WO2010134308A1 - 認知機能障害疾患を含む精神疾患のバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患を含む精神疾患の検出方法 - Google Patents

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内田和彦
石井俊
目野浩二
鈴木秀昭
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker that is a novel protein and peptide that can be used for detection of cognitive dysfunction diseases including mild cognitive dysfunction and Alzheimer's disease, and a cognitive dysfunction disease detection method using the biomarker.
  • the present invention relates to a detection method and biomarker for depression, schizophrenia and the like, which are mental diseases other than cognitive dysfunction diseases.
  • a technique that has been generally used in an in vitro diagnostic agent is a conventional technique.
  • the most common in-vitro diagnostic agents are those that perform diagnostic tests by analyzing blood components as biomarkers.
  • the presence of a single specific protein in blood or a so-called peptide having a molecular weight of 10,000 or less, or the activity in the case of an enzyme protein is measured, and a normal (healthy person) sample and a disease sample are measured. It has helped diagnosis with the obvious difference.
  • a specific primary antibody labeled with an enzyme that develops color when a sample is directly or diluted in advance and reacted with a substrate with a single or a plurality of specific proteins or peptides is bound to the primary or secondary antibody.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • enzyme activity assay measures the product by color development by directly giving a substrate when the protein is an enzyme.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • MS high performance liquid chromatography
  • SRM selected reaction monitoring
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the inventor binds an antibody against a protein or peptide of interest to beads (including magnetic beads), captures the protein or peptide to be measured by this, and then elutes from the beads to measure by immunoassay.
  • beads including magnetic beads
  • immunoassay for the purpose of analyzing intact proteins, a method of performing mass spectrometry using the above method after digestion with trypsin or the like has also been reported (see Patent Document 1).
  • utilizing the properties of intact proteins fractionation is performed as it is, or protein molecules that are specifically adsorbed are selected and analyzed by mass spectrometry.
  • Cognitive dysfunction diseases mainly Alzheimer's disease
  • the number was about 1.3 million in 1995, but about 1.9 million in 2005 and is expected to reach about 3 million in 2020.
  • Alzheimer's disease is said to account for 60-90% of cognitive impairment disorders. This disease is not only losing the patient's memory, but also destroying the personality and losing the patient's social life function, so it is becoming a social problem.
  • Donepezil hydrochloride an anti-acetylcholinesterase inhibitor, was approved at the end of 1999, and if it was administered early, it became possible to “delay” the decline in cognitive function with a high probability.
  • early diagnosis is the most important issue in order to increase the effects of current therapies and therapeutic drugs to be developed.
  • Non-patent Document 1 The main diagnostic criteria (DSM IV) of Alzheimer's disease by the American Psychiatric Association are shown below (Non-patent Document 1).
  • AD Alzheimer disease
  • MCI mild cognitive impairment
  • Lewy body dementia is characterized by progressive memory impairment and visual cognitive impairment such as hallucinations. Diagnosis based on clinical symptoms is DLB, with 10-30% of dementia being the second most common degenerative dementia disease in the elderly after Alzheimer-type dementia (AD). Histologically, it is characterized by the presence of Lewy bodies in the cerebrum. Since FTD and DLB are dementia with dementia, they are also called dementia-type neurological diseases (Non-patent Document 1). In the present invention, when collectively referred to as cognitive dysfunction diseases, MCI, AD, and dementia-type neurological diseases are included.
  • HDS-R Hasegawa Intelligence Rating Scale
  • MMSE Mini-Mental State Examination
  • HDS was revised in 1991 and is now called HDS-R. It consists of nine questions and tests for orientation, memorization, computing power, memory / recollection and common sense. Defects are suspected of being 30 out of 30 and below 23.
  • MMSE was devised in the United States for the diagnosis of dementia and covers orientation, memory, computational power, linguistic skills, and graphic skills. It consists of 11 questions with a maximum score of 30. Like HDS-R, it has a score of 23 or less and is suspected of having dementia. The results of both tests agree well with the proportions.
  • the diagnostic imaging includes CT / MRI for cerebral morphological abnormalities such as brain atrophy and cerebral cerebral ventricular enlargement, cerebral blood flow scintigraphy (SPECT) for cerebral blood flow, and oxygen consumption / glucose consumption.
  • SPECT cerebral blood flow scintigraphy
  • PET positron tomography
  • SPECT and PET are nuclear medicine methods that can detect abnormalities before morphological abnormalities occur (Non-patent Document 1).
  • image diagnosis requires special equipment, it has a drawback that it cannot be performed in all medical institutions. In addition, judgment may be different depending on the doctor who views the image, and the objectivity is lacking.
  • the diagnosis of dementia including AD, currently depends on methods that are not objective and require the use of expensive devices, and screening for disease detection is impossible. . If a biomarker is found here that enables objective diagnosis using easily obtained patient samples such as blood (including serum and plasma), screening will be the most important issue at present. It becomes possible to detect early cognitive dysfunction diseases.
  • the present invention provides such a novel biomarker and a method for detecting a cognitive dysfunction disease using the biomarker.
  • the present invention provides a detection method and a biomarker for depression, schizophrenia, and the like, which are mental disorders other than cognitive impairment disorders.
  • non-cognitive impairment subjects including healthy individuals, subjects who may suffer from some disease but do not suffer from cognitive impairment disease
  • presence, abundance in patients with cognitive impairment disease Provides a method for detecting cognitive dysfunction including mild cognitive dysfunction and Alzheimer's disease using different proteins and partial peptides thereof, and further comprising cognitive dysfunction consisting of the protein and the partial peptide and cognition including Alzheimer's disease
  • the purpose is to provide a biomarker for detecting a dysfunctional disease.
  • an object of the present invention is to provide a detection method and a biomarker for depression, schizophrenia and the like which are mental diseases other than cognitive dysfunction diseases.
  • the present inventor has intensively studied a method for detecting a cognitive dysfunction disease, and found in the serum peptides capable of detecting mild cognitive dysfunction, cognitive dysfunction diseases including Alzheimer's disease, and psychiatric disorders.
  • the peptide found in the present invention has significance as a biomarker when it is detected not only in serum but also in other biological samples such as blood, plasma, cerebrospinal fluid, and urine.
  • proteins or peptides that are the origin of these peptides (hereinafter referred to as intact proteins or peptides) also have significance as biomarkers.
  • the present inventor has identified a neuroxin-2-beta precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a prothrombin precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and an amino acid represented by SEQ ID NO: 6.
  • Pendrin composed of sequence, Coatomer subunit zeta-1 composed of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor composed of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 Gelsolin precursor consisting of the clusterin precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, Leucine consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 -rich at least one protein selected from the group consisting of repeat-containing protein 27 Found that may be used a peptide or the protein to amino acid residues 5 or more peptide fragments resulting from the peptide as a biomarker for mental disease diagnosis or cognitive dysfunction disease diagnosis.
  • the Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the Prothrombin precursor-derived peptide THRB (R-) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • the sequence number 5 Prothrombin precursor derived peptide THRB (R +) consisting of the amino acid sequence Pendrin derived peptide S26A4 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, Coatomer subunit zeta-1 derived peptide COPZ1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor peptide RARR2 (S-) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor peptide RARR2 (S +) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • Gelsolin precursor-derived peptide GELS comprising the amino
  • the present inventors further measured a large number of proteins, peptides or peptide fragments at a time by using these proteins, peptides or peptide fragments by two-dimensional liquid chromatography MALDI TOFMS method (mass spectrometry) or immunoMS method. Has succeeded in accomplishing the present invention.
  • Neuroxin-2-beta precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Prothrombin precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • Pendrin consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: Coatomer subunit zeta-1 consisting of the amino acid sequence represented by 8
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • Gelsolin precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
  • Clusterin precursor comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, Leucine-rich repeat-containing protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20
  • Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Prothrombin precursor-derived peptide THRB R-
  • Prothrombin precursor derived peptide THRB R +
  • Pendrin derived peptide S26A4 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • Coatomer subunit zeta-1 derived peptide COPZ1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor peptide RARR2 S-
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor protein RARR2 S +
  • a Gelsolin precursor-derived peptide GELS A Gelsolin precursor-derived peptide GELS
  • Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Prothrombin precursor-derived peptide THRB R-
  • Prothrombin precursor derived peptide THRB R +
  • Pendrin derived peptide S26A4 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • Coatomer subunit zeta-1 derived peptide COPZ1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor peptide RARR2 (S-) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor protein RARR2 S +
  • a cognitive impairment disorder which is a peptide consisting of an amino acid sequence represented by a sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 16
  • a biomarker for a cognitive impairment disease that appears or increases compared to a biological sample of a subject not suffering from a mental illness.
  • a cognitive dysfunction disease which is a peptide consisting of an amino acid sequence represented by a sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 17, 19, and 21
  • a biomarker for a cognitive impairment disease that disappears or decreases compared to a biological sample of a subject.
  • An Alzheimer's disease biomarker that appears or increases in a biological sample of an Alzheimer's disease patient, which is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, as compared with a biological sample of a non-demented neurological disease patient.
  • An Alzheimer's disease biomarker that disappears or decreases in an Alzheimer's disease patient biological sample which is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, as compared to a non-demented neurological disease patient's biological sample.
  • a method for detecting a mental illness comprising measuring at least one biomarker for diagnosing a mental illness according to any one of [1] and [2] in a biological sample.
  • a method for detecting a cognitive dysfunction disease comprising measuring at least one biomarker for diagnosing a cognitive dysfunction disease according to any one of [1] and [3] in a biological sample.
  • At least one cognitive dysfunction disease biomarker according to [4] in a biological sample is measured, and cognitive dysfunction is present when the biomarker is present more than in a subject not suffering from mental illness
  • a method for detecting a cognitive dysfunction disease that is judged to be suffering from a disease is compared to [4] in a biological sample.
  • Cognitive dysfunction is measured when at least one cognitive dysfunction biomarker according to [5] is measured in a biological sample and the biomarker is present in a small amount as compared with a subject not suffering from mental illness.
  • a mental disease detection kit for measuring at least one biomarker according to any one of [1] and [2].
  • a kit for detecting a cognitive dysfunction disease for measuring at least one biomarker according to any one of [1] and [3] to [5].
  • a detection kit for a psychiatric disorder comprising an antibody or aptamer against at least one biomarker according to any one of [1] and [2].
  • a detection kit for a cognitive dysfunction disease comprising an antibody or aptamer to at least one biomarker according to any one of [1] and [3] to [5].
  • Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in a biological sample derived from a subject
  • Prothrombin precursor-derived peptide THRB consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (R-), Prothrombin precursor-derived peptide THRB (R +) composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, Pendrin-derived peptide S26A4 composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • Coatomer subunit consisting of zeta-1 derived peptide COPZ1, Retinoic acid receptor responder protein 2 consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, precursor derived peptide RARR2 (S-), Retinoic acid consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 receptor responder protein 2 precursor-derived peptide RARR2 (S +),
  • Gels
  • Alzheimer's disease by measuring the amount of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, it can be diagnosed as Alzheimer's disease when it increases compared to the biological sample of a patient with non-demented neurological disease.
  • Alzheimer's disease By measuring the amount of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by No. 4, Alzheimer's disease can be diagnosed when the amount decreases compared to the biological sample of a patient with non-demented neurological disease.
  • the present invention also provides a diagnostic system with extremely high accuracy and specificity. According to the present invention, it becomes possible for the first time to make a highly accurate diagnosis for a cognitive dysfunction disease for which there is no specific test method for a biological sample such as blood. Furthermore, the biomarker of the present invention is highly useful in determining drug effects.
  • FIG. 3 An example of the difference analysis result, Marker A.
  • Marker A is a Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B.
  • A) is a comparison between ADN, MCI, and AD
  • B) is a comparison between ADN, AD, NDall, NDdem, and NDnon.
  • SD average value
  • A) ADN 0.1 (0.1); MCI 45.8 (42.2); AD 41.7 (22.2).
  • C), D), and E) are ROC curves in comparison of MCI vs. ADN, AD vs. ADN, and AD vs. NDnon, respectively.
  • MS / MS spectrum chart by TOF / TOF mass spectrometer of Marker A SEQ ID NO: 2 NRX2B.
  • Example 1 Comparison of serum THRB (R-) (A) and B)) and THRB (R +) (C) and D)) between nonpsychiatric subjects (ADN) and psychiatric patients including dementia.
  • Example 1 A) Individual comparison between serum THRB (R-) and THRB (R +) non-psychiatric subjects (ADN) and cognitive impairment patients (MCI, AD). B) ROC curve in comparison of AD versus NDnon for serum THRB (R-).
  • Example 1 Comparison of serum S264A between nonpsychiatric subjects (ADN) and psychiatric patients with dementia (A) and B)) and comparison between serum COPZ1 nonpsychotic subjects and psychiatric patients with dementia ( C) and D)).
  • Example 1 Comparison of serum PARR2 (S-) (A)) and PARR2 (S +) (B)) between nonpsychotic subjects (ADN) and cognitive impairment patients (MCI, AD).
  • Example 1 Comparison of serum GELS between non-psychiatric subjects (ADN) and psychiatric patients including dementia (A) and B)).
  • Example 1 Comparison between serum CLUS (N-term SDVP) non-psychiatric subjects (ADN) and psychiatric patients with dementia (A) and B)) and serum CLUS (N-term RFFT) non-psychiatric subjects Comparison between (ADN) and psychiatric patients including dementia (C) and D)).
  • Example 1 Comparison between serum EIF3J nonpsychotic subjects (ADN) and patients with mental illness including dementia (A) and B)) and serum LRC27 nonpsychotic subjects (ADN) and cognitive impairment patients (MCI, Comparison between (AD) (C)).
  • Example 1 Mass spectrum of NRX2B peptide captured and detected by immunoMS method using antibodies specific for NRX2B from AD and MCI patient sera. The enlargement of the arrow on the left is the right. The peaks of the endogenous NRX2B peptide (right in the figure, solid line arrow) and the stable isotope-labeled NRX2B synthetic peptide (right in the figure, broken line arrow) are shown.
  • Example 4 Mass spectrum of NRX2B peptide captured and detected by immunoMS method using antibodies specific for NRX2B from AD and MCI patient sera. The enlargement of the arrow on the left is the right. The peaks of the endogenous NRX2B peptide (right in the figure, solid line arrow) and the stable isotope-labeled NRX2B synthetic peptide (right in the figure, broken line arrow) are shown.
  • Example 4 Mass spectrum of NRX2B peptide captured and detected by immunoMS method using antibodies specific for
  • the present invention detects the type and amount of an intact protein and / or its partial peptide and simultaneously measures the variation of the type and amount of the intact protein and its partial peptide when the subject suffers from a cognitive impairment disease.
  • This is a method for diagnosing whether or not a subject suffers from a cognitive dysfunction disease.
  • it is a method for diagnosing whether or not a person has a mental illness.
  • the peptide generally refers to a peptide in which amino acids having a molecular weight of 10,000 or less are linked, or the number of amino acid residues is from several to about 50 or less.
  • a partial peptide of an intact protein can be used as a biomarker for detecting a cognitive dysfunction disease.
  • the intact peptide partial peptide refers to a peptide having a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the intact protein, and is generated as a partial peptide in the expression synthesis process by transcription and translation; After being synthesized as an intact protein, it may be digested and decomposed in vivo to produce a digested degradation product peptide. This is because protein synthesis and control mechanisms are deregulated when the living body is in a state other than normal, such as a cognitive impairment disorder.
  • the present invention determines whether a subject is in a normal state or suffers from a cognitive dysfunction disease by using expression synthesis and / or digestion degradation of protein in vivo as an index, and also suffers from a cognitive dysfunction disease. It is also a method for evaluating and discriminating the degree of progression of the disease in the case of being present.
  • the detection of a cognitive dysfunction disease refers to evaluation discrimination, that is, diagnosis, whether or not a subject suffers from a cognitive dysfunction disease. It may also include an assessment of the risk that the subject will suffer from more severe cognitive impairment.
  • a Neuroxin-2-beta precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3
  • Prothrombin precursor consisting of the amino acid sequence represented by Pendrin consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6,
  • Coatomer subunit zeta-1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8,
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor Gelsolin precursor consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • Clusterin precursor consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, Eukaryotic consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 translation initialization factor 3 subunit J, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20
  • Examples include Leucine-rich repeat-containing protein 27, and peptide fragments of 5 or more amino acid residues that are partial peptides of these intact
  • a Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • Prothrombin precursor derived peptide THRB R-
  • Pendrin derived peptide S26A4 composed of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9
  • Coatomer subunit zeta-1-derived peptide COPZ1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide RARR2 (S-) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide RARR2 S-
  • the intact proteins and peptides described above are used as markers, and consist of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 21.
  • Proteins and peptides are also included, and these proteins or peptides can also be used as biomarkers in the methods of the invention.
  • “one or several” means “one or three”, “one or two” or “one”.
  • these peptides that can be used as biomarkers for detecting cognitive dysfunction diseases also include peptide fragments having 5 or more amino acid residues resulting from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 21.
  • Non-Patent Document 2 The reason why the peptide fragment is 5 or more amino acid residues is due to the following description in Non-Patent Document 2. That is, the peptide CGGGERA in which R is replaced with K for the amino acid residue sequence IRGERA at the C-terminus (130-135) of histone H3 and IR is deleted, and the peptide CGGGERA in which CGG is bound to GERA is used instead of the peptide IRGERA. It was reported that it was recognized by the antibody obtained. This indicates that antigenic recognition is made by a peptide consisting of 4 or more amino acid residues.
  • the number of residues is increased by 1 to 5 or more, but such low molecular peptides are also targeted. It is important when using a method for detection and fractionation using immunological techniques such as immunoblotting, ELISA, and immunoMS.
  • a sugar chain may be added to an intact protein or a partial peptide thereof. Proteins and partial peptides to which these sugar chains are added can also be used as biomarkers for detecting cognitive impairment disorders.
  • the biomarker may be quantified or the presence or absence may be determined by qualitative.
  • two-dimensional electrophoresis or two-dimensional chromatography can be used as a method for separating biomarkers in a biological sample such as serum.
  • the two types of chromatography in this case may be selected from known chromatography such as ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography and the like. It can also be quantified by the SRM / MRM method using the LC-MS / MS method.
  • an immunoMS that binds an antibody against the protein or peptide of interest to the beads (including magnetic beads) developed by the inventor, captures the protein or peptide to be measured, and then elutes from the bead and measures by mass spectrometry
  • the presence or amount of the target protein, protein fragment, or peptide can be easily evaluated without using two-dimensional electrophoresis or chromatography.
  • a subject's cognitive dysfunction can be evaluated at a mild stage, which is useful for preventive medicine. Furthermore, when psychotherapy or pharmacotherapy is performed on a patient suffering from a cognitive dysfunction disease, if the progression of the disorder is suppressed, it is also reflected in the amount of protein / partial peptide in a biological sample such as serum. By measuring this, it is possible to evaluate and determine the therapeutic effect.
  • the type and amount of protein in a biological sample can be measured by various methods.
  • a target protein including a protein fragment and a partial peptide
  • an antibody against it primary antibody
  • Immunoblot method The simplest method. Prepare test serum diluted in several stages, drop a certain amount (around 1 microliter) onto a suitable membrane such as nitrocellulose membrane, and air dry. After treatment with a blocking solution containing a protein such as BSA, washing and reacting with the primary antibody, and after washing, a labeled secondary antibody for detecting the primary antibody is reacted. After washing the membrane, the label is visualized and the concentration is measured.
  • ELISA method An antibody against a protein or its partial peptide is bound to a carrier such as a microtiter plate with special chemical modification in advance. After serial dilution of the sample, an appropriate amount is added to the microtiter plate to which the antibody is bound and incubated. . Thereafter, washing is performed to remove uncaptured proteins and partial peptides. Next, a secondary antibody conjugated with a fluorescent or chemiluminescent substance or enzyme is added and incubated. For detection, evaluation is performed by adding each substrate and then measuring visible light by fluorescent or chemiluminescent substances or enzymatic reactions. A substance capable of binding to a protein or a partial peptide thereof may be used instead of an antibody. For example, an aptamer or the like can be used.
  • microarray is a generic term for devices in which substances that can be bound to substances to be measured are arranged (arrayed) and immobilized on a carrier (substrate).
  • antibodies or aptamers against proteins and partial peptides may be used after being aligned and immobilized.
  • add a biological sample to the immobilized antibody, etc. bind the protein or partial peptide to be measured on the microarray, and then add the secondary antibody to which the fluorescent or chemiluminescent substance or enzyme is bound.
  • Detection may be performed by adding each substrate and then measuring the fluorescent or chemiluminescent substance or visible light from the enzyme reaction.
  • Mass Spectrometry for example, an antibody against a specific protein and its partial peptide is bound to microbeads or substrates (protein chips) that have been specially modified in advance.
  • the microbead may be a magnetic bead. Any material can be used for the substrate.
  • the antibodies used are (1) an antibody that recognizes only the full length of a specific protein, (2) an antibody that recognizes only a partial peptide, (3) an antibody that recognizes both a specific protein and its partial peptide, or A combination of (1) and (2), (1) and (3), or (2) and (3) may be used.
  • a sample is serially diluted with a stock solution or a buffer solution, and an appropriate amount thereof is added to a microbead or a substrate to which an antibody is bound, and incubated. Thereafter, washing is performed to remove uncaptured proteins and partial peptides.
  • the protein and partial peptide captured on the microbead or substrate are then analyzed by mass spectrometry using MALDI TOF-MS, SELDI TOF-MS, etc., and the mass number and peak intensity of the protein, protein fragment and partial peptide peaks are analyzed. Measure.
  • a certain amount of an appropriate internal standard substance is added to the original biological sample, its peak intensity is measured, and the ratio to the peak intensity of the target substance is determined to obtain the concentration in the original biological sample. I can know.
  • the sample can be diluted with a stock solution or a buffer solution or a part of protein can be removed, and then separated by HPLC and quantified by mass spectrometry using an electrospray ionization (ESI) method.
  • ESI electrospray ionization
  • the concentration in the data can be known by absolute quantification by SRM / MRM method using an isotope-labeled internal standard peptide.
  • proteins and partial peptides can be analyzed by a method using two-dimensional electrophoresis, a method using surface plasmon resonance, or the like.
  • the present invention also includes a method in which a biological sample collected from a subject is subjected to two-dimensional electrophoresis or surface plasmon resonance, and a cognitive impairment disorder is detected using the presence or absence or amount of the biomarker as an index.
  • NDall Neurological disorder Serum Serum was used.
  • NDall consists of 10 cases of NDdem (demented neurological disease) and 10 cases of NDnon (non-demented neurological disease).
  • NDdem consists of 5 cases each of Lewy body dementia and frontotemporal dementia
  • NDnon consists of 5 cases each of schizophrenia and depression. NDnon may also be called non-cognitive impairment neurological disease.
  • a value obtained by dividing the peak area at a specific mass of the sample by the peak area obtained from bradykinin 1-7 fragment 250 fmol and multiplying by 10,000 was defined as an Area value.
  • This Area value corresponds to 25 ⁇ l of sample serum.
  • Detection of peptides with differences in serum abundance between groups was performed using DeView, a multigroup statistical analysis software developed by us. Peptides in which a difference in abundance was observed were determined by MS / MS using ultraflex TOF / TOF, and the intact protein or peptide that originated the peptide was identified.
  • FIG. 1 was obtained by subjecting the serum of one AD patient to 2D-LC-MALDI TOF-MS, and was fractionated into 6 fractions using a first-dimensional SCX cation exchange column. After that, the spectrum obtained by fractionating each fraction into 191 fractions with a C18 reverse phase column was measured with MALDI TOF-MS.
  • the horizontal axis represents m / z, and the vertical axis represents the fraction of reverse phase column chromatography. It is the figure visualized by DeView.
  • SCX1 is a flow-through fraction
  • SCX2 is a fraction eluted at a salt concentration of 10%
  • SCX3 is a fraction eluted at a salt concentration of 20%
  • SCX4 is a fraction eluted at a salt concentration of 30%
  • SCX5 is eluted at a salt concentration of 50%
  • SCX6 is a fraction eluted at a salt concentration of 100%.
  • FIG. 1 many sera have many peptides in the SCX1, SCX3, SCX4, and SCX5 fractions.
  • the total number of peptides fractionated by 2D-LC and detected by MALDI TOF-MS is approximately It was 4,000.
  • Fig. 2 shows the case of Marker A as an example of the difference analysis results.
  • Marker A is a Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B as shown in FIG. 3 later.
  • 2A is a comparison between ADN, MCI, and AD
  • B) is a comparison between ADN, AD, NDall, NDdem, and NDnon.
  • A) and B) are the results of separate experiments, and the same sample was used in both experiments for ADN and AD (ie, the reproducibility of the measurement results was shown for ADN and AD).
  • A) of FIG. 2 it was found that Marker A increased in MCI and AD patients from ADN.
  • Fig. 2 shows the case of Marker A as an example of the difference analysis results.
  • Marker A is a Neuroxin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B as shown in FIG. 3 later.
  • 2A is a comparison between ADN, MCI, and AD
  • B) is a
  • C), D), and E) in FIG. 2 are ROC curves in comparison of MCI vs. ADN, AD vs. ADN, and AD vs. NDnon, respectively.
  • Typical values of sensitivity and specificity are the minimum distance when a straight line is drawn on the ROC curve from 100% point on the y-axis in C), D), and E) in FIG.
  • NDnon were compared, and the sensitivity was 100%, the specificity was 50%, and the ROC value was 0.710. From the above, it was clarified that Marker A (NRX2B) is useful in distinguishing MCI and AD from ADN, and also useful in distinguishing AD from non-demented neurological disease (NDnon). In particular, since MCI is a pre-stage of AD, Marker A (NRX2B) is considered to be extremely useful as a marker for early diagnosis and detection of subjects who may migrate to AD.
  • Figure 3 shows the MS / MS results for Marker A using ultraflex TOF / TOF. Signals indicating y-ion and b-ion appeared sufficiently, and the amino acid sequence could be easily determined. This result was searched by Mascot.
  • the origin protein or peptide (hereinafter referred to as intact protein or peptide) is Neuroxin-2-beta precursor, and the detected peptide is derived from this RSGGNATLQVDSWP (SEQ ID NO: 2) It became clear that.
  • NRX2B which is Swiss-Prot's Entry Name for Neurexin-2-beta precursor is used as an abbreviation for peptide name. For other detected peptides, the Swiss-Prot Entry Name is also used in the following description as an abbreviation for the peptide name.
  • (+ Oxidation (M)) was written at the end of the amino acid sequence for those whose sequence was determined in the state where methionine was oxidized.
  • amino acid residues at the corresponding positions are represented by (X).
  • Neurexin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B NRX2B of SEQ ID NO: 2 was not detected by ADN, but was detected in MCI and AD patients and NDall, NDdem, and NDnon patients. Furthermore, even in comparison between AD and Ndnon, AD had a higher value and showed discriminatory power (see above, Fig. 2).
  • Neurexin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B RSGGN ATLQVDSWP (SEQ ID NO: 2)
  • THRB (R-) Prothrombin precursor-derived peptide
  • R- means a peptide lacking R at the C-terminal.
  • THRB (R-) of SEQ ID NO: 4 was specifically detected by ADN, and was extremely low in MCI, AD, NDall, NDdem, and NDnon. 4 and 5 show THRB (R ⁇ ) and THRB (R +) side by side.
  • FIG. 4 is a scatter diagram
  • FIG. 5, A) shows how THRB (R ⁇ ) and THRB (R +) appear different for each ADN, MCI, and AD individual.
  • FIG. 5B is a ROC curve in the comparison of THRB (R ⁇ ) AD vs. NDnon.
  • the ROC value was as high as 0.815, which was lower in AD than NDnon.
  • THRB (R-) was found to be useful in distinguishing patients with cognitive impairment (MCI, AD, NDdem) from patients with non-cognitive impairment (NDnon), like NRX2B.
  • Prothrombin precursor-derived peptide THRB R-) GLDEDSDRAIEG (SEQ ID NO: 4)
  • Prothrombin precursor-derived peptide THRB R +
  • GLDEDSDRAIEGR SEQ ID NO: 5
  • Pendrin-derived peptide S26A4 of SEQ ID NO: 7 was not detected by ADN, but was detected by MCI, AD, NDall, NDdem, and NDnon (FIG. 6).
  • FFPILTYFIF GTSRHISVGP FPVVSLMVGS 151 VVLSMAPDEH FLVSSSNGTV LNTTMIDTAA RDTARVLIAS ALTLLVGIIQ 201 LIFGGLQIGF IVRYLADPLV GGFTTAAAFQ VLVSQLKIVL NVSTKNYNGV 251 LSIIYTLVEI FQNIGDTNLA DFTAGLLTIV V
  • Pendrin-derived peptide S26A4 LAGLIFGLLTVVLR SEQ ID NO: 7
  • Coatomer subunit zeta-1 derived peptide (COPZ1) COPZ1 of SEQ ID NO: 9 was low in ADN, but high in MCI, AD and NDdem (FIG. 6).
  • Intact protein / peptide 001 MEALILEPSL YTVKAILILD NDGDRLFAKY YDDTYPSVKE QKAFEKNIFN 051 KTHRTDSEIA LLEGLTVVYK SSIDLYFYVI GSSYENELML MAVLNCLFDS 101 LSQMLRKNVE KRALLENMEG LFLAVDEIVD GGVILESDPQ QVVHRVALRG 151 EDVPLTEQTV SQVLQSAKEQ IKWSLLR (SEQ ID NO: 8)
  • Coatomer subunit zeta-1 derived peptide COPZ1 AILILDNDGDRLFAKYYDD (SEQ ID NO: 9)
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide (RARR2 (S-)) RARR2 (S ⁇ ) of SEQ ID NO: 11 was not detected by ADN, but was detected by AD and MCI (FIG. 7).
  • RARR2 (S-) Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide
  • S- Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide RARR2 S-
  • PHSFYFPGQFAFSKALPR SEQ ID NO: 11
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide (RARR2 (S +)) RARR2 (S +) of SEQ ID NO: 12 was not detected by ADN like RARR2 (S ⁇ ), but was detected by AD and MCI (FIG. 7).
  • S + means a peptide having S at the C-terminus.
  • Retinoic acid receptor responder protein 2 precursor-derived peptide RARR2 S +
  • PHSFYFPGQFAFSKALPRS SEQ ID NO: 12
  • Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J-derived peptide (EIF3J) EIF3J of SEQ ID NO: 19 was detected in ADN, and was not detected at all or hardly detected in MCI, AD, NDall, NDdem, and NDnon (FIG. 10).
  • LRC27 Leucine-rich repeat-containing protein 27-derived peptide (LRC27) LRC27 of SEQ ID NO: 21 was detected in ADN and not detected in AD (FIG. 10).
  • Intact protein / peptide 001 MEGSSSYEVP SVAAADLEEG AGQTRSLPAT PSKDVHKGVG GIIFSSSPIL 051 DLSESGLCRL EEVFRIPSLQ QLHLQRNALC VIPQDFFQLL PNLTWLDLRY 101 NRIKALPSGI GAHQHLKTLL LERNPIKMLP VELGSVTTLK ALNLRHCPLE 151 FPPQLVVQKG LVAIQRFLRM WAVEHSLPRN PTSQEAPPVR EMTLRDLPSP 201 GLELSGDHAS NQGAVNAQDP EGAVMKEKAS FLPPVEKPDL SELRKSADSS 251 ENWPSEEEIR RFWKLRQEIV EHVKADVLGD QLLTRELPPN LKAALNIEKE 301 LPKPR
  • FIGS. 2, 4 and 6 to 10 show scatter plots for comparison between ADN, MCI and AD for peptides from SEQ ID NO: 2 (NRX2B) to SEQ ID NO: 21 (LRC27) and A scatter diagram for comparison between ADN, AD, NDall, NDdem, and NDnon, and p-value of t test in each comparison are shown.
  • Table 1 shows a list of ROC values in the comparison of MCI vs. ADN and AD vs. ADN for the above 12 types of marker peptides.
  • Table 1 shows the usefulness of each marker peptide in the detection of cognitive impairment disorders (MCI and AD).
  • MCI and AD cognitive impairment disorders
  • Each of these marker peptides can be used alone or in combination so that the abundance in serum can be directly analyzed by mass spectrometry or immunology with or without liquid chromatography and / or other appropriate separation means. It is possible to make a diagnostic distinction between non-demented and demented forms of cognitive dysfunction diseases such as AD and MCI and neurological diseases by measuring by other methods such as mechanical or enzymological methods.
  • Peptide markers not detected by ADN but detected by MCI, AD, NDall, NDdem, NDnon, or vice versa peptide markers detected by ADN but not detected by MCI, AD, NDall, NDdem, NDnon It is also effective for detection.
  • An antigenic peptide was synthesized in order to produce a specific antibody that recognizes the Neurexin-2-beta precursor-derived peptide NRX2B of SEQ ID NO: 2.
  • the synthetic peptide was added with a cysteine residue (denoted as Cys or C) at the C-terminus in order to bind to the carrier protein.
  • a peptide conjugated with a carrier protein (RSGGNATC-KLH, see below) was mixed with an adjuvant, and rabbits were immunized.
  • a total of 8 immunizations were performed every 1 to 2 weeks, and test blood was collected twice every 4 weeks, and the antibody titer was measured by an enzyme immunoassay method (EIA method).
  • EIA method enzyme immunoassay method
  • a stable isotope-labeled NRX2B synthetic peptide (V is substituted with 13C5, 15N) having a mass 6 larger than that of NRX2B was used. Both endogenous peptides and stable isotope labeled peptides are captured by anti-NRX2B antibodies. 1 ⁇ l of 200 fmol / ⁇ l of stable isotope-labeled NRX2B synthetic peptide was added to each 25 ⁇ l of AD and MCI patient serum, and incubated at 4 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 475 ⁇ l of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) was added and boiled at 105 ° C. for 5 minutes.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • FIG. 11 shows the results of detection of NRX2B peptide from AD and MCI patient sera using the above method as mass spectra.
  • FIG. 11A is an overall view of the obtained spectrum
  • FIG. 11B is an enlarged view of the arrow part of FIG. 11A).
  • the signal indicated by the dashed arrow in FIG. 11B) is a spiked stable isotope-labeled NRX2B synthetic peptide
  • the signal indicated by the solid arrow is the endogenous NRX2B peptide.
  • the observed mass value was within the measurement error range of the assumed value, and the mass difference between the stable isotope-labeled NRX2B synthetic peptide and the endogenous NRX2B peptide was 6, indicating that the captured peptide was NRX2B. Proven.
  • biomarker disclosed in the present invention enables detection of cognitive dysfunction diseases including mild cognitive dysfunction and Alzheimer's disease and detection of psychiatric diseases other than cognitive dysfunction diseases, and uses in the diagnostic field including diagnostic agents Applicable to.

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Abstract

【課題】　非認知機能障害被験者と認知機能障害疾患患者において存在量が異なるタンパク質およびその部分ペプチドを用いて軽度認知機能障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患を検出する方法ならびに該タンパク質および該部分ペプチドからなる軽度認知機能障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーの提供。同時に、認知機能障害疾患以外の精神疾患の検出方法およびバイオマーカーの提供。 【解決手段】　配列番号１、３、６、８、１０、１３、１５、１８および２０のタンパク質からなる群および、これらのタンパク質の部分ペプチドである配列番号２、４、５、７、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはタンパク質から生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる認知機能障害疾患および精神疾患の診断のためのバイオマーカーならびにこれを用いた診断方法および、診断方法で用いるペプチド特異抗体を作成するための配列番号２２で表される抗原ペプチド。

Description

認知機能障害疾患を含む精神疾患のバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患を含む精神疾患の検出方法
　本発明は、軽度認知機能障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患の検出に用い得る新規なタンパク質およびペプチドであるバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患の検出方法に関する。同時に、本発明は認知機能障害疾患以外の精神疾患であるうつ病、統合失調症などの検出方法およびバイオマーカーに関する。
　生体の正常と正常以外の状態を呈する試料を用いてその差異を判別する手段としては、一般的には体外診断薬において用いられてきた技術が主たる従来技術である。体外診断薬のうち最も多いのが、血液中の成分をバイオマーカーとして分析することで診断検査を行うものである。本分野における従来技術では、血液中の単独の特定のタンパク質または分子量１万以下のいわゆるペプチドの存在量、あるいは酵素タンパク質の場合は活性の測定を行って、正常(健常人)試料と疾患試料との明らかな差をもって診断の一助としてきた。すなわちあらかじめ一定数の健常人と疾患患者由来の試料における単独もしくは複数の特定のタンパク質またはペプチドの量もしくは活性量を計測し、異常値と正常値の範囲を決め、評価する試料を同様の方法で測定し、異常値と正常値のどちらの範囲に属するかによって検査評価を行うものである。
　具体的な計測方法としては、試料をそのまま、またはあらかじめ希釈しておき、単独または複数の特定のタンパク質またはペプチドの量を、基質と反応させると発色する酵素によって標識された特異的１次抗体または２次抗体を用いて、試料の発色量で計測する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA;enzyme　linked　immmunosorbent　assay)や化学発光測定法(CLIA;chemiluminescent　immunoassay)と１次抗体または２次抗体に結合させたラジオアイソトープを用いて計測する放射性免疫測定法(RIA;radioimmunoassay)、タンパク質が酵素の場合は直接基質を与えて産生物を発色などで計測する酵素活性測定法などがある。抗体を用いるこれらの方法を酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法と呼ぶこととする。また酵素の基質分解産物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析する方法もある。またHPLCと質量分析装置を組み合わせたLC-MS/MS法ならびにこれを用いたselected　reaction　monitoring(SRM)/multiple　reaction　monitoring(MRM)法もある。また、試料に適当な前処理を施した後、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)を行ってタンパク質またはペプチドを分離した後、目的のタンパク質またはペプチドについて銀染色、クマシーブルー染色、あるいは対応する抗体を用いた免疫染色(ウエスタン・ブロッティング)を行って、試料中の濃度を測定する方法もある。また、生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析法によって分析する手法がある。またカラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。
　さらに、発明者はビーズ(磁気ビーズを含む)に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質またはペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法を開発している。またインタクトなタンパク質の解析を目的としてトリプシンなどで分解した後、上記の方法で質量分析まで行う方法も報告されている(特許文献１参照)。しかしいずれもインタクトなタンパク質の性質を利用して、そのまま分画し、または特異的に吸着するタンパク質分子を選別して質量分析で解析するものである。
　アルツハイマー病を主とする認知機能障害疾患は、我が国においても近年の高齢化に伴って急激に増加している。1995年に約130万人であったが、2005年には約190万人となり、2020年には約300万人に達すると予想されている。アルツハイマー病は認知機能障害疾患の60-90%を占めると言われている。本疾患は患者の記憶を喪失させるのみでなく人格をも崩壊して患者の社会生活機能を喪失させてしまうことから、社会問題化しつつある。本邦においては1999年末に抗アセチルコリンエステラーゼ阻害薬である塩酸Donepezilが認可を受け、早期に投与されれば高い確率で認知機能の低下を「遅らせる」ことができるようになった。アルツハイマー病においては、現状の治療法やこれから開発される治療薬効果をあげるためには早期に診断することが最重要の課題となっている。
　米国精神医学会によるアルツハイマー病の主たる診断基準(DSM　IV)を以下に示す(非特許文献１)。
　A．多彩な認知欠損の発現で、以下の両方により明らかにされる。
　　(1)記憶障害(新しい情報を学習したり、以前に学習した情報を想起する能力の障害)
　　(2)以下の認知障害の一つまたはそれ以上
　　　　a)失語(言語の障害)
　　　　b)失行(運動機能の障害がないにもかかわらず、動作を行う能力の障害)
　　　　c)失認(感覚機能の障害がないにもかかわらず、対象を認識または同定する能力の障害)
　　　　d)実行能力(計画を立てる・組織化する・順序だてる・抽象化する)の障害
　B．基準A(1)および、A(2)の認知欠損は、その各々が社会的または職業的機能の著しい障害を引き起こし、病前の機能水準から著しい低下を示す。
　アルツハイマー病(Alzheimer　disease)(AD)の関連疾患にはいろいろなものがある。ADなどの認知症は徐々に認知機能の低下が出現するため、認知症の前駆状態と呼ぶべき状態が存在する。このような状態を軽度認知機能障害(mild　cognitive　impairment)(MCI)と呼んでいる。米国のデータでは物忘れ外来を受診したMCI　のうち、1年に10-15％、4年間でおよそ50％がADに移行するという。ADの前駆状態の大部分は健忘型MCI　に含まれる。現在の定義によると、MCIは認知機能の低下に関する訴えが聞かれるが、基本的な日常生活には支障がない状態とされる。前頭側頭型認知症(FTD)は認知機能低下とともに周囲を気にせずわが道を行く行動が特徴的で、周囲に合わせようとするADと対照的である。FTDには大脳皮質に組織学的にPick球の存在を認めるPick病が含まれる。レビー小体型認知症(DLB)は、記憶障害が進行性であり幻視などの視覚認知障害があることを特徴としている。臨床症状からの診断では認知症の10-30％がDLBであり、老年期の変性性認知症疾患ではアルツハイマー型認知症(AD)に次いで2番目に多いとされる。組織学的には大脳におけるレビー小体の存在を特徴とする。FTDおよびDLBは認知症を認め痴呆型であるので痴呆型神経疾患とも呼ばれる(非特許文献１)。
　本発明において、認知機能障害疾患と総称するとき、MCI、ADおよび痴呆型神経疾患を含むものとする。
　認知症の診断に広く用いられている検査は、改訂長谷川式知能評価スケール(HDS-R)とMMSE(Mini-Mental　State　Examination)で、被験者への問診を行い、その結果から判断するものである。HDSは1991年に改訂されてHDS-Rと称されるようになった。これは9項目の質問からなり、見当識、記銘力、計算能力、記憶・想起および常識をテストするものである。30点満点で23点以下を認知症の疑いありとする。また、MMSEは痴呆の診断のために米国で考案されたもので、見当識、記憶力、計算力、言語的能力、図形的能力などをカバーする。30点満点で11の質問からなり、HDS-Rと同様に23点以下で認知症の疑いありとする。両テストの結果は割合によく一致するとされている。これらの問診法はあくまでスクリーニングの目的で用いられ、確定診断に至ることはないし、HDS-R、MMSEともに重症度分類に用いられることはない(非特許文献１)。
　画像診断法としては、脳萎縮・脳溝脳室拡大など、脳の形態的異常を見るCT・MRIと脳血流量を見る脳血流シンチグラフィ(SPECT)および酸素消費量・ブドウ糖消費量を見るポジトロン断層法(PET)がある。SPECTおよびPETは核医学的方法で、形態的異常の起きる前に異常を検出することができるとされている(非特許文献１)。しかし、これらの画像診断は特殊な設備を必要とするため、全ての医療機関で実施することができないという欠点を有する。また画像を見る医師によって判断が異なることがあり、客観性に欠ける。
　このようにADを含む認知症の診断は、客観性を欠く、かつ高価な装置の使用を前提とした方法に依存しているのが現状であり、疾患発見のためのスクリーニングは不可能である。ここに血液(血清、血漿を含む)のような容易に得られる患者の試料を用いて客観的診断を可能にするバイオマーカーが見出されるならば、スクリーニングを行うことによって、現在最重要の課題となっている認知機能障害疾患の早期発見が可能となる。本発明はそのような新規バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患の検出方法を提供するものである。同時に、本発明は認知機能障害疾患以外の精神疾患であるうつ病、統合失調症などについてもその検出方法とバイオマーカーを提供する。
特開2004-333274号公報
特開2006-308533号公報
中野今治、水澤英洋編集：よくわかるアルツハイマー病、2004、永井書店
N. Benkiraneら、J. Biol. Chem. Vol. 268, 26279-26285, 1993
　本発明は、非認知機能障害被験者(健常人を含み、何らかの疾患に罹患していてもよいが認知機能障害疾患には罹患していない被験者)と認知機能障害疾患患者において存在の有無、存在量が異なるタンパク質およびその部分ペプチドを用いて軽度認知機能障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患を検出する方法を提供し、さらに該タンパク質および該部分ペプチドからなる軽度認知機能障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーの提供を目的とする。同時に、本発明は認知機能障害疾患以外の精神疾患であるうつ病、統合失調症などについてもその検出方法とバイオマーカーを提供することを目的とする。
　本発明者は、認知機能障害疾患を検出する方法について鋭意検討を行い、軽度認知機能障害、アルツハイマー病を含む認知機能障害疾患ならびに精神疾患を検出することができるペプチドを血清中に見出した。本発明において見出された該ペプチドは血清中のみならず、血液、血漿、脳脊髄液、尿などの他の生体試料中に検出される場合もバイオマーカーとして意義をもつものである。同時に、これらのペプチドの起源であるタンパク質またはペプチド(以下、インタクトタンパク質またはペプチドと称する)もバイオマーカーとしての意義をもつ。
　具体的には、本発明者は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPendrin、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片を精神疾患診断ないし認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーとして用い得ることを見出した。
　さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを精神疾患診断ないし認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーとして用い得ることを見出した。
　本発明者らは、さらに、これらのタンパク質やペプチドないしペプチド断片を２次元液体クロマトグラフィーMALDI　TOFMS法(質量分析法)やimmunoMS法を用いることにより、一度に多数のタンパク質ないしペプチドないしペプチド断片を測定することに成功し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPendrin、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる精神疾患診断ないし認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカー。
[２]　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる精神疾患診断のためのバイオマーカー。
[３]　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカー。
[４]　　配列番号２、５、７、９、１１、１２、１４、１６からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、認知機能障害疾患患者生体試料中において、精神疾患に罹患していない被験者の生体試料中と比較し出現または増加する認知機能障害疾患バイオマーカー。
[５]　　配列番号４、１７、１９、２１からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、認知機能障害疾患患者生体試料中において、精神疾患に罹患していない被験者の生体試料中と比較し消失または減少する認知機能障害疾患バイオマーカー。
[６]　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、アルツハイマー病患者生体試料中において、非痴呆型神経疾患患者の生体試料中と比較し出現または増加するアルツハイマー病バイオマーカー。
[７]　　配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、アルツハイマー病患者生体試料中において、非痴呆型神経疾患患者の生体試料中と比較し消失または減少するアルツハイマー病バイオマーカー。
[８]　　生体試料中の[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの精神疾患診断のためのバイオマーカーを測定することを含む、精神疾患の検出方法。
[９]　　生体試料中の[１]および[３]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーを測定することを含む、認知機能障害疾患の検出方法。
[１０]　生体試料中の[４]に記載の少なくとも１つの認知機能障害疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが精神疾患に罹患していない被験者と比較して多く存在する場合に認知機能障害疾患に罹患していると判断する認知機能障害疾患の検出方法。
[１１]　生体試料中の[５]に記載の少なくとも１つの認知機能障害疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが精神疾患に罹患していない被験者と比較して少なく存在する場合に認知機能障害疾患に罹患していると判断する認知機能障害疾患の検出方法。
[１２]　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる[８]に記載の精神疾患の検出方法。
[１３]　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる[９]～[１１]のいずれか１項に記載の認知機能障害疾患の検出方法。
[１４]　[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための精神疾患の検出キット。
[１５]　[１]および[３]～[５]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キット。
[１６]　[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む精神疾患の検出キット。
[１７]　[１]および[３]～[５]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む認知機能障害疾患の検出キット。
[１８]　抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている[１６]または[１７]に記載の検出キット。
　本発明によれば、被験者由来の生体試料中の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの種類および量を計測することにより、被験者が精神疾患ないし認知機能障害疾患に罹患しているかどうかを診断することができる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量を計測することにより、非痴呆型神経疾患患者の生体試料中と比較し増加する場合にアルツハイマー病と診断することができるし、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量を計測することにより、非痴呆型神経疾患患者の生体試料中と比較し減少する場合にアルツハイマー病と診断することができる。
　本発明は、また精度および特異性の両方が極めて高い診断システムを提供する。本発明によって血液のような生体試料について特定の検査方法がなかった認知機能障害疾患に対して精度の高い診断がはじめて可能になる。さらに、本発明のバイオマーカーは、薬剤効果判定においても有用性が高い。
2D-LC-MALDI　TOFMS法でアルツハイマー病(AD)患者血清を分離した図。(実施例１) 差異解析の結果の1例、Marker　Aの場合。Marker　Aは図３に示すように、Neurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2Bである。Ａ)はADN、MCI、AD　間の比較、Ｂ)はADN、AD、NDall、NDdem、NDnon　間の比較である。それぞれの平均値　(SD)/1000は以下のとおり。Ａ)　ADN　0.1　(0.1);　MCI　45.8　(42.2);　AD　41.7　(22.2)。Ｂ)　ADN　0.1　(0.2);　AD　34.0　(27.8);　NDall　19.2　(15.8);　NDdem　24.3　(20.8);　NDnon　14.0　(6.1)。Ｃ)、Ｄ)、Ｅ)はそれぞれMCI対ADN、AD対ADN、AD対NDnonの比較におけるROC曲線である。(実施例１) Marker　A(配列番号２　NRX2B)のTOF/TOF型質量分析計によるMS/MSスペクトル図。(実施例１) 血清中THRB(R-)(Ａ)とＢ))とTHRB(R+)(Ｃ)とＤ))の非精神疾患被験者(ADN)および認知症を含む精神疾患患者間における比較。(実施例１) Ａ)　血清中THRB(R-)とTHRB(R+)の非精神疾患被験者(ADN)および認知機能障害疾患患者(MCI、AD)間における個体ごとの比較。Ｂ)　血清中THRB(R-)のAD対NDnonの比較におけるROC曲線。(実施例１) 血清中S264Aの非精神疾患被験者(ADN)および認知症を含む精神疾患患者間における比較(Ａ)とＢ))および血清中COPZ1の非精神疾患被験者および認知症を含む精神疾患患者間における比較(Ｃ)とＤ))。(実施例１) 血清中PARR2(S-)(Ａ))とPARR2(S+)(Ｂ))の非精神疾患被験者(ADN)および認知機能障害疾患患者(MCI、AD)間における比較。(実施例１) 血清中GELSの非精神疾患被験者(ADN)および認知症を含む精神疾患患者間における比較(Ａ)とＢ))。(実施例１) 血清中CLUS(N-term　SDVP)の非精神疾患被験者(ADN)および認知症を含む精神疾患患者間における比較(Ａ)とＢ))および血清中CLUS(N-term　RFFT)の非精神疾患被験者(ADN)および認知症を含む精神疾患患者間における比較(Ｃ)とＤ))。(実施例１) 血清中EIF3Jの非精神疾患被験者(ADN)および認知症を含む精神疾患患者間における比較(Ａ)とＢ))および血清中LRC27の非精神疾患被験者(ADN)および認知機能障害疾患患者(MCI、AD)間における比較(Ｃ))。(実施例１) ADとMCIの患者血清からNRX2Bに特異的な抗体を用いてimmunoMS法によって捕捉・検出されたNRX2Bペプチドの質量スペクトル。図左の矢印部分の拡大が図右。内在性NRX2Bペプチド(図右、実線矢印)および安定同位体標識NRX2B合成ペプチド(図右、破線矢印)のピークをそれぞれ示す。(実施例４)
　本発明は、被験者が認知機能障害疾患に罹患しているとき、インタクトなタンパク質および／またはその部分ペプチドの種類および量を検出すると同時に、インタクトなタンパク質とその部分ペプチドの種類と量の変動を測定することにより被験者が認知機能障害疾患に罹患しているかどうかを診断する方法である。また同時に、精神疾患に罹患しているかどうかを診断する方法でもある。ここで、ペプチドは、一般的には分子量１万以下のアミノ酸が連結したものをいい、あるいはアミノ酸残基の数としては数個から50個以下程度のものをいう。本発明においては、インタクトなタンパク質の部分ペプチドを認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得るが、部分ペプチドという場合、インタクトなタンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドであって分子量１万以下のものをいう。本発明において、インタクトなタンパク質の部分ペプチドとは、インタクトなタンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドをいい、転写・翻訳による発現合成過程で部分ペプチドとして生成する場合と、インタクトなタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成する場合がある。この原因としては、生体が認知機能障害疾患等の正常以外の状態にあるときに、タンパク質の合成および制御機構が脱制御されることが挙げられる。すなわち、本発明は、生体内のタンパク質の発現合成および／または消化分解を指標として被験者が正常状態であるか認知機能障害疾患に罹患しているかを判別し、また認知機能障害疾患に罹患している場合の疾患の進行度をも評価判別する方法でもある。本発明において、認知機能障害疾患の検出とは、被験者が認知機能障害疾患に罹患しているかどうかの評価判別、すなわち診断を行うことをいう。また、被験者がより重篤な認知機能障害に罹患するリスクの評価等も含み得る。
　本発明の方法において、認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得るインタクトなタンパク質として、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPendrin、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27が挙げられ、これらのインタクトなタンパク質の部分ペプチドであるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も同じ目的に用い得る。
　また、認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得る部分ペプチドとして、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27が挙げられる。本発明においては、上記のインタクトなタンパク質およびペプチドをマーカーとして用いるが、配列番号１～２１で表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質およびペプチドも含み、これらのタンパク質またはペプチドも本発明の方法においてバイオマーカーとして用いることができる。ここで、「１個または数個」とは「１個または３個」、「１個または２個」または「１個」をいう。さらに、認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得るこれらのペプチドとして、配列番号１～２１で表されるアミノ酸配列から生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も含まれる。ペプチド断片についてアミノ酸残基５個以上とした理由は、非特許文献２の以下の記載による。すなわち、ヒストンH3のC端(130-135)のアミノ酸残基配列IRGERAについてRをKに置換したペプチドおよびIRを欠失させ、代わりにCGGをGERAに結合させたペプチドCGGGERAがペプチドIRGERAを免疫原として得た抗体によって認識されたとの報告である。これは、抗原性の認識が４個以上のアミノ酸残基からなるペプチドによってなされることを示している。本発明では、ヒストンH3のC端以外にも一般性を持たせるために、残基数を１つ増やして、５個以上としたが、このような低分子のペプチドをも対象とすることは、イムノ・ブロット法、ELISA法、immunoMS法などのような免疫学的手法を用いて検出ならびに分別する方法を用いるときに重要である。
　なお、インタクトなタンパク質またはその部分ペプチドに糖鎖が付加されることがある。これらの糖鎖が付加したタンパク質および部分ペプチドも認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得る。
　なお、本発明において、バイオマーカーを定量してもよいし、定性により存在、非存在を決定してもよい。
　本発明で血清等の生体試料中のバイオマーカーを分離する方法としては、２次元電気泳動あるいは２次元クロマトグラフィーを用い得る。この場合の２種類のクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィーから選択すればよい。またLC-MS/MS法を用いたSRM/MRM法で定量することもできる。さらに、発明者が開発したビーズ(磁気ビーズを含む)に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質またはペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法を用いれば、２次元電気泳動あるいはクロマトグラフィーを用いることなく、簡便に目的のタンパク質、タンパク質断片、ペプチドの有無あるいは量を評価することができる。
　本発明の方法によれば、被験者の認知機能障害が軽度の段階で評価することができ、予防医学にも有用である。さらに、認知機能障害疾患に罹患した患者に心理療法や薬物療法を行った場合、障害の進行が抑制されるならば、血清などの生体試料中のタンパク質／部分ペプチドの量にも反映される。これを測定することにより、治療効果の評価と判定を行うこともできる。
　生体試料中のタンパク質の種類および量は種々の方法で測定することができる。対象となるタンパク質(タンパク質断片および部分ペプチドを含む)が特定されていて、それに対する抗体(１次抗体)が得られている場合は、以下の方法を用いることができる。
１．イムノ・ブロット法
　最も単純な方法である。数段階に希釈した被験血清を用意し、その一定量(１マイクロリットル前後)をニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに滴下し、風乾する。BSAなどのタンパク質を含むブロッキング溶液で処理した後、洗浄し、１次抗体を反応させ、洗浄後１次抗体を検出するための標識された２次抗体を反応させる。メンブレンを洗浄後、標識を可視化して濃度を測定する。
２．ウエスタン・ブロット法
　等電点ないしSDS-PAGEを含む１次元ないし２次元ゲル電気泳動を行った後で、分離されたタンパク質を一旦、ニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに転写し、１次抗体と標識された２次抗体を用いて上述のイムノ・ブロット法と同様に操作して、目的のタンパク質の存在量を測定する。
３．ELISA法
　タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、試料を段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加えてインキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドを除く。次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。抗体の代わりにタンパク質またはその部分ペプチドに結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
　さらに以下に方法(特許文献２参照)を例示するが、それらには限定されない。
４．マイクロアレイ(マイクロチップ)を用いた方法
　マイクロアレイとは、担体(基板)上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列(アレイ)固定化させたデバイスを総称していう。本発明の場合、タンパク質および部分ペプチドに対する抗体またはアプタマーを整列固定化させて用いればよい。測定は、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質または部分ペプチドを結合させ、次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
５．質量分析法
　質量分析法においては、例えば、特定のタンパク質とその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロビーズもしくは基板(プロテインチップ)に結合させる。マイクロビーズは磁気ビーズであってもよい。基板の素材は問わない。使用する抗体は(１)特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、(２)部分ペプチドのみを認識する抗体、(３)特定のタンパク質とその部分ペプチドの両方を認識する抗体のすべて、または上記(１)と(２)、(１)と(３)、もしくは(２)と(３)の組み合わせでもよい。試料を原液または緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロビーズまたは基板にこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドを除く。その後、マイクロビーズまたは基板上に捕捉されたタンパク質および部分ペプチドをMALDI　TOF-MS、SELDI　TOF-MSなどを用いた質量分析によって分析し、タンパク質、タンパク質断片および部分ペプチドのピークの質量数とピーク強度を計測する。適当な内部標準物質をもとの生体試料に一定量加えておき、そのピーク強度を測定して、対象となる物質のピーク強度との比を求めることにより、もとの生体試料中の濃度を知ることができる。この方法をimmunoMS法という。また試料を原液または緩衝液で希釈または一部のタンパク質を除去した後、HPLCで分離、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法を用いた質量分析によって定量することができる。その際に、同位体標識した内部標準ペプチドを用いたSRM/MRM法による絶対定量によって資料中の濃度を知ることができる。
　さらに、上記の方法の他、２次元電気泳動を用いた方法、表面プラズモン共鳴を用いた方法等によっても、タンパク質および部分ペプチドを解析することが可能である。
　本発明は、被験者から採取した生体試料を２次元電気泳動ないし表面プラズモン共鳴法に供し、前記バイオマーカーの有無ないし量を指標に認知機能障害疾患を検出する方法をも包含する。
　２次元液体クロマトグラフィー(2D-LC)-MALDI　TOF-MSによる認知機能障害疾患診断マーカーペプチドの探索
(１)血清試料
　以下、括弧の前は略称である。
　AD(アルツハイマー病)20例、ADN(AD患者と年齢・性別をマッチさせた精神疾患に罹患していない被験者、Nはnormalを意味する)20例、およびNDall(神経疾患)20例から得られた血清を用いた。NDallはNDdem(痴呆型神経疾患)10例とNDnon(非痴呆型神経疾患)10例からなる。さらにNDdemはレビー小体型認知症、前頭側頭型認知症各5例からなり、NDnonは統合失調症、うつ病の各5例からなる。なお、NDnonは非認知障害神経疾患とも呼ぶことがある。
(２)方法
　血清25μlの各々に475μlの0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を加え、100℃で15分間煮沸した。その後、分子量1万以下のペプチドを回収するためにミリポア社YM-10を用いて限外ろ過を行った。次に以下のように、2D-LC-MALDI　TOF-MSによる分析を行った。すなわち、回収されたサンプルを２次元HPLC(SCX陽イオン交換カラムならびにC18逆相カラム)を用いて1サンプルあたり1,146に分画した。分画された全てのサンプルはオンラインで接続されたスポッティングロボット(AccuSpot,SHIMADZU)を用いて、MALDI　TOFTOF型質量分析計(ultraflex　TOF/TOF)用のMALDIターゲットプレート上のウエルにスポットし、マトリックス溶液(α-シアノ-ヒドロキシケイ皮酸,CHCA)を混合して共結晶化後にレーザーを照射しリフレクトロンモードで質量ならびにその質量におけるピーク面積(以下に述べる正規化プロセスを含む)を自動測定した。ピーク面積はマトリックス溶液に予め加えられた各ウエル当り250fmolのbradykinin　1-7　fragmentで正規化し、Area値とした。すなわち、サンプルの特定の質量におけるピーク面積をbradykinin　1-7　fragment　250fmolから得られるピーク面積で割って10,000倍した値をArea値とした。このArea値はサンプル血清25μlに対応する。群間で血清中の存在量に差のあるペプチドの検出(差異解析)は、我々が開発した多群間統計解析ソフトウェアであるDeViewを用いて行った。存在量に差の認められたペプチドは、そのままultraflex　TOF/TOFでMS/MSにてアミノ酸配列を決定し、その起源であるインタクトタンパク質またはペプチドを同定した。
(３)結果
　図１は、AD患者1例の血清を2D-LC-MALDI　TOF-MSに供して得られたもので、１次元目のSCX陽イオン交換カラムで6つの画分に分画した後、それぞれをC18逆相カラムで191の画分に分画した画分をMALDI　TOF-MSで測定したスペクトルについて、横軸はm/zを、縦軸は逆相カラムクロマトグラフィーの分画としてDeViewで視覚化した図である。SCX1は素通り画分、SCX2は塩濃度10%で溶出した画分、SCX3は塩濃度20%で溶出した画分、SCX4は塩濃度30%で溶出した画分、SCX5は塩濃度50%で溶出した画分、SCX6は塩濃度100%で溶出した画分である。図１に見るように、多くの血清でSCX1、SCX3、SCX4、SCX5の画分でペプチドが多く存在しており、2D-LCで分画し、MALDI　TOF-MSで検出したペプチドの総数はおよそ4,000であった。
　差異解析の結果の1例としてMarker　Aの場合を図２に示す。Marker　Aは後に図３に示すように、Neurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2Bである。図２のＡ)はADN、MCI、AD間の比較、Ｂ)はADN、AD、NDall、NDdem、NDnon間の比較である。Ａ)とＢ)はそれぞれ別の実験の結果で、ADNおよびADについては両実験で同じサンプルが用いられた(すなわち、ADNおよびADについては測定結果の再現性を示していることになる。)。図２のＡ)ではADNよりMCIとAD患者においてMarker　Aが増加していることが分かった。図２のＢ)ではADNよりADとNDall、NDdem、NDnonにおいてMarker　Aが増加していることが分かった。とくに、AD対NDnonの比較ではADのほうがNDnonより有意に高かった(t-検定、p=0.035)。これらの結果から、Marker　Aは認知機能障害疾患(MCI、AD、NDdem)患者を非認知障害神経疾患(NDnon)患者と区別するのに有用であることが分かった。
　図２のＡ)およびＢ)の結果から、Marker　Aがバイオマーカーとしてどの程度に有用であるかを評価するために受信者操作特性曲線(receiver　operating　characteristic　curve,ROC曲線)による分析を行った。図２のＣ)、Ｄ)、Ｅ)はそれぞれMCI対ADN、AD対ADN、AD対NDnonの比較におけるROC曲線である。ROC曲線の下部の面積値(AUC　of　ROC)(以下、ROC値という)が1に近いほどバイオマーカーとしての有用性が高くなる。感度(sensitivity)と特異度(specificity)の代表的な値は図２のＣ)、Ｄ)、Ｅ)においてy軸上の100%の点からROC曲線に直線を引いたとき、その距離が最小となるROC曲線上の点の座標(図中のopen　square)の値である。この点を与えるcut-off値が異なる群の間の分別に有用な閾値となり、そのときの感度と特異度(すなわち上述の代表的な値)がROC値とともにバイオマーカーの有用性の指標となる。図２のＣ)では、MCI対ADNにおいて代表的な値としての感度が90%、特異度が100%、ROC値が0.99であり、Ｄ)ではAD対ADNにおいて代表的な値としての感度が100%、特異度が100%、ROC値が1であった。Ｅ)ではAD対NDnonを比較しており、感度が100%、特異度が50%、ROC値が0.710であった。以上から、Marker　A(NRX2B)はMCIおよびADをADNと区別する上で有用であり、ADを非痴呆型神経疾患(NDnon)と区別する上でも有用性があることが明らかとなった。とくに、MCIはADの前段階であることから、ADに移行する可能性がある被験者を早期に診断、検出するマーカーとしてMarker　A(NRX2B)はきわめて有用と考えられる。
　図３はMarker　Aについて、ultraflex　TOF/TOFを用いたMS/MSの結果を示す。y-ionおよびb-ionを示すシグナルが十分に現れており、アミノ酸配列が容易に決定できた。この結果についてMascotによる検索を行い、その起源であるタンパク質またはペプチド(以下、インタクトタンパク質またはペプチドという)がNeurexin-2-beta　precursorであり、検出されたペプチドがこれに由来するRSGGNATLQVDSWP(配列番号２)であることが明らかとなった。Neurexin-2-beta　precursorに対するSwiss-ProtのEntry　NameであるNRX2Bをペプチド名の略称として用いることにする。検出された他のペプチドについても同様にSwiss-ProtのEntry　Nameをペプチド名の略称として以下の記述に用いる。
　Marker　Aを含め、群間で血清中の存在量に差のあるペプチドをultraflex　TOF/TOFにてMS/MSを行い、アミノ酸配列を決定するとともに、インタクトタンパク質またはペプチドを同定した結果を以下に示す。Marker　A以外のペプチドについてもy-ionおよびb-ionを示すシグナルが十分に現れており、アミノ酸配列が容易に決定できた。以下のアミノ酸配列は２つの配列のセットを示しているが、１番目の配列の配列全体はインタクトタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を示す。１番目の配列の下線部および２番目の配列からなるペプチドが検出されたペプチドである。１はＮ末端であることを表わす。２番目の配列からなるペプチドのうち、メチオニンが酸化した状態で配列が決定されたものに関しては、アミノ酸配列の最後に(+　Oxidation　(M))を記した。遺伝子変異によるアミノ酸残基の変異があるタンパク質について、該当する箇所のアミノ酸残基は(X)で表わした。
〔１〕　Neurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B
　　配列番号２のNRX2BがADNで検出されず、MCIとAD患者およびNDall、NDdem、NDnon患者において検出された。さらにADとNdnonの比較でもADのほうが高値であり、判別力を示した(既出、図２)。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MPPGGSGPGG　CPRRPPALAG　PLPPPPPPPP　PPLLPLLPLL　LLLLLGAAEG
051　ARVSSSLSTT　HHVHHFHSKH　GTVPIAINRM　PFLTRGGHAG　TTYIFGKGGA
101　LITYTWPPND　RPSTRMDRLA　VGFSTHQRSA　VLVRVDSASG　LGDYLQLHID
151　QGTVGVIFNV　GTDDITIDEP　NAIVSDGKYH　VVRFTRSGGN　ATLQVDSWPV
201　NERYPAGNFD　NERLAIARQR　IPYRLGRVVD　EWLLDKGRQL　TIFNSQAAIK
251　IGGRDQGRPF　QGQVSGLYYN　GLKVLALAAE　SDPNVRTEGH　LRLVGEGPSV
301　LVASAECPSD　DEDLEECEPS　TGGELILPII　TEDSLDPPPV　ATRSPFVPPP
351　PTFYPFLTGV　GATQDTLPPP　AARRPPSGGP　CQAERDDSDC　EEPIEASGFA
401　SGEVFDSSLP　PTDDEDFYTT　FPLVTDRTTL　LSPRKPAPRP　NLRTDGATGA
451　PGVLFAPSAP　APNLPAGKMN　HRDPLQPLLE　NPPLGPGAPT　SFEPRRPPPL
501　RPGVTSAPGF　PHLPTANPTG　PGERGPPGAV　EVIRESSSTT　GMVVGIVAAA
551　ALCILILLYA　MYKYRNRDEG　SYQVDQSRNY　ISNSAQSNGA　VVKEKAPAAP
601　KTPSKAKKNK　DKEYYV　(配列番号１)
Neurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B
RSGGN　ATLQVDSWP　(配列番号２)
〔２〕　Prothrombin　precursor由来ペプチド(THRB(R-))
　　Prothrombin　precursor由来ペプチドには2種類あり、(R-)はC端のRを欠くペプチドを意味する。配列番号４のTHRB(R-)はADNで特異的に検出され、MCI、AD、NDall、NDdem、NDnonではきわめて低値であった。図４および図５にTHRB(R-)とTHRB(R+)を並べて示す。図４は散布図であり、図５、Ａ)はADN、MCI、ADの個体ごとに、THRB(R-)とTHRB(R+)の出現がどう違うかを示している。同一個体内でもADNでは圧倒的にTHRB(R-)が多く、MCI、ADでは逆転してTHRB(R+)が多く出現している。両者はMCIとADNの判別にきわめて有用なマーカーといえる。図５、Ｂ)はTHRB(R-)のAD対NDnonの比較におけるROC曲線で、ROC値は0.815と高い値を示し、NDnonに比してADでは低値であった。すなわち、THRB(R-)はNRX2Bと同様に認知機能障害疾患(MCI、AD、NDdem)患者を非認知障害神経疾患(NDnon)患者と区別するのに有用であることが分かった。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MAHVRGLQLP　GCLALAALCS　LVHSQHVFLA　PQQARSLLQR　VRRANTFLEE
051　VRKGNLEREC　VEETCSYEEA　FEALESSTAT　DVFWAKYTAC　ETARTPRDKL
101　AACLEGNCAE　GLGTNYRGHV　NITRSGIECQ　LWRSRYPHKP　EINSTTHPGA
151　DLQENFCRNP　DSSTTGPWCY　TTDPTVRRQE　CSIPVCGQDQ　VTVAMTPRSE
201　GSSVNLSPPL　EQCVPDRGQQ　YQGRLAVTTH　GLPCLAWASA　QAKALSKHQD
251　FNSAVQLVEN　FCRNPDGDEE　GVWCYVAGKP　GDFGYCDLNY　CEEAVEEETG
301　DGLDEDSDRA　IEGRTATSEY　QTFFNPRTFG　SGEADCGLRP　LFEKKSLEDK
351　TERELLESYI　DGRIVEGSDA　EIGMSPWQVM　LFRKSPQELL　CGASLISDRW
401　VLTAAHCLLY　PPWDKNFTEN　DLLVRIGKHS　RTRYERNIEK　ISMLEKIYIH
451　PRYNWRENLD　RDIALMKLKK　PVAFSDYIHP　VCLPDRETAA　SLLQAGYKGR
501　VTGWGNLKET　WTANVGKGQP　SVLQVVNLPI　VERPVCKDST　RIRITDNMFC
551　AGYKPDEGKR　GDACEGDSGG　PFVMKSPFNN　RWYQMGIVSW　GEGCDRDGKY
601　GFYTHVFRLK　KWIQKVIDQF　GE　(配列番号３)
Prothrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)
GLDEDSDRAIEG　(配列番号４)
〔３〕　Prothrombin　precursor　由来ペプチド(THRB(R+))
　　配列番号５のTHRB(R+)がADNで検出されず、MCI、AD、NDall、NDdem、NDnonで検出された(図４)。(R+)はC端にRを有するペプチドを意味する。説明は〔２〕　Prothrombin　precursor由来ペプチド(THRB(R-))を参照。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MAHVRGLQLP　GCLALAALCS　LVHSQHVFLA　PQQARSLLQR　VRRANTFLEE
051　VRKGNLEREC　VEETCSYEEA　FEALESSTAT　DVFWAKYTAC　ETARTPRDKL
101　AACLEGNCAE　GLGTNYRGHV　NITRSGIECQ　LWRSRYPHKP　EINSTTHPGA
151　DLQENFCRNP　DSSTTGPWCY　TTDPTVRRQE　CSIPVCGQDQ　VTVAMTPRSE
201　GSSVNLSPPL　EQCVPDRGQQ　YQGRLAVTTH　GLPCLAWASA　QAKALSKHQD
251　FNSAVQLVEN　FCRNPDGDEE　GVWCYVAGKP　GDFGYCDLNY　CEEAVEEETG
301　DGLDEDSDRA　IEGRTATSEY　QTFFNPRTFG　SGEADCGLRP　LFEKKSLEDK
351　TERELLESYI　DGRIVEGSDA　EIGMSPWQVM　LFRKSPQELL　CGASLISDRW
401　VLTAAHCLLY　PPWDKNFTEN　DLLVRIGKHS　RTRYERNIEK　ISMLEKIYIH
451　PRYNWRENLD　RDIALMKLKK　PVAFSDYIHP　VCLPDRETAA　SLLQAGYKGR
501　VTGWGNLKET　WTANVGKGQP　SVLQVVNLPI　VERPVCKDST　RIRITDNMFC
551　AGYKPDEGKR　GDACEGDSGG　PFVMKSPFNN　RWYQMGIVSW　GEGCDRDGKY
601　GFYTHVFRLK　KWIQKVIDQF　GE　(配列番号３)
Prothrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)
GLDEDSDRAIEGR　(配列番号５)
〔４〕　Pendrin由来ペプチド(S26A4)
　　配列番号７のS26A4がADNで検出されず、MCI、AD、NDall、NDdem、NDnonで検出された(図６)。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MAAPGGRSEP　PQLPEYSCSY　MVSRPVYSEL　AFQQQHERRL　QERKTLRES
051　AKCCSCSRKR　AFGVLKTLVP　ILEWLPKYRV　KEWLLSDVIS　GVSTGLVATL
101　QGMAYALLAA　VPVGYGLYSA　FFPILTYFIF　GTSRHISVGP　FPVVSLMVGS
151　VVLSMAPDEH　FLVSSSNGTV　LNTTMIDTAA　RDTARVLIAS　ALTLLVGIIQ
201　LIFGGLQIGF　IVRYLADPLV　GGFTTAAAFQ　VLVSQLKIVL　NVSTKNYNGV
251　LSIIYTLVEI　FQNIGDTNLA　DFTAGLLTIV　VCMAVKELND　RFRHKIPVPI
301　PIEVIVTIIA　TAISYGANLE　KNYNAGIVKS　IPRGFLPPEL　PPVSLFSEML
351　AASFSIAVVA　YAIAVSVGKV　YATKYDYTID　GNQEFIAFGI　SNIFSGFFSC
401　FVATTALSRT　AVQESTGGKT　QVAGIISAAI　VMIAILALGK　LLEPLQKSVL
451　AAVVIANLKG　MFMQLCDIPR　LWRQNKIDAV　IWVFTCIVSI　ILGLDLGLLA
501　GLIFGLLTVV　LRVQFPSWNG　LGSIPSTDIY　KSTKNYKNIE　EPQGVKILR
551　SSPIFYGNVD　GFKKCIKSTV　GFDAIRVYNK　RLKALRKIQK　LIKSGQLRAT
601　KNGIISDAVS　TNNAFEPDED　IEDLEELDIP　TKEIEIQVDW　NSELPVKVNV
651　PKVPIHSLVL　DCGAISFLDV　VGVRSLRVIV　KEFQRIDVNV　YFASLQDYV
701　EKLEQCGFFD　DNIRKDTFFL　TVHDAILYLQ　NQVKSQEGQG　SILETITLIQ
751　DCKDTLELIE　TELTEEELDV　QDEAMRTLAS　(配列番号６)
Pendrin由来ペプチドS26A4
LAGLIFGLLTVVLR　(配列番号７)
〔５〕　Coatomer　subunit　zeta-1　由来ペプチド(COPZ1)
　　配列番号９のCOPZ1がADNで低値であったが、MCIとADおよびNDdemで高い値を示した(図６)。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MEALILEPSL　YTVKAILILD　NDGDRLFAKY　YDDTYPSVKE　QKAFEKNIFN
051　KTHRTDSEIA　LLEGLTVVYK　SSIDLYFYVI　GSSYENELML　MAVLNCLFDS
101　LSQMLRKNVE　KRALLENMEG　LFLAVDEIVD　GGVILESDPQ　QVVHRVALRG
151　EDVPLTEQTV　SQVLQSAKEQ　IKWSLLR　(配列番号８)
Coatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1
AILILDNDGDRLFAKYYDD　(配列番号９)
〔６〕　Retinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor　由来ペプチド(RARR2(S-))
　　配列番号１１のRARR2(S-)がADNで検出されず、AD、MCIで検出された(図７)。Retinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドには2種類あり、(S-)はC端にSを欠くペプチドを意味する。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MRRLLIPLAL　WLGAVGVGVA　ELTEAQRRGL　QVALEEFHKH　PPVQWAFQET
051　SVESAVDTPF　PAGIFVRLEF　KLQQTSCRKR　DWKKPECKVR　PNGRKRKCLA
101　CIKLGSEDKV　LGRLVHCPIE　TQVLREAEEH　QETQCLRVQR　AGEDPHSFYF
151　PGQFAFSKAL　PRS　(配列番号１０)
Retinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)
PHSFYFPGQFAFSKALPR　(配列番号１１)
〔７〕　Retinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor　由来ペプチド(RARR2(S+))
　　配列番号１２のRARR2(S+)がRARR2(S-)と同様ADNで検出されず、AD、MCIで検出された(図７)。(S+)はC端にSを有するペプチドを意味する。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MRRLLIPLAL　WLGAVGVGVA　ELTEAQRRGL　QVALEEFHKH　PPVQWAFQET
051　SVESAVDTPF　PAGIFVRLEF　KLQQTSCRKR　DWKKPECKVR　PNGRKRKCLA
101　CIKLGSEDKV　LGRLVHCPIE　TQVLREAEEH　QETQCLRVQR　AGEDPHSFYF
151　PGQFAFSKAL　PRS　(配列番号１０)
Retinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)
PHSFYFPGQFAFSKALPRS　(配列番号１２)
〔８〕　Gelsolin　precursor　由来ペプチド(GELS)
　　配列番号１４のGELSがADNで低値であったが、MCIとADで比較的高い値を示した(図８)。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MAPHRPAPAL　LCALSLALCA　LSLPVRAATA　SRGASQAGAP　QGRVPEARPN
051　SMVVEHPEFL　KAGKEPGLQI　WRVEKFDLVP　VPTNLYGDFF　TGDAYVILKT
101　VQLRNGNLQY　DLHYWLGNEC　SQDESGAAAI　FTVQLDDYLN　GRAVQHREVQ
151　GFESATFLGY　FKSGLKYKKG　GVASGFKHVV　PNEVVVQRLF　QVKGRRVVRA
201　TEVPVSWESF　NNGDCFILDL　GNNIHQWCGS　NSNRYERLKA　TQVSKGIRDN
251　ERSGRARVHV　SEEGTEPEAM　LQVLGPKPAL　PAGTEDTAKE　DAANRKLAKL
301　YKVSNGAGTM　SVSLVADENP　FAQGALKSED　CFILDHGKDG　KIFVWKGKQA
351　NTEERKAALK　TASDFITKMD　YPKQTQVSVL　PEGGETPLFK　QFFKNWRDPD
401　QTDGLGLSYL　SSHIANVERV　PFDAATLHTS　TAMAAQHGMD　DDGTGQKQIW
451　RIEGSNKVPV　DPATYGQFYG　GDSYIILYNY　RHGGRQGQII　YNWQGAQSTQ
501　DEVAASAILT　AQLDEELGGT　PVQSRVVQGK　EPAHLMSLFG　GKPMIIYKGG
551　TSREGGQTAP　ASTRLFQVRA　NSAGATRAVE　VLPKAGALNS　NDAFVLKTPS
601　AAYLWVGTGA　SEAEKTGAQE　LLRVLRAQPV　QVAEGSEPDG　FWEALGGKAA
651　YRTSPRLKDK　KMDAHPPRLF　ACSNKIGRFV　IEEVPGELMQ　EDLATDDVML
701　LDTWDQVFVW　VGKDSQEEEK　TEALTSAKRY　IETDPANRDR　RTPITVVKQG
751　FEPPSFVGWF　LGWDDDYWSV　DPLDRAMAEL　AA　(配列番号１３)
Gelsolin　precursor由来ペプチドGELS
PVRAATASRGAS　(配列番号１４)
〔９〕　Clusterin　precursor　由来ペプチド(CLUS(N-term　SDVP))
　　配列番号１６のCLUS(N-term　SDVP)がADNで低値であったが、MCIとADで比較的高い値を示した(図９)。Clusterin　precursor由来ペプチドには2種類あり、(N-term　SDVP)はN端がSDVPであるものを示す。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MMKTLLLFVG　LLLTWESGQV　LGDQTVSDNE　LQEMSNQGSK　YVNKEIQNAV
051　NGVKQIKTLI　EKTNEERKTL　LSNLEEAKKK　KEDALNETRE　SETKLKELPG
101　VCNETMMALW　EECKPCLKQT　CMKFYARVCR　SGSGLVGRQL　EEFLNQSSPF
151　YFWMNGDRID　SLLENDRQQT　HMLDVMQDHF　SRASSIIDEL　FQDRFFTREP
201　QDTYHYLPFS　LPHRRPHFFF　PKSRIVRSLM　PFSPYEPLNF　HAMFQPFLEM
251　IHEAQQAMDI　HFHSPAFQHP　PTEFIREGDD　DRTVCREIRH　NSTGCLRMKD
301　QCDKCREILS　VDCSTNNPSQ　AKLRRELDES　LQVAERLTRK　YNELLKSYQW
351　KMLNTSSLLE　QLNEQFNWVS　RLANLTQGED　QYYLRVTTVA　SHTSDSDVPS
401　GVTEVVVKLF　DSDPITVTVP　VEVSRKNPKF　METVAEKALQ　EYRKKHREE　(配列番号１５)
Clusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)
SDVPSGVTEVVVKLFDS　(配列番号１６)
〔１０〕　Clusterin　precursor　由来ペプチド(CLUS(N-term　RFFT))
　　配列番号１７のCLUS(N-term　RFFT)がADNに検出され、ADでは全く検出されなかった(図９)。(N-term　RFFT)はN端がRFFTであるものを示す。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MMKTLLLFVG　LLLTWESGQV　LGDQTVSDNE　LQEMSNQGSK　YVNKEIQNAV
051　NGVKQIKTLI　EKTNEERKTL　LSNLEEAKKK　KEDALNETRE　SETKLKELPG
101　VCNETMMALW　EECKPCLKQT　CMKFYARVCR　SGSGLVGRQL　EEFLNQSSPF
151　YFWMNGDRID　SLLENDRQQT　HMLDVMQDHF　SRASSIIDEL　FQDRFFTREP
201　QDTYHYLPFS　LPHRRPHFFF　PKSRIVRSLM　PFSPYEPLNF　HAMFQPFLEM
251　IHEAQQAMDI　HFHSPAFQHP　PTEFIREGDD　DRTVCREIRH　NSTGCLRMKD
301　QCDKCREILS　VDCSTNNPSQ　AKLRRELDES　LQVAERLTRK　YNELLKSYQW
351　KMLNTSSLLE　QLNEQFNWVS　RLANLTQGED　QYYLRVTTVA　SHTSDSDVPS
401　GVTEVVVKLF　DSDPITVTVP　VEVSRKNPKF　METVAEKALQ　EYRKKHREE　(配列番号１5)
Clusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)
RFFTREPQDTYHYLPFSLPH　(配列番号１７)
〔１１〕　Eukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J　由来ペプチド(EIF3J)
　　配列番号１９のEIF3JがADNに検出され、MCI、AD、NDall、NDdem、NDnonでは全く検出されないか、ほとんど検出されなかった(図１０)。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MAAAAAAAGD　SDSWDADAFS　VEDPVRKVGG　GGTAGGDRWE　GEDEDEDVKD
051　NWDDDDDEKK　EEAEVKPEVK　ISEKKKIAEK　IKEKERQQKK　RQEEIKKRLE
101　EPEEPKVLTP　EEQLADKLRL　KKLQEESDLE　LAKETFGVNN　AVYGIDAMNP
151　SSRDDFTEFG　KLLKDKITQY　EKSLYYASFL　EVLVRDVCIS　LEIDDLKKIT
201　NSLTVLCSEK　QKQEKQSKAK　KKKKGVVPGG　GLKATMKDDL　ADYGGYDGGY
251　VQDYEDFM　(配列番号１８)
Eukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J
GVVPGGGLKATMKDDLADYGGYDGG　+　Oxidation　(M)　(配列番号１９)
〔１２〕　Leucine-rich　repeat-containing　protein　27　由来ペプチド(LRC27)
　　配列番号２１のLRC27がADNに検出され、ADでは全く検出されなかった(図１０)。
インタクトタンパク質／ペプチド
001　MEGSSSYEVP　SVAAADLEEG　AGQTRSLPAT　PSKDVHKGVG　GIIFSSSPIL
051　DLSESGLCRL　EEVFRIPSLQ　QLHLQRNALC　VIPQDFFQLL　PNLTWLDLRY
101　NRIKALPSGI　GAHQHLKTLL　LERNPIKMLP　VELGSVTTLK　ALNLRHCPLE
151　FPPQLVVQKG　LVAIQRFLRM　WAVEHSLPRN　PTSQEAPPVR　EMTLRDLPSP
201　GLELSGDHAS　NQGAVNAQDP　EGAVMKEKAS　FLPPVEKPDL　SELRKSADSS
251　ENWPSEEEIR　RFWKLRQEIV　EHVKADVLGD　QLLTRELPPN　LKAALNIEKE
301　LPKPRHVFRR　KTASSRSILP　DLLSPYQMAI　RAKRLEESRA　AALRELQEKQ
351　ALMEQQRREK　RALQEWRERA　QRMRKRKEEL　SKLLPPRRSM　VASKIPSATD
401　LIDNRKVPLN　PPGKMKPSKE　KSPQASKEMS　ALQERNLEEK　IKQHVLQMRE
451　QRRFHGQAPL　EEMRKAAEDL　EIATELQDEV　LKLKLGLTLN　KDRRRAALTG
501　NLSLGLPAAQ　PQNTFFNTKY　GESGNVRRYQ　(配列番号２０)
Leucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27
SSPILDLSESGLCRLEEVFRIPS　(配列番号２１)
　すでに引用してあるが、図２、図４および図６から図１０に配列番号２(NRX2B)から配列番号２１(LRC27)までのペプチドについて、ADN、MCI、AD間の比較についての散布図およびADN、AD、NDall、NDdem、NDnon間の比較についての散布図とそれぞれの比較におけるt検定のp値を示した。
　表１に上記12種類のマーカーペプチドについて、MCI対ADNおよびAD対ADNの比較におけるROC値のリストを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１には各マーカーペプチドの認知機能障害疾患(MCIおよびAD)の検出における有用性が示されている。これらのマーカーペプチドについては、それぞれ単独、あるいは組み合わせで用いることにより、液体クロマトグラフィーおよび／または他の適当な分離手段を用いて、あるいは用いないで直接、血清中の存在量を質量分析または免疫学的あるいは酵素学的方法などの他の方法によって測定することにより、AD、MCIのような認知機能障害疾患、神経疾患の非痴呆型と痴呆型を診断上区別することが可能である。ADNで検出されず、MCI、AD、NDall、NDdem、NDnonで検出されるペプチドマーカー、あるいはその逆に、ADNで検出され、MCI、AD、NDall、NDdem、NDnonで検出されないペプチドマーカーは精神疾患の検出にも有効である。
　マーカーペプチド合成とマーカーペプチド特異ポリクローナル抗体作成
　配列番号２のNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2Bを認識する特異抗体を作製するために抗原ペプチドを合成した。合成ペプチドにはキャリアタンパク質と結合させるために、Ｃ末端にシステイン残基(CysまたはCと表記)を付加した。キャリアタンパク質と結合させたペプチド(RSGGNATC-KLH、下記参照)とアジュバントを混合し、ウサギに免疫した。1～2週間おきに合計8回免疫し、4週間おきに2回試験採血を行い、抗体力価をエンザイムイムノアッセイ法(EIA法)で測定した。免疫開始から3か月後、全採血を行って抗血清を回収して、抗原ペプチドをリガンドとしたペプチドカラムを用いて特異抗体の精製を行った。
　特異抗体を作製するための合成抗原ペプチドの配列を下に示す。
RSGGNAT+Cys　(配列番号２２)
　抗体ビーズの作成
(１)方法
　(１－１)　抗体の調製と磁気ビーズへの結合
　配列番号２２で表わされるアミノ酸配列のペプチドを特異的に認識する抗体(抗NRX2B抗体、Rabbit　IgG)　1mgを0.1M　MESで3mlの抗体溶液とした。磁気ビーズMagnosphere　MS300/carboxyl(JSR　Corporation)を1ml(10mg　beads)を0.1M　MESで洗浄し、抗体溶液と混合して室温で30分間穏やかに振盪した。
　(１－２)　抗体と磁気ビーズのクロスリンク
　400mlのEDC溶液(10mg/ml　1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)　carbodiimide　hydrochloride　in　0.1M　MES)を抗体ビーズ溶液に加えて3時間穏やかに懸濁し抗体とビーズを共有結合化した。
　(１－３)　ブロッキング
　200mM　ethanolamine(pH8.0)を1ml加えてビーズを洗浄し、さらに200mM　ethanolamine　(pH8.0)を1ml加え、室温で1時間穏やかに浸透し、アミン基のブロッキングを行った。
　(１－４)　洗浄
　200mM　ethanolamine(pH8.0)を除去した後、1mlのTBST溶液(25mM　Tris-HCl(pH7.2)　containing　0.15M　NaCl　and　0.05%Tween　20)で3回ビーズを洗浄した。
　(１－５)　保存
　TBST溶液を1ml加えてビーズを懸濁した後、4℃で保存した。
　患者血清中に2D-LC-MALDI　TOF-MSで検出されたm/z　1488のピークがNRX2BであることのimmunoMS法による立証
(１)方法
　比較のためのコントロールとしてNRX2Bより質量が6大きい安定同位体標識NRX2B合成ペプチド(Vが13C5,15Nで置換されている)を用いた。内在性ペプチドも安定同位体標識ペプチドもともに抗NRX2B　抗体によって捕捉される。ADとMCIの患者血清25μlの各々に200fmol/μlの安定同位体標識NRX2B合成ペプチドを1μl添加し、4℃で10分間温置した。その後、475μlの0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を加え、105℃で5分間煮沸した。その後、14,000×gで15分間遠心後、上清に0.3M塩化ナトリウム、0.2%n-オクチルグルコシドを含む100mMトリス-HCl(pH7.5)を500μl加えて、ペプチド溶液とした。ペプチド溶液に実施例３で作成した抗NRX2B抗体ビーズを20μl加えて2時間穏やかに振盪した。その後、磁性スタンドに1分間静置し上清を取り除いた。0.15M塩化ナトリウム、0.1%n-オクチルグルコシドを含む50mMトリス-HCl(pH7.5)(TBS)を1ml加えて、10分間穏やかに振盪した。磁性スタンドに1分間静置し上清を取り除いた。さらにTBSを500μl加えて磁性スタンドに1分間静置し上清を取り除いた。これを3回繰り返した。さらに、50mM炭酸アンモニウムを500μl加えて磁性スタンドに1分間静置し上清を取り除いた。これを3回繰り返した。2-プロパノール:水:ギ酸=4:4:1の溶液を50μl加えて10分間放置し、磁性スタンドに1分間静置してろ液を回収した。これを2回繰り返した。ろ液は遠心真空乾燥を行い、乾固した。その後、5%アセトニトリルを含む0.095%TFAを20μl加えて、超音波で再溶解した。C18ピペットチップ(Eppendorf社、PerfectPure　C-18　Tip)でペプチドを濃縮してMALDIターゲットプレート(MTP　AnchorChipTM　600/384　plate(BRUKER　DALTONICS)にスポットし、MALDI　TOF型質量分析計(AXIMA　CFRplus)で質量分析した。
(２)結果
　上記方法を用いて、NRX2BペプチドがADとMCIの患者血清から検出された結果を質量スペクトルとして図１１に示す。図１１　Ａ)は得られたスペクトルの全体像、図１１　Ｂ)は図１１　Ａ)の矢印部分の拡大図である。図１１　Ｂ)の破線矢印で示されるシグナルはスパイクした安定同位体標識NRX2B合成ペプチドであり、実線矢印で示されるシグナルは内在性NRX2Bペプチドである。観測された質量値は想定された値の測定誤差範囲内であり、かつ安定同位体標識NRX2B合成ペプチドと内在性NRX2Bペプチドの質量差は6であったから、捕捉されたペプチドがNRX2Bであることが立証された。
　本実験において、本発明者が独自に開発したimmunoMS法を用いて、血清からペプチドマーカーであるNRX2Bを検出し、ADとMCIの患者をADNから区別することが可能であることを示すことができた。本実験は同時に、NRX2Bに対する特異的な抗体が本ペプチドマーカーの検出に有効であることも示している。さらに、NRX2Bに対する特異的な抗体がNRX2Bのアミノ酸配列に含むペプチドあるいはタンパク質に対して免疫学的検出法が有効である可能性も示している。また、本実験では１種類のペプチドマーカーを認識する特異抗体で判別したが、実施例１で見出された他のバイオマーカーペプチドを認識する特異抗体を組み合わせれば、さらに病態の診断の精度が高まることが予想される。
　本発明において開示されたバイオマーカーを用いれば、軽度認知機能障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患の検出ならびに認知機能障害疾患以外の精神疾患の検出が可能となり、診断薬を含む診断分野における用途に適用できる。

Claims (18)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPendrin、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる精神疾患診断ないし認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカー。
  2. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる精神疾患診断のためのバイオマーカー。
  3. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるNeurexin-2-beta　precursor由来ペプチドNRX2B、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R-)、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるProthrombin　precursor由来ペプチドTHRB(R+)、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるPendrin由来ペプチドS26A4、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるCoatomer　subunit　zeta-1由来ペプチドCOPZ1、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S-)、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるRetinoic　acid　receptor　responder　protein　2　precursor由来ペプチドRARR2(S+)、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin　precursor由来ペプチドGELS、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　SDVP)、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるClusterin　precursor由来ペプチドCLUS(N-term　RFFT)、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるEukaryotic　translation　initiation　factor　3　subunit　J由来ペプチドEIF3J、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるLeucine-rich　repeat-containing　protein　27由来ペプチドLRC27からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカー。
  4. 　配列番号２、５、７、９、１１、１２、１４、１６からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、認知機能障害疾患患者生体試料中において、精神疾患に罹患していない被験者の生体試料中と比較し出現または増加する認知機能障害疾患バイオマーカー。
  5. 　配列番号４、１７、１９、２１からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、認知機能障害疾患患者生体試料中において、精神疾患に罹患していない被験者の生体試料中と比較し消失または減少する認知機能障害疾患バイオマーカー。
  6. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、アルツハイマー病患者生体試料中において、非痴呆型神経疾患患者の生体試料中と比較し出現または増加するアルツハイマー病バイオマーカー。
  7. 　配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、アルツハイマー病患者生体試料中において、非痴呆型神経疾患患者の生体試料中と比較し消失または減少するアルツハイマー病バイオマーカー。
  8. 　生体試料中の請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの精神疾患診断のためのバイオマーカーを測定することを含む、精神疾患の検出方法。
  9. 　生体試料中の請求項１および３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーを測定することを含む、認知機能障害疾患の検出方法。
  10. 　生体試料中の請求項４に記載の少なくとも１つの認知機能障害疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが精神疾患に罹患していない被験者と比較して多く存在する場合に認知機能障害疾患に罹患していると判断する認知機能障害疾患の検出方法。
  11. 　生体試料中の請求項５に記載の少なくとも１つの認知機能障害疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが精神疾患に罹患していない被験者と比較して少なく存在する場合に認知機能障害疾患に罹患していると判断する認知機能障害疾患の検出方法。
  12. 　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる請求項８に記載の精神疾患の検出方法。
  13. 　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる請求項９～１１のいずれか１項に記載の認知機能障害疾患の検出方法。
  14. 　請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための精神疾患の検出キット。
  15. 　請求項１および請求項３～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キット。
  16. 　請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む精神疾患の検出キット。
  17. 　請求項１および請求項３～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む認知機能障害疾患の検出キット。
  18. 　抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている請求項１６または１７に記載の検出キット。
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