JP6265507B2 - 認知機能障害疾患のバイオマーカー及び当該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 - Google Patents
認知機能障害疾患のバイオマーカー及び当該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 Download PDFInfo
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Description
体外診断薬のうち最も多いのが、血液中の成分をバイオマーカーとして分析することで診断検査を行うものである。
本分野における従来技術では、血液中の単独の特定のタンパク質若しくは分子量1万以下のいわゆるオリゴペプチドの存在量の測定、又は酵素タンパク質の場合は活性の測定を行って、正常(健常人)試料と疾患試料との明らかな差をもって診断の一助としてきた。
すなわち、あらかじめ一定数の健常人と疾患患者由来の生体試料における単独若しくは複数の特定のタンパク質若しくは特定のオリゴペプチドの量又はこれらの活性量を計測し、異常値と正常値の範囲を決める。次いで、評価する生体試料を同様の方法で測定し、測定結果がこの決まった異常値と正常値のどちらの範囲に属するかによって検査評価を行うものである。
また、試料に適当な前処理を施した後、2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)を行ってタンパク質又はペプチドを分離した後、目的のタンパク質又はペプチドについて、銀染色、クマシーブルー染色、あるいは対応する抗体を用いた免疫染色(ウエスタン・ブロッティング)を行って、試料中の濃度を測定する方法もある。
また、生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析によって分析する手法がある。
また、カラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。
また、インタクトなタンパク質の解析を目的としてトリプシンなどで分解した後、上記の方法で質量分析まで行う方法も報告されている(特許文献1参照)。
しかし、いずれもインタクトなタンパク質の性質を利用して、そのまま分画し、又は特異的に吸着するタンパク質分子を選別して質量分析で解析するものである。
本邦においては1999年末に抗アセチルコリンエステラーゼ阻害薬である塩酸Donepezilが認可を受け、早期に投与されれば高い確率で認知機能の低下を「遅らせる」ことができるようになった。アルツハイマー病においては、現状の治療法やこれから開発される治療薬効果をあげるためには早期に診断することが最重要の課題となっている。
A.多彩な認知欠損の発現で、以下の両方により明らかにされる。
(1)記憶障害(新しい情報を学習したり、以前に学習した情報を想起する能力の障害)
(2)以下の認知障害の一つ又はそれ以上
a)失語(言語の障害)
b)失行(運動機能の障害がないにもかかわらず、動作を行う能力の障害)
c)失認(感覚機能の障害がないにもかかわらず、対象を認識又は同定する能力の障害)
d)実行能力(計画を立てる・組織化する・順序だてる・抽象化する)の障害
B.基準A(1)およびA(2)の認知欠損は、その各々が社会的又は職業的機能の著しい障害を引き起こし、病前の機能水準から著しい低下を示す(非特許文献1)。
現在の定義によると、MCIは認知機能の低下に関する訴えが聞かれるが、基本的な日常生活には支障がない状態とされる。前頭側頭型認知症(FTD)は認知機能低下とともに周囲を気にせずわが道を行く行動が特徴的で、周囲に合わせようとするADと対照的である。FTDには大脳皮質に組織学的にPick球の存在を認めるPick病が含まれる。
レビー小体型認知症(DLB)は、記憶障害が進行性であり幻視などの視覚認知障害があることを特徴としている。臨床症状からの診断では認知症の10〜30%がDLBであり、老年期の変性性認知症疾患ではアルツハイマー型認知症(AD)に次いで2番目に多いとされる。組織学的には大脳におけるレビー小体の存在を特徴とする。FTD及びDLBは認知症を認め痴呆型であるので痴呆型神経疾患とも呼ばれる(非特許文献1)。
これは9項目の質問からなり、見当識、記銘力、計算能力、記憶・想起および常識をテストするものである。30点満点で23点以下を認知症の疑いありとする。また、MMSEは痴呆の診断のために米国で考案されたもので、見当識、記憶力、計算力、言語的能力、図形的能力などをカバーする。30点満点で11の質問からなり、HDS-Rと同様に23点以下で認知症の疑いありとする。両テストの結果は割合によく一致するとされている。これらの問診法はあくまでスクリーニングの目的で用いられ、確定診断に至ることはないし、HDS-R、MMSEともに重症度分類に用いられることはない(非特許文献1)。
特許文献2には、当該文献2記載の配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノーゲンα鎖等からなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質又はペプチドからなる肝がん検出のための肝がんバイオマーカーが開示されている。
特許文献3−5には、認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーが開示されている。特許文献5には、当該文献5記載の配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3、当該文献5記載の配列番号15で表されるアミノ酸配列からなるTransthyretin等から選択される少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチド、又は当該タンパク質若しくはペプチドから生じるアミノ酸残基5個以上のペプチド断片からなる、認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーが開示されている。
そして、本発明者は、鋭意検討を行った結果、認知機能障害疾患を検出することができる3種のポリペプチドを血清中に見出した。当該3種のポリペプチドは、(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein A1由来のペプチド、(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるTransthyretin由来のペプチド及び(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3由来のペプチドであった。
さらに、本発明者は、認知機能障害疾患の検出の際に正答率の高いバイオマイカーの組み合わせについてロジスティック回帰分析で解析した。この結果、このうちの前記(c)Complement C3由来のペプチドと、前記(b)Transthyretin由来のペプチド又は前記(a)Apolipoprotein A1由来のペプチドとの2種のペプチドを組み合わせて用いることで、認知機能障害疾患(特に軽度認知機能障害及びアルツハイマー病)の検出精度を高めることができることを見出した。
また、本技術において、認知機能障害疾患と総称するとき、軽度認知機能障害(MCI)、アルツハイマー病(AD)及び痴呆型神経疾患を含むものとする。本技術において、軽度認知機能障害(MCI)、アルツハイマー病(AD)が好適に検出することができる。
本技術において見出された当該ペプチドは血清中のみならず、血液、血清、血漿、脳髄膜液、尿等の他の生体試料中に検出される場合もバイオマーカーとして意義をもつものである。同時に、これらペプチドの起源であるタンパク質(以下、「インタクトなタンパク質」と称する)又はペプチドも、バイオマーカーとしての意義を持つ。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
さらに、本技術は、生体試料中の前記(a)〜(c)記載のうちの少なくとも1つ又は2つ以上のインタクトなタンパク質とその部分ペプチドを検出すると同時に、これらの種類と量の変動を測定することにより、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかをより精度よく診断することができる。
本技術は、生体試料中の前記(a)〜(c)のバイオマーカーから選ばれる1種又は2種以上を測定することで、精度及び特異性の両方が極めて高い診断等のシステムを提供することができる。これによって、認知機能障害疾患に対して精度の高い診断等を行うことができる。さらに、本技術のバイオマーカーは、薬剤効果判定においても有用性が高い。
また、本技術は、前記(a)〜(c)の各バイオマーカーの量を計測することにより、被験者の生体試料中の前記(a)〜(c)のインタクトなタンパク質及び/又はその部分ペプチドの出現又は増加する場合には、当該被験者は軽度の認知障害又はアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患に羅患していると、検出、評価、判別、診断又は検査等を行うことができる。また、本技術は、さらに非認知機能障害被験者の生体試料と比較することにより、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかをより精度よく診断等を行うことができる。
より好ましくは、前記(c)バイオマーカー(C3)と、前記(a)バイオマーカー(ApoA1)又は前記(b)バイオマーカー(TTR)との2種を測定するのが、認知機能障害疾患(MCI及びAD)の検出精度が向上するので、好適である。この2つのバイオマーカーを検出した場合には、、認知機能障害疾患(MCI及びAD)
さらに検出精度が向上するので、前記認知機能障害疾患の検出が軽度認知障害の検出である場合、前記(c)バイオマーカー(C3)及び前記(a)バイオマーカー(ApoA1)の2種を測定するか、又は、前記認知機能障害疾患の検出がアルツハイマー病の検出である場合、前記(c)バイオマーカー(C3)及び前記(b)バイオマーカー(TTR)の2種を測定するのが、より好適である。
当該「オリゴペプチド」は一般的には分子量1万以下のアミノ酸が結合したものをいい、又はアミノ酸残基の数として数個〜50個以下程度のものをいう。
当該「ポリペプチド」は、分子量1万以上のアミノ酸が結合したものをいい、又はアミノ酸残基の数として50個以上程度のものをいう。
本技術において、インタクトなタンパク質の部分ペプチドとは、インタクトなタンパク質が有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドをいう。
このインタクトなタンパク質の部分ペプチドは、転写・翻訳による発現合成過程で部分ペプチドとして生成される場合と、インタクトなタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成される場合がある。この原因として、生体が認知機能障害疾患等の正常以外の状態にあるときに、タンパク質の合成及び制御機構が脱制御されることが挙げられる。
本技術は、生体内タンパク質の発現合成及び/又は消化分解を指標として被験者が正常状態であるか認知機能障害疾患に羅患しているかを評価、判別等を行うことができ、また認知機能障害疾患に羅患している場合の進行度をも評価、判別等を行うことができる。
本技術における「認知機能障害疾患の検出」とは、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかの検出であり、この他評価、判別、診断又は検査等であってもよい。また、本技術の認知機能障害疾患の検出は、被験者がより重篤な認知機能障害に羅患するリスクの評価等も含み得る。
また、これらインタクトなタンパク質の部分ペプチドも、認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーとして用い得る。
本技術における「インタクトなタンパク質の部分ペプチド」には、インタクトなタンパク質及びその合成・分解過程で生成されるペプチドから生じるアミノ酸残基5個以上のペプチド断片も含む意味である。
本技術は、前記(a)〜(c)に記載のタンパク質及びこの部分ペプチドの各アミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドをバイオマーカーとして用いることができる。
ここで、「1個又は数個」とは、「1〜3個」、「1又は2個」、「1個」をいう。
本技術においてバイオマーカーに用いる部分ペプチドは、配列番号1〜3で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質若しくはペプチド、及びこれらから生じるアミノ酸残基5個以上のペプチド断片も含む意味である。
本技術では、ヒストンH3のC端以外にも一般性を持たせるために、残基数を1つ増やして、5個以上としたが、このような低分子のペプチドをも対象とすることは、イムノ・ブロット法、ELISA法、immunoMS法などのような免疫学的手法を用いて検出及び分別する方法を用いるときに重要である。
また、本技術でバイオマーカーを分離する方法として、クロマトグラフィー(LC)と三連四重極質量分析を組み合わせたLC-MSを用いたSRM/MRM法で定量することもできる。この時用いるLCは1次元のLCでもよい。
さらに、本技術でバイオマーカーを分離する方法として、本発明者が開発したビーズ(磁気ビーズを含む)に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質又はペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法(特許文献1参照)を用いれば、2次元電気泳動又はクロマトグラフィーを用いることなく、簡便に目的のタンパク質、タンパク質断片、ペプチドの有無あるいは量を評価することができる。
本技術は、イムノ・ブロット法;ウェスタン・ブロット法;酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質標識法;質量分析法;immunoMS法;表面プラズモン共鳴法の何れか1つ以上の方法により測定することが好適である。
また、本技術のバイオマーカーは、種類や量が異なる場合でも、同時又は別々に測定することが可能である。
本技術は、これらタンパク質やペプチド又はペプチド断片を、2次元クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた2D-LC-MALDI-TOF-MS法、SRM/MRM法、immunoMS法を用いることにより、一度に多数のタンパク質又はそれら部分ペプチドを測定することがより好適である。
ここで、本技術において、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay)、化学発光測定法(CLIA; ChemiLuminescent Immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA; RadioImmunoassay)、酵素活性測定法等を用いる方法を酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質の標識法」という。抗体を用いるこれらの方法を「酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質標識抗体法」という。
最も単純な方法である。数段階に希釈した被験血清を用意し、その一定量(1マイクロリットル前後)をニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに滴下し、風乾する。BSAなどのタンパク質を含むブロッキング溶液で処理した後、洗浄し、1次抗体を反応させ、洗浄後1次抗体を検出するための標識された2次抗体を反応させる。メンブレンを洗浄後、標識を可視化して濃度を測定する。
等電点又はSDS-PAGEを含む1次元若しくは2次元ゲル電気泳動を行った後で、分離されたタンパク質を一旦、PVDFメンブレンなどの適当なメンブレンに転写し、1次抗体と標識された2次抗体を用いて上述のイムノ・ブロット法と同様に操作して、目的のタンパク質の存在量を測定する。
タンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、試料を段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加えてインキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。次に、蛍光若しくは化学発光物質又は酵素を結合させた2次抗体を加えインキュベーションする。
検出は、それぞれの基質を加えた後、蛍光若しくは化学発光物質又は酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。抗体の代わりにタンパク質又はその部分ペプチドに結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
本技術は、前記(a)〜(c)に記載のバイオマーカーに対する物質(例えば、抗体又はアプタマー等)を用いることが好適である。
4.マイクロアレイ(マイクロチップ)を用いた方法
マイクロアレイとは、担体(基板)上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列(アレイ)固定化させたデバイスを総称していう。本技術の場合、タンパク質又は部分ペプチドに対する抗体又はアプタマーを整列固定化させて用いればよい。
測定は、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質又は部分ペプチドを結合させ、次に蛍光若しくは化学発光の物質又は酵素を結合させた2次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
質量分析法においては、例えば、特定のタンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロビーズ若しくは基板(プロテインチップ)に結合させる。マイクロビーズは磁気ビーズであってもよい。基板の素材は問わない。
使用する抗体は(1)特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、(2)部分ペプチドのみを認識する抗体、(3)特定のタンパク質とその部分ペプチドの両方を認識する抗体のすべて、又は上記(1)と(2)、(1)と(3)、若しくは(2)と(3)の組み合わせでもよい。
試料を、原液又は緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロビーズ又は基板にこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。その後、マイクロビーズ又は基板上に捕捉されたタンパク質及び部分ペプチドをMALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MSなどを用いた質量分析によって分析し、タンパク質、タンパク質断片及び部分ペプチドのピークの質量数とピーク強度を計測する。適当な内部標準物質をもとの生体試料に一定量加えておき、そのピーク強度を測定して、対象となる物質のピーク強度との比を求めることにより、もとの生体試料中の濃度を知ることができる。この方法をimmunoMS法という。
また、試料を原液または緩衝液で希釈又は一部のタンパク質を除去した後、HPLCで分離、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法を用いた質量分析によって定量することができる。その際に、同位体標識した内部標準ペプチドを用いたSRM/MRM法による絶対定量によって資料中の濃度を知ることができる。
さらに、本技術の装置は、得られたデータを解析する解析部を含んでもよく、解析部はデータ処理装置及び解析用ソフトウェアを含むのが好適である。
さらに、本開示の装置に備えられるCPU等を含む制御部又はこれに接続可能なシステム(例えば、パーソナルコンピュータ、コンピュータ・ネットワークシステム等)には、上述した本技術の認知機能障害疾患の検出、診断等の方法を実行可能なプログラム又はこのプログラムを格納した記憶部若しくはシステム等が設けられている。
さらに、マルチマーカーによる認知機能障害疾患(MCI及びAD)と、非認知機能障害の健常者とが区別できるかどうかを検討した。このとき、ロジスティック回帰分析を利用して検討を行った。
ロジスティック回帰分析の解析結果、Transthyretin及びComplement C3をマルチマーカーとすることで、ほぼ9割と非常に精度の高い認知機能障害疾患の検出を可能とした。
このとき、ロジスティック回帰分析を用い、NDCとMCIを比して、MCIと区別する正答率が、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上であるとき、又は、NDCとADを比較して、ADと区別する正答率が、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上であるとき、MCI又はADであると区別しこれらを検出するためのバイオマーカーとして選択するのが好適である。
なお、ROC曲線及びロジスティック回帰曲線は、後記実施例に記載のとおりである。
この組み合わせのうち、前記(b)バイオマーカー及び前記前記(c)バイオマーカーを同時又は別々に測定し、これら測定結果に基づき認知機能障害疾患の検出、診断等に用い得るのが、最も正答率が高いので、好適である。
本技術は、前記(a)バイオマーカー(ApoA1)、前記(b)バイオマーカー(TTR)及び(c)バイオマーカー(C3)から選択される1種又は2種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キットとすることができる。
このうち、(c)バイオマーカー(C3)と、前記(a)バイオマーカー(ApoA1)又は(b)バイオマーカー(TTR)とを組み合わせた検出キットが好適である。
また、本技術の検出キットは、これらを同時に又は別々に検出できるように、前記(a)〜(c)記載のバイオマーカー検出可能な試薬全てを一緒に含む一液型の認知機能障害用検出キットとしてもよし、又は、各バイオマーカーを検出可能な試薬を別々の容器に存在させた複数(2又は3以上の)の検出キッドを有する認知機能障害疾患用検出キットとしてもよい。
また、この検出キットには、本技術の各バイオマーカーに対する抗体又はアプタマーを含むのが好適である。
本技術の認知機能障害疾患の検出方法として、(i)被験者の生体試料中の前記(a)バイオマーカー、前記(b)バイオマーカー及び前記(c)バイオマーカーから選択される2種又は3種の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定すること、(ii)少なくとも2種以上のバイオマーカーの測定結果が認知機能障害疾患に分類される場合、被験者を認知機能障害疾患と判定することを含むのが、より好適である。
すなわち、本技術は、以下のとおりである。
[1] 次の(a)、(b)及び(c)から選択される1種又は2種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
[3] 以下の(i)及び(ii)を含む、請求項2記載の認知機能障害疾患の検出方法。
(i)被験者の生体試料中の次の(a)、(b)及び(c)から選択される2種又は3種の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定すること。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(ii)少なくとも2種以上のバイオマーカーの測定結果が認知機能障害疾患に分類される場合、被験者を認知機能障害疾患と判定すること。
[5] 前記認知機能障害疾患の検出が、軽度認知障害の検出である場合、前記(c)バイオマーカー及び前記(a)バイオマーカーの2種を測定する前記[2]〜[4]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
[6] 前記認知機能障害疾患の検出が、アルツハイマー病の検出である場合、前記(c)バイオマーカー及び前記(b)バイオマーカーの2種を測定する前記[2]〜[4]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
[10]前記抗体又はアプタマーが基板上に固相化されている前記[8]又は[9]記載の認知機能障害疾患の検出キット。
[11] 前記(c)バイオマーカーと、前記(a)バイオマーカー又は前記(b)バイオマーカーとの2種を有する前記[8]〜[10]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
[12] 前記認知機能障害疾患の検出が、軽度認知障害の検出である場合、前記(c)バイオマーカー及び前記(a)バイオマーカーの2種を有する前記[8]〜[11]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
[13] 前記認知機能障害疾患の検出が、アルツハイマー病の検出である場合、前記(c)バイオマーカー及び前記(b)バイオマーカーの2種を有する前記[8]〜[11]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
前記選出キットは、一液型でも、多液型でもよい。
[15] 前記[8]〜[13]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出キットを用いる前記[2]〜[7]の何れか1項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
[17] マルチプレックスイムノアッセイ法で2種以上のタンパク質の測定を行うこと、
そのうち、MCI(軽度認知機能障害)対NDC(非認知機能障害)、AD(アルツハイマー病)対NDC(非認知機能障害)の比較におけるROC曲線を作成し、AUCが0.6以上を示すタンパク質を認知機能障害疾患バイオマーカーと選定することを含む、前記[16]記載の認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定方法。
[18] NDCとMCIを比してMCIと区別する正答率が、80%以上、より好ましくは85%以上である、及び/又は、NDCとADを比してADと区別する正答率が、85%%以上、より好ましくは90%以上である、前記[16]又は[17]記載の認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定方法。
[19]コンピュータを、前記[16]〜[18]の何れか1項記載の方法を実行させるための認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定プログラム又は当該プログラムを格納する制御部若しくはコンピュータ。
[20]コンピュータを、前記[16]〜[18]の何れか1項記載の方法を実行させるために記憶媒体上に記憶された認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定プログラム又は当該プログラムを格納する制御部若しくはコンピュータ。
[22] 前記部分ペプチドが、インタクトなタンパク質の部分ペプチド、又は当該タンパク質若しくはペプチドから生じるアミノ酸残基5個以上のペプチド断片である前記[1]〜[18]の何れか1つの、バイオマーカー、検出方法、検出キット又は組み合わせ選定方法。
<マルチプレックスイムノアッセイ法による認知機能障害疾患マーカーの検出>
アルツハイマー病を含む神経変性疾患に関わるマーカータンパク質のうち、補体系のComplement C3, Complement C4, Complement factor H、脳アミロイドーシスの原因であるAβ線維形成の抑制に関わるTransthyretin、Alpha-2-macroglobulinをマーカーとし、被験者から採取した生体試料をイムノアッセイ法に供してマーカーの有無ないし量を指標に認知機能障害疾患を検出する。
検出方法として、生体試料から複数のマーカー(アナライト)を同時に検出するマルチプレックスイムノアッセイ法を用いた。
以下、括弧の前は略称である。
AD(アルツハイマー病)37例、NDC(精神疾患に罹患していない被験者)22例、およびMCI(軽度認知機能障害)39例から得られた血清を用いた。
(2)方法
Apolipoprotein E (ApoE), Apolipoprotein A1 (ApoA1), Complement C3 (C3), Transthyretin (TTR), Complement Factor H (Factor H), Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)はMILLIPLEXTMマルチプレックスキット(HNDG1-36K, Merck Millipore社)を用いて測定した。Complement C4 (C4)はMILLIPLEXTMマルチプレックスキット(HNDG2-36K, Merck Millipore社)を用いて測定した。
(ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用血清サンプル)
血清サンプルを40,000倍希釈したものを用いた。すなわち、血清5 μlを1.5 mlチューブに加え、Assay Bufferを995 μl加えて穏やかに攪拌した。この希釈液5 μlを別のチューブに取り、Assay Bufferを995 μl加えて穏やかに攪拌した。これをアッセイサンプルとした。
(C4測定用血清サンプル)
血清サンプルを2,000倍希釈したものを用いた。すなわち、血清5 μlを1.5 mlチューブに加え、Assay Bufferを495 μl加えて穏やかに攪拌した。この希釈液10 μlを別のチューブに取り、Assay Bufferを190 μl加えて穏やかに攪拌した。これをアッセイサンプルとした。
(2−2)ビーズ希釈液の調製
検出対象のタンパク質を認識する抗体が結合したビーズを混合・希釈して、ビーズ希釈液を調製した。
(ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用ビーズ希釈液)
ミキシング用ボトルにBead Diluentを2,100 μl加え、さらに各抗体が結合したビーズ懸濁液6種類をそれぞれ150 μl加えて攪拌した。これをビーズ希釈液とした。
(C4測定用ビーズ希釈液)
ミキシング用ボトルにBead Diluentを2,850 μl加え、C4抗体が結合したビーズ懸濁液を150 μl加えて攪拌した。これをビーズ希釈液とした。
Quality Control用タンパク質が封入されているボトルに純水を 250 μl加え、穏やかに攪拌したのち、5〜10分間静置した。これをQCサンプルとした。
(2−4)スタンダードサンプルの調製
定量用標準曲線作成用のスタンダードサンプルは6段階の段階希釈で作成した。すなわち、スタンダードタンパク質が入っているボトルに250 μlの純水を加えて穏やかに攪拌したのち、5〜10分間静置し、これを最高濃度のスタンダード溶液とした。これを50 μlを別のチューブに取り、Assay Buffer 150 μlを加えて攪拌した。さらに、希釈した溶液50 μlを別のチューブに取り、Assay Buffer 150 μlを加えて攪拌した。これを合計6回繰り返した。希釈の系列は1, 4, 16, 64, 256, 1024, 4096倍である。
ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-Mを測定するアッセイ用96Wellフィルタープレートと、C4を測定するアッセイ用96Wellフィルタープレートを別々に用意して抗原抗体反応を行った。
アッセイ用96Wellフィルタープレートに200 μlのWash Buffer を加えて、Plate Shaker (M・BR-022, TAITEC社)を用いて1,200 rpmで10分間、室温で攪拌した。その後、マニホールドを用いて、Wash Bufferを吸引除去した。使用ずる全WellにAssay Bufferを25 μlを加え、さらにビーズ希釈液を25 μl加えた。続いて、アッセイサンプル用Well、スタンダードサンプル用Well、QCサンプル用Well、バックグラウンド測定用Wellにそれぞれのサンプルを25 μlを加えた。バックグラウンド測定用WellにはAssay Bufferを加えた。プレートをシーリングしたのち、Plate Shakerで抗原抗体反応を行った。ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用プレートは2時間、室温で抗原抗体反応を行った。C4測定用プレートは16時間、4℃で抗原抗体反応を行った。
抗原抗体反応後、溶液を吸引除去し、さらにWash Buffer を200 μl加えて吸引除去を3回繰り返し、ビーズの洗浄を行った。洗浄後、Detection Antibodiesを25 μlを使用Well全てに25 μl加えてプレートをシーリングし、Plate Shakerで1時間、室温で攪拌して二次抗体反応を行った。反応後、Streptavidin-Phycoerythrinを25 μl加えてシーリングし、Plate Shakerで30分間、室温で攪拌した。反応後、溶液を吸引除去し、さらにWash Buffer を200 μl加えて吸引除去を3回繰り返し、ビーズの洗浄を行った。100 μlのSheath Fluidを各Wellに加えて5分間室温で攪拌したのち、Luminex 200TM(Luminex Corp., USA)で蛍光測定を行った。血清サンプル中のマーカーの定量解析は、xPONENT 3.1 ソフトウェア(Luminex Corp., USA)を用いて、スタンダードサンプルから求められた標準曲線の数式を用いて定量した。
検出したマーカータンパク質がNDC群、MCI群、AD群で血清中の存在量に差があるか差異解析を行った。表1は各症例群を2対t検定で検定し、有意水準をp<0.05とした時のp値を示した表である。Complement C3 (C3)はNDC対MCI、NDC対AD、MCI対ADのいずれでも有意に差がみられ、認知機能障害疾患(MCI、AD)患者を非認知機能障害(NDC)患者と区別するのに有用であることが分かった。また、Apolipoprotein A1 (ApoA1)、Transthyretin (TTR)はAD患者をNDCと区別するのに有用であることが分かった。Apolipoprotein E (ApoE)、Complement factor H (Factor H)、Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)、Complement C4 (C4)はいずれの疾患群とも有意な差を示さなかった。
検出したマーカータンパク質がどの程度に有用であるかを評価するために、受信者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve, ROC曲線)による分析を行った。ROC曲線の下部の面積値(AUC of ROC)(以下、AUCという)が1に近いほどバイオマーカーとしての有用性が高くなる。MCI対NDC、AD対NDCの比較におけるROC曲線を作成し、AUCが0.6以上を示すマーカータンパク質を解析したところ、C3、ApoA1、TTRがAUCが0.6以上を示すマーカーであった。表2にC3、ApoA1、TTRのNDC対MCI、NDC対ADのAUCを示した。
図1、図2、図3はC3、ApoA1、TTRの3つのマーカータンパク質について、差異解析とROC曲線を示している。図1のA)は差異解析の図であり、NDCとMCIで比較するとMCIでC3は有意に減少し(t検定、p値0.034)、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値1.668E-4)。さらに、MCIとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値0.01)。図1のB)および、C)はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.663、NDCとADで比較した時のAUCは0.834であった。図2のA)はApoA1の差異解析の図であり、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値0.049)。図2のB)および、C)はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.649、NDCとADで比較した時のAUCは0.673であった。図3のA)はTTRの差異解析の図であり、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値5.811E-4)。図3のB)および、C)はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.677、NDCとADで比較した時のAUCは0.730であった。
これら、C3、ApoA1、TTRの3つのマーカータンパク質について、NDCに対して、MCI、ADをより精度よく区別する組み合わせを解析するため、試験例2を行った。
〔インタクトタンパク質/ペプチド〕
0001 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG
0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE
0101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL
0151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA
0201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK
0251 VSFLSALEEY TKKLNTQ
〔インタクトタンパク質/ペプチド〕
0001 MASHRLLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV
0051 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK
0101 ALGISPFHEH AEVVFTANDS GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE
〔インタクトタンパク質/ペプチド〕
0001 MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
0051 GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
0101 GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
0151 TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
0201 MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
0251 LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
0351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
0401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
0451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
0501 LKAGRQVREP GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
0551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
0601 GVFVLNKKNK LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
0651 GQQTAQRAEL QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
0701 NPMRFSCQRR TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
0751 LDEDIIAEEN IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
0801 TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
0851 LYNYRQNQEL KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
0901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
0951 RLGREGVQKE DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN
<ロジスティック回帰分析を用いたマルチマーカーによるMCI、ADの区別>
(1)ロジスティック回帰分析の原理
この方法はバイオマーカーに対応する各パラメーターの係数をデータセットから得て、二つの疾患カテゴリー(正常、疾患)における患者ごとの判定確率を与えることができる。ロジスティック回帰に関する比較的丁寧な解説は以下から得られる(非特許文献3:Czepiel, SA, http://czep.net/stat/mlelr.pdf, 2010, Maximum likelihood estimation of logistic regression models: theory and implementation.)。この解説にはNewton-Raphson法による分析法が含まれている。
この解析手法の原理は以下のとおりである。ある事象の生起確率をPとしたとき、
式(2)の最終化法として以下の2通りがある。
(I)係数の統計的有意性による方法
有意でない係数が見出された場合は、これを除外して式(2)を作り、同様に当てはめを行うことを繰り返す。こうして、式(2)の係数がすべて有意になったら、xiの実測値を代入して(2)からZ値を求める。ついで式(1) からP(判定確率)の値を求めることができる。なお、係数βiについてはその標準誤差(standard error)を算出することができる。
正答率とは元来属する群に属すると正しく判定された率をいうが、この方法では、統計的有意性が認められない係数を含むすべての係数を対象にtrial and errorにより最大正答率を与える係数の組み合わせを求める。判定確率は(I)と同様に求める。
ロジスティック回帰の正答率を以下の式(3)によって定義する。判別は被験者の二つのカテゴリー(例えばNDCとMCI)のうちのどちらに属するかをロジスティック回帰式から推定することによって行われる。被験者のカテゴリーをi(例えばMCI)とし、ロジスティック回帰式から得られた判定確率が0.5以上のときiと正しく診断されたとみなす。カテゴリーiの総被験者数をNi 、正しくiと診断された被験者数をCi として、
ロジスティック回帰において変量xiに対するオッズ比(odds ratio)とはxiを1単位増加させた場合のオッズを元のオッズで割った値であるが、これはexp(βi)に等しい。オッズ比が1であるとは、xiを1単位増加させても元と同じオッズであるので、今考えている事象の起きる確率に変化がないことを意味する。すなわち、この場合βiは0であり、Zに寄与していないことを示す。オッズ比の95%信頼区間が1を含む場合も統計学的にそのβiは有意ではないことになる。なお、当然ながらexp(0) = 1である。
試験例1において、マルチプレックスイムノアッセイ法で測定したタンパク質Apolipoprotein E (ApoE)、Apolipoprotein A1 (ApoA1)、Complement C3 (C3)、Transthyretin (TTR)、Complement Factor H (Factor H)、Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)、Complement C4 (C4)のうち、NDC対MCI、NDC対ADの2群有意差検定(t検定)で有意に差がみられ、さらにROC曲線のAUCが0.6以上を示した3つのタンパク質C3、ApoA1、TTRを選択し、ロジスティック回帰分析を行った。ロジスティック回帰分析による解析はtrial and errorによってマーカータンパク質の加除を行い、正答率が最も高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせを求め、この組み合わせによるロジスティック回帰式(2)の係数(coefficient, βi)を算出した。
ロジスティック回帰分析はMedCalc for Windows(登録商標), version 9, 2007, (MedCalc Software社)を用いて実行した。このプログラムはNewton-Raphson法によっている。
マーカータンパク質3種の組み合わせとその組み合わせのデータを用いてロジスティック回帰を行い、算出された統計学的p値の表を表3に示す。組み合わせに用いたマーカータンパク質は(○)で示し、使用しなかったものは(-)で示した。
マーカータンパク質3種の組み合わせとその組み合わせのデータを用いてロジスティック回帰を行い、算出された統計学的p値の表を表4に示す。組み合わせに用いたマーカータンパク質は(○)で示し、使用しなかったものは(-)で示した。
Claims (11)
- 次の(a)、(b)及び(c)から選択される2種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 前記認知機能障害疾患は、アルツハイマー病又は軽度認知障害疾患である、請求項1に記載のバイオマーカー。
- 次の(a)及び(c)のバイオマーカーを含む、軽度認知障害検出用バイオマーカー。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー、及び
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 次の(b)及び(c)のバイオマーカーを含む、アルツハイマー病検出用バイオマーカー。
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー、及び
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 生体試料中の、次の(a)、(b)及び(c)から選択される2種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定する認知機能障害疾患の検出方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 前記認知機能障害疾患は、アルツハイマー病又は軽度認知障害疾患である、請求項5に記載の認知機能障害疾患の検出方法。
- 生体試料中の、次の(a)及び(c)のバイオマーカーを含む軽度認知障害検出用バイオマーカーを同時又は別々に測定する、軽度認知障害の検出方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー、及び
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 生体試料中の、次の(b)及び(c)のバイオマーカーを含むアルツハイマー病検出用バイオマーカーを同時又は別々に測定する、アルツハイマー病の検出方法。
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー、及び
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 請求項1に記載の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キット。
- 請求項1に記載のバイオマーカーに対する抗体又はアプタマーを含む、認知機能障害疾患の検出キット。
- 複数の生体試料中の、以下の(a)、(b)及び(c)のバイオマーカー:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー、
(c)配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
を測定すること、
前記バイオマーカーのそれぞれの測定結果をロジスティック回帰分析で解析すること、
前記複数の生体試料中の解析結果に基づき認知機能障害疾患の正答率の高い前記バイオマーカーの組み合わせを選定すること、
被験者の生体試料中の前記バイオマーカー(a)、(b)及び(c)を測定すること、及び
前記被験者の測定結果及び前記バイオマーカーの組み合わせ選定結果に基づき、前記被験者を、軽度認知機能障害、アルツハイマー病又は非認知機能障害の健常者に区別すること、
を含む、認知機能障害疾患の検出精度を向上させる方法。
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