JP2801077B2 - 移植拒絶反応検査法 - Google Patents
移植拒絶反応検査法Info
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- JP2801077B2 JP2801077B2 JP24980590A JP24980590A JP2801077B2 JP 2801077 B2 JP2801077 B2 JP 2801077B2 JP 24980590 A JP24980590 A JP 24980590A JP 24980590 A JP24980590 A JP 24980590A JP 2801077 B2 JP2801077 B2 JP 2801077B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血清中の塩基性胎児蛋白を測定することを特
徴とする移植に伴なう拒絶反応の検査法に関する。
徴とする移植に伴なう拒絶反応の検査法に関する。
［従来の技術］ 塩基性胎児蛋白（Basic Fetoprotein:BFPと略記）は
ヒト胎児の血清，腸および脳組織中に見出されたもので
あって、後記の文献等で既に公知の塩基性蛋白である。
既知の胎児蛋白が酸性蛋白であるのと対照的に、この蛋
白は塩基性であるところから、特に塩基性胎児蛋白と呼
称される。さらに当該蛋白についてのラジオイムノアッ
セイ（RIAと略記）等の免疫測定法も確立されており、
血清中における当該蛋白の測定が癌の診断およびその病
状経過、治療効果の判定に役立つことが知られている。
とりわけ当該蛋白はα−フェトプロテイン（AFPと略
記）のように特定臓器の癌診断にしか役立たないもので
はなく、非癌と癌との鑑別診断、すなわち担癌の有無の
診断に役立つことが判明している。
ヒト胎児の血清，腸および脳組織中に見出されたもので
あって、後記の文献等で既に公知の塩基性蛋白である。
既知の胎児蛋白が酸性蛋白であるのと対照的に、この蛋
白は塩基性であるところから、特に塩基性胎児蛋白と呼
称される。さらに当該蛋白についてのラジオイムノアッ
セイ（RIAと略記）等の免疫測定法も確立されており、
血清中における当該蛋白の測定が癌の診断およびその病
状経過、治療効果の判定に役立つことが知られている。
とりわけ当該蛋白はα−フェトプロテイン（AFPと略
記）のように特定臓器の癌診断にしか役立たないもので
はなく、非癌と癌との鑑別診断、すなわち担癌の有無の
診断に役立つことが判明している。
上記従来知見については、下記の列挙する文献（１）
〜（９）を参照されたい。
〜（９）を参照されたい。
（１） 石井 勝ほか:Feto−Neoplastic Antigenに関
する研究。第34回日本癌学回総会記事、p.173（197
5）。
する研究。第34回日本癌学回総会記事、p.173（197
5）。
（２） 石井 勝：諸種悪性腫瘍に存在する新胎児蛋白
besic fetoproteinに関する研究。医学のあゆみ、100
（３）,344−346（1977）。
besic fetoproteinに関する研究。医学のあゆみ、100
（３）,344−346（1977）。
（３） 石井 勝：ベイシックフェトプロテイン（塩基
性胎児蛋白）。医学のあゆみ、106（５）,273−281（19
78）。
性胎児蛋白）。医学のあゆみ、106（５）,273−281（19
78）。
（４） Ishii,M.:A new carcinoembryonic protein ch
aracterized by basic property.Scand.J.Immunol.,8
（Suppl.8）,611−620（1978）。
aracterized by basic property.Scand.J.Immunol.,8
（Suppl.8）,611−620（1978）。
（５） Ishii,M.:Characterization of besic fetopro
tein and clinical usefulness of BFP for immunodiag
nosis of human cancer.Carcino−Embryonic Proteins.
Chemistry,Biology,Clinical Applications,Vol.1,Lehm
ann,F.−G.（ed.）,Elsevier/North−Holland Biomedic
al Press,Amsterdam,333−340（1979）。
tein and clinical usefulness of BFP for immunodiag
nosis of human cancer.Carcino−Embryonic Proteins.
Chemistry,Biology,Clinical Applications,Vol.1,Lehm
ann,F.−G.（ed.）,Elsevier/North−Holland Biomedic
al Press,Amsterdam,333−340（1979）。
（６） Ishii,M.,Nishimura,K., Hattori,M.,Kanda,Y.
and Ishihara,A:Postoperative surveillance in patie
nts with stomach cancer and monitoring of immuno−
and polychemotherapy in patients with leukemia by
basic fetoprotein.Carcino−Embryonic Proteins.Chem
istry,Biology,Clinicaf Applications,Vol.2 Lehmann,
F.−G.（ed.）,Elsevier/North−Holland Biomedical P
ress, Amsterdam,603−606（1979）。
and Ishihara,A:Postoperative surveillance in patie
nts with stomach cancer and monitoring of immuno−
and polychemotherapy in patients with leukemia by
basic fetoprotein.Carcino−Embryonic Proteins.Chem
istry,Biology,Clinicaf Applications,Vol.2 Lehmann,
F.−G.（ed.）,Elsevier/North−Holland Biomedical P
ress, Amsterdam,603−606（1979）。
（７） Ishii,M.:Clinical usefulness of basic feto
protein for immunodiagnosis of human cancer. Compe
ndium of Assay for Immunodiagnosis of Human Cance
r,Development in Cencer Research,Herberman,R.B.（e
d.）,Vol.1,Elsevier/North−Holland Biomedical Pres
s,New York,45−50（1979）。
protein for immunodiagnosis of human cancer. Compe
ndium of Assay for Immunodiagnosis of Human Cance
r,Development in Cencer Research,Herberman,R.B.（e
d.）,Vol.1,Elsevier/North−Holland Biomedical Pres
s,New York,45−50（1979）。
（８） 第６回腫瘍マーカー研究会（昭和61年10月20
日、札幌）プログラム・抄録集111頁 （９） 第６回腫瘍マーカー研究回（昭和61年10月20
日、札幌）記録248〜250頁 さて、癌患者血清中のBFPはその存在量が微量である
ために、その定量のためには高感度測定法の確立が必要
であり、主としてRIA法およびEIA法（酵素免疫測定法）
が開発されてきた。RIA法の詳細については上記文献
（３）〜（７）を、また、EIA法の詳細については下記
文献（10）〜（11）を参照されたい。
日、札幌）プログラム・抄録集111頁 （９） 第６回腫瘍マーカー研究回（昭和61年10月20
日、札幌）記録248〜250頁 さて、癌患者血清中のBFPはその存在量が微量である
ために、その定量のためには高感度測定法の確立が必要
であり、主としてRIA法およびEIA法（酵素免疫測定法）
が開発されてきた。RIA法の詳細については上記文献
（３）〜（７）を、また、EIA法の詳細については下記
文献（10）〜（11）を参照されたい。
（10） 石井 勝ほか:Basic Fetoprotein,現代臨床機
能検査−その実際と解釈。日本臨床37:1536〜1539,197
9。
能検査−その実際と解釈。日本臨床37:1536〜1539,197
9。
（11） 石井 勝：塩基性フェトプロテイン（Basic Fe
toprotein）。臨床検査24（８）:931〜936,1980。
toprotein）。臨床検査24（８）:931〜936,1980。
その後、モノクローナル抗塩基性胎児蛋白抗体も得ら
れている。当該モノクローナル抗体の作製並びに成績に
ついては下記文献（12）を参照されたい。
れている。当該モノクローナル抗体の作製並びに成績に
ついては下記文献（12）を参照されたい。
（12） 石井 勝ほか:Production of Monoclonal Anti
−Basic Fetoprotein（BFP） and Useful−ness of Mon
oclonal Anti−BFP for Immunodiagnosis of Human Can
cer,Tumor Research Vol.18（Special Issue）.1983,p7
5〜86。
−Basic Fetoprotein（BFP） and Useful−ness of Mon
oclonal Anti−BFP for Immunodiagnosis of Human Can
cer,Tumor Research Vol.18（Special Issue）.1983,p7
5〜86。
さて、上記モノクローナル抗体のBFPに対する反応特
異性についてEIA法およびMO法を用いて検討すると、BFP
の分子上には少なくとも３種のそれぞれ異なる抗原決定
基が存在しており、各抗原検定基に対応してモノクロー
ナル抗体は３種類に分類されることが判明した。３種の
抗原検定基をA,B,Cとし、各抗原決定基に対応するモノ
クローナル抗体を列記すれば、例えば以下のごとくな
る。
異性についてEIA法およびMO法を用いて検討すると、BFP
の分子上には少なくとも３種のそれぞれ異なる抗原決定
基が存在しており、各抗原検定基に対応してモノクロー
ナル抗体は３種類に分類されることが判明した。３種の
抗原検定基をA,B,Cとし、各抗原決定基に対応するモノ
クローナル抗体を列記すれば、例えば以下のごとくな
る。
以上の知見に基づき、これらモノクローナル抗体を使
用したサンドイッチ法により、血清中のBFPを精度よく
測定する方法が確立されている（特開昭60−80768号公
報参照）。更に、泌尿器癌の診断を目的として尿中のBF
Pを測定する方法も開示されている（特開平１−105163
号公報参照）。
用したサンドイッチ法により、血清中のBFPを精度よく
測定する方法が確立されている（特開昭60−80768号公
報参照）。更に、泌尿器癌の診断を目的として尿中のBF
Pを測定する方法も開示されている（特開平１−105163
号公報参照）。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、以上に紹介した測定は、全て癌等の疾
患を診断するための腫瘍マーカーとしてBFPが測定され
ていたものである。
患を診断するための腫瘍マーカーとしてBFPが測定され
ていたものである。
本発明者は、移植患者、特に腎移植患者における拒絶
反応の程度と血清中BFP量との間に相関関係が存在する
ことを見出し、当該拒絶反応のモニタリング手段として
の有用性について種々の検討を行なった結果、本発明に
至ったものである。
反応の程度と血清中BFP量との間に相関関係が存在する
ことを見出し、当該拒絶反応のモニタリング手段として
の有用性について種々の検討を行なった結果、本発明に
至ったものである。
［課題を解決するための手段］ 即ち、本発明の目的は、抗塩基性胎児蛋白抗体を使用
する抗原抗体反応に基づく血清中の塩基性胎児蛋白を測
定することを特徴とする移植拒絶反応検査法を提供する
ものである。
する抗原抗体反応に基づく血清中の塩基性胎児蛋白を測
定することを特徴とする移植拒絶反応検査法を提供する
ものである。
本発明で用いる抗原抗体反応は例えばEIA法及びRIA法
等のいずれも利用できるが、安全性・測定感度等の点か
らEIA法が好ましい。
等のいずれも利用できるが、安全性・測定感度等の点か
らEIA法が好ましい。
更に、上記方法のより好適な具体例として、第一抗体
及び第２抗体にモノクローナル抗体を使用するサンドイ
ッチ法によるEIA法を挙げることができる。
及び第２抗体にモノクローナル抗体を使用するサンドイ
ッチ法によるEIA法を挙げることができる。
以下、本発明で用いる抗原抗体反応を、好適具体例で
ある前記モノクローナル抗体を用いるEIA法（サンドイ
ッチ法）に基づいて詳細に説明する。
ある前記モノクローナル抗体を用いるEIA法（サンドイ
ッチ法）に基づいて詳細に説明する。
本発明で用いる抗塩基性胎児蛋白モノクローナル抗体
は例えば次のようにして作製すればよい。まずBFPを感
作せしめたBALB/cマウスから抗体産生細胞を用意し、ミ
エローマ細胞としてP3−X63−Ag8−U1等を用いて、これ
との間でHerzenbergらの変法により細胞融合する。次に
HAT培地により選択した融合細胞からの抗体価を125I標
識したBFPを用いるプレートバインディングアッセイに
より測定する。高抗体価を示し、かつ細胞増殖のよい融
合細胞を限界希釈法によりクローニングし、高抗体価を
産生する細胞株を数種類収得する。最後に各細胞株をマ
ウス腹腔内に移植し、得られた腹水を硫安塩析し、透析
後、DEAE−celluloseにかけてIgG成分を集めれば、本発
明で用いる種類のモノクローナル抗体を収得することが
できる。得られたモノクローナル抗体をBFPの異なる抗
原決定基に対応して分類するためには下記に示すMO法お
よびEIA法を実施すればよい。
は例えば次のようにして作製すればよい。まずBFPを感
作せしめたBALB/cマウスから抗体産生細胞を用意し、ミ
エローマ細胞としてP3−X63−Ag8−U1等を用いて、これ
との間でHerzenbergらの変法により細胞融合する。次に
HAT培地により選択した融合細胞からの抗体価を125I標
識したBFPを用いるプレートバインディングアッセイに
より測定する。高抗体価を示し、かつ細胞増殖のよい融
合細胞を限界希釈法によりクローニングし、高抗体価を
産生する細胞株を数種類収得する。最後に各細胞株をマ
ウス腹腔内に移植し、得られた腹水を硫安塩析し、透析
後、DEAE−celluloseにかけてIgG成分を集めれば、本発
明で用いる種類のモノクローナル抗体を収得することが
できる。得られたモノクローナル抗体をBFPの異なる抗
原決定基に対応して分類するためには下記に示すMO法お
よびEIA法を実施すればよい。
MO法 二種類のモノクローナル抗体を1:1の比率をもって混
合したものを全てのモノクローナル抗体の組合せについ
て用意し、MO法によりこれら混合物とBFPの間における
沈降線の生成並びに融合の有無を観察する、明瞭な沈降
線が観察される場合は組合せに係るモノクローナル抗体
はそれぞれ異なる抗原決定基に反応するグループに属
し、反対に沈降線がまったく観察されない場合は同じ抗
原決定基に反応するグループに属する。また沈降線の生
成が不明瞭であり、判定が不確実であるときは、次のEI
A法によって判定する。
合したものを全てのモノクローナル抗体の組合せについ
て用意し、MO法によりこれら混合物とBFPの間における
沈降線の生成並びに融合の有無を観察する、明瞭な沈降
線が観察される場合は組合せに係るモノクローナル抗体
はそれぞれ異なる抗原決定基に反応するグループに属
し、反対に沈降線がまったく観察されない場合は同じ抗
原決定基に反応するグループに属する。また沈降線の生
成が不明瞭であり、判定が不確実であるときは、次のEI
A法によって判定する。
EIA法 実施例１記載においてK1及び5C2の代りに任意に選択
した二種類のモノクローナル抗体を使用する点を除いて
実施例１と同様に実施して調製した測定試薬を全てのモ
ノクローナル抗体の組合せについて用意する。EIA操作
をおこない発色値の吸光度を読む。発色がある場合は組
合せに係るモノクローナル抗体はそれぞれ異なる抗原決
定基に反応するグループに属し、反応に発色がない場合
は同じ抗原決定基に反応するグループに属する。
した二種類のモノクローナル抗体を使用する点を除いて
実施例１と同様に実施して調製した測定試薬を全てのモ
ノクローナル抗体の組合せについて用意する。EIA操作
をおこない発色値の吸光度を読む。発色がある場合は組
合せに係るモノクローナル抗体はそれぞれ異なる抗原決
定基に反応するグループに属し、反応に発色がない場合
は同じ抗原決定基に反応するグループに属する。
以上のごとくMO法およびEIA法によりグループ分けを
おこなうと前記したごとくBFPには三種の異なる抗原決
定基があり、モノクローナル抗体はそれぞれを確認する
三つのグループに分類される。
おこなうと前記したごとくBFPには三種の異なる抗原決
定基があり、モノクローナル抗体はそれぞれを確認する
三つのグループに分類される。
測定系全体の構成要素は固相、固相コート用抗体（第
一抗体）、BFP（標準抗原および被検尿）、標識用抗体
（第二抗体）、酵素および基質である。固相としてはエ
ンザイムイムノアッセイ用のマイクロタイタープレート
のウェル又はプラスチックビーズを用いればよい。測定
に先立ち固相コート用抗体（第一抗体）として本発明で
用いるモノクローナル抗体の一種を任意に選択し、例え
ば蛋白濃度としてのOD280nmが0.050となるように0.1M炭
酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）に溶解し、例えばポリス
チロール性エンザイムイムノアッセイ用ウェル又はプラ
スチックピーズに入れ、例えば４℃で一夜放置すれば、
固相表面は第一抗体によってコートされる。標準抗原
は、例えば肝癌患者から得た腹水を精製処理して精製BF
Pを用意し、標準抗原希釈送液を用いて所定の濃度に調
製したものを使用する。
一抗体）、BFP（標準抗原および被検尿）、標識用抗体
（第二抗体）、酵素および基質である。固相としてはエ
ンザイムイムノアッセイ用のマイクロタイタープレート
のウェル又はプラスチックビーズを用いればよい。測定
に先立ち固相コート用抗体（第一抗体）として本発明で
用いるモノクローナル抗体の一種を任意に選択し、例え
ば蛋白濃度としてのOD280nmが0.050となるように0.1M炭
酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）に溶解し、例えばポリス
チロール性エンザイムイムノアッセイ用ウェル又はプラ
スチックピーズに入れ、例えば４℃で一夜放置すれば、
固相表面は第一抗体によってコートされる。標準抗原
は、例えば肝癌患者から得た腹水を精製処理して精製BF
Pを用意し、標準抗原希釈送液を用いて所定の濃度に調
製したものを使用する。
標識用抗体（第二抗体）としては第一抗体が反応（認
識）する抗原決定基と異なる抗原決定基と反応する（を
認識する）モノクローナル抗体を選択する。また酵素と
しては例えばアルカホスファターゼ，グルコースオキシ
ダーゼ，ペルオキシダーゼ，ベータガラクトシダーゼ等
種々のものを使用することができる。測定に先立ちグル
タールアルデニヒドのごとき結合剤をもって標識用抗体
に酵素を結合せしめて酵素標識抗体とし、本発明の検査
法の実施のための試薬の一部としてあらかじめ準備して
おくことができる。基質は選択した酵素に応じて適宜使
用すればよい。例えば酵素としてアルカリホスファター
ゼを選択した場合においてはｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート等を使用すればよい。
識）する抗原決定基と異なる抗原決定基と反応する（を
認識する）モノクローナル抗体を選択する。また酵素と
しては例えばアルカホスファターゼ，グルコースオキシ
ダーゼ，ペルオキシダーゼ，ベータガラクトシダーゼ等
種々のものを使用することができる。測定に先立ちグル
タールアルデニヒドのごとき結合剤をもって標識用抗体
に酵素を結合せしめて酵素標識抗体とし、本発明の検査
法の実施のための試薬の一部としてあらかじめ準備して
おくことができる。基質は選択した酵素に応じて適宜使
用すればよい。例えば酵素としてアルカリホスファター
ゼを選択した場合においてはｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート等を使用すればよい。
測定はEIA法における通常の手順に従って実施すれば
よい。従って後記実施例において示されるごとく、第一
抗体をコートしたウェル又はビーズに標準抗原または被
検液（血清）を加えてインキュベートし、続いて酵素標
識抗体、例えばアルカリホスファターゼで標識した第二
抗体を加えてインキュベートし、あるいは、固相化した
第一抗体と標識した第二抗体と標準抗原又は被検液を混
合しインキュベートし、最後に基質、例えばｐ−ニトロ
フェニルホスフェートを加えてインキュベートし、基質
の分解量を分光光度計を用いて測定すればよい。
よい。従って後記実施例において示されるごとく、第一
抗体をコートしたウェル又はビーズに標準抗原または被
検液（血清）を加えてインキュベートし、続いて酵素標
識抗体、例えばアルカリホスファターゼで標識した第二
抗体を加えてインキュベートし、あるいは、固相化した
第一抗体と標識した第二抗体と標準抗原又は被検液を混
合しインキュベートし、最後に基質、例えばｐ−ニトロ
フェニルホスフェートを加えてインキュベートし、基質
の分解量を分光光度計を用いて測定すればよい。
なお、固相にコートすべき第一抗体は単一種のモノク
ローナル抗体であってもよいが、複数種のモノクローナ
ル抗体を混合した物であってもよい。要は第一抗体と第
二抗体とがそれぞれ別個の抗原決定基を認識する物であ
ればよく、各抗体が単一種のモノクローナル抗体より構
成されるか、あるいは複数種のモノクローナル抗体より
構成されるかは本発明において特に限定すべき要件では
ない。
ローナル抗体であってもよいが、複数種のモノクローナ
ル抗体を混合した物であってもよい。要は第一抗体と第
二抗体とがそれぞれ別個の抗原決定基を認識する物であ
ればよく、各抗体が単一種のモノクローナル抗体より構
成されるか、あるいは複数種のモノクローナル抗体より
構成されるかは本発明において特に限定すべき要件では
ない。
以上、モノクローナル抗体を用いる場合について説明
してきたが、本発明においては、抗体はモノクローナル
抗体に限られず、従来のポリクローナル抗体を用いるこ
ともできる。
してきたが、本発明においては、抗体はモノクローナル
抗体に限られず、従来のポリクローナル抗体を用いるこ
ともできる。
以下に記載する実施例をもって本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
実施例１ BFPの異なる抗原決定基をそれぞれ認識する二種類の
モノクローナル抗体K1および5C2を含有するマウス腹水
各5mlに飽和硫安（4.05M）を最終濃度1.8Mになるように
加え、室温で２時間撹拌する。内容物を12,000rpmで20
分間遠心して沈渣と上清を分離する。沈渣を0.01M PBS
（pH8.0）3mlに溶解し、沈渣を溶解した緩衝液で透析す
る。次にDEAE−celluloseカラムにかけ、0.1Mリン酸緩
衝液（以下PBと略記）（pH8.0）でIgG成分を溶出させ
る。溶出IgG成分をコロジオンバック（MW12000）で濃縮
し、K1および5C2を用意する。K1を0.1M炭酸ナトリウム
緩衝液（pH9.0）に蛋白濃度としてのOD280nmが0.05とな
るように溶解し、エンザイムイムノアッセイ用マイクロ
タイタープレートのウェルに注入し、一夜放置後排液
し、0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）で洗浄し、ウ
ェル乾燥機にて乾燥し、固相化第一抗体とする。
モノクローナル抗体K1および5C2を含有するマウス腹水
各5mlに飽和硫安（4.05M）を最終濃度1.8Mになるように
加え、室温で２時間撹拌する。内容物を12,000rpmで20
分間遠心して沈渣と上清を分離する。沈渣を0.01M PBS
（pH8.0）3mlに溶解し、沈渣を溶解した緩衝液で透析す
る。次にDEAE−celluloseカラムにかけ、0.1Mリン酸緩
衝液（以下PBと略記）（pH8.0）でIgG成分を溶出させ
る。溶出IgG成分をコロジオンバック（MW12000）で濃縮
し、K1および5C2を用意する。K1を0.1M炭酸ナトリウム
緩衝液（pH9.0）に蛋白濃度としてのOD280nmが0.05とな
るように溶解し、エンザイムイムノアッセイ用マイクロ
タイタープレートのウェルに注入し、一夜放置後排液
し、0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）で洗浄し、ウ
ェル乾燥機にて乾燥し、固相化第一抗体とする。
他方、酵素標識抗体の作製は下記によって行った。グ
ルタールアルデヒドを1.25％含む0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.8）にワサビペルオキシダーゼを溶解し、室温にて20
時間反応させた後、生食水にて透析する。この溶液とあ
らじめ生食水にて透析したモノクローナル抗塩基性胎児
蛋白抗体5C2溶液を等量混和し、これに1M炭酸緩衝液（p
H9.5）を５％の割合になるように添加し、４℃、24時間
静置する。次いで、0.2Mリジン溶液を５％の割合で加
え、室温２時間放置後生食水にて透析する。その後、0.
05Mリン酸緩衝液（pH7.4）にて透析し、ワサビペルオキ
シダーゼ標識抗塩基性胎児蛋白抗体を作製した。
ルタールアルデヒドを1.25％含む0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.8）にワサビペルオキシダーゼを溶解し、室温にて20
時間反応させた後、生食水にて透析する。この溶液とあ
らじめ生食水にて透析したモノクローナル抗塩基性胎児
蛋白抗体5C2溶液を等量混和し、これに1M炭酸緩衝液（p
H9.5）を５％の割合になるように添加し、４℃、24時間
静置する。次いで、0.2Mリジン溶液を５％の割合で加
え、室温２時間放置後生食水にて透析する。その後、0.
05Mリン酸緩衝液（pH7.4）にて透析し、ワサビペルオキ
シダーゼ標識抗塩基性胎児蛋白抗体を作製した。
別に反応希釈液，発色液，反応停止液および標準抗原
希釈液を以下のように調製する。
希釈液を以下のように調製する。
反応希釈液は正常仔牛血清，正常マウス血清（非働化
処理56℃,30分間）,EDTA 3Na,塩化ナトリウム、アジ化
ナトリウムを0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中に各々
11.8％,2％,10mM,0.15M,0,1％となるように含有せしめ
て調製する。
処理56℃,30分間）,EDTA 3Na,塩化ナトリウム、アジ化
ナトリウムを0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中に各々
11.8％,2％,10mM,0.15M,0,1％となるように含有せしめ
て調製する。
発色液は０は2,2′−アジノビス（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム（ABTS）
を0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.0）中に3mg/mlとなるよう
に含有せしめ、さらに過酸化水素を0.02％の割合になる
ように加えて調製する。
チアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム（ABTS）
を0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.0）中に3mg/mlとなるよう
に含有せしめ、さらに過酸化水素を0.02％の割合になる
ように加えて調製する。
反応停止液としては0.01％のアジ化ナトリウムを含む
0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH4.0）を用いる。
0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH4.0）を用いる。
標準抗原希釈液は正常仔牛血清（非働化処理56℃,30
分間）,EDTA 3Na,塩化ナトリウム、アジ化ナトリウム
を0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中に各々18.1％,10m
M,0,1％となるように含有せしめて調製する。
分間）,EDTA 3Na,塩化ナトリウム、アジ化ナトリウム
を0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中に各々18.1％,10m
M,0,1％となるように含有せしめて調製する。
まず検体および既知濃度の標準抗原を反応希釈液によ
って11倍希釈し、あらかじめ洗浄したウェルに100μ
ずつ注入し、37℃で１時間インキュベーションした。生
食水で洗浄し、次に至適濃度の酵素標識抗体100μを
加え、37℃で１時間インキュベーションした。再び生食
水で洗浄し、発色液100μを加え、37℃で１時間イン
キュベーションした。0.01％アジ化ナトリウム液100μ
を加えて反応を停止させOD420nm吸光値を測定し、BFP
値を算出した。
って11倍希釈し、あらかじめ洗浄したウェルに100μ
ずつ注入し、37℃で１時間インキュベーションした。生
食水で洗浄し、次に至適濃度の酵素標識抗体100μを
加え、37℃で１時間インキュベーションした。再び生食
水で洗浄し、発色液100μを加え、37℃で１時間イン
キュベーションした。0.01％アジ化ナトリウム液100μ
を加えて反応を停止させOD420nm吸光値を測定し、BFP
値を算出した。
検体の内訳は、腎移植症例延べ17例であり、急性拒絶
反応８例、慢性拒絶反応３例、非拒絶状態６例である。
反応８例、慢性拒絶反応３例、非拒絶状態６例である。
対象症例より採取した血液は、通常手段を用いて速や
かに血清に分離した後、−20℃以下で凍結保存し、測定
直前に自然解凍し、検体とした。血清中のBFP量は急性
拒絶反応では平均236.2±141.5ng/ml、慢性拒絶反応で
は平均133.0±53.7ng/mlで、cut off値を75ng/mlとする
と、各々100％（8/8）、66.6％（2/3）の陽性率を呈す
る一方、非拒絶状態では59.2±15.6ng/mlで陽性率０％
であった。肝障害を合併したのは、急性症例中の1/8、
慢性症例中の1/3のみであり、ひどい溶血反応を合併し
た症例も無かった（第１図参照）。
かに血清に分離した後、−20℃以下で凍結保存し、測定
直前に自然解凍し、検体とした。血清中のBFP量は急性
拒絶反応では平均236.2±141.5ng/ml、慢性拒絶反応で
は平均133.0±53.7ng/mlで、cut off値を75ng/mlとする
と、各々100％（8/8）、66.6％（2/3）の陽性率を呈す
る一方、非拒絶状態では59.2±15.6ng/mlで陽性率０％
であった。肝障害を合併したのは、急性症例中の1/8、
慢性症例中の1/3のみであり、ひどい溶血反応を合併し
た症例も無かった（第１図参照）。
腎移植症例２例の臨床経過を例示する。
症例１は移植後４日目から拒絶反応が起こり、ステロ
イド大量療法が効かず、OKT3（抗リンパ球血清）で鎮静
化した症例である。血清BFPは、血清Cr（SCr）の変動に
若干先行して上昇し、急性拒絶反応の鎮静に伴い速やか
に正常化（低下）していた（第２図Ａ参照）。
イド大量療法が効かず、OKT3（抗リンパ球血清）で鎮静
化した症例である。血清BFPは、血清Cr（SCr）の変動に
若干先行して上昇し、急性拒絶反応の鎮静に伴い速やか
に正常化（低下）していた（第２図Ａ参照）。
症例２は腎移植した患者の拒絶反応の反復により透析
の再開に陥った症例である。機能のほぼ廃絶したgraft
（移植腎）への激しい拒絶反応が外来通院中に再燃、最
終的に移植腎摘出手術（再摘出術）に至った。血清BFP
は移植手術の直前に（手術当日朝）をピークに、わずか
２日で正常化していた（第２図Ｂ参照）。
の再開に陥った症例である。機能のほぼ廃絶したgraft
（移植腎）への激しい拒絶反応が外来通院中に再燃、最
終的に移植腎摘出手術（再摘出術）に至った。血清BFP
は移植手術の直前に（手術当日朝）をピークに、わずか
２日で正常化していた（第２図Ｂ参照）。
［効 果］ 以上のことから明らかなように、移植症例において、
拒絶反応と血清中のBFPとの間に極めて高い相関関係が
見られ、血清BFPが拒絶反応に対する新たなモニタリン
グ手段として、臨床上利用し得ることが明らかとなっ
た。
拒絶反応と血清中のBFPとの間に極めて高い相関関係が
見られ、血清BFPが拒絶反応に対する新たなモニタリン
グ手段として、臨床上利用し得ることが明らかとなっ
た。
第１図は、腎移植に伴なう拒絶反応患者の血清中BFP量
を示すものである。 第２図Ａ及びＢは、腎移植症例の臨床経過を示すもので
ある。
を示すものである。 第２図Ａ及びＢは、腎移植症例の臨床経過を示すもので
ある。
Claims (5)
- 【請求項１】抗塩基性胎児蛋白抗体を使用する抗原抗体
反応に基づく血清中の塩基性胎児蛋白を測定することを
特徴とする移植拒絶反応検査法。 - 【請求項２】前記抗原又は抗体が酵素標識されているこ
とを特徴とする請求項１に記載の検査法。 - 【請求項３】前記抗塩基性胎児蛋白抗体を使用する抗原
抗体反応をサンドイッチ法で行なうことを特徴とする請
求項１又は２に記載の検査法 - 【請求項４】前記抗塩基性胎児蛋白抗体が、夫々認識す
る抗原決定基が異なる第１モノクローナル抗体および第
二モノクローナル抗体から成ることを特徴とする請求項
３に記載の検査法。 - 【請求項５】移植拒絶反応が腎移植に伴なうものである
ことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の
検査法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24980590A JP2801077B2 (ja) | 1990-09-19 | 1990-09-19 | 移植拒絶反応検査法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24980590A JP2801077B2 (ja) | 1990-09-19 | 1990-09-19 | 移植拒絶反応検査法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04128656A JPH04128656A (ja) | 1992-04-30 |
| JP2801077B2 true JP2801077B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=17198474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24980590A Expired - Fee Related JP2801077B2 (ja) | 1990-09-19 | 1990-09-19 | 移植拒絶反応検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2801077B2 (ja) |
-
1990
- 1990-09-19 JP JP24980590A patent/JP2801077B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04128656A (ja) | 1992-04-30 |
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