KR20160055780A

KR20160055780A - 인지기능장애질환의 바이오 마커 및 당해 바이오 마커를 사용하는 인지기능장애질환의 검출방법

Info

Publication number: KR20160055780A
Application number: KR1020167002424A
Authority: KR
Inventors: 가즈히코 우치다; 고지 메노; 히데아키 스즈키; 요시노리 니시무라
Original assignee: 가부시키가이샤 엠씨비아이; 고쿠리쯔 다이가쿠 호징 츠쿠바 다이가쿠
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2016-05-18
Also published as: US20160178642A1; EP3015865A1; US20240003913A1; PH12015502849A1; US20200309789A1; SG11201510701QA; CA2916861A1; PH12015502849B1; CN111426848A; WO2014207888A1; JP6265507B2; CN105659093A; JPWO2014207888A1; EP3015865A4; KR101850827B1; EP3015865B1

Abstract

본 기술은, 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커 및 바이오 마커를 사용하여 인지기능장애질환을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
생체시료 중의, 다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 인지기능장애질환의 검출방법. (a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Apolipoprotein A1의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커. (b)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커. (c)배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Complement C3의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.

Description

인지기능장애질환의 바이오 마커 및 당해 바이오 마커를 사용하는 인지기능장애질환의 검출방법{BIOMARKERS FOR COGNITIVE DYSFUNCTION DISEASES AND METHOD FOR DETECTING COGNITIVE DYSFUNCTION DISEASE USING BIOMARKERS}

본 발명은, 경도(輕度)의 인지장애(認知障碍) 및 알츠하이머병(Alzheimer disease)을 포함하는 인지기능장애질환(認知機能障碍疾患)의 검출에 사용할 수 있는 신규의 단백질(protein) 및 펩티드(peptide)인 바이오 마커(biomarker) 및 상기 바이오 마커를 사용하는 인지기능장애질환의 검출방법에 관한 것이다.

생체(生體)의 정상(正常)과 정상 이외의 상태를 나타내는 시료를 사용하여 그 차이를 판별하는 수단으로서는, 일반적으로는 체외진단약(體外診斷藥)에서 사용되어 온 기술이 주된 종래기술이다.

체외진단약 중에서 가장 많은 것이, 혈액 중의 성분을 바이오 마커로서 분석함으로써 진단검사를 하는 것이다.

본 분야에 있어서의 종래기술에서는, 혈액(血液) 중의 단독의 특정 단백질 혹은 분자량이 1만 이하인 소위 올리고 펩티드(oligopeptide)의 존재량의 측정, 또는 효소 단백질의 경우에는 활성(活性)의 측정을 하여, 정상(건강한 사람)시료와 질환시료와의 분명한 차이를 확인하여 진단에 일조(一助)를 하여 왔다.

즉 일정 수의 건강한 사람과 질환환자에서 유래된 생체시료(生體試料)에 있어서의 단독 또는 복수의 특정한 단백질 또는 특정한 올리고 펩티드의 양 또는 이들의 활성량을 미리 계측하여, 이상치(異常値)와 정상치(定常値)의 범위를 정한다. 계속하여 평가하는 생체시료를 같은 방법으로 측정하고, 측정결과가 이 결정된 이상치와 정상치 중에서 어느 쪽의 범위에 속하는가에 따라 검사평가를 하는 것이다.

구체적인 계측방법으로서는, 시료를 그대로 또는 미리 희석하여 두고, 단독 또는 복수의 특정한 단백질 또는 펩티드의 양을, 기질(基質)과 반응시키면 발색(發色)하는 효소에 의하여 표지(標識)된 특이적 1차항체(1次抗體) 또는 2차항체를 사용하여 시료의 발색량에 의하여 계측하는 효소결합면역흡착측정법(ELISA ; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay)이나 화학발광측정법(CLIA ; ChemiLuminescent Immunoassay) 등이 있다. 또한 당해 특정의 단백질 또는 펩티드의 양을, 1차항체 또는 2차항체에 결합시킨 라디오아이소토프(radioisotope)를 사용하여 계측하는 방사성면역측정법(RIA ; RadioImmunoassay), 단백질이 효소인 경우에는 직접 기질을 부여하여 생산물을 발색 등에 의하여 계측하는 효소활성측정법(酵素活性測定法) 등이 있다.

또한 효소의 기질분해산물을 고속액체 크로마토그래피(HPLC(high pressure liquid chromatography))에 의하여 분석하는 방법도 있다. 또한 HPLC와 질량분석장치를 조합시킨 LC-MS/MS법 및 이것을 사용한 선택반응검지(selected reaction monitoring(SRM))/다중반응검지(multiple reaction monitoring(MRM))법도 있다.

또한 시료에 적절한 전처리(前處理)를 실시한 후, 2차원 폴리아크릴아미드겔 전기영동(2D-PAGE(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis))을 하여 단백질 또는 펩티드를 분리한 후, 목적으로 하는 단백질 또는 펩티드에 대하여 은염색(silver staining), 쿠마시 블루 염색(coomassie blue staining) 또는 대응하는 항체를 사용한 면역 염색(immuno staining)(웨스턴·블로팅(western blotting))을 하여, 시료 중의 농도를 측정하는 방법도 있다.

또한 생체시료를 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)에 의하여 분획(分劃)하고, 그 분획된 부분에 포함되는 단백질과 펩티드를 질량분석에 의하여 분석하는 방법이 있다.

또한 칼럼 크로마토그래피가 아니라, 전처리로서 단백질칩(protein chip)을 사용하여 질량분석하는 방법이나, 전처리로서 자기 비드(magnetic bead)를 사용하여 질량분석하는 방법이 있다.

또한 본 발명자는, 비드(자기 비드를 포함한다)에 대상이 되는 단백질 또는 펩티드에 대한 항체를 결합시키고, 이에 따라 측정하고 싶은 단백질 또는 펩티드를 포착한 후에, 비드로부터 용출(溶出)시켜서 질량분석에 의하여 측정하는 immunoMS법을 개발하고 있다.

또한 인택트 단백질의 해석을 목적으로, 트립신(trypsin) 등에 의하여 분해한 후에 상기의 방법에 의하여 질량분석까지 하는 방법도 보고되어 있다(특허문헌1을 참조).

그러나 모두 인택트 단백질의 성질을 이용하여 그대로 분획하거나 또는 특이적(特異的)으로 흡착하는 단백질 분자를 선별하여 질량분석에 의하여 해석하는 것이다.

알츠하이머병으로 대표되는 인지기능장애질환은, 일본에 있어서도 최근의 고령화에 따라 급격하게 증가하고 있다. 1995년에 약 130만명이었지만, 2010년에는 약 280만명으로 되고, 2020년에는 약 410만명에 도달할 것으로 예상되고 있다. 알츠하이머병은 인지기능장애질환의 60∼90%를 차지한다고 말해지고 있다. 본 질환은 환자의 기억을 상실시킬뿐만 아니라 인격(人格)도 붕괴시켜서 환자의 사회생활기능을 상실시켜 버리는 것이기 때문에, 사회문제화 되고 있다.

일본에 있어서는 1999년 말에 항아세틸콜린 에스테라아제 저해약(anti-acetylcholine esterase inhibitor)인 염산 도네페질(Donepezil hydrochloride)이 인가를 받았고, 조기(早期)에 투여되면 높은 확률로 인지기능의 저하를 「지연」시킬 수 있게 되었다. 알츠하이머병에 있어서는, 현재의 치료법이나 이제부터 개발되는 치료약의 효과를 올리기 위해서는 조기에 진단하는 것이 가장 중요한 과제로 되어 있다.

미국의 정신의학회에 의한 알츠하이머병의 주된 진단기준(DSM IV)을 이하에 나타낸다.

A.다양한 인지결손의 발현에 의하여, 이하의 양방(兩方)에 의하여 명확하게 된다.

(1)기억장애(새로운 정보를 학습하거나 이전에 학습한 정보를 상기(想起)하는 능력의 장애)

(2)이하의 인지장애 중에서 하나 또는 그 이상

a)실어(失語 : aphasia)(언어의 장애)

b)실행(失行 : apraxia)(운동기능의 장애가 없음에도 불구하고, 동작을 하는 능력의 장애)

c)실인(失認 : agnosia)(감각기능의 장애가 없음에도 불구하고, 대상을 인식 또는 식별하는 능력의 장애)

d)실행능력(實行能力)(계획을 세우는 것·조직화 하는 것·순서를 정하는 것·추상화 하는 것)의 장애

B.기준 A(1) 및 A(2)의 인지결손은, 그 각각이 사회적 또는 직업적 기능의 현저한 장애를 야기하여, 병전(病前)의 기능수준으로부터 현저한 저하를 나타낸다(비특허문헌1).

알츠하이머병(Alzheimer disease)(AD)의 관련질환에는 여러 가지의 것이 있다. AD 등의 인지증(認知症)은 서서히 인지기능의 저하가 출현하기 때문에, 인지증의 전구상태(前驅狀態)라고 불러야 하는 상태가 존재한다. 이러한 상태를 경도인지장애(mild cognitive impairment)(MCI)라고 부르고 있다. 미국의 데이터에서는, 건망증(健忘症)으로 인하여 외래진찰을 받은 MCI 중에서 1년에 10∼15％, 4년 동안에 약 50％가 AD로 이행한다고 한다. AD의 전구상태의 대부분은 건망형 MCI에 포함된다.

현재의 정의에 의하면, MCI는 인지기능의 저하에 관한 호소가 있지만, 기본적인 일상생활에는 지장이 없는 상태가 된다. 전두측두형 인지증(前頭側頭型認知症)(FTD(Frontotemporal dementia))은 인지기능의 저하와 함께 주위를 고려하지 않고 이기적으로 하는 행동이 특징적이고, 주위에 맞추려고 하는 AD와 대조적이다. FTD에는 대뇌피질(大腦皮質)에 조직학적으로 피크구(Pick球 : Pick body)의 존재를 인정하는 피크병(Pick's disease)이 포함된다.

레비소체형 인지증(DLB(Dementia with Lewy Bodies))은, 기억장애가 진행성이며 환시(幻視) 등의 시각인지장애(視覺認知障碍)가 있는 것을 특징으로 하고 있다. 임상증상으로부터의 진단에서는 인지증의 10∼30％가 DLB이고, 노년기의 변성성 인지증 질환(變性性認知症疾患)에서는 알츠하이머형 인지증(AD)에 이어서 2번째로 많다고 한다. 조직학적으로는 대뇌에 있어서의 레비소체의 존재를 특징으로 한다. FTD 및 DLB는 인지증을 나타내는 치매형이기 때문에 치매형 신경질환이라고도 부른다(비특허문헌1).

인지증의 진단에 널리 사용되고 있는 검사는, 개정 하세가와식 지능평가 스케일(Revised Hasegawa's Dementia Scale)(HDS-R)과 MMSE(Mini-Mental State Examination)에 의하여 피험자에게 문진(問診)을 하고, 그 결과로부터 판단하는 것이다. HDS는 1991년에 개정되어 HDS-R이라고 부르게 되었다.

이것은 9개 항목의 질문으로 이루어지는 것으로서, 소재식(所在識), 기명력(記銘力), 계산능력, 기억·상기(memory·recall) 및 상식을 테스트 하는 것이다. 30점 만점에서 23점 이하를 인지증의 의심이 있다라고 한다. 또한 MMSE는 치매의 진단을 위하여 미국에서 고안된 것으로서, 소재식, 기억력, 계산력, 언어적 능력, 도형적 능력 등을 커버한다. 30점 만점이고 11개의 질문으로 이루어지는 것으로서, HDS-R과 마찬가지로 23점 이하에서 인지증의 의심이 있다라고 한다. 양쪽 테스트의 결과는 비교적 잘 일치하고 있다. 이들의 문진법은 어디까지나 스크리닝(screening)의 목적으로 사용되고, 확정진단에 사용되지 않으며, HDS-R, MMSE는 그 어느 것도 중증도(重症度) 분류에 사용되지 않는다(비특허문헌1).

화상진단법(畵像診斷法)으로서는, 뇌 위축(腦萎縮)·뇌구뇌실 확대(腦溝腦室擴大) 등 뇌의 형태적 이상(形態的異常)을 관찰하는 CT·MRI와, 뇌혈류량을 관찰하는 뇌혈류 신티그래피(腦血流 scintigraphy)(SPECT(single photon emission computed tomography)) 및 산소 소비량·포도당 소비량을 보는 포지트론 단층법(positron 斷層法)(PET(positron emission tomography))이 있다. SPECT 및 PET는 핵의학적(核醫學的) 방법으로서, 형태적 이상이 일어나기 전에 이상을 검출할 수 있다고 되어 있다(비특허문헌1). 그러나 이들의 화상진단은 특수한 설비를 필요로 하기 때문에, 모든 의료기관에서 실시할 수 없다는 결점을 갖는다. 또 화상을 관찰하는 의사에 따라 판단이 서로 다른 경우가 있어 객관성이 결여된다.

이와 같이 AD를 포함하는 인지증의 진단은, 객관성을 결여하고 또한 고가의 장치의 사용을 전제로 한 방법에 의존하고 있는 것이 현재의 상태로서, 질환 발견을 위한 스크리닝은 불가능하다. 그래서 혈액(혈청, 혈장을 포함한다)과 같이 용이하게 얻을 수 있는 환자의 시료를 사용하여 객관적 진단을 가능하게 하는 바이오 마커를 찾아내면, 스크리닝을 함으로써 현재 가장 중요한 과제로 되어 있는 인지기능장애질환의 조기발견이 가능하게 된다.

특허문헌1에는, 동일한 담암포유동물(擔癌哺乳動物 ; cancer-carrying mammal)에서 유래되는 복수의 혈청샘플에 포함되는 아폴리포 단백질A-Ⅱ(apolipoprotein A-II)의 정량치(定量値)를 상기 샘플 사이에서 서로 비교하는 것을 특징으로 하는, 상기 담암포유동물 혈청 중의 아폴리포 단백질A-Ⅱ량의 변화를 검출하는 방법이 개시되어 있다.

특허문헌2에는, 당해 문헌2에 기재되어 있는 배열번호1로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 피브리노겐 α사슬(fibrinogen α chain) 등으로 이루어지는 군(群)으로부터 선택되는 적어도 1개의 단백질 또는 펩티드로 이루어지는 간암(hepatoma) 검출을 위한 간암 바이오 마커(hepatoma biomarker)가 개시되어 있다.

특허문헌3∼5에는, 인지기능장애질환을 진단하기 위한 바이오 마커가 개시되어 있다. 특허문헌5에는, 당해 문헌5에 기재되어 있는 배열번호1로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Complement C3, 당해 문헌5에 기재되어 있는 배열번호15로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Transthyretin 등으로부터 선택되는 적어도 1개의 단백질 또는 펩티드, 혹은 당해 단백질 또는 펩티드로부터 발생하는 아미노산 잔기(amino acid 殘基)가 5개 이상인 펩티드 단편(peptide 斷片)으로 이루어지는, 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커가 개시되어 있다.

: 일본국 공개특허 특개2004-333274호 공보 : 일본국 공개특허 특개2006-308533호 공보 : 일본국 공개특허 특개2010-271078호 공보 : 일본국 공개특허 특개2012-037349호 공보 : 일본국 공개특허 특개2012-132808호 공보

: 나카노 이마하루(Nakano, Imaharu), 미즈사와 히데히로(Mizusawa, Hidehiro) 편집 : 알기 쉬운 알츠하이머병, 2004, 나가이(Nagai) 서점 : N. Benkirane 등, J. Biol. Chem. Vol.268, 26279-26285, 1993. : Czepiel, SA, http://czep.net/stat/mlelr.pdf,2010, Maximum likelihood estimation of logistic regression models: theory and implementation. : Bowling, SR, et al. JIEM, 2009, 2 : 114-127, A logistic approximation to the cumulative normal distribution.

본 기술은, 바이오 마커 및 상기 바이오 마커를 사용한 인지기능장애질환의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 비인지기능장애(非認知機能障碍) 피험자 및 인지기능장애 질환환자에 있어서의, 존재의 유무 및 존재량이 서로 다른 단백질 및 그 부분 펩티드를 탐색하였다.

그리고 본 발명자는 예의 검토를 한 결과, 인지기능장애질환을 검출할 수 있는 3종의 폴리펩티드(polypeptide)를 혈청 중에서 찾아내었다. 당해 3종의 폴리펩티드는, (a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Apolipoprotein A1에서 유래된 펩티드, (b)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Transthyretin에서 유래된 펩티드 및 (c)배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Complement C3에서 유래된 펩티드이었다.

또한 본 발명자는, 인지기능장애질환의 검출 시에 정답률이 높은 바이오 마커의 조합에 대하여 로지스틱 회귀분석(logistic 回歸分析)에 의하여 해석하였다. 이 결과, 이 중에서 상기 (c)Complement C3에서 유래된 펩티드와, 상기 (b)Transthyretin에서 유래된 펩티드 또는 상기 (a)Apolipoprotein A1에서 유래된 펩티드의 2종의 펩티드를 조합시켜서 사용함으로써 인지기능장애질환(특히 경도인지기능장애 및 알츠하이머병)의 검출정밀도를 높일 수 있는 것을 찾아내었다.

본 기술에 있어서 비인지기능장애피험자(NDC)는, 건강한 사람을 포함하며, 어떠한 질환에 이환(罹患)되더라도 좋지만 인지기능장애질환에는 이환되어 있지 않은 피험자(non-demented control)를 의미하는 것이다.

또한 본 기술에 있어서, 인지기능장애질환이라고 총칭할 때에 경도인지기능장애(MCI), 알츠하이머병(AD) 및 치매형 신경질환을 포함하는 것으로 한다.

본 기술에 있어서, 경도인지기능장애(MCI), 알츠하이머병(AD)을 적합하게 검출할 수 있다.

본 기술에서 찾아낸 당해 펩티드는 혈청 중에서 뿐만 아니라, 혈액, 혈청, 혈장(血漿), 뇌수막액(腦髓膜液), 오줌(尿) 등 다른 생체시료 중에서 검출되는 경우에도 바이오 마커로서 의의를 갖는 것이다. 동시에, 이들 펩티드의 기원인 단백질(이하 「인택트한 단백질」이라고 부른다) 또는 펩티드도 바이오 마커로서의 의의를 갖는다.

즉 본 기술은, 다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 제공하는 것이다.

(a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Apolipoprotein A1의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.

(b)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.

(c)배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Complement C3의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.

본 기술은, 생체시료 중의, 상기의 (a)바이오 마커, (b)바이오 마커 및 (c)바이오 마커로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 인지기능장애질환의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 기술은, 상기의 (a)바이오 마커, (b)바이오 마커 및 (c)바이오 마커로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 측정하기 위한 인지기능장애질환의 검출키트를 제공하는 것이다.

본 기술은, 피험자의 생체시료 중에 있어서의 인지기능장애질환의 2종 이상의 바이오 마커를 각각 측정하는 것, 상기 2종 이상의 바이오 마커의 각각의 측정결과를 로지스틱 회귀분석에 의하여 해석하는 것, 상기 해석결과에 의거하여 인지기능장애질환의 정답률이 높은 바이오 마커의 조합을 선정하는 것을 포함하는, 정답률이 높은 복수의 인지기능장애질환 검정용 바이오 마커의 조합선정방법을 제공하는 것이다.

본 기술에 의하여 바이오 마커 및 상기 바이오 마커를 사용한 인지기능장애질환의 검출방법을 제공할 수 있다.

도1은, 배열번호3 ; C3의 마커 단백질에 대하여, 차이해석과 ROC 곡선의 결과. NDC vs. MCI와 NDC vs. AD를 나타내는 도면이다.
도2는, 배열번호1 ; ApoA1의 마커 단백질에 대하여, 차이해석과 ROC 곡선의 결과. NDC vs. MCI와 NDC vs. AD를 나타내는 도면이다.
도3은, 배열번호2 ; TTR의 마커 단백질에 대하여, 차이해석과 ROC 곡선의 결과. NDC vs. MCI와 NDC vs. AD를 나타내는 도면이다.

본 기술에 있어서, 다음의 (a)∼(c)에 기재된 인택트 단백질(intact protein) 및/또는 이 부분 펩티드(partial peptide)로부터 선택되는 1종 이상의 바이오 마커(biomarker)를, 인지기능장애질환(認知機能障碍疾患)을 검출하기 위하여 사용할 수 있다.

(a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열(amino acid sequence)을 포함하는 Apolipoprotein A1의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.

본 기술은, 피험자(被驗者)가 인지기능장애질환에 이환(罹患)되어 있을 때에, 생체시료(生體試料) 중의 상기 (a)∼(c)에 기재되어 있는 것 중에서 적어도 1개의 인택트 단백질 및/또는 그 부분 펩티드의 종류 및 양을 각각 검출할 수 있다.

또한 본 기술은, 생체시료 중의 상기 (a)∼(c)에 기재되어 있는 것 중에서 적어도 1개 또는 2개 이상의 인택트 단백질과 그 부분 펩티드를 검출함과 동시에, 이들의 종류와 양의 변동을 측정함으로써 피험자가 인지기능장애질환에 이환되어 있는가 아닌가를 더 고정밀도로 진단할 수 있다.

본 기술은, 생체시료 중의 상기 (a)∼(c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 바이오 마커를 측정함으로써, 정밀도 및 특이성(特異性)의 양방이 매우 높은 진단 등의 시스템을 제공할 수 있다. 이에 따라 인지기능장애질환에 대하여 정밀도가 높은 진단 등을 할 수 있다. 또한 본 기술의 바이오 마커는 약제효과판정(藥劑效果判定)에 있어서도 유용성이 높다.

또한 본 기술은, 상기 (a)∼(c)의 각 바이오 마커의 양을 계측함으로써, 피험자의 생체시료 중의 상기 (a)∼(c)의 인택트 단백질 및/또는 그 부분 펩티드가 출현 또는 증가하는 경우에는 당해 피험자는 경도(輕度)의 인지장애 또는 알츠하이머병(Alzheimer disease)을 포함하는 인지기능장애질환에 이환되어 있다라고 검출, 평가, 판별, 진단 또는 검사 등을 할 수 있다. 또한 본 기술은, 비인지기능장애(非認知機能障碍) 피험자의 생체시료와 또 비교함으로써 피험자가 인지기능장애질환에 이환되어 있는가 아닌가를 더 고정밀도로 진단 등을 할 수 있다.

바람직하게는, 상기 (a)∼(c)의 바이오 마커를 2종 또는 3종 이상 조합시켜서 인지기능장애질환을 검출하는 것이, 인지기능장애질환의 검출정밀도가 향상되기 때문에 적합하다. 복수의 바이오 마커를 검출하였을 경우에는, 인지기능장애질환이라고 고정밀도로 검출 또는 진단할 수 있다.

더 바람직하게는, 상기 (c)바이오 마커(C3)와, 상기 (a)바이오 마커(ApoA1) 또는 상기 (b)바이오 마커(TTR)의 2종을 측정하는 것이, 인지기능장애질환(MCI 및 AD)의 검출정밀도가 향상되기 때문에 적합하다. 이 2개의 바이오 마커를 검출하였을 경우에는 인지기능장애질환(MCI 및 AD)의 검출정밀도가 더 향상되기 때문에, 상기 인지기능장애질환의 검출이 경도의 장애의 검출인 경우에 상기 (c)바이오 마커(C3) 및 상기 (a)바이오 마커(ApoA1)의 2종을 측정하거나 또는 상기 인지기능장애질환의 검출이 알츠하이머병의 검출인 경우에 상기 (c)바이오 마커(C3) 및 상기 (b)바이오 마커(TTR)의 2종을 측정하는 것이 더 바람직하다.

여기에서 본 기술의 「인택트 단백질에 있어서의 부분 펩티드」의 「펩티드」에는, 「폴리펩티드(polypeptide)」와 「올리고 펩티드(oligopeptide)」가 포함되는 의미이다.

당해 「올리고 펩티드」는 일반적으로는 분자량이 1만 이하인 아미노산이 결합한 것을 말하거나 또는 아미노산 잔기(amino acid 殘基)의 수로서 몇 개∼50개 이하 정도의 것을 말한다.

당해 「폴리펩티드」는, 분자량이 1만 이상인 아미노산이 결합한 것을 말하거나 또는 아미노산 잔기의 수로서 50개 이상 정도의 것을 말한다.

본 기술에 있어서 인택트 단백질의 부분 펩티드라는 것은, 인택트 단백질이 구비하는 아미노산 배열에 있어서의 일부의 부분적 아미노산 배열을 구비하는 펩티드를 말한다.

이 인택트 단백질의 부분 펩티드는, 전사·번역(轉寫·飜譯)에 의한 발현합성(發現合成)의 과정에서 부분 펩티드로서 생성되는 경우와, 인택트 단백질로서 합성된 후에 생체 내에서 소화분해(消化分解)를 받아서 소화분해산물 펩티드로서 생성되는 경우가 있다. 이 원인으로서, 생체가 인지기능장애질환 등 정상 이외의 상태에 있을 때에 단백질의 합성 및 제어기구가 탈제어(脫制御)되는 것을 들 수 있다.

본 기술은, 생체 내 단백질의 발현합성 및/또는 소화분해를 지표로 하여 피험자가 정상상태인가 인지기능장애질환에 이환되어 있는가를 평가, 판별 등을 할 수 있고, 또 인지기능장애질환에 이환되어 있는 경우의 진행 정도도 평가, 판별 등을 할 수 있다.

본 기술에 있어서의 「인지기능장애질환의 검출」이라는 것은, 피험자가 인지기능장애질환에 이환되어 있는가 아닌가의 검출이고, 그 이외의 평가, 판별, 진단 또는 검사 등이더라도 좋다. 또한 본 기술의 인지기능장애질환의 검출은, 피험자가 더 심각한 인지기능장애에 이환될 리스크(risk)의 평가 등도 포함할 수 있다.

본 기술에 있어서 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커로서 사용할 수 있는 인택트 단백질로서, 배열번호1로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Apolipoprotein A1, 배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin, 배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Complement C3을 들 수 있다.

또한 이들 인택트 단백질의 부분 펩티드도 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커로서 사용할 수 있다.

본 기술에 있어서의 「인택트 단백질의 부분 펩티드」에는, 인택트 단백질 및 그 합성·분해과정에서 생성되는 펩티드로부터 발생하는 아미노산 잔기가 5개 이상인 펩티드 단편(peptide 斷片)도 포함하는 의미이다.

또한 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커로서 사용할 수 있는 인택트 단백질의 부분 펩티드로서, 예를 들면 배열번호1로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드(적합하게는 Apolipoprotein A1에서 유래된 폴리펩티드(Apolipoprotein A1-derived polypeptide)), 배열번호2로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드(적합하게는 Transthyretin에서 유래된 폴리펩티드(Transthyretin-derived polypeptide)), 배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드(Complement C3에서 유래된 폴리펩티드(Complement C3-derived polypeptide))를 들 수 있다.

본 기술은, 상기 (a)∼(c)에 기재되어 있는 단백질 및 이 부분 펩티드의 각 아미노산 배열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실(缺失), 치환(置換), 부가(付加)된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 또는 펩티드를 바이오 마커로서 사용할 수 있다.

여기에서 「1개 또는 몇 개」라는 것은, 「1개∼3개」, 「1개 또는 2개」, 「1개」를 말한다.

본 기술에 있어서 바이오 마커에 사용하는 부분 펩티드는, 배열번호1∼3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 단백질 또는 펩티드 및 이들로부터 발생하는 아미노산 잔기가 5개 이상인 펩티드 단편도 포함하는 의미이다.

또 본 기술에 있어서의 「아미노산 잔기가 5개 이상인 펩티드 단편」에서 「아미노산 잔기가 5개 이상」이라고 한 이유는, 비특허문헌2의 기재에 의한다. 당해 비특허문헌2는, 히스톤 H3(histone H3)의 C단(C-terminal)(130∼135)의 아미노산 잔기배열 IRGERA에 대하여 R을 K로 치환한 펩티드 및 IR을 결실시키고 대신에 CGG를 GERA에 결합시킨 펩티드 CGGGERA가 펩티드 IRGERA를 면역원(免疫原)으로 하여 얻은 항체에 의하여 인식되었다는 보고이다. 이것은, 항원성(抗原性)의 인식이 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드에 의하여 이루어지는 것을 나타내고 있다.

본 기술에서는 히스톤 H3의 C단 이외에도 일반성을 갖게 하기 위하여 잔기수(殘基數)를 1개 늘려서 5개 이상으로 하였지만, 이러한 저분자의 펩티드도 대상으로 하는 것은, 이뮤노·블로팅법(immunoblotting法), ELISA법(Enzyme Linked Immmunosorbent Assay法), immunoMS법 등과 같은 면역학적 방법을 사용하여 검출 및 분별하는 방법을 사용할 때에 중요하다.

또 인택트 단백질 또는 그 부분 펩티드에 당사슬(sugar chain)이 부가되는 경우가 있다. 이들 당사슬이 부가된 단백질 및 부분 펩티드도 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커로서 사용할 수 있다.

또 본 기술에 있어서 바이오 마커를 정량(定量)하더라도 좋고, 정성(定性)에 의하여 존재 또는 비존재를 결정하더라도 좋다. 이 때에 바이오 마커의 농도가 소정의 측정치 이상이었을 경우 또는 비인지기능질환 환자군의 표준치 이상이었던 경우에는, 인지기능장애질환이라고 검출, 진단 등을 할 수 있다. 또한 바이오 마커의 정성에 의하여 양성-음성이라고 검출, 진단 등을 할 수 있으며 예를 들면 바이오 마커와 반응하여 발색(發色) 등을 나타내었을 때에는 양성이라고 한다.

본 기술에서 혈청(血淸) 등의 생체시료 중의 바이오 마커를 분리하는 방법으로서는, 2차원 전기영동(two-dimensional electrophoresis) 또는 2차원 크로마토그래피(two-dimensional chromatography)(2D-LC)를 사용할 수 있다. 2차원 크로마토그래피에 사용하는 크로마토그래피는, 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 겔여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 등 공지의 크로마토그래피로부터 선택하면 좋다.

또한 본 기술에서 바이오 마커를 분리하는 방법으로서, 크로마토그래피(LC)와 3중 4극자 질량분석(triple quadrupole 質量分析)을 조합시킨 LC-MS를 사용한 SRM/MRM법에 의하여 정량할 수도 있다. 이 때에 사용하는 LC는 1차원의 LC이더라도 좋다.

또한 본 기술에서 바이오 마커를 분리하는 방법으로서, 본 발명자가 개발한 비드(bead)(자기 비드(magnetic bead)를 포함한다)에 대상이 되는 단백질 또는 펩티드에 대한 항체를 결합시키고, 이에 따라 측정하고 싶은 단백질 또는 펩티드를 포착한 후에 비드로부터 용출(溶出)시켜서 질량분석에 의하여 측정하는 immunoMS법(특허문헌1을 참조)을 사용하면, 2차원 전기영동 또는 크로마토그래피를 사용하지 않고, 간편하게 원하는 단백질, 단백질 단편, 펩티드의 유무 혹은 양을 평가할 수 있다.

생체시료 중의 1종 또는 2종 이상의 단백질의 종류 및 양은, 다양한 방법에 의하여 동시에 또는 각각 측정할 수 있다. 대상이 되는 단백질(단백질 단편 및 그 부분 펩티드를 포함한다)이 특정되어 있고, 그것에 대한 항체(抗體)(1차항체)가 얻어지고 있는 경우에는, 이하의 방법을 사용할 수 있다.

본 기술은, 이뮤노·블로팅법 ; 웨스턴·블로팅법(western blotting method) ; 효소(酵素) 또는 형광(螢光) 또는 방사성물질 표지법(放射性物質標識法) ; 질량분석법 ; immunoMS법 ; 표면 플라즈몬 공명법(surface plasmon resonance method) 중에서 어느 하나 이상의 방법에 의하여 측정하는 것이 바람직하다.

또한 본 기술의 바이오 마커는, 종류나 양이 서로 다른 경우에도 동시에 또는 각각 측정할 수 있다.

본 기술은, 이들 단백질이나 펩티드 또는 펩티드 단편을, 2차원 크로마토그래피와 질량분석을 조합시킨 2D-LC-MALDI-TOF-MS법, SRM/MRM법, immunoMS법을 사용함으로써, 한번에 다수의 단백질 또는 그들 부분 펩티드를 측정하는 것이 더 바람직하다.

여기에서 본 기술에 있어서, 효소결합면역흡착측정법(ELISA ; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay), 화학발광측정법(CLIA ; ChemiLuminescent Immunoassay), 방사성면역측정법(RIA ; RadioImmunoassay), 효소활성측정법 등을 사용하는 방법을 「효소 또는 형광 또는 방사성물질의 표지법」이라고 한다. 항체를 사용하는 이들의 방법을 「효소 또는 형광 또는 방사성물질표지항체법」이라고 한다.

1.이뮤노·블로팅법

가장 단순한 방법이다. 몇 단계로 희석한 피험혈청(被驗血淸)을 준비하고, 그 일정량(1 마이트로 리터(microliter) 전후)을 니트로셀룰로오스·멤브레인(nitrocellulose·membrane) 등의 적당한 멤브레인에 적하(滴下)하고 풍건(風乾)한다. BSA 등의 단백질을 포함하는 블록킹 용액(blocking 溶液)으로 처리한 후에 세정하고, 1차항체를 반응시키고, 세정한 후에 1차항체를 검출하기 위하여 표지(標識)된 2차항체를 반응시킨다. 멤브레인을 세정한 후에 표지를 가시화(可視化)하여 농도를 측정한다.

2.웨스턴·블로팅법

등전점(等電點) 또는 SDS-PAGE를 포함하는 1차원 또는 2차원 겔 전기영동을 한 후에, 분리된 단백질을 일단 PVDF 멤브레인 등의 적절한 멤브레인에 전사하고, 1차항체와 표지된 2차항체를 사용하여 상기의 이뮤노·블로팅법과 마찬가지로 조작하여, 목적하는 단백질의 존재량을 측정한다.

3.ELISA법

단백질 또는 그 부분 펩티드에 대한 항체를 미리 특수한 화학수식(化學修飾)을 실시한 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등의 담체(擔體)에 결합시키고, 시료를 단계희석(serial dilution)한 후에, 항체를 결합시킨 마이크로타이터 플레이트에 이것을 적당량 부가하여 인큐베이션(incubation) 한다. 그 후에 세정하여, 포착되지 않은 단백질 및 부분 펩티드를 제거한다. 다음에 형광 또는 화학발광물질 또는 효소를 결합시킨 2차항체를 부가하여 인큐베이션 한다.

검출은, 각각의 기질(基質)을 부가한 후에 형광 또는 화학발광물질 또는 효소반응에 의한 가시광을 계측함으로써 평가판정을 하여 한다. 항체를 대신하여 단백질 또는 그 부분 펩티드에 결합할 수 있는 물질을 사용하더라도 좋다. 예를 들면 압타머(aptamer) 등을 사용할 수 있다.

본 기술은, 상기 (a)∼(c)에 기재되어 있는 바이오 마커에 대한 물질(예를 들면 항체 또는 압타머 등)을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 이하에 방법(특허문헌2를 참조)을 예시하지만, 이들에는 한정되지 않는다.

4.마이크로 어레이(microarray)(마이트로칩(microchip))를 사용한 방법

마이크로 어레이라는 것은, 담체(기판) 위에 측정하려고 하는 물질에 결합할 수 있는 물질을 정렬(어레이(array))하여 고정화시킨 디바이스(device)를 총칭하여 말한다. 본 기술의 경우에 단백질 또는 부분 펩티드에 대한 항체 또는 압타머를 정렬하여 고정화시켜서 사용하면 좋다.

측정은, 고상화(固相化)한 항체 등에 생체시료를 첨가하고, 마이크로 어레이 위에 측정하려고 하는 단백질 또는 부분 펩티드를 결합시키고, 이어서 형광 또는 화학발광의 물질 또는 효소를 결합시킨 2차항체를 부가하고 인큐베이션 하여 한다. 검출은 각각의 기질을 부가한 후에 형광 혹은 화학발광물질 또는 효소반응에 의한 가시광을 계측하여 하면 좋다.

5.질량분석법

질량분석법에 있어서는, 예를 들면 특정의 단백질 또는 그 부분 펩티드에 대한 항체를 미리 특수한 화학수식을 한 마이크로 비드 또는 기판(단백질칩(protein chip))에 결합시킨다. 마이크로 비드는 자기 비드이더라도 좋다. 기판의 소재는 묻지 않는다.

사용하는 항체는 (1)특정의 단백질의 전체 길이(full-length)만을 인식하는 항체, (2)부분 펩티드만을 인식하는 항체, (3)특정의 단백질과 그 부분 펩티드의 양방을 인식하는 항체의 전부, 또는 상기 (1)과 (2), (1)과 (3), 또는 (2)와 (3)의 조합이더라도 좋다.

시료를 원액(原液) 또는 완충액(緩衝液)에 의하여 단계희석한 후에, 항체를 결합시킨 마이크로 비드 또는 기판에 이것을 적당량 부가하여 인큐베이션 한다. 그 후에 세정하고, 포착되지 않은 단백질 및 부분 펩티드를 제거한다. 그 후에 마이크로 비드 또는 기판 위에 포착된 단백질 및 부분 펩티드를 MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS 등을 사용한 질량분석에 의하여 분석하여, 단백질, 단백질 단편 및 부분 펩티드의 피크(peak)의 질량수와 피크강도를 계측한다. 적당한 내부표준물질을 처음의 생체시료에 일정량 부가하여 두고, 그 피크강도를 측정하여 대상이 되는 물질의 피크강도와의 비를 구함으로써 처음의 생체시료 중의 농도를 알 수 있다. 이 방법을 immunoMS법이라고 한다.

또한 시료를 원액 또는 완충액에 의하여 희석 또는 일부의 단백질을 제거한 후에, HPLC에 의하여 분리, 전자분무이온화(ESI(electrospray ionization))법을 사용한 질량분석에 의하여 정량할 수 있다. 그 때에 동위체 표지(同位體標識)된 내부표준 펩티드를 사용한 SRM/MRM법에 의한 절대정량에 의하여 자료 중의 농도를 알 수 있다.

또한 상기의 방법 이외에, 2차원 전기영동을 사용한 방법, 표면 플라즈몬 공명을 사용한 방법 등에 의해서도 단백질 및 부분 펩티드를 해석할 수 있다.

본 기술은, 피험자로부터 채취한 생체시료를 2차원 전기영동 또는 표면 플라즈몬 공명법에 제공하여, 상기 바이오 마커의 유무 또는 양을 지표(指標)로 인지기능장애질환을 검출하는 방법도 포함한다.

본 기술은, 상기한 생체시료 중의 바이오 마커를 검출할 수 있는 장치(예를 들면 검출장치, 측정장치, 해석장치 등)도 포함한다. 당해 본 기술의 장치는, 항체 또는 압타머 고정부(aptamer 固定部)(포착부) 및 측정부를 구비하는 것이 바람직하다. 항체 또는 압타머 고정부는, 항체 또는 압타머를 고정화한 슬라이드 글라스(slide glass), 96웰 타이터 플레이트(96-well titer plate) 등의 고상담체(固相擔體)를 구비하는 것이 바람직하다. 또한 측정부에는, 분광광도계(分光光度計), 형광분광계(螢光分光計) 등의 검출대상에 대응하는 광검출수단을 설치하는 것이 바람직하다.

또한 본 기술의 장치는, 얻어진 데이터를 해석하는 해석부를 포함하더라도 좋고, 해석부는 데이터 처리장치 및 해석용 소프트웨어를 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 개시의 장치에 구비되는 CPU 등을 포함하는 제어부 또는 이것에 접속 가능한 시스템(예를 들면 퍼스널 컴퓨터, 컴퓨터·네트워크 시스템 등)에는, 상기한 본 기술의 인지기능장애질환의 검출, 진단 등의 방법을 실행할 수 있는 프로그램 또는 이 프로그램을 저장한 기억부 또는 시스템 등이 설치되어 있다.

본 기술에 의하면, 피험자의 인지기능장애를 판정할 수 있다. 또한 본 기술에 의하면, 피험자의 인지기능장애를 경도의 단계에서 평가할 수도 있어 예방의학에도 유용하다. 또한 인지기능장애질환에 이환된 환자에게 심리요법이나 약물요법을 실시한 경우에 장애의 진행이 억제된다면, 혈청 등의 생체시료 중의 단백질/부분 펩티드의 양에도 반영된다. 이것을 측정함으로써 치료효과의 평가로 판정을 할 수도 있어, 신약 개발 타깃(target)의 생체분자(生體分子)를 스크리닝(screening)할 수도 있다.

다음에 설명하는 실시예에 나타내는 바와 같이 본 발명자는, 다수의 펩티드를 준비하고, 각 펩티드에 대한 각 항체를 제작하였다. 이들 항체를 사용하여 인지기능장애질환 검출용의 바이오 마커를 탐색하였다. 이 때에 수신자 조작 특성곡선(ROC 곡선(receiver operating characteristic curve))에 의한 분석을 사용하여 각 바이오 마커의 유용성에 대하여 평가를 하였다. 이 결과, 배열번호1로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Apolipoprotein A1에서 유래된 펩티드, 배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin에서 유래된 펩티드, 배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 Complement C3에서 유래된 펩티드가, 수신자 조작 특성곡선(ROC 곡선)에 의한 분석에 있어서 AUC가 0.6 이상을 나타내는 마커인 것을 찾아내었다.

또한 멀티 마커(multi marker)에 의한 인지기능장애질환(MCI 및 AD)과, 비인지기능장애의 건강인을 구별할 수 있는가 아닌가를 검토하였다. 이 때에 로지스틱 회귀분석(logistic 回歸分析)을 이용하여 검토를 하였다.

로지스틱 회귀분석의 해석결과, Transthyretin 및 Complement C3을 멀티 마커로 함으로써, 거의 9할이라는 매우 정밀도가 높은 인지기능장애질환의 검출을 가능하게 하였다.

즉 본 기술은, (i)피험자의 생체시료 중에 있어서의 인지기능장애질환의 2종 이상의 바이오 마커를 각각 측정하는 것, (ⅱ)상기 2종 이상의 바이오 마커의 각각의 측정결과를 로지스틱 회귀분석에 의하여 해석하는 것, (ⅲ)상기 해석결과에 의거하여 인지기능장애질환의 정답률이 높은 바이오 마커의 조합을 선정하는 것을 포함한, 정답률이 높은 복수의 인지기능장애질환 검출용 바이오 마커의 조합선정방법을 제공할 수 있다.

이 때에 로지스틱 회귀분석을 사용하여, NDC와 MCI를 비교하여 MCI를 구별하는 정답률이, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상일 때, 또는 NDC와 AD를 비교하여 AD를 구별하는 정답률이, 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상일 때, MCI 또는 AD를 구별하고 이들을 검출하기 위한 바이오 마커로서 선택하는 것이 바람직하다.

또한 상기 (i)의 전에, 피험자의 생체시료 중의 인지기능장애질환에 관한 단백질 또는 그 부분 펩티드를, ROC 곡선에 의한 분석에 의거하여 AUC가 높은 것을 인지기능장애질환 검출용의 바이오 마커로서 선정할 수 있다. AUC가 0.6 이상이 되는 단백질 또는 그 부분 펩티드를 인지기능장애질환 검출용의 바이오 마커로 하는 것이 유익하다.

또 ROC 곡선 및 로지스틱 회귀곡선은, 다음에 설명하는 실시예에 기재되어 있는 것과 같다.

이에 따라 최적의 바이오 마커의 조합을 선출할 수 있고, 그렇게 함으로써 인지기능장애질환의 검출 또는 진단 등의 정답률이 높아지게 된다. 따라서 선정된 복수의 바이오 마커를 측정함으로써, 더 객관적이고 더 정밀도가 좋은 인지기능장애질환을 검출, 진단 등을 하는 것이 가능하게 된다.

이 조합 중에서 상기 (b)바이오 마커 및 상기 (c)바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하고, 이들 측정결과에 의거하여 인지기능장애질환의 검출, 진단 등에 사용할 수 있는 것이 가장 정답률이 높기 때문에 바람직하다.

본 기술의 방법은, CPU 등을 포함하는 제어부 및 기억매체(USB 메모리, HDD, CD, DVD 등)를 구비하는 하드웨어 자원에 프로그램으로서 저장하고, 검사장치나 선정장치(選定裝置) 등의 제어부에 의하여 실행되는 것이 가능하다.

본 기술은, 상기 (a)∼(c)에 기재되어 있는 바이오 마커를 사용하는 인지기능장애질환의 검출키트(detection kit)로서도 이용할 수 있다.

본 기술은, 상기 (a)바이오 마커(ApoA1), 상기 (b)바이오 마커(TTR) 및 (c)바이오 마커(C3)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 측정하기 위한 인지기능장애질환의 검출키트로 할 수 있다.

이 중에서 (c)바이오 마커(C3)와, 상기 (a)바이오 마커(ApoA1) 또는 (b)바이오 마커(TTR)를 조합시킨 검출키트가 바람직하다.

또한 본 기술의 검출키트는, 이들을 동시에 또는 각각 검출할 수 있도록, 상기 (a)∼(c)에 기재되어 있는 바이오 마커를 검출할 수 있는 시약(試藥) 모두를 함께 포함하는 1액형(1液型)의 인지기능장애용 검출키트로 하더라도 좋고, 또는 각 바이오 마커를 검출할 수 있는 시약을 각각의 용기에 존재시킨 복수(2 또는 3 이상의)의 검출키트를 구비하는 인지기능장애질환용 검출키트로 하더라도 좋다.

또한 이 검출키트에는, 본 기술의 각 바이오 마커에 대한 항체 또는 압타머를 포함하는 것이 바람직하다.

본 기술의 인지기능장애질환의 검출방법으로서, 생체시료 중의, 상기 (a)바이오 마커, 상기 (b)바이오 마커 및 상기 (c)바이오 마커로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 것이 바람직하다.

본 기술의 인지기능장애질환의 검출방법으로서, (i)피험자의 생체시료 중의, 상기 (a)바이오 마커, 상기 (b)바이오 마커 및 상기 (c)바이오 마커로부터 선택되는 2종 또는 3종의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 것, (ⅱ)적어도 2종 이상의 바이오 마커의 측정결과가 인지기능장애질환으로 분류되는 경우에 피험자를 인지기능장애질환이라고 판정하는 것을 포함하는 것이, 더 바람직하다.

본 기술은, 이하의 구성을 채용할 수도 있다.

즉 본 기술은 이하와 같다.

[1]다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.

[2]생체시료 중의, 다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 인지기능장애질환의 검출방법.

[3]이하의 (i) 및 (ⅱ)를 포함한, 상기 [2]에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법.

(i)피험자의 생체시료 중의, 다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 2종 또는 3종의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 것.

(ⅱ)적어도 2종 이상의 바이오 마커의 측정결과가 인지기능장애질환으로 분류되는 경우에 피험자를 인지기능장애질환이라고 판정하는 것.

[4]상기 (c)바이오 마커와, 상기 (a)바이오 마커 또는 상기 (b)바이오 마커의 2종을 측정하는, 상기 [2] 또는 [3]에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법.

[5]상기 인지기능장애질환의 검출이 경도의 인지장애의 검출인 경우에, 상기 (c)바이오 마커 및 상기 (a)바이오 마커의 2종을 측정하는, 상기 [2]∼[4] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법.

[6]상기 인지기능장애질환의 검출이 알츠하이머병의 검출인 경우에, 상기 (c)바이오 마커 및 상기 (b)바이오 마커의 2종을 측정하는, 상기 [2]∼[4] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법.

[7]이뮤노·블로팅법 ; 웨스턴·블로팅법 ; 효소 또는 형광 또는 방사성물질의 표지법 ; 질량분석법 ; immunoMS법 ; 표면 플라즈몬 공명법 중에서 어느 하나 이상의 방법에 의하여 측정하는, 상기 [2]∼[6] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법.

[8]다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 측정하기 위한 인지기능장애질환의 검출키트.

[9]상기 바이오 마커에 대한 항체 또는 압타머를 포함하는, 상기 [8]에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출키트.

[10]상기 항체 또는 압타머가 기판 위에 고상화되어 있는, 상기 [8] 또는 [9]에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출키트.

[11]상기 (c)바이오 마커와, 상기 (a)바이오 마커 또는 상기 (b)바이오 마커의 2종을 구비하는, 상기 [8]∼[10] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출키트.

[12]상기 인지기능장애질환의 검출이 경도의 인지장애의 검출인 경우에, 상기 (c)바이오 마커 및 상기 (a)바이오 마커의 2종을 구비하는, 상기 [8]∼[11] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출키트.

[13]상기 인지기능장애질환의 검출이 알츠하이머병의 검출인 경우에, 상기 (c)바이오 마커 및 상기 (b)바이오 마커의 2종을 구비하는, 상기 [8]∼[11] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출키트.

상기 검출키트는 1액형이더라도 다액형이더라도 좋다.

[14]상기 [2]∼[7] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법을 실시하기 위한 인지기능장애질환의 검출키트.

[15]상기 [8]∼[13] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출키트를 사용하는, 상기 [2]∼[7] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 검출방법.

[16]피험자의 생체시료 중에 있어서의 인지기능장애질환의 2종 이상의 바이오 마커를 각각 측정하는 것 ; 상기 2종 이상의 바이오 마커의 각각의 측정결과를 로지스틱 회귀분석에 의하여 해석하는 것 ; 상기 해석결과에 의거하여 인지기능장애질환의 정답률이 높은 바이오 마커의 조합을 선정하는 것을 포함한, 정답률이 높은 복수의 인지기능장애질환 검출용 바이오 마커의 조합선정방법.

[17]멀티플렉스 이뮤노어세이법(multiplex immunoassay method)에 의하여 2종 이상의 단백질의 측정을 하는 것,

그 중에서 MCI(경도인지기능장애) 대 NDC(비인지기능장애), AD(알츠하이머병) 대 NDC(비인지기능장애)의 비교에 있어서의 ROC 곡선을 작성하고, AUC가 0.6 이상을 나타내는 단백질을 인지기능장애질환 바이오 마커로 선정하는 것을 포함하는, 상기 [16]에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 바이오 마커의 조합선정방법.

[18]NDC와 MCI를 비교하여 MCI를 구별하는 정답률이 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상인, 및/또는 NDC와 AD를 비교하여 AD를 구별하는 정답률이 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상인, 상기 [16] 또는 [17]에 기재되어 있는 인지기능장애질환의 바이오 마커의 조합선정방법.

[19]컴퓨터를, 상기 [16]∼[18] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 방법으로 실행시키기 위한, 인지기능장애질환의 바이오 마커의 조합선정 프로그램 또는 당해 프로그램을 저장하는 제어부 또는 컴퓨터.

[20]컴퓨터를, 상기 [16]∼[18] 중에서 어느 하나의 항에 기재되어 있는 방법으로 실행시키기 위하여, 기억매체상에 기억된 인지기능장애질환의 바이오 마커의 조합선정 프로그램 또는 당해 프로그램을 저장하는 제어부 또는 컴퓨터.

[21]상기 바이오 마커가, 배열번호1로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드, 배열번호2로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 및 배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드로부터 선택되는 1종 이상인, 상기 [1]∼[18] 중의 어느 하나의 바이오 마커, 검출방법, 검출키트 또는 조합선정방법.

[22]상기 부분 펩티드가, 인택트 단백질의 부분 펩티드 또는 당해 단백질 또는 펩티드로부터 발생하는 아미노산 잔기 5개 이상의 펩티드 단편인, 상기 [1]∼[18] 중의 어느 하나의 바이오 마커, 검출방법, 검출키트 또는 조합선정방법.

이하에서는 구체적인 실시예 등을 설명하지만, 본 발명(본 기술)은 이것에 한정되는 것은 아니다.

실시예

시험예1

<멀티플렉스 이뮤노어세이법에 의한 인지기능장애질환 마커의 검출>

알츠하이머병을 포함하는 신경변성질환(神經變性疾患)에 관한 마커 단백질 중에서 보체계(補體系)의 Complement C3, Complement C4, Complement factor H, 뇌 아밀로이드증(cerebral amyloidosis)의 원인인 Aβ섬유(Aβfiber) 형성의 억제에 관한 Transthyretin, Alpha-2-macroglobulin을 마커로 하고, 피험자로부터 채취한 생체시료를 이뮤노어세이법에 제공하여 마커의 유무 또는 양을 지표로 인지기능장애질환을 검출한다.

검출방법으로서, 생체시료로부터 복수의 마커(애너라이트(analyte))를 동시에 검출하는 멀티플렉스 이뮤노어세이법을 사용하였다.

(1)혈청시료

이하, 괄호 앞은 약칭이다.

AD(알츠하이머병) 37 케이스, NDC(정신질환에 이환되지 않은 피험자) 22 케이스 및 MCI(경도인지기능장애) 39 케이스로부터 얻어진 혈청을 사용하였다.

(2)방법

Apolipoprotein E(ApoE), Apolipoprotein A1(ApoA1), Complement C3(C3), Transthyretin(TTR), Complement Factor H(Factor H), Alpha-2-macroglobulin(Alpha-2-M)은 MILLIPLEX^TM 멀티플렉스 키트(HNDG1-36K, 머크 밀리포아 주식회사(Merck Millipore Corporation))를 사용하여 측정하였다. Complement C4(C4)는 MILLIPLEX^TM 멀티플렉스 키트(HNDG2-36K, 머크 밀리포아 주식회사)를 사용하여 측정하였다.

(2-1)혈청샘플의 조제(調製)

(ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M 측정용 혈청샘플)

혈청샘플을 40,000배 희석한 것을 사용하였다. 즉 혈청 5㎕를 1.5㎖의 튜브에 부가하고, 어세이 버퍼(assay buffer)를 995㎕ 부가하여 천천히(gently) 교반(攪拌)하였다. 이 희석액 5㎕를 다른 튜브에 집어넣고, 어세이 버퍼를 995㎕ 부가하여 천천히 교반하였다. 이것을 어세이 샘플(assay sample)로 하였다.

(C4 측정용 혈청샘플)

혈청샘플을 2,000배 희석한 것을 사용하였다. 즉 혈청 5㎕를 1.5㎖ 튜브에 부가하고, 어세이 버퍼를 495㎕ 부가하여 천천히 교반하였다. 이 희석액 10㎕를 다른 튜브에 집어넣고, 어세이 버퍼를 190㎕ 부가하여 천천히 교반하였다. 이것을 어세이 샘플로 하였다.

(2-2)비드 희석액(diluted bead solution)의 조제

검출대상의 단백질을 인식하는 항체가 결합된 비드를 혼합·희석하여 비드 희석액을 조제하였다.

(ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M 측정용 비드 희석액)

믹싱용(mixing用)의 병에 희석용 비드(bead diluent)를 2,100㎕ 부가하고, 각 항체가 결합된 비드 현탁액(beed 懸濁液) 6종류를 각각 150㎕ 더 부가하여 교반하였다. 이것을 비드 희석액으로 하였다.

(C4 측정용 비드 희석액)

믹싱용의 병에 희석용 비드를 2,850㎕ 부가하고, C4 항체가 결합된 비드 현탁액을 150㎕ 부가하여 교반하였다. 이것을 비드 희석액으로 하였다.

(2-3)QC 샘플의 조제

품질관리(quality control)용 단백질이 봉입(封入)되어 있는 병에 순수(純水)를 250㎕ 부가하고, 천천히 교반한 후에 5∼10분간 정치(靜置)하였다. 이것을 QC 샘플로 하였다.

(2-4)스탠다드 샘플(standard sample)의 조제

정량용 표준곡선 작성용의 스탠다드 샘플은 6단계의 단계희석에 의하여 제작하였다. 즉 스탠다드 단백질이 들어 있는 병에 250㎕의 순수를 부가하고 천천히 교반한 후에 5∼10분간 정치하고, 이것을 최고 농도의 스탠다드 용액으로 하였다. 이것을 50㎕를 다른 튜브에 집어넣고, 어세이 버퍼 150㎕를 부가하여 교반하였다. 또한 희석된 용액 50㎕를 다른 튜브에 집어넣고, 어세이 버퍼 150㎕를 부가하여 교반하였다. 이것을 합계 6회 반복하였다. 희석의 계열은 1, 4, 16, 64, 256, 1024, 4096배이다.

(2-5)항원항체반응

ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M을 측정하는 어세이용 96웰 필터 플레이트(assay用 96well filter plate)와, C4를 측정하는 어세이용 96웰 필터 플레이트를 각각 준비하여 항원항체반응을 하였다.

어세이용 96웰 필터 플레이트에 200㎕의 워시 버퍼(wash buffer)를 부가하고, 플레이트 쉐이커(plate shaker)(M·BR-022, 타이테크 주식회사(TAITEC Corporation))를 사용하여 1,200rpm에서 10분간, 실온(室溫)에서 교반하였다. 그 후에 매니폴드(manifold)를 사용하여 워시 버퍼를 흡인제거(吸引除去)하였다. 사용한 모든 웰(well)에 어세이 버퍼를 25㎕를 부가하고, 비드 희석액을 25㎕ 더 부가하였다. 계속하여 어세이 샘플용 웰, 스탠다드 샘플용 웰, QC 샘플용 웰, 백그라운드 측정용 웰에 각각의 샘플을 25㎕를 부가하였다. 백그라운드 측정용 웰(background measurement well)에는 어세이 버퍼를 부가하였다. 플레이트를 실링(sealing)을 한 후에 플레이트 쉐이커에 의하여 항원항체반응을 하였다. ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M 측정용 플레이트는 2시간, 실온에서 항원항체반응을 하였다. C4 측정용 플레이트는 16시간, 4℃에서 항원항체반응을 하였다.

(2-6)세정 및 측정

항원항체반응 후에 용액을 흡인제거하고, 워시 버퍼를 200㎕ 더 부가하여 흡인제거를 3회 반복하여 비드를 세정하였다. 세정 후에, 검출항체(detection antibodie) 25㎕를 사용한 웰 모두에 25㎕ 부가하여 플레이트를 실링하고, 플레이트 쉐이커에 의하여 1시간, 실온에서 교반하여 2차항체반응을 하였다. 반응 후에 스트렙타아비딘-피코에리트린(streptavidin-phycoerythrin)을 25㎕ 부가하여 실링하고, 플레이트 쉐이커에 의하여 30분간, 실온에서 교반하였다. 반응 후에 용액을 흡인제거하고, 워시 버퍼를 200㎕ 더 부가하여 흡인제거를 3회 반복하여 비드를 세정하였다. 100㎕의 시스 플루이드(sheath fluid)를 각 웰에 부가하고 5분간 실온에서 교반한 후에 Luminex 200^TM(미국의 루미넥스 주식회사(Luminex Corp., USA))에 의하여 형광측정(螢光測定)을 하였다. 혈청샘플 중의 마커의 정량해석은, xPONENT 3.1 소프트웨어(미국의 루미넥스 주식회사)를 사용하여 스탠다드 샘플로부터 구해진 표준곡선의 수식을 사용하여 정량하였다.

(3)결과

검출한 마커 단백질이 NDC군, MCI군, AD군에서 혈청 중의 존재량에 차이가 있는지 차이해석을 하였다. 표1은 각 증례군(症例群)을 대응표본 t-검정(paired t-test)에 의하여 검정하여, 유의수준(有意水準)을 p < 0.05로 하였을 때의 p값을 나타낸 표이다. Complement C3(C3)은 NDC 대 MCI, NDC 대 AD, MCI 대 AD의 어느 것에서도 유의한 차이가 보여서, 인지기능장애질환(MCI, AD) 환자를 비인지기능장애(NDC) 환자와 구별하는 것에 유용한 것을 알았다. 또한 Apolipoprotein A1(ApoA1), Transthyretin(TTR)은 AD환자를 NDC와 구별하는 것에 유용한 것을 알았다. Apolipoprotein E(ApoE), Complement factor H(Factor H), Alpha-2-macroglobulin(Alpha-2-M), Complement C4(C4)는 어느 것의 질환군과도 유의한 차이를 나타내지 않았다.

검출한 마커 단백질이 어느 정도로 유용할지를 평가하기 위하여 수신자 조작 특성곡선(receiver operating characteristic curve, ROC 곡선)에 의한 분석을 하였다. ROC 곡선의 하부의 면적값(AUC of ROC)(이하, AUC라고 한다)이 1에 가까울수록 바이오 마커로서의 유용성이 높아지게 된다. MCI 대 NDC, AD 대 NDC의 비교에 있어서의 ROC 곡선을 작성하고, AUC가 0.6 이상을 나타내는 마커 단백질을 해석한 바, C3, ApoA1, TTR이 AUC가 0.6 이상을 나타내는 마커이었다. 표2에 C3, ApoA1, TTR에 있어서의 NDC 대 MCI, NDC 대 AD의 AUC를 나타내었다.

도1, 도2, 도3은, C3, ApoA1, TTR의 3개의 마커 단백질에 대하여 차이해석과 ROC 곡선을 나타내고 있다. 도1의 A)는 차이해석의 도면으로서, NDC와 MCI를 비교하면 MCI에서 C3은 유의적(有意的)으로 감소하고 있고(t검정, p값 0.034), NDC와 AD를 비교하면 AD에서 C3은 유의적으로 감소하고 있다(t검정, p값 1.668E-5). 또한 MCI와 AD를 비교하면 AD에서 C3은 유의적으로 감소하고 있다(t검정, p값 0.01). 도1의 B) 및 C)는 NDC 대 MCI, NDC 대 AD를 비교하였을 때의 ROC 곡선이다. NDC와 MCI를 비교하였을 때의 AUC는 0.663, NDC와 AD를 비교하였을 때의 AUC는 0.834이었다. 도2의 A)는 ApoA1의 차이해석의 도면으로서, NDC와 AD를 비교하면 AD에서 C3은 유의적으로 감소하고 있다(t검정, p값 0.049). 도2의 B) 및 C)는 NDC 대 MCI, NDC 대 AD를 비교하였을 때의 ROC 곡선이다. NDC와 MCI를 비교하였을 때의 AUC는 0.649, NDC와 AD를 비교하였을 때의 AUC는 0.673이었다. 도3의 A)는 TTR의 차이해석의 도면으로서, NDC와 AD를 비교하면 AD에서 C3은 유의적으로 감소하고 있다(t검정, p값 5.811E-4). 도3의 B) 및 C)는 NDC 대 MCI, NDC 대 AD를 비교하였을 때의 ROC 곡선이다. NDC와 MCI를 비교하였을 때의 AUC는 0.677, NDC와 AD를 비교하였을 때의 AUC는 0.730이었다.

이들 C3, ApoA1, TTR의 3개의 마커 단백질에 관하여, NDC에 대하여 MCI, AD를 더 정밀도 좋게 구별하는 조합을 해석하기 위하여 시험예2를 하였다.

[표1]

[표2]

[1]Apolipoprotein A1에서 유래된 펩티드(ApoA1)(배열번호1)

[인택트 단백질/펩티드]

0001 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG

0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE

0101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL

0151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA

0201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK

0251 VSFLSALEEY TKKLNTQ

[2]Transthyretin에서 유래된 펩티드(TTR)(배열번호2)

[인택트 단백질/펩티드]

0001 MASHRLLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV

0051 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK

0101 ALGISPFHEH AEVVFTANDS GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE

[3]Complement C3에서 유래된 펩티드(C3)(배열번호3)

[인택트 단백질/펩티드]

0001 MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ

0051 GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK

0101 GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF

0151 TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN

0201 MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG

0251 LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV

0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT

0351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL

0401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG

0451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL

0501 LKAGRQVREP GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS

0551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK

0601 GVFVLNKKNK LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS

0651 GQQTAQRAEL QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE

0701 NPMRFSCQRR TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN

0751 LDEDIIAEEN IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT

0801 TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV

0851 LYNYRQNQEL KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI

0901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE

0951 RLGREGVQKE DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL

1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK

1051 KGYTQQLAFR QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL

1101 CGAVKWLILE KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS

1151 LQEAKDICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG

1201 RLKGPLLNKF LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP

1251 PVVRWLNEQR YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL

1301 PSRSSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA

1351 KAKDQLTCNK FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM

1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK

1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG

1501 KLNKLCRDEL CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV

1551 KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK

1601 HYLMWGLSSD FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG

1651 AFTESMVVFG CPN

시험예2

<로지스틱 회귀분석을 사용한 멀티 마커에 의한 MCI, AD의 구별>

(1)로지스틱 회귀분석의 원리

이 방법은 바이오 마커에 대응하는 각 파라메타의 계수를 데이터 세트로부터 얻어서, 2개의 질환 카테고리(정상, 질환)에 있어서의 환자마다의 판정확률을 부여할 수 있다. 로지스틱 회귀에 관한 비교적 자세한 해설은 이하로부터 얻을 수 있다(비특허문헌3 : Czepiel,SA,http://czep.net/stat/mlelr.pdf,2010,Maximum likelihood estimation of logistic regression models:theory and implementation.). 이 해설에는 뉴턴 랩슨법(Newton-Raphson method)에 의한 분석법이 포함되어 있다.

이 해석방법의 원리는 이하와 같다. 어떤 현상의 발생확률을 P라고 하였을 때에,

식1

은 누적 표준정규분포에 근사할 수 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌4 : Bowling, SR, et al. JIEM, 2009, 2: 114-127, A logistic approximation to the cumulative normal distribution). 로지스틱 회귀는 이 근사를 이용하여 통계해석을 한다. 아래와 같이 Z는 다변량(多變量) x_i ; i = 1, 2, … r의 선형결합으로서 나타내어진다.

식2

다수의 데이터를 식(1) 및 식(2)에 적용하여 계수(coefficient)β_i를 구하고, 그 유의성(有意性)(β_i가 제로(zero)는 아닐 것)을 통계학적 p값으로부터 판정한다.

식(2)의 최종화법(最終化法)으로서 이하의 2종류가 있다.

(I)계수의 통계적 유의성에 의한 방법

유의하지 않은 계수가 발견된 경우에는, 이것을 제외하고 식(2)를 만들고, 마찬가지로 적용하는 것을 반복한다. 이렇게 하여 식(2)의 계수가 모두 유의하게 되면, x_i의 실측치를 대입하여 (2)로부터 Z값을 구한다. 계속하여 식(1)로부터 P(판정확률)의 값을 구할 수 있다. 또 계수β_i에 대해서는 그 표준오차(standard error)를 산출할 수 있다.

(Ⅱ)최대 정답률을 부여하는 계수의 조합을 구하는 방법

정답률이라는 것은 원래 속하는 군에 속하면 올바르다고 판정된 비율을 말하지만, 이 방법에 의해서는, 통계적 유의성이 인정되지 않은 계수를 포함하는 모든 계수를 대상으로 시행착오(trial and error)에 의하여 최대 정답률을 부여하는 계수의 조합을 구한다. 판정확률은 (I)과 마찬가지로 구한다.

로지스틱 회귀의 정답률을 이하의 식(3)에 의하여 정의한다. 판별은 피험자의 2개의 카테고리(예를 들면 NDC와 MCI) 중 어느 쪽에 속하는가를 로지스틱 회귀식으로부터 추정함으로써 이루어진다. 피험자의 카테고리를 i(예를 들면 MCI)로 하고, 로지스틱 회귀식으로부터 얻어진 판정확률이 0.5 이상일 때에 i라고 올바르게 진단되었다고 간주한다. 카테고리(i)의 총피험자수를 N_i, 올바르게 i라고 진단된 피험자수를 C_i로 하여,

식3

이라고 정답률이 나타내어진다.

로지스틱 회귀에 있어서 변량(x_i)에 대한 오즈비(odds ratio)라는 것은 x_i를 1단위 증가시켰을 경우의 오즈를 원래의 오즈로 나눈 값이지만, 이것은 exp(β_i)와 같다. 오즈비가 1이라는 것은, x_i를 1단위 증가시키더라도 원래와 같은 오즈이기 때문에, 지금 생각하고 있는 현상이 일어날 확률에 변화가 없는 것을 의미한다. 즉 이 경우 β_i는 0이며, Z에 기여하지 않고 있는 것을 나타낸다. 오즈비의 95% 신뢰구간이 1을 포함하는 경우에도 통계학적으로 그 β_i는 유의하지 않은 것으로 된다. 또 당연하지만 exp(0) = 1이다.

(2)로지스틱 회귀분석

시험예1에 있어서, 멀티플렉스 이뮤노어세이법에 의하여 측정한 단백질 Apolipoprotein E(ApoE), Apolipoprotein A1(ApoA1), Complement C3(C3), Transthyretin(TTR), Complement Factor H(Factor H), Alpha-2-macroglobulin(Alpha-2-M), Complement C4(C4) 중 NDC 대 MCI, NDC 대 AD의 2군 유의차 검정(two-group significance test)(t검정)에서 유의한 차이가 보이고 또한 ROC 곡선의 AUC가 0.6 이상을 나타낸 3개의 단백질 C3, ApoA1, TTR을 선택하여, 로지스틱 회귀분석을 하였다. 로지스틱 회귀분석에 의한 해석은 시행착오에 의하여 마커 단백질의 가제(加除)를 하고, 정답률이 가장 높은 결과를 얻은 마커 단백질의 조합을 구하고, 이 조합에 의한 로지스틱 회귀식(2)의 계수(coefficient, β_i)를 산출하여 하였다.

로지스틱 회귀분석은 MedCalc for Windows(등록상표), version 9,2007,(MedCalc Software사)을 사용하여 실행하였다. 이 프로그램은 뉴턴 랩슨법에 의하고 있다.

(3)결과 : MCI라고 구별하고, 정답률이 가장 높은 결과를 얻은 마커 단백질의 조합과 로지스틱 회귀식의 계수

마커 단백질 3종의 조합과 그 조합의 데이터를 사용하여 로지스틱 회귀를 하고, 산출된 통계학적 p값의 표를 표3에 나타낸다. 조합에 사용한 마커 단백질은 (○)으로 나타내고, 사용하지 않은 것은 (-)로 나타내었다.

[표3]

통계학적 p값이 p > 0.05인 경우에 로지스틱 회귀식의 계수는 유의성이 인정되지 않는다. 그래서 표3의 No.2, 4, 6, 7은 계수산출로부터 제외하였다. 표3의 No.1, 3, 5의 조합 중에서 가장 정답률이 높은 결과를 얻은 마커 단백질의 조합과 로지스틱 회귀식의 계수(Coefficient)를 표5에 나타내었다. 가장 정답률이 높은 결과를 얻은 조합의 마커 단백질은 Complement C3(C3)과 Apolipoprotein A1(ApoA1)이며, 이 때의 로지스틱 회귀식의 계수는, C3이 -0.02567, ApoA1이 -0.001653, 정수(定數)가 4.6667이었다. NDC와 MCI를 비교하여 MCI를 구별하는 정답률은 89.74%이며, NDC의 정답률은 50%이었다.

(4)결과 : AD라고 구별하고, 정답률이 가장 높은 결과를 얻은 마커 단백질의 조합과 로지스틱 회귀식의 계수

마커 단백질 3종의 조합과 그 조합의 데이터를 사용하여 로지스틱 회귀를 하고, 산출된 통계학적 p값의 표를 표4에 나타낸다. 조합에 사용한 마커 단백질은 (○)로 나타내고, 사용하지 않은 것은 (-)로 나타내었다.

[표4]

통계학적 p값이 p > 0.05인 경우에 로지스틱 회귀식의 계수는 유의하지 않다. 그 때문에 표4의 No.4, 5, 6, 7은 계수산출로부터 제외하였다. 표4의 No.1, 2, 3의 조합 중에서 가장 정답률이 높은 결과를 얻은 마커 단백질의 조합과 로지스틱 회귀식의 계수(Coefficient)를 표6에 나타내었다. 가장 정답률이 높은 결과를 얻은 조합의 마커 단백질은 Complement C3(C3)과 Transthyretin(TTR)이며, 이 때의 로지스틱 회귀식의 계수는, C3이 -0.0465, TTR가 -0.00564, 정수가 4.5218이었다. NDC와 AD를 비교하여 AD를 구별하는 정답률은 91.89%이며, NDC의 정답률은 68.18%이었다.

[표5]

[표6]

본 개시의 바이오 마커를 복수 사용하면, 경도인지기능장애 및 알츠하이머병을 포함하는 인지기능장애질환의 검출 정밀도가 높아지게 되어, 진단약을 포함하는 진단분야에서의 용도에 적용할 수 있다.

<110> MCBI Inc. University of Tsukuba <120> BIOMARKERS FOR COGNITIVE DYSFUNCTION DISEASES AND METHOD FOR DETECTING COGNITIVE DYSFUNCTION DISEASE USING BIOMARKERS <130> FPCT332 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 2 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe 1 5 10 15 Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu 20 25 30 Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val 35 40 45 Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe 50 55 60 Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr 65 70 75 80 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu 100 105 110 Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala 115 120 125 Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn 130 135 140 Pro Lys Glu 145 <210> 3 <211> 1663 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Pro Thr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr His 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn 20 25 30 Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp 35 40 45 Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly 50 55 60 Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr 65 70 75 80 Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe 85 90 95 Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe 100 105 110 Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly 115 120 125 Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr 130 135 140 Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly 145 150 155 160 Arg Thr Val Met Val Asn Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys 165 170 175 Gln Asp Ser Leu Ser Ser Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser 180 185 190 Trp Asp Ile Pro Glu Leu Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala 195 200 205 Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val 210 215 220 Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu 225 230 235 240 Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr 245 250 255 Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Gln Asp Gly Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu 275 280 285 Lys Arg Ile Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg 290 295 300 Lys Val Leu Leu Asp Gly Val Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val 305 310 315 320 Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser 325 330 335 Asp Met Val Gln Ala Glu Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro 340 345 350 Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met 355 360 365 Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala 370 375 380 Tyr Arg Val Pro Val Ala Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu 385 390 395 400 Thr Gln Gly Asp Gly Val Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser 405 410 415 Gln Lys Pro Leu Ser Ile Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Glu Gln Ala Thr Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr 435 440 445 Val Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu 450 455 460 Leu Arg Pro Gly Glu Thr Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp 465 470 475 480 Arg Ala His Glu Ala Lys Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn 485 490 495 Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln 500 505 510 Asp Leu Val Val Leu Pro Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser 515 520 525 Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg 530 535 540 Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val 545 550 555 560 Gly Ser Leu Val Val Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val 565 570 575 Pro Gly Gln Gln Met Thr Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg 580 585 590 Val Val Leu Val Ala Val Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys 595 600 605 Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp 610 615 620 Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser 625 630 635 640 Asp Ala Gly Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln 645 650 655 Arg Ala Glu Leu Gln Cys Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser 660 665 670 Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys 675 680 685 Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg 690 695 700 Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys 705 710 715 720 Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg 725 730 735 Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp 740 745 750 Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro 755 760 765 Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn 770 775 780 Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr 785 790 795 800 Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys 805 810 815 Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp 820 825 830 Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg 835 840 845 Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val 850 855 860 Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg 865 870 875 880 Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val 885 890 895 Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val 900 905 910 Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser 915 920 925 Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val 930 935 940 Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu 945 950 955 960 Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser 965 970 975 Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu 980 985 990 Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser 995 1000 1005 Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala 1010 1015 1020 Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu 1025 1030 1035 1040 Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln 1045 1050 1055 Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg 1060 1065 1070 Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu 1075 1080 1085 Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val 1090 1095 1100 Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu 1105 1110 1115 1120 Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn 1125 1130 1135 Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln 1140 1145 1150 Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser 1155 1160 1165 Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln 1170 1175 1180 Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly 1185 1190 1195 1200 Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp 1205 1210 1215 Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala 1220 1225 1230 Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe 1235 1240 1245 Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly 1250 1255 1260 Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn Leu Asp Val 1285 1290 1295 Ser Leu Gln Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr His Arg Ile His 1300 1305 1310 Trp Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu 1315 1320 1325 Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly Gln Gly Thr Leu Ser Val 1330 1335 1340 Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu Thr Cys Asn Lys 1345 1350 1355 1360 Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu Thr Glu Lys Arg 1365 1370 1375 Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr Arg Tyr 1380 1385 1390 Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met 1395 1400 1405 Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly 1410 1415 1420 Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Ala Phe Ser Asp 1425 1430 1435 1440 Arg Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser His Ser Glu Asp 1445 1450 1455 Asp Cys Leu Ala Phe Lys Val His Gln Tyr Phe Asn Val Glu Leu Ile 1460 1465 1470 Gln Pro Gly Ala Val Lys Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser 1475 1480 1485 Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu Lys Glu Asp Gly Lys Leu Asn Lys 1490 1495 1500 Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu Asn Cys Phe Ile 1505 1510 1515 1520 Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Ala 1525 1530 1535 Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg Leu Val Lys Val 1540 1545 1550 Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile Glu Gln Thr 1555 1560 1565 Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg Thr Phe 1570 1575 1580 Ile Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys 1585 1590 1595 1600 His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro 1605 1610 1615 Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly Lys Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro 1620 1625 1630 Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln Cys Gln Asp 1635 1640 1645 Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met Val Val Phe Gly Cys Pro Asn 1650 1655 1660

Claims

다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환(認知機能障碍疾患)을 검출하기 위한 바이오 마커(biomarker).
(a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열(amino acid 配列)을 포함하는 Apolipoprotein A1의 인택트 단백질(intact protein) 또는 이 부분 펩티드(partial peptide)로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
(b)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
(c)배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Complement C3의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
생체시료(生體試料) 중의, 다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 동시에 또는 각각 측정하는 인지기능장애질환의 검출방법.
(a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Apolipoprotein A1의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
(b)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
(c)배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Complement C3의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
제2항에 있어서,
상기 (c)바이오 마커와,
상기 (a)바이오 마커 또는 상기 (b)바이오 마커와의 2종을 측정하는
인지기능장애질환의 검출방법.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 인지기능장애질환의 검출이 경도(輕度)의 인지장애의 검출인 경우에, 상기 (c)바이오 마커 및 상기 (a)바이오 마커의 2종을 측정하거나 또는
상기 인지기능장애질환의 검출이 알츠하이머병(Alzheimer disease)의 검출인 경우에, 상기 (c)바이오 마커 및 상기 (b)바이오 마커의 2종을 측정하는
인지기능장애질환의 검출방법.
다음의 (a), (b) 및 (c)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커를 측정하기 위한 인지기능장애질환의 검출키트(檢出kit).
(a)배열번호1로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Apolipoprotein A1의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
(b)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Transthyretin의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
(c)배열번호3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 Complement C3의 인택트 단백질 또는 이 부분 펩티드로 이루어지는 인지기능장애질환을 검출하기 위한 바이오 마커.
제5항에 있어서,
상기 바이오 마커에 대한 항체(抗體) 또는 압타머(aptamer)를 포함하는 인지기능장애질환의 검출키트.
피험자(被驗者)의 생체시료 중의 인지기능장애질환의 2종 이상의 바이오 마커를 각각 측정하는 것,
상기 2종 이상의 바이오 마커의 각각의 측정결과를 로지스틱 회귀분석(logistic 回歸分析)에 의하여 해석하는 것,
상기 해석결과에 의거하여 인지기능장애질환의 정답률이 높은 바이오 마커의 조합을 선정하는 것을
포함하는, 정답률이 높은 복수의 인지기능장애질환 검출용 바이오 마커의 조합선정방법.