KR20200029530A - 질환 검출 방법 - Google Patents

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다이스케 가와카미
도시야 마츠바라
가즈히코 우치다
코지 메노
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가부시키가이샤 엠씨비아이
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Abstract

본 발명은 LC-MS를 이용하여 생체 시료에 포함되는 바이오 마커로서의 펩타이드의 양을 측정하고, 그 결과에 근거하여, 특정 질환을 검출하는 방법이며, LC-MS를 이용한 측정 전에 수행되는 전처리 공정이, 생체 시료에, 펩타이드를 안정 동위체로 표지한 안정 동위체 시약과 트리플루오로아세트산을 첨가하여 혼합 시료액을 조제하는 공정, 혼합 시료액을 비등시키는 공정, 비등된 혼합 시료액을 고상 추출 컬럼에 주입하여 펩타이드를 당해 고상 추출 컬럼에 유지시키는 공정, 고상 추출 컬럼에 수용성 유기용매를 흘려서 당해 고상 추출 컬럼에 유지된 펩타이드를 용출하는 공정을 구비한다.

Description

질환 검출 방법
본 발명은, 혈액이나 뇨 등의 생체 시료에 포함되는 특정 성분의 양의 측정치에 근거하여 특정 질환을 검출하는 방법에 관한 것이고, 특히 인지 기능 장애 질환의 검출 방법에 관한 것이다.
특정 질환에 이환(罹患)하고 있는 사람으로부터 채취한 혈액이나 뇨 등의 생체 시료에 존재하고, 그 이외의 사람으로부터 채취한 생체 시료에는 전혀, 또는 거의 존재하지 않는 물질은, 그 질환에 이환하고 있음을 나타내는 바이오 마커가 될 수 있다. 여기서, 생체 시료에 포함되는 바이오 마커가 되는 물질의 양을 측정하고, 그 결과로부터 여러가지 질환을 진단하는 것이 수행되고 있다. 종래, 생체 시료 중의 바이오 마커의 측정에는, 체외 진단약이 이용되어 왔다.
체외 진단약을 이용한 바이오 마커의 측정 방법의 하나로, 생체 시료를 그대로, 또는 미리 희석해 두고, 거기에 포함되는 특정 단백질 또는 펩타이드를 항원항체 반응을 이용하여 측정하는 방법이 있다. 예를 들면 효소 결합 면역 흡착 측정법(ELISA) 및 화학 발광 측정법(CLIA)은, 시료 중의 특정 단백질 또는 펩타이드를, 기질과 반응하면 발색하는 효소에 의해서 표지된 1차 항체 또는 2차 항체와 결합시켜, 단백질 또는 펩타이드와 결합한 항체의 발색량으로 그 양을 측정한다. 또, 방사성 면역 측정법(RIA)에서는, 1차 항체 또는 2차 항체를 방사성 동위 원소로 표지하여, 특정 단백질 또는 펩타이드와 결합한 항체의 방사선량으로 그 양을 측정한다. 추가로, 특정 단백질 등이 효소인 경우에는, 당해 단백질과 기질을 반응시켜서, 그로 인해 생기는 생성물의 양을 측정하는 효소 활성 측정법이 이용된다.
근래, 생체가 정상 상태에 있을 때는 당해 생체 내에 완전한 상태로 존재하는 단백질(이하 「인택트한 단백질」이라고 한다)이, 특정 질환에 이환한 상태(질환 상태)에 있는 생체에서는 소화 분해되어 여러가지의 소화 분해 산물 펩타이드(또는 소화 분해 산물 단백질)인 부분 펩타이드(또는 부분 단백질)를 생성하는 것, 혹은, 단백질의 번역 합성에 있어서의 스플라이싱 이상 등에 의해 부분 단백질 또는 부분 펩타이드로서 번역 합성되는 것이 밝혀지고 있다. 또, 질환 상태에 있어서, 그 질환의 진행과 함께 소화 분해, 또는 번역 합성되는 부분 단백질이나 부분 펩타이드의 종류나 양이 변동하는 것이 밝혀지고 있다. 여기서, 생체 시료 중의 인택트한 단백질의 양뿐만 아니라, 당해 인택트한 단백질과 그 부분 단백질이나 부분 펩타이드의 양이나 종류로부터 질환이나 그 진행도를 진단하는 방법이 모색되고 있다. 그런데, 상기한 항원항체 반응이나 효소와 기질의 반응을 이용한 종래의 측정 방법은 모두 단백질이나 펩타이드를 단독으로 측정하는 것이기 때문에, 인택트한 단백질과 그 부분 단백질, 부분 펩타이드를 각각 측정하는 데에는 시간이나 수고가 든다. 또, 측정 대상이 많아지면 그만큼, 피검자(질환에 이환하고 있는 사람)로부터 많은 생체 시료를 채취할 필요가 있다.
이에 대해서, 액체 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용하여, 생체 시료 중의 복수의 단백질 및 그 부분 단백질, 부분 펩타이드의 양을 망라하여 측정하고, 당해 단백질, 부분 단백질, 부분 펩타이드의 존재 패턴이나 프로파일에 근거하여 질환을 진단하는 방법이 제안되고 있다. 예를 들면 특허문헌 1에는, 정상인과 비알코올성 지방성 간질환 환자 또는 지방간과 비알코올성 지방성 간염 환자에게 존재의 유무, 존재량이 상이한 단백질 및 그 부분 펩타이드를 질량 분석 장치를 이용하여 측정한 결과로부터 비알코올성 지방성 간염을 포함하는 비알코올성 간질환을 검출하는 방법이 기재되어 있다. 또, 특허문헌 2, 3에는, 정상인과 간암 환자에게 존재의 유무, 존재량이 상이한 단백질 및 그 부분 펩타이드를 질량 분석 장치를 이용하여 측정한 결과로부터 간암을 검출하는 방법이 기재되어 있다.
일본 특개 2010-071900호 공보 일본 특개 2006-308533호 공보 일본 특개 2006-284389호 공보
질환의 진단에 이용되는 생체 시료는, 여러가지 병원이나 진료소 등의 의료 기관에서 피검자로부터 채취된 것으로, 모든 기관에서 완전히 동일한 절차, 동일한 조건, 품질로 생체 시료를 채취하는 것은 곤란하다. 그 때문에, 동일한 단백질 유래의 피크라도, 그러한 생체 시료의 채취의 절차나 조건, 품질 등의 편차에 의해서, 그 피크의 신호 강도에 차이가 생기는 경우가 있다.
질환이나 그 진행도의 진단은, 예를 들면 인택트한 단백질과 그 부분 단백질 및 부분 펩타이드 각각의 양이나 존재비(양 비) 등을 해석한 결과에 근거하여 수행된다. 따라서, 각 성분의 피크의 신호 강도에 차이가 생기면, 단백질이나 부분 단백질, 부분 펩타이드의 각각의 양 뿐만 아니라, 이들 단백질과 부분 단백질, 부분 펩타이드의 양 비에 차이가 생기게 되어, 정확한 진단을 수행할 수 없다.
또한, 상기 설명에서는, 편의상, 인택트한 단백질의 일부분을 「부분 단백질」, 「부분 펩타이드」라고 불렀지만, 일반적으로는, 단백질의 일부분은 「펩타이드」라고 불린다.
본 발명이 해결하려고 하는 과제는, 특정 질환의 바이오 마커가 되는 펩타이드를 질량 분석 장치를 이용하여 정확하게 측정하기 위한 기술을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해서 이루어진 본 발명에 따른 질환 검출 방법은 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용하여 생체 시료에 포함되는 바이오 마커로서의 펩타이드의 양을 측정하고, 그 결과에 근거하여, 특정 질환을 검출하는 방법으로서,
상기 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용한 측정 전에 수행되는 전처리 공정이,
a) 상기 생체 시료에, 상기 펩타이드를 안정 동위체로 표지한 안정 동위체 시약과, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 혼합 시료액을 조제하는 공정과,
b) 상기 혼합 시료액을 비등시키는 공정과,
c) 상기 비등된 혼합 시료액을 고상 추출 컬럼에 주입하고, 상기 펩타이드를 당해 고상 추출 컬럼에 유지시키는 공정과,
d) 상기 고상 추출 컬럼에 수용성 유기용매를 흘려서 당해 고상 추출 컬럼에 유지된 상기 펩타이드를 용출하고 용출액을 채취하는 공정을 구비하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 생체 시료는, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌수액, 뇨 등을 말한다.
또, 바이오 마커로서의 펩타이드는, 특정 질환에 이환하고 있는 사람으로부터 채취된 생체 시료액 중에서의 존재량과, 당해 특정 질환에 이환하고 있지 않은 사람으로부터 채취된 생체 시료액 중에서의 존재량과의 사이에 차이가 있는 펩타이드를 말한다. 예를 들면 특정 질환에 이환하고 있지 않은 상태의 생체에서는 인택트한 단백질로서 존재하고, 특정 질환에 이환하고 있는 상태의 생체에서는 당해 인택트한 단백질의 일부분인 펩타이드로서 생성 또는 합성되는 경우, 당해 펩타이드가 바이오 마커에 상당한다.
추가로, 상기 펩타이드를 안정 동위체로 표지한 안정 동위체 시약은, 상기 펩타이드를 구성하는 몇개의 원자를 그 원자의 안정 동위체 원소로 치환시킨 것을 말한다.
전처리 공정에서 생체 시료에 첨가되는 트리플루오로아세트산은, 생체 시료 중에서 피브리노겐이나 알부민 등의 매트릭스에 얽힌 상태의 펩타이드를 당해 매트릭스로부터 분리하는 작용을 가진다. 또, 혼합 시료액을 비등시키는 공정은, 펩타이드가 덩어리 모양으로 있을 때 그 펩타이드를 푸는 작용을 가진다. 혼합 시료액을 비등시키는 시간은 1분 내지 30분이 바람직하지만, 이것으로 한정되지 않는다. 예를 들면 생체 시료의 종류나 질량 분석에 의한 측정 대상이 되는 바이오 마커(펩타이드)의 종류에 의해 적절한 비등 시간을 설정하면 된다.
생체 시료에 첨가되는 안정 동위체 시약은, 그에 대응하는 펩타이드와 질량 전하비의 값이 거의 동일하고, 또, 물리적/화학적 성질이 유사하다. 따라서, 생체 시료를 크로마토그램 질량 분석 장치로 측정했을 때에, 안정 동위체 시약과 그에 대응하는 펩타이드의 거동이 유사하다. 크로마토그램 질량 분석의 결과 얻어진 매스 스펙트럼 상에는, 안정 동위체 시약의 피크와, 그에 대응하는 펩타이드의 피크가 근처에 나타난다. 전처리시의 회수율에 편차가 있는 경우에 그 영향은, 안정 동위체 시약의 피크와, 그에 대응하는 펩타이드의 피크에 미치지만, 안정 동위체 시약의 첨가량은 이미 알고 있기 때문에, 양자의 피크 강도의 대비로부터, 소정의 펩타이드의 양을 정확하게 구할 수 있다.
본 발명에서, 상기 수용성 유기용매가 50%~100% 메탄올인 경우에는, 상기 용출하는 공정의 후에, 추가로,
상기 용출액에 포함되는 상기 수용성 유기용매를 증발시켜서 상기 펩타이드를 건고(乾固)시키는 공정과,
상기 건고된 상기 펩타이드를 0.1%~1%의 트리플루오로아세트산과 5%~50%의 아세토니트릴을 포함하는 수용액에 용해시켜서 질량 분석용 시료액을 조제하는 공정을 구비하는 것이 바람직하다.
또, 바람직하게는, 본 발명에서, 상기 수용성 유기용매가 0.1%~1%의 트리플루오로아세트산과 10%~99.9%의 아세토니트릴을 포함하고,
상기 아세토니트릴의 농도가 50%~99.9%인 경우에는, 상기 용출하는 공정의 후에, 추가로,
상기 용출액에 포함되는 상기 아세토니트릴의 농도가 50%보다도 낮아지도록 희석하여 질량 분석용 시료액을 조제하는 공정을 구비한다.
또한, 본 명세서 중에서 각종 물질의 농도를 표현하는 「%」는 「v/v%」를 의미한다.
고상 추출 컬럼으로부터 메탄올을 이용하여 상기 펩타이드를 용출한 경우에 그 용출액을 그대로 크로마토그램 질량 분석 장치에 제공하면, 상기 메탄올에 의해서 생체 시료의 분리가 방해될 가능성이 있기 때문에, 상기 메탄올을 증발시킬 필요가 있지만, 0.1%~1%의 트리플루오로아세트산과 10%~99.9%의 아세토니트릴을 포함하는 수용성 유기용매를 이용하여 용출한 경우는, 당해 수용성 유기용매를 증발시키는 처리를 생략할 수 있다. 다만, 아세토니트릴의 농도가 50%~99.9%인 경우는, 당해 아세토니트릴에 의해서 분리가 방해되기 때문에 아세토니트릴의 농도가 50%보다도 낮아지도록 용출액을 희석하여 질량 분석용 시료액으로 하면 된다.
추가로, 상기 크로마토그래프 질량 분석 장치가, 액체 크로마토그래프부와 MRM(다중 반응 모니터링) 측정이 가능한 질량 분석부를 구비하고,
상기 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용한 측정이,
상기 질량 분석용 시료액을 상기 액체 크로마토그래프부에서 시간적으로 분리하는 공정과,
상기 액체 크로마토그래프부에서 시간적으로 분리된, 상기 질량 분석용 시료액에 포함되는 상기 펩타이드가 이온화하여 생기는 전구체 이온, 당해 전구체 이온이 상이한 개소에서 아미노산이 개열하여 형성되는 복수종의 프로덕트 이온에 따른 복수의 MRM 트랜지션을 측정 조건으로 한 MRM 측정을 상기 질량 분석부에서 실행하는 공정을 구비하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 질환 검출 방법의 대상이 되는 질환의 하나로서, 정상 상태에서는 인택트한 단백질이, 특정 질환 상태에서 당해 인택트한 단백질의 일부분인 펩타이드로서 생성 또는 합성되는 것과 같은 질환이 있다. 그러한 질환의 예로서 인지 기능 장애 질환, 간질환(비알코올성 지방성 간질환, 지방간, 간암)을 들 수 있다. 상기 특정 질환이 인지 기능 장애 질환인 경우 상기 인택트한 단백질로서, 프로트롬빈, 겔솔린, 보체 C4A 및 보체 C3를 들 수 있다. 또, 이들 단백질 이외에도, 전사 인자 AP-2γ, 옥시토신 수용체, E3 유비퀴틴 리가아제 HERC2, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 16, 뉴렉신-2-β-전구체, 뉴렉신 1-β, 프로토카드헤린γ A-10이 상기 인택트한 단백질에 포함된다.
본 발명은, 생체 시료에 트리플루오로아세트산을 첨가하여 혼합 시료액을 조제한 후, 비등시키기 때문에, 생체 시료 중의 매트릭스(피브리노겐이나 알부민 등)로부터 펩타이드를 분리하여, 덩어리 모양의 펩타이드를 풀 수 있다. 이 때문에, 혼합 시료액을 고상 추출 컬럼에 주입했을 때에 생체 시료 중의 펩타이드를 안정적으로 당해 고상 추출 컬럼에 유지시킬 수 있다. 이 때문에, 그 후, 고상 추출 컬럼에 수용성 유기용매를 흘려서 당해 고상 추출 컬럼에 유지되고 있던 펩타이드를 용출할 수 있다.
또, 생체 시료에 바이오 마커로서의 펩타이드의 안정 동위체 시약을 첨가했기 때문에, 생체 시료에 대해 크로마토그래프 질량 분석을 수행함으로써 얻어지는 데이터로부터 펩타이드의 정확한 양을 구할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 질환 검출 방법을 실시하기 위해서 이용되는 질량 분석 장치의 일 실시형태의 개략 구성도이다.
도 2는 전처리의 절차를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 액체 크로마토그래프부의 분석의 그래디언트 프로파일을 나타내는 도면이다.
도 4는 14종의 인지 기능 장애 질환의 바이오 마커 펩타이드의 MRM 트랜지션을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 실시형태에 따른 액체 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용하여, 소정의 생체 시료의 측정을 수행한 결과, 얻어진 MRM 크로마토그램이다.
이하, 본 발명에 따른 질환 검출 방법의 일 실시형태에 대해 도면을 참조하여 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 질환 검출 방법을 실시하기 위해서 이용되는 액체 크로마토그래프 질량 분석 장치(LC-MS/MS)의 개략 구성도이다.
액체 크로마토그래프 질량 분석 장치는, 액체 크로마토그래프부(LC부)(10)와 질량 분석부(MS/MS부)(20)를 포함한다.
LC부(10)는, 이동상이 저류된 이동상 용기(11)와, 이동상을 흡인하여 일정 유량으로 송급하는 펌프(12)와, 이동상 중에 미리 준비된 시료를 소정량씩 주입하는 인젝터(injector)(13)와, 시료에 포함되는 각종 화합물을 시간 방향으로 분리하는 컬럼(14)을 포함한다. 또한, LC부(10)가 복수의 이동상의 조성을 연속적으로 변화시키면서 시료에 포함되는 화합물을 분리하는, 이른바 그래디언트 분리를 실시하는 경우는, 이동상 용기(11) 및 펌프(12)는 각각 2개 이상 마련된다.
MS/MS부(20)는, 텐덤 사중극형 질량 분석 장치로 이루어지고, 대기압인 이온화실(21)과 도시하지 않은 고성능의 진공 펌프에 의해 진공 배기되는 고진공의 분석실(24)과의 사이에, 단계적으로 진공도가 높아진 제1, 제2 중간 진공실(22, 23)을 구비한 다단 차동 배기계의 구성이다. 이온화실(21)에는, 시료 용액에 전하를 부여하면서 분무하는 일렉트로 스프레이 이온화용 프로브(25)가 설치되고, 이온화실(21)과 차단의 제1 중간 진공실(22)과의 사이는 세경(細徑)의 가열 캐필러리(26)를 통해 연통하고 있다. 제1 중간 진공실(22)과 제2 중간 진공실(23)과의 사이는 정부(頂部)에 소공(小孔)을 가지는 스키머(28)로 나뉘고, 제1 중간 진공실(22)과 제2 중간 진공실(23)에는 각각, 이온을 수렴시키면서 후단에 수송하기 위한 이온 가이드(27, 29)가 설치되어 있다. 분석실(24)에는, 다중극 이온 가이드(32)가 내부에 설치된 콜리젼 셀(3l)을 사이에 두고, 이온을 질량 전하비에 따라 분리하는 전단 사중극 매스 필터(30)와, 동일하게 이온을 질량 전하비에 따라 분리하는 후단 사중극 매스 필터(33), 추가적으로는 이온 검출기(34)가 설치되어 있다. CID 가스 공급부(35)는 콜리젼 셀(31)의 내부에 아르곤, 질소 등의 CID 가스를 공급하는 것이다. 또 전원부(36)는 일렉트로 스프레이 이온화용 프로브(25), 이온 가이드(27, 29, 32), 사중극 매스 필터(30, 33) 등에 각각 소정의 전압을 인가한다.
데이터 처리부(40)는, 기능 블록으로서, 데이터 수집부(41), 데이터 기억부(42), 그래프 작성부(43), 정량 분석부(44) 등을 구비한다. 입력부(52)나 표시부(53)가 부설된 제어부(50)는, 처리 조건 파라미터 기억부(51)를 구비하고, 당해 기억부(51)에 미리 기억되어 있는 처리 조건 파라미터에 근거하여 액체 크로마토그래프부(10)의 펌프(12)나 인젝터(13), 질량 분석부(20)의 전원부(36)나 CID 가스 공급부(35) 등의 각부의 동작을 각각 제어한다. 또한, 제어부(50) 및 데이터 처리부(40)의 기능의 적어도 일부는, 퍼스널 컴퓨터를 하드웨어 자원으로 하여, 당해 컴퓨터에 미리 인스톨된 전용의 제어·처리 소프트웨어를 컴퓨터 상에서 실행함으로써 실현될 수 있다.
본 실시형태에 따른 LC-MS/MS에 있어서의 기본적인 MS/MS 측정 동작은 다음과 같다.
우선, 펌프(12)는 이동상 용기(11)로부터 이동상을 흡인하여 일정 유량으로 컬럼(14)에 송급한다. 인젝터(13)로부터 일정량의 시료액이 이동상 중에 도입되면, 이동상의 흐름을 타고 시료는 컬럼(14)에 도입되고, 컬럼(14)을 통과하는 동안에 시료 중의 각종 화합물은 시간 방향으로 분리되어 컬럼(14) 출구로부터 용출하고, MS/MS부(20)에 도입된다.
MS/MS부(20)에서, 일렉트로 스프레이 이온화용 프로브(25)에 컬럼(14)으로부터의 용출액이 도달하면, 당해 프로브(25)의 선단에서 전하가 부여되면서 용출액이 분무된다. 분무에 의해 형성된 대전 액적은 부여된 전하에 의한 정전기력의 작용에 의해 분열하면서 미세화되고, 그 과정에서 용매는 기화하여 화합물 유래의 이온이 튀어 나온다.
이렇게 하여 생성된 이온은 가열 캐필러리(26)를 통해 제1 중간 진공실(22)로 보내지고, 이온 가이드(27)로 수렴되어 스키머(28) 정부의 소공을 거쳐 제2 중간 진공실(23)에 보내진다. 그리고, 화합물 유래의 이온은 이온 가이드(29)로 수렴되어 분석실(24)에 보내지고, 전단 사중극 매스 필터(30)의 장축 방향의 공간에 도입된다. 또한, 이온화법은 일렉트로 스프레이 이온화법으로 한정하지 않고, 대기압 화학 이온화법이나 대기압 광이온화법 등을 이용해도 되는 것은 당연하다.
MS/MS부(20)에서 MS/MS분석을 수행할 때에는, 전단 사중극 매스 필터(30) 및 후단 사중극 매스 필터(33)의 각 로드 전극에 전원부(36)로부터 각각 소정의 전압(고주파 전압과 직류 전압이 중첩된 전압)이 인가되어, 콜리젼 셀(31) 내에는 CID 가스 공급부(35)로부터 연속적으로 또는 간헐적으로 CID 가스가 공급된다. 이로써, 전단 사중극 매스 필터(30)에 들여보내진 각종 이온 중에서, 전단 사중극 매스 필터(30)의 각 로드 전극에 인가되고 있는 전압에 따른 특정 질량 전하비를 갖는 이온만이 당해 필터(30)를 통과하여, 전구체 이온으로서 콜리젼 셀(31)에 도입된다. 콜리젼 셀(31) 내에서 전구체 이온은 CID 가스에 충돌하여 개열하고, 각종 프로덕트 이온이 생성된다. 생성된 각종 프로덕트 이온이 후단 사중극 매스 필터(33)에 도입되면, 후단 사중극 매스 필터(33)의 각 로드 전극에 인가되고 있는 전압에 따른 특정 질량 전하비를 가지는 프로덕트 이온만이 당해 필터(33)를 통과하고, 이온 검출기(34)에 도달하여 검출된다. 이온 검출기(34)는 펄스 카운트형 검출기를 이용할 수 있고, 이 경우, 입사된 이온의 수에 따른 개수의 펄스 신호를 검출 신호로서 출력한다.
이온 검출기(34)의 검출 신호는 데이터 처리부(40)에 입력되어, 매스 스펙트럼이나 매스 크로마토그램이 작성됨과 동시에, 그들 매스 스펙트럼이나 매스 크로마토그램의 해석 처리가 실행된다. 그리고, 그 해석 결과에 근거하여, 당해 생체 시료의 제공자인 피검자가 특정 질환에 이환하고 있는지 아닌지의 진단, 혹은, 특정 질환에 이환하고 있는 경우는 그 진행도의 판정이 수행된다.
일반적인 LC-MS/MS와 마찬가지로, 본 실시형태에서도, MS/MS 측정의 모드로서, 다중 반응 모니터링(MRM) 측정, 프로덕트 이온 스캔 측정, 전구체 이온 스캔 측정, 뉴트럴 로스 스캔 측정이 준비되어 있다.
MRM 측정에서는, 전단 사중극 매스 필터(30) 및 후단 사중극 매스 필터(33)로 각각 소정의 질량 전하비의 이온만을 통과시켜서 MS/MS 측정이 수행되고, 이로써, 목적 화합물 유래의 특정 전구체 이온에 대한 특정 프로덕트 이온이 검출된다. MRM 측정에서는, 전구체 이온의 질량 전하비(m/z)와 프로덕트 이온의 질량 전하비(m/z)를 1세트로 하는 채널을 복수 설정한 측정을 수행할 수 있고, 전구체 이온의 질량 전하비와 프로덕트 이온의 질량 전하비의 세트를 「MRM 트랜지션」이라고 한다. 이하에 설명하는 질환 검출 처리에서는, MS/MS 측정으로서 MRM 측정이 사용된다.
다음에, 특정 질환의 검출을 위해서 상기 LC-MS/MS를 이용하여 실시되는 측정 처리에 대해 설명한다. 여기에서는, 인지 기능 장애 질환의 검출을 위해서 실시되는 측정 처리를 예로 들어 설명한다.
<1. 시약·용구 등의 준비>
이하에 나타내는 시약 및 용구 등을 준비한다.
(1) 검량선용 표준 용액(STD 용액): 인지 기능 장애 질환의 바이오 마커가 되는 인택트한 단백질(프로트롬빈, 겔솔린, 보체 C4A, 보체 C3)의 아미노산 배열의 일부로 이루어지는 펩타이드, 구체적으로는, 표 1에 나타낸 14종의 펩타이드로부터 선택되는 1 내지 복수의 펩타이드를, 소정량씩 포함하는 시약. 표준 혈청 중에, 14종의 펩타이드로부터 선택되는 1 내지 복수의 펩타이드를 소정량씩 포함한 것이어도 된다. 소정의 희석액을 이용하여 STD 용액을 단계적으로 희석함으로써 검량선 상의 각 검량점용 용액(예를 들면 6점의 검량점용의 용액)을 제작한다. 또한, 표 1에는, 14종의 펩타이드의 서열 번호(No. 1~14), 식별 번호(ID), 당해 펩타이드의 기원이 되는 단백질의 명칭, 및 당해 펩타이드의 아미노산 배열을 나타내고 있다.
No. 펩타이드 ID 단백질의 명칭 아미노산 배열
1 AD1008 보체 C4-A APLQPVTPLQLFEGRRN
Complement C4-A
2 AD1025 전사 인자 AP-2 γ PGRQSQEGAGLPSHHG
Transcription factor AP-2 gamma
3 AD1042 옥시토신 수용체 AAPPGAEGNRT
Oxytocin receptor
4 AD1046 E3 유비퀴틴 리가아제 HERC2 KLAELPAAAQPSAEDSD
E3 ubiquitin-protein ligase HERC2
5 AD1048
(ADPEP2036)		 프로트롬빈 TATSEYQTFFNPRTFGSGEA D
Prothrombin
6 AD1049 Complement C3 APVIHQEMIGGLRN
보체 C3
7 ADPEP109315 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 16 QTASGQALKGDGGLYS
Tumor nectrosis factor receptor superfly
8 ADPEP421488 겔솔린 GLGLSYLSSHIANVERVPFD
Gelsolin
9 ADPEP1315 뉴렉신-2-β 전구체 RSGGNATLQVDSWP
Neurexin-2-beta precursor
10 ADPEP12neu 뉴렉신 1-β NIAIVGDVRLVGEVPSSGT
Neurexin 1-β
11 ADPEP1396 프로트롬빈 전구체 TATSEYQTFFNPR
Prothrombin precursor
12 ADPEP1039 프로트롬빈 전구체 GLDEDSDRAIEG
Prothrombin precursor
13 ADPEP1250 프로트롬빈 전구체 GLDEDSDRAIEGR
Prothrombin precursor
14 AD1089 프로토카드헤린 γ A-10 GVSGSHFVGVDGVR
Protocadherin gamma A-10
(2) 정밀도 관리용 표준 용액(QC 용액): STD 용액으로부터 제작한 검량점용 용액을 혼합하여 제작한 것. 예를 들면, 6점 검량점의 경우, 검량점 1의 용액과 검량점 2의 용액을 혼합하여 제작한 것, 검량점 3의 용액과 검량점 4의 용액을 혼합하여 제작한 것, 검량점 5의 용액과 검량점 6의 용액을 혼합하여 제작한 것을, 각각 QC 용액으로서 사용한다.
(3) 안정 동위체 시약: 상기 14종의 펩타이드의 일부의 원자를 안정 동위체로 치환한 것을 소정량씩 포함하는 시약.
(4) 용매 A: 0.1%~1% TFA) 및 5%~50% 아세토니트릴(ACN)을 포함하는 수용성 유기용매
(5) 용매 B: 50%~100% 메탄올
(6) 용매 C: 0.1%~1% TFA를 포함하는 수용액
(7) 용매 D: 0.1%~1% TFA 및 5%~50% 메탄올을 포함하는 수용성 유기용매
(8) 알루미늄 씰
(9) 96 구멍(웰)의 샘플 플레이트
(10) 증발 방지용 플레이트 매트
<2. 생체 시료(혈청)의 준비>
피검자로부터 혈액을 채취하고, 이를 소정 시간 방치한 후, 원심분리하여, 상청(혈청)을 채취한다.
<3. 시료의 조제>
도 2에 나타내는 절차에 따라서, 전처리를 수행한다.
우선, 96 구멍의 샘플 플레이트의 각 웰에 생체 시료인 혈청을 25㎕씩 주입한다. 또, 혈청을 주입한 웰과는 별개의 웰에 STD 용액, QC 용액을 각각 25㎕씩 주입한다.
다음에, 혈청, STD 용액, QC 용액을 주입한 샘플 플레이트의 각 웰에 용매 C(0.1%~1% TFA를 포함하는 수용액)를 475㎕씩 첨가하고, 추가로, 안정 동위체 시약을 20㎕씩 첨가한다. 이로써, 각 웰에는, 520㎕의 액체(혼합액)가 주입된 상태가 된다.
이어서, 샘플 플레이트의 상면을 알루미늄제 씰로 봉하고, 이를 플레이트 쉐이커로 교반한다. 그 후, 샘플 플레이트에 대응한 원심기로 제1회 원심분리(100g, 2분, 4℃), 열처리(100℃, 15분), 얼음 중 보관(10분), 제2회 원심분리(100g, 2분, 4℃)를 수행한다.
<4. 고상 추출 컬럼(고상 추출 플레이트)에 의한 처리>
우선, 96 구멍 플레이트에 대응한 고상 추출 컬럼(상품명 Oasis HLB μElution Plate, Water사제, 이하, 「고상 추출 플레이트」라고 칭한다)의 각 웰에, 용매 B(500㎕의 50%-100% 메탄올)를 흘려서 불용 성분을 제거하고, 이어서 500㎕의 용매 C(0.1%-1% TFA를 포함하는 수용액)를 흘려서 상기 고상 추출 플레이트를 조정한다.
다음에, 전처리의 제2회 원심분리 후의 샘플 플레이트의 각 웰 중 상청액 500㎕를 고상 추출 플레이트의 대응하는 웰에 흘린다. 이어서, 500㎕의 용매 D([0.1%~1% TFA]＋[5%~50% 메탄올]를 포함하는 수용성 유기용매)를 당해 고상 추출 플레이트의 각 웰에 흘려서, 고상 추출 플레이트에 비특이적으로 흡착하고 있는 매트릭스 성분을 세정 배출한다. 그 후, 고상 추출 플레이트의 각 웰에 50㎕의 용매 A([0.1%~1% TFA]＋[5%~50% ACN]를 포함하는 수용성 유기용매)를 첨가하여, 고상 추출 플레이트에 흡착하고 있는 펩타이드를 질량 분석용의 96 구멍 샘플 플레이트의 각 웰에 용출한다. 이상에 의해 얻어진, 96 구멍 샘플 플레이트의 각 웰에 수용되어 있는 액체가 질량 분석용 시료액이 된다.
<5. 크로마토그래프 질량 분석 장치에 의한 측정>
고상 추출 컬럼에 의한 처리에 의해서 얻어진 질량 분석용 시료액이 수용된 96 구멍 샘플 플레이트를 상술의 LC-MS/MS의 인젝터(13)의 시료 재치부에 셋팅하여, 크로마토그래프 질량 분석을 실시하였다. LC부(10), MS/MS부(20)의 구체적인 장치명 및 각 부에 있어서의 처리 조건 등과, 그 분석 결과를 이하에 나타낸다.
<5.1　LC부>
·장치명:　그래디언트 분석이 가능한 고속 액체 크로마토그래프 장치(상품명 Nexera XR(주식회사 시마즈 제작소제)를 이용하였다.
·컬럼:　펩타이드나 단백질의 분석용 역상 컬럼(상품명 Aeris(등록상표) 펩타이드(Phenomenex사), 컬럼 사이즈; 2.1×50㎜, 2.6㎛ (MAX 압력: 1000bar(100MPa))를 이용하였다.
·분석 방식:　이하의 용매 E와 용매 F의 혼합비를 시간적으로 변화시키면서, 질량 분석용 시료액을 시간적으로 분리하는, 그래디언트 분석을 채용하였다. 도 3에 그래디언트 프로파일을 나타낸다.
용매 E: 물:ACN:포름산 = 98:2:0.1
용매 F: 물:ACN:포름산 = 10:90:0.1
가열 온도; 55℃
샘플러 온도; 5℃
<5.2　MS/MS부>
·장치명: MRM 분석이 가능한 질량 분석 장치인 트리플 사중극형 질량 분석 장치(상품명 LCMS-8060(주식회사 시마즈 제작소제))를 이용하였다. 분석시의 각부의 설정치는 이하와 같다.
CID 가스압: 270kPa
인터페이스 전압: 3kV
네뷸라이저 가스 유량: 3L/분
히팅 가스 유량: 10L/분
인터페이스 온도: 300℃
DL 온도: 250℃
히트 블록 온도: 400℃
드라잉 가스 유량: 10L/분
또, 14종의 펩타이드의 MRM 파라미터를 도 4에 나타낸다. MRM 파라미터는, 전구체 이온의 질량 전하비와 프로덕트 이온의 질량 전하비의 세트(MRM 트랜지션), Q1 프리 로드 바이어스(Q1 Pre Rod Vias) 전압, 콜리젼 에너지, Q3 프리 로드 바이어스(Q3 Pre Rod Vias) 전압을 포함한다.
<5.3　측정 결과>
도 5는, 소정의 피검자로부터 채취된 생체 시료에 대해서 액체 크로마토그래프 질량 분석을 수행한 결과, 얻어진 14종의 펩타이드의 이온 강도에 근거하여 작성된 베이스 피크 크로마토그램이다. 도 5에 나타내는 각 기호는 표 1에 나타내는 기호에 대응하고 있다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 14종의 펩타이드 유래의 피크가 각각 관측되었다.
또한, 상기한 실시형태는 본 발명의 일 예에 지나지 않고, 예를 들면 액체 크로마토그래프를 대신하여 가스 크로마토그래프를 이용해도 된다. 또, 상기 실시형태에서, 고상 추출 플레이트에 흡착하고 있는 펩타이드를 용출하기 위해서 용매 A([0.1%~1% TFA]＋[5%~50% ACN]를 포함하는 수용성 유기용매)를 이용했지만 이를 대신하여 용매 B(50%~100% 메탄올)를 이용해도 된다. 용매 B를 이용한 경우는, 상기 펩타이드를 용출하는 공정의 후에, 추가로, 상기 용출액에 포함되는 상기 용매 B를 증발시켜서 펩타이드를 건고시키는 것이 바람직하다.
또, 상기 실시형태에서 이용한 용구나 장치는 일 예에 지나지 않고, 그것들에 한정되지 않는다. 예를 들면, 액체 크로마트그라피의 역상 컬럼으로서 일반적인 C18 컬럼을 이용하여 고상 추출 플레이트를 구성해도 된다.
그 외, 본 발명의 취지에 따른 범위에서 적당 변형이나 수정, 추가를 수행하더라도 본 발명의 특허청구범위에 포함됨은 분명하다.
10…액체 크로마토그래프부
14…컬럼
20…MS/MS부
30…사중극 매스 필터
30…전단 사중극 매스 필터
31…콜리젼 셀
32…다중극 이온 가이드
34…이온 검출기
35…CID 가스 공급부
36…전원부
40…데이터 처리부
41…데이터 수집부
42…데이터 기억부
43…그래프 작성부
44…정량 분석부
50…제어부
52…입력부
53…표시부
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Claims (6)

  1. 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용하여 생체 시료에 포함되는 바이오 마커로서의 펩타이드의 양을 측정하고, 그 결과에 근거하여, 특정 질환을 검출하는 방법으로서,
    상기 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용한 측정 전에 수행되는 전처리 공정이,
    a) 상기 생체 시료에, 상기 펩타이드를 안정 동위체로 표지한 안정 동위체 시약과, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 혼합 시료액을 조제하는 공정과,
    b) 상기 혼합 시료액을 비등시키는 공정과,
    c) 상기 비등된 혼합 시료액을 고상 추출 컬럼에 주입하고, 상기 펩타이드를 당해 고상 추출 컬럼에 유지시키는 공정과,
    d) 상기 고상 추출 컬럼에 수용성 유기용매를 흘려서 당해 고상 추출 컬럼에 유지된 상기 펩타이드를 용출하고 용출액을 채취하는 공정
    을 구비하는, 질환 검출 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 유기용매가 50%~100%의 메탄올인 경우에는, 상기 용출하는 공정 후에, 추가로,
    상기 용출액에 포함되는 상기 수용성 유기용매를 증발시켜서 상기 펩타이드를 건고시키는 공정과,
    상기 건고된 상기 펩타이드를 0.1%~1%의 트리플루오로아세트산 및 5%~50%의 아세토니트릴을 포함하는 수용액에 용해시켜서 질량 분석용 시료액을 조제하는 공정을 구비하는 질환 검출 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 유기용매가 0.1%~1%의 트리플루오로아세트산 및 5%~99.9%의 아세토니트릴을 포함하고,
    상기 아세토니트릴의 농도가 50%~99.9%인 경우에는, 상기 용출하는 공정 후에, 추가로,
    상기 용출액에 포함되는 상기 아세토니트릴의 농도가 50%보다도 낮아지도록 희석하여 질량 분석용 시료액을 조제하는 공정을 구비하는 질환 검출 방법.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 크로마토그래프 질량 분석 장치가, 액체 크로마토그래프부와 MRM(다중 반응 모니터링) 측정이 가능한 질량 분석부를 구비하고,
    상기 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용한 측정이,
    상기 질량 분석용 시료액을 상기 액체 크로마토그래프부에서 시간적으로 분리하는 공정과,
    상기 액체 크로마토그래프부에서 시간적으로 분리된, 상기 질량 분석용 시료액에 포함되는 상기 펩타이드가 이온화하여 생기는 전구체 이온, 당해 전구체 이온이 상이한 개소에서 아미노산이 개열하여 형성되는 복수종의 프로덕트 이온에 따른 복수의 MRM 트랜지션을 측정 조건으로 한 MRM 측정을 상기 질량 분석부에서 실행하는 공정
    을 구비하는, 질환 검출 방법.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 크로마토그래프 질량 분석 장치가 액체 크로마토그래프부와 MRM(다중 반응 모니터링) 측정이 가능한 질량 분석부를 구비하고,
    상기 크로마토그래프 질량 분석 장치를 이용한 측정이,
    상기 질량 분석용 시료액을 상기 액체 크로마토그래프부에서 시간적으로 분리하는 공정과,
    상기 액체 크로마토그래프부에서 시간적으로 분리된, 상기 질량 분석용 시료액에 포함되는 상기 펩타이드가 이온화하여 생기는 전구체 이온, 당해 전구체 이온이 상이한 개소에서 아미노산이 개열하여 형성되는 복수종의 프로덕트 이온에 따른 복수의 MRM 트랜지션을 측정 조건으로 한 MRM 측정을 상기 질량 분석부에서 실행하는 공정
    을 구비하는, 질환 검출 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 특정 질환이, 인지 기능 장애 질환이고,
    상기 펩타이드가, 프로트롬빈, 겔솔린, 보체 C4A 및 보체 C3으로부터 선택되는 1 내지 복수의 단백질의 일부분인 펩타이드를 포함하는, 질환 검출 방법.

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