症発症のリスクがないため、そのリスクからこれまで明らかに肝臓・胆道疾患がある患者にのみしか実施できなかった肝臓・胆道疾患マーカー検査を、肝臓・胆道疾患の発症の有無が不明である被験者に対しても、より安全に実施することができる。
　本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法において供される十二指腸液は、胆汁排出刺激剤を投与されていない被験者の十二指腸の腸管内から採取された液であることが好ましい。この場合、測定試料である十二指腸液を、胆汁排出刺激剤による刺激が必要な場合よりもより短時間（例えば、数分～十数分間程度）で採取することができる。また、胆汁排出刺激剤による刺激が不要であるため、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法をより低コストに実施することができる。
　本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法において供される十二指腸液は、十二指腸の腸管内のいずれの部位から採取された十二指腸液であってもよいが、十二指腸の第二ポーション又は第三ポーションから採取された十二指腸液であることが好ましい。十二指腸の第一ポーションは胃の幽門部から直接つながる部位であり、胃液の混入の可能性があること、また、採取のための内視鏡の固定が比較的難しく、採取が難しい場合があること等のためである。
　十二指腸液の採取方法は、十二指腸の腸管内の貯留液を採取可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えば、十二指腸液を内視鏡カテーテルに接続したシリンジや真空ポンプなどの吸引手段にて採取することができる。具体的には、内視鏡を口腔から十二指腸まで挿入し、かんしチャネルを挿通して挿入したカテーテルを用いて、十二指腸の第二・第三ポーションに存在する十二指腸液を吸引し採取する。例えば、いわゆる胃カメラとしての胃・十二指腸の内視鏡検査（上部内視鏡検査）のついでに、十二指腸の腸管内に貯留している十二指腸液を採取し、得られた十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーを検査してもよい。
　採取された十二指腸液に対して、採取後ただちに又は数時間以内に、肝臓・胆道疾患マーカーの測定試験が実施されることが好ましいが、採取後から所定期間保存した後の十二指腸液を、肝臓・胆道疾患マーカーの濃度測定試験に供してもよい。採取された十二指腸液は、冷蔵又は冷凍で保存してもよく、室温で保存してもよく、凍結乾燥処理を行い、凍結粉末として保存してもよい。
　採取された十二指腸液は、そのまま肝臓・胆道疾患マーカーの測定試験に用いてもよく、遠心分離処理等により、細胞等の固形分を分離除去した後に用いてもよい。その他、採取された十二指腸液を適当なバッファー等で希釈した希釈液や、十二指腸液又はその希釈液に各種添加剤を添加したものを、肝臓・胆道疾患マーカーの測定試験に用いてもよい。添加剤としては、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等が挙げられる。
　本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法において検出される肝臓・胆道疾患マーカーは、糖タンパク質であるＣＥＡである。十二指腸液中のＣＥＡ濃度を指標とすることによって、胆道癌及び胆道炎等の発症の有無や発症リスク等を調べることができる。中でも、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法によって得られた結果は、胆道癌や肝癌等の悪性の肝臓・胆道疾患についての発症の有無や発症リスク等の評価に好適に用いることができる。
　十二指腸液中のＣＥＡを検出する方法としては、抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる。抗ＣＥＡ抗体を用い、抗原抗体反応によって形成された抗原抗体複合体を、固相上又は液相中で検出することによって、ＣＥＡを検出することができる。
　例えば、抗ＣＥＡ抗体を予め固相に固定させておき、当該固相に十二指腸液を接触させて、固定化された抗ＣＥＡ抗体と当該十二指腸液中のＣＥＡを結合させ、形成された複合体を検出することができる。逆に、十二指腸液中のＣＥＡを予め固相に固定させておき、当該固相に抗ＣＥＡ抗体を接触させて固定化されたＣＥＡと結合させ、形成された複合体を検出してもよい。
　ＣＥＡ又は抗ＣＥＡ抗体を固定する固相としては、例えば、ニトロセルロース膜等の高分子膜、アガロースゲル、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル等のゲル、プラスチックチューブやマイクロプレート等の容器の内表面、ラテックスビーズ、磁気ビーズ等のビーズ等が挙げられる。固相に固定されたＣＥＡ又は抗ＣＥＡ抗体に対して形成された抗原抗体複合体を検出する方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法、ドットプロット法、スロットブロット法、免疫電気泳動法、免疫拡散法、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ビーズに結合した抗原抗体複合体を検出する方法等が挙げられる。ＣＥＡ又は抗ＣＥＡ抗体の固定化方法、及びこれらの抗原抗体複合体の検出方法は、測定対象として十二指腸液を用い、かつ抗ＣＥＡ抗体を用いる以外は、常法により行うことができる。
　十二指腸液中のＣＥＡを検出する方法としては、固相を利用せず、液相中の抗原抗体複合体を検出する方法であってもよい。例えば、蛍光物質等の標識物質によって標識された抗ＣＥＡ抗体を用い、この標識済抗ＣＥＡ抗体と十二指腸液中のＣＥＡとで形成された複合体を、当該複合体中の抗ＣＥＡ抗体と結合した標識物質を指標として検出することができる。当該検出方法としては、例えば、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用する方法や、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）や蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ）等の蛍光測定技術を利用した方法が挙げられる。
　十二指腸液中のＣＥＡは、抗原抗体反応を利用せず、直接検出してもよい。例えば、飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ－ＭＳ）等の分子量測定によっても、十二指腸液中のＣＥＡを検出することができる。
　本発明においては、迅速かつ簡便であり、また、定量的な検出も容易であることから、イムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法によりＣＥＡを検出することが好ましく、イムノクロマトグラフィー法により検出することがより好ましい。例えば、予め膜表面上に抗ＣＥＡ抗体が固定化されたニトロセルロース膜に、十二指腸液を滴下し、当該十二指腸液中のＣＥＡを固定化された抗ＣＥＡ抗体と結合させ、形成された複合体を検出する。当該複合体と結合する抗体として、蛍光物質、金コロイド、酵素等により予め標識した標識済抗体を用いることにより、当該複合体をバンドとして検出することができる。
　十二指腸液中のＣＥＡの濃度は、十二指腸液を用いて検出されたバンドの濃さを既知濃度のＣＥＡを用いて作成された検量用の色見本と目視で比較することにより、定性的に測定することができる。また、バンドの濃さを光学的に測定し、既知濃度のＣＥＡを用いて同様に検出されたバンドの濃さと比較することによっても、簡便に求めることができる。さらに、バンドの濃さとＣＥＡの濃度との関係を表す検量線を予め作成しておき、十二指腸液を用いて検出されたバンドの濃さを光学的に測定し、検量線から換算することにより、十二指腸液中のＣＥＡの濃度を求めることもできる。
　自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中のＣＥＡの濃度は、肝臓・胆道疾患を発症している罹患者のほうが、肝臓・胆道疾患の非罹患者よりも高い傾向にある。このため、被検者の十二指腸液中のＣＥＡの濃度を利用して、当該被検者の肝臓・胆道疾患への罹患可能性を判断することができる。予め肝臓・胆道疾患の罹患者と非罹患者とを分ける閾値を設定し、被検者の十二指腸液中のＣＥＡの濃度を測定し、当該濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する。当該濃度が所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が肝臓・胆道疾患に罹患している可能性が高いと判断することができる。このように、自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中のＣＥＡの濃度を測定し、所定の閾値と比較することにより、肝臓・胆道疾患を検出することができる。
　肝臓・胆道疾患の罹患者と非罹患者とを分ける閾値は、ＣＥＡの検出方法等を考慮して、実験的に設定することができる。例えば、肝臓・胆道疾患に罹患していないことが分かっている集団から採取された十二指腸液と、当該疾患に罹患していることが分かっている集団から採取された十二指腸液とに対して、本発明に係る検出方法を行って自然に排出された十二指腸液中のＣＥＡの濃度を測定し、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。
　具体的には、予め膜表面上に抗ＣＥＡ抗体が固定化されたニトロセルロース膜（イムノクロマト）に、十二指腸液を、膜上に固定化された抗体とはエピトープ部位が異なる標識済抗ＣＥＡ抗体とともに滴下し、当該ニトロセルロース膜の膜表面上に、固定化された抗ＣＥＡ抗体とＣＥＡと標識済抗ＣＥＡ抗体とからなる複合体を形成させる。形成されたバンドは、当該標識済抗ＣＥＡ抗体中の標識により、バンドとして検出される。イムノクロマト上のＣＥＡ濃度は、所定濃度のＣＥＡを添加した場合に得られるバンドが記載された色見本のバンド濃度と目視で比較し、バンドの濃さから定量することもできる。また、バンドの濃さを光学的に測定して、所定の検量線等から換算してＣＥＡ濃度を換算することもできる。例えば、イムノクロマト上のバンドの濃さを、５０ｎｇ／ｍＬと２００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ濃度のバンドが記載された色見本と比較し、これらの２本のバンドの間の濃さであった場合、又は２００ｎｇ／ｍＬのバンドより濃かった場合に、陽性（測定に用いられた十二指腸液が採取された被験者が、胆道癌、胆道炎等の肝臓・胆道疾患に罹患している可能性が高い。）と判断することができる。
　進行した胆道癌や進行した胆道炎ではＣＥＡ濃度が高いことが想定される。このため、適当な閾値を設定することにより、胆道癌以外の特定の肝臓・胆道疾患への罹患可能性の大小を判断することも期待できる。
　自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、イムノクロマトグラフィー法のような迅速キットによって測定することにより、十二指腸液の採取が行われる内視鏡室で迅速かつ簡便に陽性陰性の判断（被験者に肝臓・胆道疾患があるかどうかの判定）を行うことができる。すなわち、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法を用いることにより、安全かつ高性能で迅速な胆道癌のスクリーニング検査を行うことができるため、進行が早く、数ヶ月で死に至る胆道癌の可能性を、十二指腸液の採取後速やかに判断でき、精密検査への動機づけやその予約を迅速に行うことにより、迅速に胆道癌の治療を開始することができる。
　十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーを検出するための方法に使用する試薬・装置等をキット化することにより、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法をより簡便に実施することができる。自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの測定キットとしては、肝臓・胆道疾患マーカーであるＣＥＡに対する抗体（抗ＣＥＡ抗体）を予め固定させた固相、例えば、ＣＥＡに対する第１の抗体が固相された膜を含むことが好ましい。当該膜としては、例えば、イムノクロマトグラフィー用テストストリップが挙げられる。当該測定キットは、ＣＥＡを標識する第２の抗体を有することも好ましい。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　肝臓・胆道疾患を疑われる患者７例から、十二指腸液を採取しＣＥＡ濃度を測定した。
　一晩絶食した患者に、内視鏡を十二指腸の第二ポーションまで挿入し、胆管造影用のカテーテル（オリンパス社製、製品名：ＰＲ－１３０Ｑ）を用いて、第二、第三ポーション全体の十二指腸壁に浅く溜まっている十二指腸液を採取した。採取は、カテーテルの内視鏡外の手元側に接続したシリンジを吸引することによって行った。２～３分間程度で平均１ｍＬ程度の十二指腸液が採取できた。十二指腸の第一ポーションでは、胃側に内視鏡が抜けてしまい、安定な採取をすることができなかった。
　当該７例のうち３例においては、ＥＲＣＰ（内視鏡的逆行性膵胆管造影）時に胆管にカテーテルを挿入し、胆汁採取も行った。
　その後、各患者に対してさらに画像診断又は病理検査を行い、最終診断を行った。最終診断の結果、胆道癌３例、胆嚢ポリープ１例、胆嚢炎１例、肝癌１例、総胆管結石１例であった。このうち、胆道癌と肝癌が悪性疾患であり、胆嚢ポリープ及び胆嚢炎及び総胆管結石は良性疾患である。
　採取された各十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、市販のキット（ＩＢＬ社製）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。表１に、各十二指腸液中のＣＥＡ濃度の測定結果を、疾患別に示した。この結果、自然に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度は、胆道癌患者３例でそれぞれ１９０ｎｇ／ｍＬ（患者１）、１４１ｎｇ／ｍＬ（患者２）、１５ｎｇ／ｍＬ（患者３）、肝癌患者で２４１ｎｇ／ｍＬ、胆嚢ポリープ患者で７０ｎｇ／ｍＬ、胆嚢炎患者で２６ｎｇ／ｍＬ、総胆管結石患者で１８ｎｇ／ｍＬであった。表２に、各胆汁のＣＥＡの測定結果を、疾患別に記載した。胆汁のＣＥＡ濃度は、胆道癌患者２で１７５ｎｇ／ｍＬ、胆道癌患者３で２６９ｎｇ／ｍＬ、総胆管結石患者で０ｎｇ／ｍＬであった。同一症例から得られた胆汁と十二指腸液濃度は、３例中２例で同等であった。また、非特許文献１等の過去の報告と比較しても、本実施例における自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度は、乳頭部にカニュレーションして採取した純粋な胆汁のＣＥＡ濃度とも同様の濃度域であった。また、十二指腸液のＣＥＡ濃度は、悪性の胆道癌及び肝癌では、良性の胆嚢ポリープ及び胆嚢炎及び総胆管結石よりも明らかに高かった。この結果から、本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法により、胆汁のＣＥＡを充分な精度で検出することができ、かつ純粋な胆汁のＣＥＡ濃度を測定した場合と同様の肝臓・胆道疾患識別効果が得られることが明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例２］
　市販のＣＥＡイムノクロマトキット（製品名：ラナマンモカードＣＥＡ、日本化薬社製）を用いて、実施例１で用いた自然排出された十二指腸液検体中のＣＥＡを検出した。ＣＥＡ濃度は、当該キット添付のバンドの色見本と、各十二指腸液検体から検出されたイムノクロマトのバンドの濃さを比較して、目視で判定した。
　この結果、色見本の１００ｎｇ／ｍＬ及び４００ｎｇ／ｍＬと比較した場合の十二指腸液検体のバンドの濃さと、ＥＬＩＳＡによるＣＥＡ濃度の測定値には相関が認められ、十二指腸液中のＣＥＡ濃度がイムノクロマトグラフィー法によっても測定可能であることが確認された。
　本発明に係る肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法は、胆管炎のリスク等がなく安全である上に、胆汁排出刺激を行った後に胆管に挿入されたカテーテルから直接採取した純粋な胆汁中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同等の精度で肝臓・胆道疾患マーカーを検出することができるため、胆汁を解析する分野、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。

Claims (8)

  1. 　ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、
    　十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定することを特徴とする、肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
  2. 　十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定し、当該濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する、請求項１に記載の肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
  3. 　前記肝臓・胆道疾患が胆道癌である、請求項１又は２に記載の肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
  4. 　前記測定方法がイムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法である、請求項１～３のいずれか一項に記載の肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
  5. 　前記十二指腸液が、自然に排出された胆汁を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の肝臓・胆道疾患マーカーの検出方法。
  6. 　自然に排出された胆汁を含む十二指腸液中の肝臓・胆道疾患マーカーの測定キットであって、
    　ＣＥＡを肝臓・胆道疾患マーカーとし、
    　ＣＥＡに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする肝臓・胆道疾患マーカー測定キット。
  7. 　さらに、ＣＥＡを標識する第２の抗体を有する、請求項６に記載の肝臓・胆道疾患マーカー測定キット。
  8. 　前記膜が、イムノクロマトグラフィー用テストストリップである、請求項６又は７に記載の肝臓・胆道疾患マーカー測定キット。
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