ES2617918T9 - Biomarcador para trastornos mentales, incluyendo trastornos cognitivos, y método de utilización de dicho biomarcador para la detección de trastornos mentales, incluyendo los trastornos cognitivos - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Biomarcador para trastornos mentales, incluyendo trastornos cognitivos, y método de utilización de dicho biomarcador para la detección de trastornos mentales, incluyendo los trastornos cognitivos

La presente invención se refiere a nuevos biomarcadores de deterioro cognitivo, incluyendo el deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer y a métodos de detección de deterioro cognitivo utilizando dichos biomarcadores. Asimismo, la presente invención se refiere a nuevos biomarcadores para enfermedades neurológicas no demencias tales como la depresión, la esquizofrenia, etc., y a métodos para la detección de enfermedades neurológicas no demencias utilizando dichos biomarcadores.

Antecedentes de la técnica

Los medios utilizados comúnmente para diferenciar entre los estados normales y no normales de un sujeto humano utilizando sus materiales biológicos son principalmente los que han sido utilizados en el campo del diagnóstico. Los métodos utilizados más frecuentemente son los que presentan como dianas biomarcadores en sangre. En el presente campo se ha realizado una medición comparativa de la cantidad de una proteína específica o péptido que presenta un peso molecular inferior a 10.000 o, en el caso de una proteína enzimática, las actividades enzimáticas en muestras de sujetos (sanos) normales y las procedentes de individuos enfermos para ayudar al diagnóstico. En la presente memoria, antes de someter a ensayo muestras reales, se realizan mediciones en un número fijo de muestras procedentes de controles sanos y de pacientes con determinadas enfermedades con respecto a la cantidad o cantidades o actividad (actividades) de proteínas o péptidos específicos individuales o múltiples y se determinan los intervalos respectivos de los valores anormales y normales. A continuación, se analiza la muestra que debe evaluarse mediante el mismo método y el valor resultante se evalúa con respecto a si se encuentra en el intervalo normal o en un intervalo anormal.

En las mediciones reales, la cantidad o cantidades de la proteína o proteínas o péptido o péptidos especificados en las muestras de ensayo, sin modificación o después de dilución, se determinan mediante la utilización de un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) que utiliza un anticuerpo primario o secundario marcado con un enzima que reacciona con un sustrato que rinde un color con la reacción, un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA, por sus siglas en inglés), un radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés), que utiliza un anticuerpo primario o secundario marcado con un isótopo radioactivo y, en el caso de que la proteína sea un enzima, la medición de la actividad del enzima mediante la adición del sustrato del mismo y la determinación de la intensidad del color producido, etc. Estos métodos basados en anticuerpos se denominan métodos de marcaje enzimática, fluorescente o radioisotópico, respectivamente. Además, existe un método en el que un producto de reacción enzimática derivado del sustrato correspondiente se determina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Adicionalmente, existe un método en el que se combina la HPLC con un espectrómetro de masas, denominado CL- EM/EM, y existe un método denominado seguimiento de la reacción seleccionada (SRM, por sus siglas en inglés)/seguimiento de múltiples reacciones (MRM, por sus siglas en inglés) que utiliza CL-EM/EM. En otro método para determinar la concentración en una muestra, se somete a un pretratamiento apropiado y se lleva a cabo la separación de las proteínas o péptido mediante electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE) y se determina la proteína o péptido diana mediante tinción de plata, tinción de azul de Coomassie o tinción inmunológica (transferencia western) que utiliza un anticuerpo con diana en la proteína o péptido. Todavía adicionalmente, existe un método que utiliza la espectrometría de masas para determinar la cantidad de proteína o péptido diana en muestras fraccionadas mediante cromatografía de columna. En lugar de cromatografía de columna también pueden utilizarse chips de proteínas y perlas magnéticas con el fin de realizar el pretratamiento.

Además, dichos inventores han desarrollado un método inmuno-EM en el que una proteína o péptido diana se captura en perlas (incluyendo perlas magnéticas) con anticuerpo unido a la proteína o péptido, se eluye de las perlas y se determina mediante espectrometría de masas. Además, se ha informado del análisis de proteínas intactas mediante espectrometría de masas utilizando los métodos anteriormente indicados tras la digestión con tripsina, etc. (PTL 1). En este método, se seleccionan proteínas diana intactas mediante fraccionamiento o mediante adsorción a un adsorbente específico de las mismas y después se determinan mediante espectrometría de masas.

El número de pacientes que sufren de deterioro cognitivo, tal como la enfermedad de Alzheimer, se está incrementando rápidamente a la vez que el incremento de la población de edad avanzada en Japón. Se estima que el número de pacientes era de 1,3 millones de 1995 y de 1,9 millones en 2005 y que alcanzará aproximadamente 3,0 millones en 2020. Se informa de que el 60% a 90% de los casos de deterioro cognitivo se deben a enfermedad de Alzheimer. Debido a que la manifestación de la enfermedad de Alzheimer es no sólo la pérdida de memoria sino varias alteraciones en el trabajo diario, el incremento de los pacientes de esta enfermedad se está convirtiendo en una cuestión social importante que debe resolverse. En Japón, debido a que el hidrocloruro de donepezilo, un inhibidor de esterasa anti-acetilcolina, se ha encontrado disponible para el tratamiento médico de la enfermedad de Alzheimer desde 1999, se ha podido 'enlentecer' eficientemente el avance del deterioro cognitivo en estos pacientes en los casos diagnosticados en un estadio temprano. De esta manera, en la medicación de la enfermedad de Alzheimer, la cuestión más importante es el 'diagnóstico precoz' para tratar los pacientes eficazmente con los fármacos actuales y los fármacos futuros.

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A continuación, se proporcionan los criterios principales de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer descritos en el DSM IV, que ha sido publicado por la American Psychiatric Association (NPL 1).

A. El desarrollo de múltiples déficits cognitivos manifestados en tanto:

(1) deterioro de la memoria (deterioro de la capacidad de aprender nueva información o de recordar información previamente aprendida)

(2) una (o más) de las alteraciones cognitivas siguientes:

a) afasia (alteración del lenguaje)

b) apraxia (deterioro de la capacidad de realizar actividades motoras a pesar de presentar una función motora intacta)

c) agnosia (fracaso en el reconocimiento o identificación de los objetos a pesar de presentar una función sensorial intacta)

d) alteraciones del funcionamiento ejecutivo (es decir, planificación, organización, secuenciación y abstracción).

B. Los déficits cognitivos en los criterios A1 y A2 provocan un deterioro significativo del funcionamiento social o laboral y representan un declive significativo respecto a un nivel de funcionamiento previo.

Existen varios tipos de trastorno neurológico relacionados con la enfermedad de Alzheimer (EA). Debido a que la disfunción cognitiva aparece gradualmente en la demencia, también en la EA, existe un pre-estadio de demencia similar al estado de enfermedad. Este estadio se denomina deterioro cognitivo leve (DCL). En los Estados Unidos, el 10% del DCL se desarrolla en EA en 1 año y el 50% del DCL se desarrolla en EA en 4 años. El DCL se define como una condición caracterizada por un declive cognitivo recién adquirido que se manifiesta en una medida que excede la esperable por edad o nivel de formación, pero que no provoca un deterioro funcional significativo y que no supone alteraciones de la vida diaria. La demencia frontotemporal (degeneración lobular frontotemporal (DLF)) se manifiesta en pérdida de la conciencia personal, pérdida de la conciencia social, hiperoralidad y comportamiento perseverante estereotipado. Estas características clínicas son diferentes de las de la EA. La DLF incluye la enfermedad de Pick, que se caracteriza microscópicamente por cuerpos de Pick habitualmente presentes en el córtex del lóbulo temporal límbico, paralímbico y ventral. La demencia con cuerpos de Lewy (DCL) se caracteriza por ser una enfermedad progresiva y entre los síntomas psiquiátricos se incluyen ansiedad, depresión, alucinaciones (habitualmente visuales) y delirios (creencias falsas). Se cree que la DCL es el segundo subtipo más común y que 10% a 30% de las demencias son DCL. Los síntomas de la DCL están causados por la acumulación histológica de cuerpos de Lewy. La DLF y DCL pertenecen a la clase de enfermedades neurológicas demencias ya que también se produce pérdida de memoria, de capacidad de resolución de problemas y de capacidad de mantener el control emocional (NPL 1). En la descripción de la presente patente, el deterioro cognitivo incluye la EA, la DCL y las enfermedades neurológicas demencias.

Los ensayos de cribado para la demencia utilizados ampliamente son la escala de demencia de Hasegawa revisada (HDS-R, por sus siglas en inglés) y el miniexamen de estado mental (MMSE, por sus siglas en inglés). En estos ensayos de cribado, el evaluador realiza varias preguntas y evalúa el nivel de deterioro cognitivo de cada sujeto mediante puntuaciones. HDS-R es una versión revisada de la HDS publicada en 1991. En la HDS-R, el ensayo consiste de 9 preguntas para analizar la orientación, memoria, cálculo, retentiva y capacidad de recuerdo, y sentido común. La puntuación total es 30 y una persona con una puntuación inferior a 23 se sospecha que presenta demencia. MMSE fue desarrollado en Estados Unidos para cribar y diagnosticar la demencia y para analizar la función cognitiva global, con ítems que evalúan la orientación, el recuerdo de palabras, la atención y el cálculo, las capacidades lingüísticas y la capacidad visuoespacial (capacidad de dibujo). Este ensayo consiste de 11 preguntas y la puntuación máxima es 30 y una persona con una puntuación inferior a 23 se sospecha que presenta demencia. Los resultados de la HDS-R y la MMSE coinciden. Ambos son utilizados para el cribado, no para el diagnóstico y ni para la estadificación del progreso de la enfermedad de la demencia (NPL 1).

Las técnicas de imagen neurológica para la demencia son la tomografía computerizada (TC) y las imágenes de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés), las cuales evalúan los cambios morfológicos tales como la atrofia cerebral y la dilatación ventricular, y la tomografía computerizada de emisión de fotones únicos (SPECT, por sus siglas en inglés), que analiza el flujo sanguíneo en regiones del cerebro y la PET (por sus siglas en inglés), que muestra el metabolismo cerebral a partir de la medición del consumo de oxígeno y azúcar. Las técnicas de imagen nuclear SPECT y PET pueden identificar la disfunción neuronal al estadio preclínico (NPL 1). Sin embargo, estas técnicas de neuroimagen no pueden ser utilizadas generalizadamente en los hospitales debido a que requieren instalaciones especiales para llevar a cabo las técnicas de imagen nuclear y las neuroimágenes pueden no ser un ensayo objetivo ya que el diagnóstico por imágenes es completamente dependiente de las habilidades del médico que analiza las imágenes.

De esta manera, los presentes métodos de cribado y diagnóstico de la demencia, incluyendo la EA, dependen de ensayos que no son objetivos y que dependen de caros instrumentos, por lo que resulta muy difícil utilizar los ensayos actualmente disponibles para el cribado de los estadios tempranos de deterioro cognitivo. En el caso de

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que dispusiésemos de biomarcadores sanguíneos (séricos/plasmáticos) de deterioro cognitivo, que permitiesen un ensayo objetivo utilizando especímenes fáciles de obtener, podríamos identificar el deterioro cognitivo en un estadio temprano (preclínico) mediante la utilización de un análisis de sangre con dicho biomarcador. La presente patente proporciona nuevos biomarcadores y un nuevo y potente método diagnóstico para el deterioro cognitivo mediante la utilización de dichos biomarcadores y biomarcadores descritos en la presente memoria. Además, la presente patente proporciona un método diagnóstico y nuevos biomarcadores para enfermedades neurológicas no demencias tales como la depresión, la esquizofrenia, etc.

Lista de referencias

Literatura de patentes

LTP 1, JP-A-2004-333274 LTP 2, JP-A-2006-308533

Literatura no de patentes

LNP 1, "The better understanding of Alzheimer's disease", editado por Imaharu Nakano y HIdehiro Mizusawa, Nagai Shoten Co., Ltd., 2004 (en japonés)

LNP 2, Benkirane N. et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, 26279-26285, 1993.

El documento n° WO03087768 (A2) da a conocer la provisión de dianas mitocondriales para ensayos de cribado de fármacos y para la intervención terapéutica en el tratamiento de enfermedades asociadas a la función mitocondrial alterada. Se proporcionan secuencias de aminoácidos completas [SEC ID n° 1 a n° 3025] de polipéptidos que comprenden el proteoma mitocondrial del corazón humano utilizando proteínas fraccionadas derivadas de preparaciones mitocondriales altamente purificadas con el fin de identificar componentes moleculares mitocondriales previamente no identificados.

Descripción resumida de la invención

Problema técnico

La presente invención presenta como objetivos la presentación de métodos para la detección del deterioro cognitivo, incluyendo el deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer, utilizando una proteína o péptido parcial de la misma que difiere en la presencia o ausencia de la misma, o en la cantidad de la misma en sujetos con deterioro no cognitivo (incluyendo personas sanas; sujetos humanos que pueden encontrarse afectados por cualquier enfermedad y no afectados por deterioro cognitivo) y pacientes de deterioro cognitivo, y presenta como objetivo adicional presentar biomarcadores que comprenden dicha proteína y dicho péptido parcial para la utilización en la detección del deterioro cognitivo, incluyendo el deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer. Asimismo, la presente invención presenta como objetivo presentar nuevos biomarcadores para enfermedades neurológicas no demencias tales como la depresión, la esquizofrenia, etc., además de métodos para la detección de deterioro cognitivo mediante la utilización de dichos biomarcadores.

Solución al problema

Los presentes inventores han investigado con el fin de encontrar medios para detectar el deterioro cognitivo y han encontrado un péptido capaz de detectar el deterioro cognitivo y enfermedades psiquiátricas, entre ellas el deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer, en el suero. Dichos péptidos encontrados en la presente invención resultan significativos como biomarcador para la detección en el caso del suero, no sólo en otros materiales biológicos tales como la sangre, el plasma, el líquido cerebroespinal y la orina. Asimismo, la proteína o el péptido que es el origen de dichos péptidos (en lo sucesivo denominados proteínas o péptidos intactos) también resulta significativo como biomarcador. La presente invención proporciona un péptido o proteína según se define en la reivindicación 1, un método in vitro para la detección de enfermedades psiquiátricas o deterioro cognitivo según se define en la reivindicación 5, y un kit según se define en la reivindicación 7 o 8. Se dan a conocer realizaciones ventajosas en las reivindicaciones dependientes respectivas.

Específicamente, dichos inventores han encontrado un biomarcador que comprende por lo menos una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste de precursor de neurexina-2-beta que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 1, un precursor de protrombina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 3, pendrina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 6, coatómero subunidad zeta-1 que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 8, precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 1,0, precursor de gelsolina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 13, un precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 15, subunidad del factor 3 de inicio de traducción eucariótica que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 18, y proteína 27 que

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contiene repeticiones ricas en leucinas que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 20, podrían utilizarse como biomarcadores para la detección de enfermedad psiquiátrica o deterioro cognitivo.

Además, dichos inventores han encontrado un biomarcador que comprende por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo que consiste de péptido NRX2B derivado de precursor de neurexina-2-beta que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2, un péptido derivado de precursor de protrombina, THRB(R-), que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 4, un péptido derivado de precursor de protrombina, THRB(R+), que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 5, el péptido S26A4 derivado de pendrina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 7, péptido COPZ1 derivado del coatómero subunidad zeta-1 que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 9, péptido RARR2(S-) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 11, péptido RARR2(S+) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 12, el péptido GELS derivado de precursor de la gelsolina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 14, el péptido CLUS(SDVP N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 16, el péptido CLUS(RFFT N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 17, péptido EIF3J derivado derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 19, y el péptido LRC27 derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 21, podrían utilizarse como biomarcadores para la detección de enfermedad psiquiátrica o deterioro cognitivo.

Estos inventores han completado la presente invención al conseguir la determinación simultánea de esta multitud de proteínas y péptidos parciales de las mismas mediante la utilización del método de cromatografía líquida de alto rendimiento bidimensional-MALDI TOF-EM y del método de inmuno-EM.

[1] Un biomarcador para la detección de enfermedades psiquiátricas o deterioro cognitivo que comprende un fragmento de proteína o péptido no inferior a 5 residuos aminoácidos que surge de por lo menos una proteína o péptido seleccionado de entre el grupo que consiste de precursor de neurexina-2-beta consistente de la secuencia de aminoácidos expresada en la SEC ID n° 1, un precursor de protrombina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 3, pendrina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 6, coatómero subunidad zeta-1 que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 8, precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 10, precursor de gelsolina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 13, un precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 15, subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 18, y proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 20.

[2] Un biomarcador para la detección de enfermedades psiquiátricas que comprende por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo que consiste del péptido NRX2B derivado de precursor de neurexina-2-beta que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2, un péptido derivado de precursor de protrombina, THRB(R-), que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 4, un péptido derivado de precursor de protrombina, THRB(R+), que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 5, el péptido S26A4 derivado de pendrina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 7, péptido COPZ1 derivado del coatómero subunidad zeta-1 que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 9, péptido RARR2(S-) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 11, péptido RARR2(S+) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 12, el péptido GELS derivado de precursor de la gelsolina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 14, péptido CLUS(SDVP N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 16, el péptido CLUS (RFFT N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 17, péptido EIF3J derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótico, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 19 y el péptido LRC27 derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucina, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 21.

[3] Un biomarcador para la detección de deterioro cognitivo que comprende por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo que consiste del péptido NRX2B derivado de precursor de neurexina-2-beta que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2, un péptido derivado de precursor de protrombina, THRB(R-), que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 4, un péptido derivado de precursor de protrombina, THRB(R+), que consiste de la secuencia de aminoácidos

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expresada mediante la SEC ID n° 5, el péptido S26A4 derivado de pendrina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 7, péptido COPZ1 derivado del coatómero subunidad zeta-1 que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 9, péptido RARR2(S-) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 11, péptido RARR2(S+) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 12, el péptido GELS derivado de precursor de la gelsolina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 14, el péptido CLUS(SDVP N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 16, el péptido CLUS(RFFT N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 17, péptido EIF3J derivado derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 19, y el péptido LRC27 derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 21.

[4] Un biomarcador de deterioro cognitivo que comprende los péptidos seleccionados de entre el grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2, 5, 7, 9, 11, 12, 14 y 16 que se encuentra presente o incrementada en el material biológico procedente de pacientes de deterioro cognitivo en comparación con el material biológico procedente de sujetos que no sufren de una enfermedad psiquiátrica.

[5] Un biomarcador de deterioro cognitivo que comprende los péptidos seleccionados de entre el grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la sEc ID n° 4, 17, 19 y 21, que no se encuentra presente o se encuentra reducida en el material biológico procedente de pacientes de deterioro cognitivo en comparación con el material biológico procedente de sujetos que no sufren de una enfermedad psiquiátrica.

[6] Un biomarcador de enfermedad de Alzheimer que comprende los péptidos seleccionados de entre el grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2 que se encuentra presente o incrementada en material biológico procedente de pacientes de enfermedad de Alzheimer en comparación con material biológico de sujetos que no sufren de una enfermedad neurológica no demencia.

[7] Un biomarcador de enfermedad de Alzheimer que comprende los péptidos seleccionados de entre el grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 4 que no se encuentra presente o se encuentra reducido en material biológico procedente de pacientes de enfermedad de Alzheimer en comparación con material biológico de sujetos que no sufren de una enfermedad neurológica no demencia.

[8] Método para la detección de enfermedad psiquiátrica que implica la determinación en material biológico de por lo menos un biomarcador de enfermedad psiquiátrica tal como se ha indicado en [1] o [2].

[9] Método para la detección de deterioro cognitivo que implica la determinación en material biológico de por lo menos un biomarcador de deterioro cognitivo tal como se ha indicado en [1] o [3].

[10] Método para la detección de deterioro cognitivo en el que se evalúa si el paciente sufre de deterioro cognitivo en el caso de que, tras la determinación en material biológico de por lo menos un biomarcador de deterioro cognitivo tal como se indica en [4], se detecta la presencia de dicho biomarcador en cantidad más elevada que en sujetos que no sufren de una enfermedad psiquiátrica.

[11] Método para la detección de deterioro cognitivo en el que se evalúa que el paciente sufre de deterioro cognitivo en el caso de que, tras la determinación en material biológico de por lo menos un biomarcador de deterioro cognitivo tal como se ha indicado en [5], se detecta la presencia de dicho biomarcador en cantidad inferior que en sujetos que no sufren de una enfermedad psiquiátrica.

[12] Método para la detección de una enfermedad psiquiátrica tal como se indica en [8], en el que la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento de inmunotransferencia, transferencia western, un método de anticuerpos marcados enzimática, fluorescente o radioisotópicamente, espectrometría de masas, un método de inmuno-EM o un método de resonancia del plasmón superficial.

[13] Método para la detección de deterioro cognitivo tal como se indica en [9] a [11], en el que la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento de inmunotransferencia, transferencia western, un método de anticuerpos marcados enzimática, fluorescente o radioisotópicamente, espectrometría de masas, un método de inmuno-EM o un método de resonancia del plasmón superficial.

[14] Un kit para la detección de una enfermedad psiquiátrica para determinar por lo menos un biomarcador tal como se indica en [1] o [2].

[15] Un kit para la detección de deterioro cognitivo para determinar por lo menos un biomarcador tal como se indica en [1], [3] a [5].

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[16] Un kit para la detección de una enfermedad psiquiátrica que contiene un anticuerpo o aptámero contra por lo menos un biomarcador tal como se indica en [1] o [2].

[17] Un kit para la detección de una enfermedad psiquiátrica que contiene un anticuerpo o aptámero contra por lo menos un biomarcador tal como se indica en las reivindicaciones [1], [3] a [5].

[18] Un kit para la detección tal como se indica en [16] o [17], en el que el anticuerpo o aptámero se solidifica sobre una placa o placas.

Efectos beneficiosos de la invención

Según la presente invención, resulta posible diagnosticar un sujeto respecto a si sufre una enfermedad psiquiátrica o deterioro cognitivo mediante la determinación en material biológico obtenido de dicho sujeto del tipo y cantidad de por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo que consiste del péptido NRX2B derivado de precursor de la neurexina-2-beta que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada en la SEC ID n° 2, péptido THRB(R-) derivado de precursor de protrombina, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada por la SEC ID n° 4, el péptido THRB(R+) derivado de precursor de protrombina, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 5, péptido S26A4 derivado de pendrina, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 7, péptido COPZ1 derivado de subunidad zeta-1 de coatómero, que consiste de la secuencia de amionácidos expresada mediante la SEC ID n° 9, péptido RARR2(S-) derivado de precursor de proteína respondedora 2 de receptor de ácido retinoico, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 11, péptido RARR2(S+) derivado de precursor de proteína respondedora 2 del receptor de ácido retinoico, que consiste de la secuencia de aminoácido expresada mediante la SEC ID n° 12, péptido GELS derivado de precursor de gelsolina, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 14, el péptido CLUS(SDVP N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 16, el péptido CLUS(RFFT N-term.) derivado de precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 17, péptido EIF3J derivado derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 19, y el péptido LRC27 derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la sEc ID n° 21. Además, resulta posible diagnosticar un sujeto respecto a si sufre de enfermedad de Alzheimer mediante la comparación con el incremento en el material biológico de pacientes de enfermedad neurológica no demencia mediante la determinación de la cantidad de péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2 y resulta posible diagnosticar un sujeto respecto a si sufre de enfermedad de Alzheimer mediante la comparación con la reducción en el material biológico de pacientes de enfermedad neurológica no demencia mediante la determinación de la cantidad de péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 4.

La presente invención presenta un sistema diagnóstico que presenta una elevada precisión y especificidad. La presente invención permite obtener un diagnóstico altamente preciso del deterioro cognitivo en el que no se disponen de métodos de ensayo específico para materiales biológicos tales como la sangre. Además, los biomarcadores dados a conocer en la presente invención resultan altamente útiles para evaluar la eficacia de los fármacos.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La figura 1 ilustra el aislamiento de suero de enfermedad de Alzheimer mediante el método de CL-MALDI TOF 2D-EM (Ejemplo 1).

[Fig. 2] La figura 2 ilustra el caso del Marcador A, que es un ejemplo del resultado del análisis diferencial. Tal como se muestra en la figura 3, el Marcador A es el péptido NRX2B derivado precursor de neurexina-2-beta. La figura 2A ilustra una comparación entre ADN, DCL y eA, y la figura 2B ilustra una comparación entre ADN, EA, ENtodas, ENdem y ENnon. Para cada muestra el valor promedio (dividido por 1,000) y la (SD) (dividida por 1,000) son los siguientes: A) ADN 0,1 (0,1); DCL 45,8 (42,2); EA 41,7 (22,2). B) ADN 0,1 (0,2); EA 34,0 (27,8); NDtodos 19,2 (15,8); NDdem 24,3 (20,8); NDnon 14,0 (6,1). c), D) y E) ilustran, respectivamente, la curva COR de las comparaciones DCL vs. ADN, Ea vs. ADN y EA vs. ENnon (Ejemplo 1).

[Fig. 3] La figura 3 ilustra el espectro de EM/EM del Marcador A (SEC ID n° 2, NRX2B) obtenido mediante la utilización del espectrómetro de masas TOF/TOF (Ejemplo 1).

[Fig. 4] La figura 4 ilustra la comparación entre los sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y los pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo la demencia, para THRB(R-) (A) y (B) de la figura 4) y THRB(R+) (C) y (D) de la figura 4) en suero (Ejemplo 1).

[Fig. 5] La figura 5A ilustra la comparación de cada individuo entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y

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pacientes de deterioro cognitivo (DCL, EA) para THRB(R-) y THRB(R+) en suero. La figura 5B ilustra la curva COR de la comparación de EA vs. ENnon para THRB(R-) en suero. (Ejemplo 1).

[Fig. 6] La figura 6 ilustra la comparación (A) y (B) de la figura 6 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y los pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo demencia, para S264A en suero, y la comparación de (C) y (D) de la figura 6 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo demencia, para COPZ1 en suero (Ejemplo 1).

Fig. 7] La figura 7 ilustra la comparación de cada individuo entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y pacientes de deterioro cognitivo (DCL, EA) para PARR2(S-) (A) de la figura 7 y PARR2(S+) (B) de la figura 7 en suero (Ejemplo 1).

[Fig. 8] La figura 8 lustra la comparación (A) y (B) de la figura 8 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo demencia, para GELS en suero (Ejemplo 1).

[Fig. 9] La figura 9 ilustra la comparación (A) y (B) de la figura 9 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y los pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo demencia, para CLUS(SDVP N-term.) en suero, y la comparación de (C) y (D) de la figura 9 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo demencia, para CLUS(RFFT N-term.) en suero (Ejemplo 1).

[Fig. 10] La figura 10 ilustra la comparación (A) y (B) de la figura 10 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y los pacientes de enfermedad psiquiátrica, incluyendo demencia, para EIF3J en suero, y la comparación de (C) y (D) de la figura 10 entre sujetos de enfermedad no psiquiátrica (ADN) y pacientes de deterioro cognitivo (DCL, Ea) para LRC27 en suero (Ejemplo 1).

[Fig. 11] La figura 11 ilustra el espectro de masas del péptido NRX2B captura y detectado mediante el método de inmuno-EM utilizando un anticuerpo específico de NRX2B de suero de pacientes de EA y de DCL. La figura a la derecha es una vista ampliada de las partes señaladas con flechas en la figura de la izquierda. En la figura de la derecha se muestra para cada pico el péptido NRX2B endógeno (flechas continuas) y el péptido sintético NRX2B marcado isotópicamente (flechas discontinuas) (Ejemplo 4).

Descripción de realizaciones

La presente invención es un método para determinar el tipo y cantidad de proteína intacta y/o péptido parcial de la misma para el caso de que el sujeto de ensayo sufra de deterioro cognitivo así como para el diagnóstico de si el sujeto de ensayo sufre de deterioro cognitivo y para el caso de que al sujeto de ensayo se le haya diagnostico una enfermedad psiquiátrica. Se dice generalmente de un péptido que es una entidad química constituida mediante polimerización de aminoácidos, de menos de 10.000 de peso molecular, o mediante polimerización de varios y hasta menos de aproximadamente 50 residuos aminoácidos. Aunque en la presente invención puede utilizarse un péptido parcial de una proteína intacta como biomarcador para la detección del deterioro cognitivo, se define dicho péptido parcial como un péptido de menos de 10.000 de peso molecular que consiste de una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína intacta. Dicho péptido puede aparecer como péptido parcial durante la expresión mediante transcripción seguido de la síntesis mediante traducción antes de la maduración en una proteína intacta o como péptido producido mediante digestión enzimática en el cuerpo tras la síntesis de la proteína intacta. Resulta posible que, en el caso de que el cuerpo se encuentre en un estado anormal en el que sufre de una enfermedad tal como el deterioro cognitivo, el mecanismo para la síntesis y regulación de las proteínas se encuentre desregulado. En otras palabras, la presente invención además es un método para determinar si el sujeto de ensayo se encuentra en un estado normal o si sufre de deterioro cognitivo, mediante la utilización del grado de síntesis de proteínas y/o la digestión de proteínas a modo de indicador. La detección del deterioro cognitivo en la presente invención se refiere a la evaluación y diferenciación, es decir, el diagnóstico de si el sujeto de ensayo sufre de deterioro cognitivo. La presente invención puede incluir además la evaluación del riesgo del paciente de sufrir de un deterioro cognitivo más grave.

Específicamente, en un método, entre los ejemplos de proteína intacta que pueden utilizarse para el deterioro cognitivo se incluyen el precursor de la neurexina-2-beta, que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada en la SEC ID n° 1, un precursor de protrombina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 3, pendrina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 6, coatómero subunidad zeta-1 que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 8, precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 10, precursor de gelsolina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 13, un precursor de clusterina que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 15, subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 18, y proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 20, y además pueden utilizarse con el mismo propósito los fragmentos peptídicos que comprenden péptidos parciales de no menos de 5 residuos aminoácidos de dichas proteínas intactas.

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Todavía adicionalmente, un ejemplo de biomarcadores para el deterioro cognitivo incluye los péptidos parciales que consisten de la secuencia de aminoácidos expresada en la SEC ID n° 2 del péptido NRX2B derivado del precursor de la neurexina-2-beta, SEC ID n° 4 del péptido THRB(R-) derivado del precursor de protrombina, SEC iD n° 5 del péptido THRB(R+) derivado del precursor de protrombina, SEC ID n° 7 del péptido S26A4 derivado de pendrina, SEC ID n° 9 del péptido COPZ 1 derivado de la subunidad zeta-1 del coatómero, SEC ID n° 11 del péptido RARR2(S-) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico, SEC ID n° 12 del péptido RARR2(S+) derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico, SEC ID n° 14 del péptido GELS derivado de gelsolina, SEC ID n° 16 del péptido CLUS(SDVP N-term.) derivado del precursor de clusterina, SEC ID n° 17 del péptido CLUS(RFFT N-term.) derivado del precursor de clusterina, SEC ID n° 19 del péptido EIF3J derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica, SEC ID n° 21 del péptido LRC27 derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas. En la presente invención, las proteínas y péptidos que consisten de las secuencias de aminoácidos obtenidas a partir de la SEC ID n° 1 o 2 mediante deleción, intercambio y/o adición de uno o unos cuantos aminoácidos pueden utilizarse como biomarcadores y se encuentran comprendidos dentro de la presente invención. La expresión "uno o unos cuantos" en la presente memoria se refiere a "uno o tres", preferentemente "uno o dos", o "uno". Además, entre los péptidos parciales que pueden utilizarse como biomarcadores se incluyen aquellos fragmentos peptídicos que consisten de no menos de 5 residuos aminoácidos que aparecen respectivamente a partir de la SEC ID n° 1 a n° 21. La base de la limitación de los fragmentos peptídicos que consisten de no menos de 5 residuos aminoácidos se proporciona en la descripción, posteriormente, en el documento no de patente n° 2. El documento informa de que un anticuerpo obtenido mediante la utilización del péptido IRGERA como inmunógeno, que era el extremo C-terminal (130-135) de la histona H3, reconoce el péptido IKGERA derivado mediante el intercambio de K por R y el péptido CGGGERA que se derivó mediante la deleción de IR seguido de la adición de CGG. Lo anterior demuestra que la inmunogenicidad (antigenicidad) es reconocida por un péptido de no menos de 4 residuos aminoácidos. Con el fin de expandir dicho resultado a otros péptidos aparte del extremo C-terminal de la histona H3, el número de residuos aminoácidos se define como no inferior a 5 en lugar de 4. Para construir dicho péptido de bajo peso molecular resulta importante que el método de detección y diferenciación utiliza medios inmunológicos, incluyendo la inmunotransferencia, ELISA y la inmuno-EM.

Debe indicarse que existen casos en los que se ha añadido una o más cadenas sacáridas a una proteína intacta o a un péptido parcial del mismo para formar entidades glucosiladas. Las proteínas y péptidos parciales en forma glucosilada también pueden utilizarse como biomarcadores para la detección del deterioro cognitivo.

También debe indicarse que, en la presente invención, el biomarcador puede cuantificarse o puede determinarse cualitativamente su presencia o ausencia.

La electroforesis bidimensional (E2-D) o la cromatografía bidimensional (C2-D) puede utilizarse en la presente invención para separar biomarcadores en materiales biológicos, incluyendo el suero. Pueden seleccionarse métodos cromatográficos conocidos de entre cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa y cromatografía de filtración en gel. También resulta posible cuantificar el método SRM/MRM en la tecnología CL- EM/EM. Además, el método de inmuno-EM que han desarrollado los presentes inventores, en el que la proteína o péptido diana se captura con perlas (incluyendo perlas magnéticas) con anticuerpo unido a la proteína o péptido, se eluye de las perlas y se determina mediante espectrometría de masas, permite la determinación conveniente de la presencia o ausencia o de la cantidad de proteína diana, fragmento de proteína o péptido sin utilizar E2-D o cromatografía.

Resulta posible utilizar el método dado a conocer en la presente invención para la evaluación en el estadio de disfunción cognitiva leve del sujeto de ensayo y por lo tanto podría resultar útil en medicina profiláctica. Además, la administración de psicoterapia y/o terapia farmacológica a pacientes con deterioro cognitivo se refleja en la cantidad de proteínas y péptidos parciales en materiales biológicos tales como el suero en el caso de que se haya inhibido la progresión del trastorno. Por lo tanto, mediante la medición de dichas proteínas y péptidos parciales resulta posible evaluar y determinar el efecto terapéutico.

El tipo y cantidad de una proteína en los materiales biológicos puede determinarse mediante diversos métodos. En el caso de que se haya caracterizado la proteína diana (incluyendo un fragmento de proteína y un péptido parcial) y en el caso de que ya se haya obtenido un anticuerpo (anticuerpo primario) del mismo, pueden utilizarse los métodos siguientes:

1. Inmunotransferencia

Éste es uno de los métodos más simples. El suero de ensayo en una cantidad fija (aproximadamente 1 microlitro) tras la dilución escalonada se aplica sobre una membrana apropiada, tal como una de nitrocelulosa, y se seca al aire. La membrana se trata con una solución de bloqueo que contiene una proteína, tal como BSA, se lava, se hace reaccionar con anticuerpo primario y se lava. A continuación, la membrana se hace reaccionar con anticuerpo secundario marcado para detectar el anticuerpo primario. Se lava la membrana y el marcaje se visualiza para medir su densidad.

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2. Transferencia western

Tras la separación mediante electroforesis unidimensional o bidimensional que implica el enfoque isoeléctrico o SDS-PAGE, se transfieren las proteínas sobre una membrana apropiada, tal como de nitrocelulosa, y se determinan las cantidades de las mismas, tal como en la inmunotransferencia anteriormente indicada, utilizando anticuerpo primario y anticuerpo secundario marcado.

3. ELISA

El anticuerpo contra la proteína o péptido parcial de la misma se fija en dicha placa en forma de una placa de microtitulación modificada químicamente. Se aplican en la placa cantidades apropiadas de las muestras tras la dilución escalonada y se incuban. Las proteínas y péptidos no capturados se eliminan mediante lavado. A continuación, se incuba la placa con anticuerpo secundario marcado con una sustancia fluorescente o quimioluminiscente o enzima. Tras la adición del sustrato respectivo, se mide la fluorescencia, quimioluminiscencia o luz visible debida a la reacción enzimática, para la evaluación y decisión.

A continuación, se ilustran ejemplos adicionales de métodos (ver LTP 2), aunque la invención no se encuentra limitada a dichos ejemplos.

4. Métodos que utilizan micromatrices (microchips)

Una micromatriz es un término general para dispositivos en los que se aplican ordenadamente materiales solidificados con afinidad para sustancias diana sobre un soporte sólido (placa). En la presente invención se aplican ordenadamente anticuerpos o aptámeros de proteínas y péptidos parciales. Se aplica una muestra de material biológico sobre la micromatriz para la fijación de proteínas o péptidos parciales diana y a continuación se incuba la micromatriz con anticuerpo secundario marcado con sustancia fluorescente o quimioluminiscente o enzima. Tras la adición del sustrato respectivo, se mide la fluorescencia, quimioluminiscencia o luz visible debida a la reacción enzimática.

5. Espectrometría de masas

En la espectrometría de masas, por ejemplo, el anticuerpo de una proteína o péptido parcial especificado se une a microperlas químicamente modificadas o placa (chip de proteínas). Las microperlas pueden ser perlas magnéticas. No existen requisitos para el material de la placa. El anticuerpo que debe utilizarse podría ser: (1) un anticuerpo que reconoce la forma de longitud completa de la proteína especificada únicamente, (2) un anticuerpo que reconoce únicamente un péptido parcial, (3) todos los anticuerpos que reconocen tanto la proteína especificada como su péptido parcial, o una combinación de (1) y (2), (1) y (3) o (2) y (3). Las muestras tras la dilución escalonada con solvente original o tampón se añaden a las microperlas o placa portadora del anticuerpo o anticuerpos y se incuban. Las proteínas y péptidos parciales no capturados se eliminan mediante lavado. La proteína o péptido parcial capturado con microperlas o placa se eluye y se analiza mediante espectrometría de masas con MALDI-TOF-EM, SELDI-TOF-EM, etc. Las mediciones se realizan con respecto a la masa e intensidad del pico debido a la proteína, fragmento de proteína o péptido parcial. Antes de las mediciones, se añade una cantidad fija de una sustancia que sirve de estándar interno al material biológico original y también se mide la intensidad del pico de la misma. La concentración de la diana en el material biológico original puede calcularse a partir de la proporción de intensidades del pico de la diana y del pico del estándar interno. Lo anterior se denomina método de inmuno-EM. Además, resulta posible la cuantificación, tras diluir la muestra con el solvente original o tampón, o tras la eliminación de parte de las proteínas, mediante separación por HPLC seguida de espectrometría de masas utilizando el método de ionización por electropulverización (IEP). De esta manera puede utilizarse el método de SRM/MRM para la cuantificación absoluta utilizando un péptido de estándar interno marcado isotópicamente.

Además, además de los métodos anteriormente indicados, resulta posible analizar proteínas y péptidos parciales mediante la utilización de 2-DE, resonancia del plasmón superficial, etc.

La presente invención incluye el método de detección del deterioro cognitivo a partir de la presencia o ausencia o cantidad del biomarcador anteriormente indicado tras aplicar el material biológico obtenido del sujeto de ensayo a 2- DE o resonancia del plasmón superficial.

Ejemplo 1

Descubrimiento de un péptido marcador para la detección del deterioro cognitivo utilizando la cromatografía líquida bidimensional (2D-CL)-MALDI TOF-EM.

(1) Muestras de suero

A continuación, los caracteres entre paréntesis son una abreviatura.

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Los sueros obtenidos de 20 pacientes de EA (enfermedad de Alzheimer), 20 pacientes ADN (sujetos que no sufren de enfermedad psiquiátrica y pacientes de edad y sexo correspondientes con EA, "N" significa normal) y 20 pacientes de ENtodas (enfermedad neurológica). ENtodas consiste de 10 pacientes ENdem (enfermedad neurológica demencia) y 10 ENnon (enfermedad neurológica no demencia). Además, ENdem consiste de demencia con cuerpos de Lewy y demencia frontotemporal, consistiendo cada uno de 5 casos y EDnon consiste de esquizofrenia y depresión, consistente cada uno de 5 casos.

(2) Métodos

Tras la adición de 475 pl de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% a cada uno de los 25 pl de suero, se sometieron a ebullición las muestras durante 15 min. a 100 grados. A continuación, con el fin de recuperar péptidos de un peso molecular de 10.000 o inferior, se llevó a cabo la ultrafiltración mediante la utilización de una unidad de filtración YM- 10 (Millipore Corp.). A continuación, el análisis utilizando 2D-CL-MALDI TOF-EM se llevó a cabo de la manera siguiente. En otras palabras, se fraccionaron las muestras recuperadas en 1.146 fracciones por muestra mediante la utilización de HPLC bidimensional (columna de intercambio catiónico SCX y columna de fase inversa C18). Todas las muestras fraccionadas se aplicaron por puntos en una placa diana de MALDI para espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF (ultraflex TOF/TOF, Bruker Daltonics) y solución de matriz (ácido alfa-ciano-hidroxicinámico, CHCA) y se mezclaron y se cristalizaron, y la masa y el área de pico de la masa se midieron automáticamente en modo refrectrón mediante irradiación de la muestra cristalizada mediante láser. Se normalizó el área de pico con 250 fmoles por cada pocillo de fragmento de bradiquinina 1-7 que se añadió a la solución de matriz previamente. En otras palabras, se calculó el valor del área como 10.000 veces el valor mediante la división del área de pico en términos de masa específica de muestra por el área de pico obtenida de 250 fmoles de fragmento de bradiquinina 17. Dicho valor de área corresponde a 25 pl de suero de muestra. La detección de la diferencia de abundancia de los péptidos en suero entre grupos (denominado análisis diferencial) se llevó a cabo utilizando el software de análisis estadístico multigrupo DeView desarrollado por los presentes inventores. Se determinó directamente la secuencia de aminoácidos de los péptidos en los que se observaron diferencias de abundancia mediante análisis de EM/EM mediante TOF/TOF ultraflex y se identificaron las proteínas o péptidos de origen intactos.

(3) Resultados

La figura 1 muestra el resultado que se obtuvo del suero de un caso de paciente de EA que se aplicó al 2D-CL- MALDI TOF-EM. Las muestras se fraccionaron en 6 fracciones mediante columna de intercambio catiónico SCX en la primera dimensión, y después cada una de las fracciones se fraccionaron en 191 fracciones mediante columna de fase inversa C18. Los espectros de masas de 191 fracciones se obtuvieron mediante mediciones de MALDI TOF- EM. Debido a que el eje horizontal es m/z y el eje vertical son las fracciones de cromatografía de columna de fase inversa; la figura 1 se visualizó mediante Deview. SCX 1 muestra las fracciones eluidas; SCX 2 muestra las fracciones eluidas con una concentración salina de 10%; SCX 3 muestra las fracciones eluidas con una concentración salina de 20%; SCX 4 muestra las fracciones eluidas con una concentración salina de 30%; SCX 5 muestra las fracciones eluidas con una concentración salina de 50%; SCX 6 muestra las fracciones eluidas con una concentración salina de 100%. Tal como se observa en la figura 1, se encuentran presentes muchos péptidos en muchos sueros de SCX 1, SCX 3, SCX 4 y SCX 5. El número total de péptidos fraccionados mediante 2D-CL y detectados mediante MALDI TOF-EM fue de aproximadamente 4.000.

A modo de ejemplo de los resultados del análisis diferencial, la figura 2 muestra el caso del marcador A. El marcador A, tal como se muestra posteriormente, en la figura 3, era el péptido NRX2B derivado de precursor de neurexina-2- beta. A) de la figura 2 muestra una comparación entre ADN, DCL y EA. A) y B) muestran el resultado de experimentos llevados a cabo separadamente; se utilizó ADN y EA en las mismas muestras en ambos experimentos (es decir, para ADN y EA, los resultados de medición indicarían reproducibilidad). En A) de la figura 2 se encontró que el marcador A se encontraba incrementado en los pacientes de DCL y de EA en comparación con los pacientes ADN. En B) de la figura 2 se encontró que el marcador A se encontraba incrementado en los pacientes de EA, ENtodas, ENdem y ENnon en comparación con los pacientes ADN. En particular, en la comparación entre EA y ENnon, en EA era significativamente más alto que en ENnon (prueba t, p=0,035). A partir de dichos resultados se encontró que el marcador A resultaba útil para distinguir entre pacientes con deterioro cognitivo (DCL, EA, ENdem) y pacientes con enfermedad neurológica no demencia (ENnon).

A partir de los resultados de A) y B) en la figura 2, con el fin de evaluar el grado en el que el marcador A resulta útil como biomarcador, se llevó a cabo el análisis mediante la curva de característica operativa del receptor (COR). C), D) y E) en la figura 2 muestran, respectivamente, la curva COR de las comparaciones DCL vs. ADN, EA vs. ADN y EA vs. ENnon. En el caso de que el valor del área (en lo sucesivo denominado valor de COR) bajo la curva COR sea próximo a 1, la utilidad como biomarcador del marcador A será más elevada. En C), D) y E) de la figura 2, los valores típicos de sensibilidad y especificidad son los valores del punto (cuadrados blancos en la figura) de la coordenada en la curva COR en los que se minimiza la distancia al dibujar una línea recta hasta la curva COR desde el punto de 100% en el eje y. El valor de corte que proporciona dicho punto se convierte en un umbral útil para distinguir entre los diferentes grupos, y los valores de sensibilidad y especificidad en dicho tiempo (es decir, superior a los valores típicos) se convierte en un indicador de la utilidad de los biomarcadores conjuntamente con los valores de COR. En C) de la figura 2, como valores típicos en DCL vs. ADN, la sensibilidad era de 90%, la especificidad era de 100% y el

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valor de COR era de 0,99. En D) de la figura 2, como valores típicos en EA vs. ADN, la sensibilidad era de 100%, la especificidad era de 100% y el valor de COR era 1. En E) de la figura 2, con la comparación EA vs. CCC, la sensibilidad era de 100%, la especificidad era de 50% y el valor de COR era de 0,710. De esta manera, se reveló que el marcador A (NRX2B) resultaba útil para distinguir DCL y EA respecto a ADN. Y además, se reveló que el marcador A resultaba útil para distinguir la EA de enfermedad neurológica no demencia (ENnon). En particular, debido a que DCL es el estado del estadio previo de la EA, se considera que el marcador A (NRX2B) resulta un marcador extremadamente útil para detectar DCL para el diagnóstico precoz de los sujetos que potencialmente migrarán a EA.

La figura 3, para el marcador A, ilustra los resultados del espectro de EM/EM utilizando TOF/TOF ultraflex. Las señales que muestran los iones y los iones b aparecieron en grado suficiente y la secuencia de aminoácido pudo identificarse fácilmente. Se llevó a cabo una búsqueda en Mascot con dicho resultado y la proteína de origen o el péptido (en lo sucesivo denominado proteínas o pépticos intactos) era el precursor de neurexina-2-beta y se encontró que el péptido detectado presentaba la secuencia RSGgNaTLQvDsWP (SEC ID n° 2). NRX2B es el nombre de la entrada en Swiss-Prot del precursor de neurexina-2-beta como abreviatura del nombre del péptido. Además, para los otros péptidos que se detectaron, los nombres de entrada de Swiss-Prot utilizados como abreviaturas de los nombres de péptido en la descripción a continuación.

Incluyendo el marcador A, los péptidos que presentaban diferencias de abundancia entre grupos en el suero se midieron en los espectros de EM/EM utilizando TOF/TOF ultraflex y además de determinar la secuencia de aminoácidos, los resultados identificaron proteínas o péptidos intactos mostrados posteriormente. Para péptidos diferentes del marcador A, las señales que mostraban iones y e iones b aparecieron en grado suficiente y la secuencia de aminoácido pudo identificarse fácilmente. La secuencia de aminoácidos siguiente que muestra un grupo de dos secuencias, la secuencia entera de la primera secuencia muestra la secuencia de aminoácidos de proteínas o péptidos intactos. El péptido que comprende la parte subrayada de la primera secuencia y de la segunda secuencia es el péptido detectado mediante la 2D-CL-MALDI TOF- EM. 001 representa el extremo N-terminal. Respecto al péptido que se secuenció con el estado de oxidación de la metionina en los péptidos que consistían de la segunda secuencia se indicó como (oxidación + (M)) al final de la secuencia de aminoácidos. Para la proteína con mutación de aminoácidos mediante mutación génica, se señala el residuo aminoácido aplicable como (X).

(1) Péptido NRX2B derivado del precursor de la neurexina-2-beta

NRX2B mostrado como SEC ID n° 2 no se detectó en el paciente ADN y sí se detectó en los pacientes de DCL, EA, ENtodas, ENdem y ENnon. Además, en la comparación entre EA y ENnon, la EA mostraba un valor más alto que ENnon, y se demostró que NRX2B mostraba capacidad de distinción (previamente descrita en la figura 2).

Proteína / péptido intacto

001 MPPGGSGPGGCPRRPPALAG PLPPPPPPPP PPLLPLLPLL LLLLLGAAEG 051 ARVSSSLSTT HHVHHFHSKH GTVPIAINRM PFLTRGGHAG TTYIFGKGGA 101 LITYTWPPND RPSTRMDRLA VGFSTHQRSA VLVRVDSASG LGDYLQLHID 151 QGTVGVIFNV GTDDITIDEP NAIVSDGKYH WRFTRSGGN ATLOVDSWPV 201 NERYPAGNFD NERLAIARQR IPYRLGRWD EWLLDKGRQL TIFNSQAAIK 251 IGGRDQGRPF QGQVSGLYYN GLKVLALAAE SDPNVRTEGH LRLVGEGPSV 301 LVASAECPSD DEDLEECEPS TGGELILPII TEDSLDPPPV ATRSPFVPPP 351 PTFYPFLTGV GATQDTLPPP AARRPPSGGP CQAERDDSDC EEPIEASGFA 401 SGEVFDSSLP PTDDEDFYTT FPLVTDRTTL LSPRKPAPRP NLRTDGATGA 451 PGVLFAPSAP APNLPAGKMN HRDPLQPLLE NPPLGPGAPT SFEPRRPPPL 501 RPGVTSAPGF PHLPTANPTG PGERGPPGAV EV1RESSSTT GMWGIVAAA 551 ALCÍLILLYA MYKYRNRDEG SYQVDQSRNY ISNSAQSNGA WKEKAPAAP 601 KTPSKAKKNK DKEYYV (SEC ID n° 1)

Péptido NRX2B derivado del precursor de la neurexina-2-beta

RSGGNATLQVDSWP (SEC ID n° 2)

(2) Péptido THRB(R-) derivado del precursor de protrombina

Los péptidos derivados de precursor de protrombina son de dos tipos y (R-) se refiere al péptido que no presenta R (residuo de arginina) en el extremo C-terminal. Se detectó THRB(R-), mostrado como SEC ID n° 4, específicamente en el paciente ADN y sí se detectó un valor extremadamente bajo en los pacientes de DCL, EA, ENtodas, ENdem y ENnon. Los diagramas de THRB(R-) y THRB(R+) se muestran lado a lado en las figuras 4 y 5. La figura 4 muestra un gráfico de dispersión. La figura 5A muestra que la aparición de THRB(R-) y THRB(R+) es diferente en cada individuo de ADN, DCL y EA. En el mismo individuo, THRB(R-) apareció en grado muy elevado en ADN; THRB(R+) apareció

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en grado muy elevado en DCL y EA. Puede afirmarse que ambos péptidos son marcadores extremadamente útiles para determinar DCL y ADN. La figura 5B muestra la curva COR que compara la EA y las ENnon con THRB(R-). El valor de COR indicaba un valor elevado, de 0,815. El valor en la EA era más bajo que en las ENnon. En otras palabras, se encontró que THRB(R-), así como NRX2B, como marcador útil para distinguir entre pacientes con deterioro cognitivo (DCL, EA y ENdem) y pacientes con enfermedad neurológica no demencia (ENnon).

Proteína / péptido intacto

001 MAHVRGLQLP GCLALAALCS LVHSQHVFLA PQQARSLLQR VRRANTFLEE 051 VRKGNLEREC VEETCSYEEA FEALESSTAT DVFWAKYTAC ETARTPRDKL 101 AACLEGNCAE GLGTNYRGHV NITRSGIECQ LWRSRYPHKP EINSTTHPGA 151 DLQENFCRNP DSSTTGPWCY TTDPTVRRQE CSIPVCGQDQ VTVAMTPRSE 201 GSSVNLSPPL EQCVPDRGQQ YQGRLAVTTH GLPCLAWASA QAKALSKHQD 251 FNSAVQLVEN FCRNPDGDEE GVWCYVAGKP GDFGYCDLNY CEEAVEEETG 301 DGLDEDSDRA IEGRTATSEY QTFFNPRTFG SGEADCGLRP LFEKKSLEDK 351 TERELLESYI DGRIVEGSDA EIGMSPWQVM LFRKSPQELL CGASLISDRW 401 VLTAAHCLLY PPWDKNFTEN DLLVRIGKHS RTRYERNIEK ISMLEKIYIH 451 PRYNWRENLD RDIALMKLKK PVAFSDYIHP VCLPDRETAA SLLQAGYKGR 501 VTGWGNLKET WTANVGKGQP SVLQWNLPI VERPVCKDST RIRITDNMFC 551 AGYKPDEGKR GDACEGDSGG PFVMKSPFNN RWYQMGIVSW GEGCDRDGKY 601 GFYTHVFRLK KWIQKVIDQF GE (SEC ID n° 3)

Péptido THRB(R-) derivado del precursor de protrombina GLDEDSDRAIEG (SEC ID n° 4)

(3) Péptido derivado de precursor de protrombina (THRB(R+))

THRB(R-), mostrado como SEC ID n° 5, no se detectó en el paciente ADN y sí se detectó en los pacientes de DCL, EA, ENtodas, ENdem y ENnon (figura 4). (R+) se refiere a que el péptido presenta R (residuo de arginina) en el extremo C-terminal. Para una explicación, ver (2) péptido derivado del precursor de protrombina (THRB(R-)).

Proteína / péptido intacto

001 MAHVRGLQLP GCLALAALCS LVHSQHVFLA PQQARSLLQR VRRANTFLEE 051 VRKGNLEREC VEETCSYEEA FEALESSTAT DVFWAKYTAC ETARTPRDKL 101 AACLEGNCAE GLGTNYRGHV NITRSGIECQ LWRSRYPHKP EINSTTHPGA 151 DLQENFCRNP DSSTTGPWCY TTDPTVRRQE CSIPVCGQDQ VTVAMTPRSE 201 GSSVNLSPPL EQCVPDRGQQ YQGRLAVTTH GLPCLAWASA QAKALSKHQD 251 FNSAVQLVEN FCRNPDGDEE GVWCYVAGKP GDFGYCDLNY CEEAVEEETG 301 DGLDEDSDRA IEGRTATSEY QTFFNPRTFG SGEADCGLRP LFEKKSLEDK 351 TERELLESYI DGRIVEGSDA EIGMSPWQVM LFRKSPQELL CGASLISDRW 401 VLTAAHCLLY PPWDKNFTEN DLLVRIGKHS RTRYERNIEK ISMLEKIYIH 451 PRYNWRENLD RDIALMKLKK PVAFSDYIHP VCLPDRETAA SLLQAGYKGR 501 VTGWGNLKET WTANVGKGQP SVLQWNLPI VERPVCKDST RIRITDNMFC 551 AGYKPDEGKR GDACEGDSGG PFVMKSPFNN RWYQMGIVSW GEGCDRDGKY 601 GFYTHVFRLK KWIQKVIDQF GE (SEC ID n° 3)

Péptido THRB(R+) derivado del precursor de protrombina GLDEDSDRAIEGR (SEC ID n° 5)

(4) Péptido derivado de pendrina (S26A4)

S26A4, mostrado como SEC ID n° 7, no se detectó en el paciente ADN y sí se detectó en los pacientes de DCL, EA, ENtodas, ENdem y ENnon (figura 6).

Proteína / péptido intacto

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001 MAAPGGRSEP PQLPEYSCSY MVSRPVYSEL AFQQQHERRL QERKTLRES 051 AKCCSCSRKR AFGVLKTLVP ILEWLPKYRV KEWLLSDVIS GVSTGLVATL 101 QGMAYALLAA VPVGYGLYSA FFPILTYFIF GTSRHISVGP FPWSLMVGS 151 WLSMAPDEH FLVSSSNGTV LNTTMIDTAA RDTARVLIAS ALTLLVGIIQ 201 LIFGGLQIGF IVRYLADPLV GGFTTAAAFQ VLVSQLKIVL NVSTKNYNGV 251 LSIIYTLVEI FQNIGDTNLA DFTAGLLTIV VCMAVKELND RFRHKIPVPI 301 PIEVIVTIIA TAISYGANLE KNYNAGIVKS IPRGFLPPEL PPVSLFSEML 351 AASFSIAWA YAIAVSVGKV YATKYDYTID GNQEFIAFGI SNIFSGFFSC 401 FVATTALSRT AVQESTGGKT QVAGIISAAI VMIAILALGK LLEPLQKSVL 451 AAWIANLKG MFMQLCDIPR LWRQNKIDAV IWVFTCIVSIILGLDLGLLA 501 GLIFGLLTW LRVQFPSWNG LGSIPSTDIY KSTKNYKNIE EPQGVKILR 551 SSPIFYGNVD GFKKCIKSTV GFDAIRVYNK RLKALRKIQK LIKSGQLRAT 601 KNGIISDAVS TNNAFEPDED IEDLEELDIP TKEIEIQVDW NSELPVKVNV 651 PKVPIHSLVL DCGAISFLDV VGVRSLRVIV KEFQRIDVNV YFASLQDYV 701 EKLEQCGFFD DNIRKDTFFL TVHDAILYLQ NQVKSQEGQG SILETITLIQ 751 DCKDTLELIE TELTEEELDV QDEAMRTLAS (SEC ID n° 6)

Péptido S26A4 derivado de pendrina LAGLIFGLLTVVLR (SEC ID n° 7)

(5) Péptido derivado de subunidad zeta-1 de coatómero (COPZ1)

COPZ1, mostrado como SEC ID n° 9, mostró un valor bajo en el paciente ADN y un valor elevado en los pacientes de DCL, EA y ENdem (figura 6).

Proteína / péptido intacto

001 MEALILEPSL YTVKAILILD NDGDRLFAKY YDDTYPSVKE QKAFEKNIFN 051 KTHRTDSEIA LLEGLTWYK SSIDLYFYVI GSSYENELML MAVLNCLFDS 101 LSQMLRKNVE KRALLENMEG LFLAVDEIVD GGVILESDPQ QWHRVALRG 151 EDVPLTEQTV SQVLQSAKEQ IKWSLLR {SEC ID n° 8)

Péptido derivado de subunidad zeta-1 de coatómero (COPZ1)

AILILDNDGDRLFAKYYDD (SEC ID n° 9)

(6) Péptido derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico (RARR2(S-))

RARR2(S-), mostrado como SEC ID n° 11, no se detectó en el paciente ADN y sí se detectó en los pacientes de EA y DCL (figura 7). Los péptidos derivados de precursor de proteína respondedora 2 de receptor del ácido retinoico y (S-) se refiere al péptido que no presenta S (residuo de serina) en el extremo C-terminal.

Proteína / péptido intacto

001 MRRLLIPLAL WLGAVGVGVA ELTEAQRRGL QVALEEFHKH PPVQWAFQET 051 SVESAVDTPF PAGIFVRLEF KLQQTSCRKR DWKKPECKVR PNGRKRKCLA 101 CIKLGSEDKV LGRLVHCPIE TQVLREAEEH QETQCLRVQR AGEDPHSFYF 151 PGQFAFSKAL PRS (SEC ID n° 10)

Péptido derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico (RARR2(S-)) PHSFYFPGQFAFSKALPR (SEC ID n° 11)

(7) Péptido derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico (RARR2(S+))

RARR2(S+), mostrado como SEC ID n° 12, no se detectó en el paciente ADN así como tampoco RARR2(S-), y sí se detectó en los pacientes de EA y DCL (figura 7). (S+) se refiere a que el péptido presenta S (residuo de serina) en el extremo C-terminal.

Proteína / péptido intacto

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Péptido derivado del precursor de proteína respondedora 2 del receptor del ácido retinoico (RARR2(S+)) PHSFYFPGQFAFSKALPRS (SEC ID n° 12)

(8) Péptido derivado de precursor de gelsolina (GELS)

GELS, mostrado como SEC ID n° 14, mostró un valor bajo en el paciente ADN y un valor relativamente elevado en los pacientes de DCL y EA (figura 8).

Proteína / péptido intacto

OO1 MAPHRPAPAL LCALSLALCA LSLPVRAATA SRGASQAGAP QGRVPEARPN 051 SMWEHPEFL KAGKEPGLQI WRVEKFDLVP VPTNLYGDFF TGDAYVILKT 101 VQLRNGNLQY DLHYWLGNEC SQDESGAAAI FTVQLDDYLN GRAVQHREVQ 151 GFESATFLGY FKSGLKYKKG GVASGFKHW PNEVWQRLF QVKGRRWRA 201 TEVPVSWESF NNGDCFILDL GNNIHQWCGS NSNRYERLKA TQVSKGIRDN 251 ERSGRARVHV SEEGTEPEAM LQVLGPKPAL PAGTEDTAKE DAANRKLAKL 301 YKVSNGAGTM SVSLVADENP FAQGALKSED CFILDHGKDG KIFVWKGKQA 351 NTEERKAALK TASDFITKMD YPKQTQVSVL PEGGETPLFK QFFKNWRDPD 401 QTDGLGLSYL SSHIANVERV PFDAATLHTS TAMAAQHGMD DDGTGQKQIW 451 RIEGSNKVPV DPATYGQFYG GDSYIILYNY RHGGRQGQII YNWQGAQSTQ 501 DEVAASAILT AQLDEELGGT PVQSRWQGK EPAHLMSLFG GKPMIIYKGG 551 TSREGGQTAP ASTRLFQVRA NSAGATRAVE VLPKAGALNS NDAFVLKTPS 601 AAYLWVGTGA SEAEKTGAQE LLRVLRAQPV QVAEGSEPDG FWEALGGKAA 651 YRTSPRLKDK KMDAHPPRLF ACSNKIGRFV IEE\TGELMQ EDLATDDVML 701 LDTWDQVFVW VGKDSQEEEK TEALTSAKRY IETDPANRDR RTPITWKQG 751 FEPPSFVGWF LGWDDDYWSV DPLDRAMAEL AA (SEC ID n° 13)

Péptido derivado de precursor de gelsolina (GELS)

PVRAATASRGAS (SEC ID n° 14)

(9) Péptido derivado del precursor de clusterina (CLUS(SDVP N-term.))

CLUS(SDVP N-term.), mostrado como SEC ID n° 16, mostró un valor bajo en el paciente ADN y un valor relativamente elevado en los pacientes de DCL y EA (figura 9). Los péptidos derivados de precursor de clusterina son de dos tipos y (N-termSDVP) se refiere a que la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal del péptido es SDVP.

Proteína / péptido intacto

001 MMKTLLLFVG LLLTWESGQV LGDQTVSDNE LQEMSNQGSK YVNKEIQNAV

051 NGVKQIKTLI EKTNEERKTL LSNLEEAKKK KEDALNETRE SETKLKELPG

101 VCNETMMALW EECKPCLKQT CMKFYARVCR SGSGLVGRQL EEFLNQSSPF

151 YFWMNGDRID SLLENDRQQT HMLDVMQDHF SRASSIIDEL FQDRFFTREP

201 QDTYHYLPFS LPHRRPHFFF PKSRIVRSLM PFSPYEPLNF HAMFQPFLEM

251 IHEAQQAMDI HFHSPAFQHP PTEFIREGDD DRTVCREIRH NSTGCLRMKD

301 QCDKCREILS VDCSTNNPSQ AKLRRELDES LQVAERLTRK YNELLKSYQW

351 KMLNTSSLLE QLNEQFNWVS RLANLTQGED QYYLRVTTVA SHTSDSDVPS

401 GVTEWVKLF DSDPITVTVP VEVSRKNPKF METVAEKALQ EYRKKHREE (SEC ID

n° 15)

Péptido derivado del precursor de clusterina CLUS(SDVP N-term.)

SDVPSGVTEVVVKLFDS (SEC ID n° 16)

(10) Péptido derivado del precursor de clusterina (CLUS(RFFT N-term.))

CLUS(RFFT N-term.), mostrado como SEC ID n° 17, no se detectó en el paciente ADN y no se detectó completamente en los pacientes de EA (figura 9). (RFFT N-term.) se refiere a que la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal del péptido es RFFT.

Proteína / péptido intacto

001 MMKTLLLFVG LLLTWESGQV LGDQTVSDNE LQEMSNQGSK YVNKEIQNAV

051 NGVKQIKTL1 EKTNEERKTL LSNLEEAKKK KEDALNETRE SETKLKELPG

101 VCNETMMALW EECKPCLKQT CMKFYARVCR SGSGLVGRQL EEFLNQSSPF

151 YFWMNGDRID SLLENDRQQT HMLDVMQDHF SRASSIIDEL FQDRFFTREP

201 QDTYHYLPFS LPHRRPHFFF PKSRIVRSLM PFSPYEPLNF HAMFQPFLEM

251 IHEAQQAMDI HFHSPAFQHP PTEFIREGDD DRTVCREIRH NSTGCLRMKD

301 QCDKCREILS VDCSTNNPSQ AKLRRELDES LQVAERLTRK YNELLKSYQW

351 KMLNTSSLLE QLNEQFNWVS RLANLTQGED QYYLRVTTVA SHTSDSDVPS

401 GVTEVWKLF DSDPITVTVP VEVSRKNPKF METVAEKALQ EYRKKHREE (SEC ID

n° 15)

5 Péptido derivado del precursor de clusterina CLUS(RFFT N-term.)

RFFTREPQDTYHYLPFSLPH (SEC ID n° 17)

(11) Péptido derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica (EIF3J)

10

EIF3J, mostrado como SEC ID n° 19, no se detectó en el paciente ADN y no se detectó en absoluto o prácticamente no se detectó en los pacientes de DCL, EA, ENtodas, ENdem y ENnon (figura 10).

Proteína / péptido intacto 15

001 MAÁAAAAAGD SDSWDADAFS VEDPVRKVGG GGTAGGDRWE GEDEDEDVKD 051 NWDDDDDEKK EEAEVKPEVK ISEKKKIAEK IKEKERQQKK RQEEIKKRLE 101 EPEEPKVLTP EEQLADKLRL KKLQEESDLE LAKETFGVNN AVYGIDAMNP 151 SSRDDFTEFG KLLKDKITQY EKSLYYASFL EVLVRDVCIS LEIDDLKKIT 201 NSLTVLCSEK QKQEKQSKAK KKKKGWPGG GLKATMKDDL ADYGGYDGGY 251 VQDYEDFM (SEC ID n° 18)

20

Péptido derivado de la subunidad J del factor 3 de inicio de traducción eucariótica (EIF3J) GVVPGGGLKATMKDDLADYGGYDGG + oxidación (M) (SEC ID n° 19)

(12) Péptido derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas (LRC27)

25 LRC27, mostrado como SEC ID n° 21, no se detectó en el paciente ADN y no se detectó completamente en los pacientes de EA (figura 10).

30

Proteína / péptido intacto

001 MEGSSSYEVP SVAAADLEEG AGQTRSLPAT PSKDVHKGVG GIIFSSSPIL 051 DLSESGLCRL EEVFRIPSLO QLHLQRNALC VIPQDFFQLL PNLTWLDLRY 101 NRIKALPSGI GAHQHLKTLL LERNPIKMLP VELGSVTTLK ALNLRHCPLE 151 FPPQLWQKG LVAIQRFLRM WAVEHSLPRN PTSQEAPPVR EMTLRDLPSP 201 GLELSGDHAS NQGAVNAQDP EGAVMKEKAS FLPPVEKPDL SELRKSADSS 251 ENWPSEEEIR RFWKLRQEIV EHVKADVLGD QLLTRELPPN LKAALNIEKE 301 LPKPRHVFRR KTASSRSILP DLLSPYQMAI RAKRLEESRA AALRELQEKQ 351 ALMEQQRREK RALQEWRERA QRMRKRKEEL SKLLPPRRSM VASKIPSATD 401 LIDNRKVPLN PPGKMKPSKE KSPQASKEMS ALQERNLEEK IKQHVLQMRE 451 QRRFHGQAPL EEMRKAAEDL EIATELQDEV LKLKLGLTLN KDRRRAALTG 501 NLSLGLPAAQ PQNTFFNTKY GESGNVRRYQ (SEC ID n°20)

Péptido derivado de la proteína 27 que contiene repeticiones ricas en leucinas (LRC27)

SSPILDLSESGLCRLEEVFRIPS (SEC ID n° 21)

35

Aunque ya se han citado, para los péptidos de SEC ID n° 2 (NRX2B) a SEC ID n° 21 (LRC27), los gráficos de dispersión de las comparaciones entre los pacientes de ADN, DCL y EA, y el gráfico de dispersión de la comparación entre los pacientes de ADN, EA, ENtodas, ENdem y ENnon, y el valor de p de la prueba t de cada comparación se muestran en las figuras 2, 4 y 6 a 10.

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La Tabla 1 muestra la lista de valores de COR de las comparaciones DCL vs. ADN y EA vs. ADN respecto a los 12 péptidos marcadores mostrados anteriormente.

[Tabla 1]

Péptidos marcadores

DCL vs. ADN EA vs. ADN

Entrada de Swiss-Prot

Secuencia n° Valor de COR DCL era Valor de COR En la EA:

NRX2B

2 0,99 incremento 1 incremento

THRB (R-)

4 0,854 reducción 0,841 reducción

THRB (R+)

5 0,94 incremento 0,985 incremento

S26A4

7 0,925 incremento 0,95 incremento

COPZ1

9 0,786 incremento 0,767 incremento

RARR2 (S-)

11 0,885 incremento 0,914 incremento

RARR2 (S+)

12 0,95 incremento 0,919 incremento

GELS

14 0,716 incremento 0,762 incremento

CLUS (SDVP N-term.)

16 0,739 incremento 0,717 incremento

CLUS (RFFT N-term.)

17 0,675 reducción 0,75 reducción

EIF3J

19 0,748 reducción 0,775 reducción

LRC27

21 0,699 reducción 0,755 reducción

La Tabla 1 muestra la utilidad de cada péptido marcador en la detección del deterioro cognitivo (DCL y EA). Mediante la utilización de dichos péptidos marcados, individualmente o en combinación, utilizando o no cromatografía líquida y/o cualesquiera otros métodos de separación adecuados, midiendo directamente la abundancia en suero utilizando otros métodos, tales como la espectrometría de masas o métodos inmunológicos o métodos enzimáticos, resulta posible distinguir entre tipos de no demencia y demencia en la enfermedad neurológica y diagnosticar el deterioro cognitivo, tal como la EA y la DCL. El péptido marcador que no se detecta en el paciente de ADN y que se detecta en los pacientes de DCL, Ea, ENtodas, ENdem y ENnon, o viceversa, el péptido marcador que se detecta en el paciente de ADN y que no se detecta en los pacientes de DCL, EA, ENtodas, ENdem y ENnon, también resulta útil para la detección de enfermedades psiquiátricas.

Ejemplo 2

Ejemplo 2. Síntesis de un péptido marcador y preparación de un anticuerpo policlonal específico de péptido marcador

Se sintetizó el péptido antigénico con el fin de preparar el anticuerpo específico que reconoce el péptido NRX2B derivado del precursor de la neurexina-2-beta de SEC ID n° 2. Al péptido sintético para el acoplamiento a una proteína portadora se añadió el residuo de cisteína (denominado C o Cys) en el extremo C-terminal. El péptido que se combinó con la proteína portadora (RSGGNATC-KLH, ver posteriormente) se mezcló con un adyuvante y la mezcla se utilizó para inmunizar conejos. Se llevó a cabo un total de ocho inmunizaciones cada 1-2 semanas y se realizó la extracción de sangre de ensayo dos veces cada 4 semanas y se midieron los títulos de anticuerpo mediante inmunoensayo enzimático (ElA, por sus siglas en inglés). Tras tres meses desde el inicio de la inmunización, se recolectó la sangre completa de los conejos y se obtuvo el antisuero; además, se llevó a cabo la purificación del anticuerpo específico utilizando la columna peptídica en la que se encontraba unido el péptido antigénico a modo de ligando.

La secuencia del péptido antigénico sintético para la preparación del anticuerpo específico de péptido se muestra a continuación.

RSGGNAT+Cys (SEC ID n° 22)

Ejemplo 3

Ejemplo 3. Preparación de perlas de anticuerpo (1) Método

(1-1) Preparación de anticuerpo y unión a perlas magnéticas

La solución de anticuerpo: se disolvió 1 mg del anticuerpo (anticuerpo anti-NRX2B, IgG de conejo) que reconocía específicamente el péptido de secuencia de aminoácidos expresado por SEC ID n° 22 con 3 ml de MES 0,1 M. Tras el lavado de 1 ml (10 mg de perlas) de las perlas magnéticas (Magnosphere MS300/carboxilo, JSR Corporation) mediante la utilización de MES 0,1 M, se mezclaron las perlas magnéticas con la solución de anticuerpo y se

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agitaron suavemente durante 30 min. a temperatura ambiente.

(1-2) Entrecruzamiento de anticuerpo y perlas magnéticas

Se añadieron 400 pl de solución de EDC (10 mg/ml de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida en MES 0,1 M) a solución de anticuerpo-perlas y se suspendieron suavemente durante 3 horas para la unión del anticuerpo a las perlas mediante enlace covalente.

(1-3) Bloqueo

Se añadió 1 ml de etanolamina 200 mM (pH 8,0) para lavar las perlas y se añadió 1 ml adicional de etanolamina 200 mM (pH 8,0) y se agitó suavemente durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear los grupos amina.

(1-4) Lavado

Tras la eliminación de etanolamina 200 mM (pH 8,0) se lavaron las perlas tres veces con 1 ml de solución TBST (Tris-HCl 25 mM (pH 7,2) que contenía NaCl 0,15 M y Tween-20 al 0,05%).

(1-5) Almacenamiento

Tras suspender las perlas mediante la adición de 1 ml de solución de TBST, se almacenaron a 4°C.

Ejemplo 4

Ejemplo 4. Prueba mediante el método de inmuno-EM de que el pico de m/z 1,488 en suero de paciente detectado mediante 2D-CL-MALDI-TOF-EM es NRX2B.

(1) Métodos

A título de control para la comparación, se utilizó el péptido sintético NRX2B marcado con isótopo estable (se sustituyó 12C y 13C de V por 15N y 14N) de masa superior a NRX2B. La diferencia de masa entre NRX2B y el péptido con isótopo estable era de 6 u. Tanto el péptido endógeno como el péptido marcado con isótopo estable se capturaron con anticuerpo anti-NRX2B. Se añadió 1 pl de 200 fmoles/pl de péptido sintético NRX2B marcado con isótopo estable a 25 pl de cada uno de los sueros de paciente de EA y de DCL, y se incubaron durante 10 min. a 4°C. A continuación, se añadieron 475 pl de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y se sometieron a ebullición durante 5 min. a 100°C. Tras la centrifugación durante 15 min. a 14.000xg, se añadieron 500 pl de tampón de Tris-Hcl 100 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 0,3 M y n-octil-glucósido al 0,2% al sobrenadante. Se añadieron 20 pl de perlas- anticuerpo anti-NRX2B en el Ejemplo 3 a soluciones de péptido y se agitaron suavemente durante 2 horas. A continuación, tras dejar en reposo durante 1 min. sobre el soporte magnético, se eliminó el sobrenadante. Se añadió 1 ml de tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) (TBS) que contenía NaCl 0,15 M y n-octil-glucósido al 0,1% y se agitó suavemente durante 10 min. Tras dejar en reposo durante 1 min. sobre el soporte magnético, se eliminó el sobrenadante. Además, tras añadir 500 pl de TBS y dejar en reposo durante 1 min. sobre el soporte magnético, se eliminó el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces. Además, tras añadir 500 pl de carbonato amónico 50 mM y dejar en reposo durante 1 min. sobre el soporte magnético, se eliminó el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces. Se añadieron 50 pl de 2-propanol: H2O: ácido fórmico (4:4:1) y se dejó en reposo durante 10 min. y seguidamente, tras dejar en reposo durante 1 min. sobre el soporte magnético, se recuperó el filtrado. Se repitió este procedimiento dos veces. Los filtrados se secaron completamente utilizando una centrífuga de vacío. A continuación, se añadieron 20 pl de TFA al 0,095% que contenía acetonitrilo al 5% y se redisolvieron mediante sonicación. Se concentraron los péptidos utilizando una punta de pipeta de C18 (punta PerfectPure C-18, Eppendorf) y se aplicaron en puntos sobre la placa diana MALDI (placa MTP AnchorChip™ 600/384, Bruker Daltonics) mediante elución a partir de la punta de pipeta C18 y después se analizaron los péptidos utilizando un espectrómetro de masas MALDI TOF (AXiMa CFRplus, Shimadzu).

(2) Resultados

La figura 11 muestra el resultado de la espectrometría de masas del péptido NRX2B detectado en el suero de pacientes de EA y de DCL utilizando el método anteriormente indicado. La figura 11A muestra el espectro de masas global y la figura 11B muestra una vista ampliada de las partes con flechas en la figura 11A. La señal indicada por las flechas discontinuas en la figura 11B es el péptido sintético NRX2B marcado con isótopo estable añadido y la señal indicada por las flechas continuas era péptido NRX2B endógeno. El valor de masa observado se encontraba dentro del error de medición del valor esperado. Y además la diferencia de masas entre el péptido NRX2B endógeno y el péptido marcado con isótopo estable era de 6 u. Por lo tanto, se pudo demostrar que el péptido atrapado era NRX2B.

En el presente experimento, NRX2B, que era el marcador peptídico detectado en el suero mediante la utilización del método de inmuno-EM desarrollado originalmente por los presentes inventores, se pudo demostrar que resulta

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posible distinguir entre pacientes de EA y de DCL respecto de los de ADN. Además, en el presente experimento, también se ha demostrado que el anticuerpo específico contra NRX2B resulta útil en la detección de su marcador peptídico. Adicionalmente, también demuestra que el método de detección inmunológico podría resultar eficaz contra el péptido o proteína comprendido en la secuencia de aminoácidos de NRX2B utilizando el anticuerpo específico contra NRX2B. Además, en el presente experimento se realizó la determinación mediante la utilización de anticuerpos específicos que reconocían un marcador peptídico, pero la combinación de anticuerpos específicos de biomarcador que reconocen otros péptidos que se encontraron en el Ejemplo 1, se espera que incremente adicionalmente la precisión del diagnóstico de las patologías.

Aplicabilidad industrial

El deterioro cognitivo, incluyendo el deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer y el deterioro cognitivo y las enfermedades no psiquiátricas, pueden detectarse mediante la utilización de los biomarcadores dados a conocer en la presente invención. La invención es aplicable a la utilización en el campo del diagnóstico médico, incluyendo el de los agentes diagnósticos.

Listado de secuencias

09P01007_Sequence.txt LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MCBI Inc.

<120> Nuevos biomarcadores para la detección de la enfermedad de Alzheimer <130> 09P01007 <160> 25

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 616 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Péptido o proteína para la utilización como biomarcador para la detección de enfermedades psiquiátricas o deterioro cognitivo, en el que

   5 la proteína es un precursor de la neurexina-2-beta que consiste de la secuencia de aminoácidos

   expresada mediante la SEC ID n° 1 o la proteína es una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos obtenida de la SEC ID n° 1 mediante deleción, intercambio y/o adición de uno a tres aminoácidos, y

   el péptido es el péptido NRX2B derivado de un precursor de la neurexina-2-beta que consiste de la

   10 secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2 o el péptido es un péptido que consiste

   de una secuencia de aminoácidos derivada de la SEC ID n° 2 mediante deleción, intercambio y/o adición de uno a tres aminoácidos.
2. 2. Péptido o proteína según la reivindicación 1, en el que el péptido o proteína es un péptido para la utilización

   15 como biomarcador del deterioro cognitivo que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada

   mediante la SEC ID n° 2 que se encuentra presente o incrementada en material biológico procedente de pacientes de deterioro cognitivo en comparación con material biológico de sujetos que no sufren de una enfermedad psiquiátrica.

   20 3. Péptido o proteína según la reivindicación 1, en el que el péptido o proteína es un péptido para la utilización

   como biomarcador de la enfermedad de Alzheimer que consiste de la secuencia de aminoácidos expresada mediante la SEC ID n° 2 que se encuentra presente o incrementada en material biológico procedente de pacientes de enfermedad de Alzheimer en comparación con material biológico de sujetos que no sufren de una enfermedad neurológica no demencia.

   25
3. 4. Péptido o proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido presenta un peso molecular inferior a 10.000 o presenta menos de 50 aminoácidos.
4. 5. Método in vitro para la detección de una enfermedad psiquiátrica o deterioro cognitivo que implica la

   30 determinación en material biológico de por lo menos un péptido o proteína según la reivindicación 1.
5. 6. Método in vitro según la reivindicación 5 para la detección del deterioro cognitivo en el que se evalúa que el paciente sufre de deterioro cognitivo en el caso de que, tras la determinación en material biológico del péptido como biomarcador de deterioro cognitivo según la reivindicación 2, se observa que dicho péptido se

   35 encuentra presente en cantidad más elevada que en un sujeto que no sufre de una enfermedad

   psiquiátrica.
6. 7. Kit para la detección de una enfermedad psiquiátrica que contiene un anticuerpo o aptámero específico para por lo menos un péptido o proteína según la reivindicación 1, para la determinación de por lo menos un

   40 péptido o proteína según la reivindicación 1.
7. 8. Kit para la detección del deterioro cognitivo, que contiene un anticuerpo o aptámero específico para por lo menos un péptido o proteína según la reivindicación 1, para la determinación de por lo menos un péptido o proteína según la reivindicación 1 o 2.

   45

   imagen1

   Z/LU

   O)

   Área

   Fig. 2

   A Marcador A = NRX2B

   P ® 0,707

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   100-Especificidad

   DCL vs. ADN

   Sensibilidad

   imagen5

   100-Especificidad EA vs. ADN

   g

   imagen6

   100-Especificidad EA vs. ENnon

   s: cria

   Abs. Int *1000

   en

   ■fs.

   imagen7

   íp‘

   CO

   Área

   Fig. 4

   A

   THRB

   R-

   P = 0,0000029

   r

   P « 0,75

   1 P = 0,00000358

   imagen8

   Área

   P = 0,17155 ^ ^

   ¡—:-------1 P = 0,12676

   |-----------------------1 P~ 0,00431

   I---------'—-------1

   P - 0,43779

   p-2jw^r P.„1194M' '

   {-----------í-----------j P = 0,00414

   r

   i p =

   imagen9

   imagen10

   imagen11

   imagen12

   Sensibilidad

   B THRB

   R-

   imagen13

   Área

   A

   Fig. 6

   9x105 8x105 7xt05 6x105 5x105 4x105 3x105

   2x10s

   P < 0,05

   P = 0,30854

   I------------1

   1 P < 0,05

   »•

   *

   *

   •

   * *

   ►

   ♦

   F

   1 * i

   Ir

   * i * • ;

   ■W f

   m m i

   ......Jl........... ...r....................

   ADN DCL EA

   imagen14

   co

   <D

   P = 0,25609

   r

   i p

   r

   P ® 0,00475

   ------------------------j

   P » 0,40523

   r

   1

   P = 4

   r

   i

   P = 8,24438E-7

   - _ .4

   I---------- —11 3 = 1.3378C

   2,0x10

   r * 1 l

   1,8x10*

   m am 9

   1,6x10®

   «*

   1,4x10®

   1,2X10 1,0X10®

   8,0x10* 6,0x10s

   * * # # :

   4,0x10*

   : 1 _ * 1 ♦ • * * •

   0,0

   i | t t X

   EA ENtodos ENdem ENnon

   cu

   0

   O

   p m*

   1

   T P = 0,06287

   L

   -

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   *

   *

   * <9

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   0

   -

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   T

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   --1................... %

   DCL

   EA

   D

   os

   (D

   2,400 2,100 1,800 1.

   0

   1 p-

   r

   P = 0,35 í-----------|P

   r

   i

   P - 0,40 I------1

   1 P ® 0,79

   1

   -*

   * ■

   • * «

   p.

   * m

   #

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   * •A* í *!* « 4 s • : X

   •..........i,............

   ..................... _i_

   EA ENtodos ENdem ENnon

   RARR2

   T-

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   R

   o

   II

   I

   Í0

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   Sí

   o

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   ÚL

   •

   -H

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   BK ^“P*

   
   x X X X X

   
   CO h- CD in ^

   B0JV

   3x103 2x103 1x103

   <

   LU

   imagen15

   LO

   co

   Q

   <

   imagen16

   imagen17

   imagen18

   Área

   imagen19

   CLUS

   SDVP N-term.

   co

   <D

   P = 0,954757

   J-----------1 P- 0,435567

   l-----------------------f P = 0,271468

   í----------------------------------1

   P “ 0,532365

   p-------1 P = 0,572272

   P = 0,171892

   ------------------j

   5x102 4x102 3x102

   1x102

   r

   r

   i p = 0,86919 ----------1 P = 0,257674

   *

   t

   w

   « »

   *

   • • •

   m m¡

   •

   -

   S * jfc • m a

   < w # W « w *

   r

   T m t

   -

   I $ l 1 ”W”" «

   **

   * ♦

   ___l_______ t * t _______l—^

   EA ENtodos ENdem ENnon

   imagen20

   imagen21

   imagen22

   Área

   imagen23

   Área

   imagen24

   P - 0,273066

   P = 0,311711 |---------'--------1

   |-----------------1 P = 0,175414

   imagen25

   CT>

   A

   muestra de DCL

   muestra de EA

   imagen26

   imagen27

   t

   Masa/Carga

   Fig. 11

   imagen28

   1489,2

   r 090406-E4-lp48-2 0001, 0904Ü6-F4-p48-2 0001

   Kratos PCAxíma CFRplus V2.4.0

   %lnt 5.1mV 7.0mV
8. 1488.5

   Muestra
9. 1479.4

   de DCL
10. 1495.1

    Muestra

    de EA

    Masa/Carga