JP2010071900A - 新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号3(糖鎖付加型を含む)で表されるその部分ペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカーとその利用。
【選択図】 なし
Description
immunoassay)と1次抗体または2次抗体に結合させたラジオアイソトープを用いて計測する放射性免疫測定法(RIA; radioimmunoassay)、タンパク質が酵素の場合は直接基質を与えて産生物を発色などで計測する酵素活性測定法などがある。抗体を用いるこれらの方法を酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法と呼ぶこととする。また酵素の基質分解産物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析する方法もある。またHPLCと質量分析装置を組み合わせたLC-MS/MS法ならびにこれを用いたselected reaction
monitoring (SRM)/ multiple reaction monitoring (MRM)法もある。また、試料に適当な前処理を施した後、2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)を行ってタンパク質またはペプチドを分離した後、目的のタンパク質またはペプチドについて銀染色、クマシーブルー染色、あるいは対応する抗体を用いた免疫染色(ウエスタン・ブロッティング)を行って、試料中の濃度を測定する方法もある。また、生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析によって分析する手法がある。またカラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。
NAFLDと略称され、飲酒歴がない(20 g/日以下)にもかかわらず、アルコール性肝障害に類似した脂肪沈着を特徴とする肝組織所見を示す。HCVまたはHBVのようなウイルス性ないし自己免疫性の場合は、この疾患から除外される。この疾患は肥満などを伴うメタボリックシンドロームの肝臓における表現型とみなされている。非アルコール性脂肪性肝疾患は単純性脂肪肝と進行性の非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis)に大きく分かれる。後者はNASHと略称される。NASHは肝線維化を伴うことが多く、肝硬変、さらには肝細胞がんに進行することが明らかにされたことから、近年注目を集めるようになった(非特許文献1参照)。以下、単純性脂肪肝を単に脂肪肝と称する。
[1] 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
N. Benkiraneら、J. Biol. Chem. Vol. 268,26279-26285, 1993
対象となるタンパク質(タンパク質断片および部分ペプチドを含む)が特定されていて、それに対する抗体(1次抗体)が得られている場合は、以下の方法を用いることができる。
1.イムノ・ブロット法
最も単純な方法である。数段階に希釈した被験血清を用意し、その一定量(1マイクロリットル前後)をニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに滴下し、風乾する。BSAなどのタンパク質を含むブロッキング溶液で処理した後、洗浄し、1次抗体を反応させ、洗浄後1次抗体を検出するための標識された2次抗体を反応させる。メンブレンを洗浄後、標識を可視化して濃度を測定する。
2.ウエスタン・ブロット法
等電点ないしSDS-PAGEを含む一次元ないし二次元ゲル電気泳動を行った後で、分離されたタンパク質を一旦、ニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに転写し、1次抗体と標識された2次抗体を用いて上述のイムノ・ブロット法と同様に操作して、目的のタンパク質の存在量を測定する。
3.ELISA
タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、試料を段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加えてインキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドを除く。次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた2次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。抗体の代わりにタンパク質またはその部分ペプチドに結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
さらに以下に方法(特許文献2参照)を例示するが、それらには限定されない。
RLAILPASC-KLHをウサギに免疫して一定期間後採血して、対応するペプチドを結合させたカラムに吸着させて精製することにより作製した。配列番号2は配列番号1の一部であり、配列番号3は配列番号2のN末端にあり、肝疾患患者の血清中に検出されるペプチドである。
001 MKPPRPVRTC
SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR
ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA
KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL
LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK
AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV
HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF
NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV
QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY
SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP
LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS
GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT
VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME
GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF
RPGVLSSRLL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR
VMNIKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL
SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS
AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL
LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER RLDYQEGPPG VEISCWSVEL
001 RLAILPASAP PATSNPDPAV
SRVMNIKIEE TTMTTQTPAP IQAPSAILPL
051 PGQSVERLCV DPRHRQGPVN
LLSDPEQGVE VTGQYEREKA GFSWIEVTFK
101 NPLVWVHASP EHVVVTRNRR
SSAYKWKETL FSVMPGLKMT MDKTGLLLLS
151 DPDKVTIGLL FWDGRGEGLR
LLLRDTDRFS SHVGGTLGQF YQEVLWGSPA
201 ASDDGRRTLR VQGNDHSATR
ERRLDYQEGP PGVEISCWSV EL
RLAILPASAPPATSNPD
上記部分ペプチドは下に示すように糖鎖が付加された状態で血清中に存在した。
RLAILPASAPPATSNPD + -GlcNAc-Hex-GlcNAc-Hex
用いた材料は以下のとおりである。メンブレンは0.22 μm MF-millipore メンブレンフィルター、TBSは0.15 M NaClを含む20
mM Tris-HCl (pH 7.5)、TBStは0.05%
Tween 20を含むTBS、ブロッキング溶液は5% BSAを含むTBSt、BSA-TBStは0.1%
BSAを含むTBSt。
HRP conjugated anti-rabbit IgG (GE
Healthcare) (1:5000)を2 mL加えて放置する。TBStで数回洗浄したのち、TBSで洗浄し、各スポットの化学発光の強度を測定する。メンブレンごとに特定の慢性肝炎患者から得た血清(対照血清と呼ぶ)のTBS希釈液を滴下して同様に処理する。
Agilent Multiple Affinity Removal System(4.6
mm × 100 mm )を用いて血清サンプルからalbumin、IgG、IgA、transferrin、haptoglobin、antitrypsinを除いて分析した。血清35 μLにBuffer A 175 μLを加えて混和、0.45 μm遠心フィルターで不溶物を除去、その200 μLをインジェクションし、0.5
μL/minで10分間buffer Aを流す。YM-10を使ってflow throughを濃縮し、さらに、20 mM phosphate buffer
(pH 7.0)を加えて最終容量が50 μL以下となるように濃縮する。タンパク質定量を行い、150 μg分をSDS-PAGE
(10% acrylamide gel)に掛け、ウェスタン・ブロッティングを行う。すなわち、SDS-PAGE
gelをPVDF膜に転写, TBStに溶解した5% スキムミルク で一夜ブロッキング、TBStで洗浄し、1次抗体(BMPEP1117R、1:1250)と1時間反応させ、TBStで洗浄する。次に2次抗体(HRP conjugated
anti-rabbit IgG、GE Healthcare、1:5000)と反応させ、TBStで洗浄し、LAS3000(富士フイルム)で検出を行う。
immunoMS法に用いるビーズの作製は以下のとおりである。磁気ビーズはMagnosphere
MS300/Carboxylタイプ(JSR社)で10 mg
beads/mLのスラリーとして供給される。MESは0.1 M
MES (pH 5.0、NaOHでpH調整)として用い、EDCは1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide hydrochloride であり、10 mg/mL (52.2 mM)の濃度に氷冷したMESに用時溶解して調製する。ビーズスラリーを分散させ、1 mL (10 mg beads)をマイクロチューブ(2.0 mL)に取る。磁気スタンドで放置し、上清を除去する。MESを1.0 mL加え、撹拌した後、上清を除去し、抗体であるBMPEP1117R溶液を加えて室温でゆるやかに攪拌する。EDCを100 μL加え、室温でゆるやかに攪拌して反応させる。TBStで洗浄することを4回繰り返した後、TBSt 1 mLを加えて4℃に保存する。
acetonitrileに溶解した100 fmol/μLの安定同位体標識ペプチド2 μLを血清25
μLに加える。これをAとする。安定同位体標識ペプチドはRLAILPASAPPATSNPDの6番目のPを13Cおよび15Nで全て置換したもので、非標識ペプチドの平均m/z [M+H]+が1691.93であるのに対し、標識ペプチドの平均m/z [M+H]+は1697.89である。本法では血清中の糖鎖付加型ペプチド平均m/z 2422を測定するのが目的なので、血清ではきわめて低値の糖鎖非付加型のRLAILPASAPPATSNPDペプチドを標準化に用いることが可能であるが、場合によってその値が変動しないとも限らないので、標準化の目的で安定同位体標識体を用いた。
NaClと0.2% octylglucosideを含む100
mM Tris-HCl (pH 7.5) (×2 TBS)を500
μL加えてサンプル溶液とする。
bicarbonate (pH 7.5)で洗浄する。次いで2-propanol : H2O : formic acid
(4:4:1) を50 μL加えて対象のペプチドを溶出する。同じ溶液で容器を洗って計100 μLとして回収した後、遠心真空ポンプ乾固する。乾固した後、0.095 % TFA-5 % acetonitrile溶液を20 μL加えて超音波で再溶解し、C18チップ(PerfectPure C18 Tip)にペプチドを吸着させ、0.1% TFAでチップを洗浄した後、0.1% TFA-50% acetonitrile
2 μLでペプチドを溶出して質量分析用ターゲットプレートに添加して乾燥させる。次いで、マトリクス溶液を載せる。すなわち0.3 mg/mL CHCAのethanol: acetone (2:1)溶液 1 μLをターゲットプレート上の乾燥したサンプルに滴下し、乾燥させる。
2.47 (2)、脂肪肝:6.36, 5.18 (5)、NASH:17.10, 9.11 (13)、慢性肝炎:17.93, 13.82 (2)。
図4は図3の脂肪肝とNASHにおける結果を散布図としたもので、前述のように平均値はそれぞれ6.36
fmol/μL、17.10 fmol/μL で、t-検定を行うと、p値は0.026となり、NASH患者では脂肪肝患者より有意にインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチド(配列番号3)の血清中濃度が高いことがいえる。すなわち、このペプチドはNASH患者を検出する上で有用なマーカーとなる。また図5は脂肪肝とNASHの鑑別診断能を受信者動作特性(ROC: Receiver Operating Characteristics)曲線とそのArea Under Curve (AUC)の面積を示したもので、AUCが0.862であり、インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチドは脂肪肝とNASHを鑑別診断できる有用な診断マーカーであることを示している。なお、図5ではインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチド(配列番号3)をp35 peptideと略称している。
常法にしたがい、エピトープを異にする2種類の抗体で抗原を挟む形のサンドイッチ法を構築する。抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。以下にポリクローナル抗体の場合について記載する。
(217-236)を抗原として実施例1の方法にしたがってC末端に特異的な抗体(BMPEP1117C)を作製した。ただし、精製は抗血清からtotal IgGを取得する精製であった。BMPEP1117R が35 kDaタンパク質断片を捕捉する実験はBMPEP1117Rを常法にしたがってdimethyl pimelimidate
(DMP) を用いてProtein G Sepharoseビーズにクロスリンクして得たビーズ(ビーズの湿容量の2倍容量のTBSを加えて懸濁液として保存する)を用いて行った。このビーズを抗体ビーズと称する。
1 mLを加えて混和し、上述の抗体ビーズ懸濁液30 μLを加える。室温で2時間ゆるやかに攪拌した後、全体をスピンカラムに移す。遠心後TBSを加えて遠心するビーズの洗浄操作を繰り返した後、遠心して上清を除去する。ろ過面上に残った抗体ビーズに結合しているタンパク質断片を0.2 M glycine-HCl (pH 2.5)
100 μLで溶出する。これを繰り返して計200 μLの上清を得る。1 M Trisを加えて中和し、YM10でbufferをPBS (pH 7.5) に交換、遠心を繰り返して40 μLまで濃縮する。これをサンプルとして10% acrylamide ゲルでSDS-PAGEを行う。次いで、1次抗体をBMPEP1117C、1:1000とし、2次抗体をHRP conjugated anti-rabbit IgG、GE Healthcare、1:5000としてウエスタン・ブロッティングを行う。
kDaタンパク質断片(配列番号2)測定のためのELISAの構築が可能であることが示された。
Claims (15)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質またはペプチドから生じるアミノ酸残基5個以上のタンパク質断片またはペプチド断片からなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカー。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質またはペプチドから生じるアミノ酸残基5個以上のタンパク質断片またはペプチド断片からなる非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカー。
- 生体試料中の請求項1および2のいずれか1項に記載の少なくとも1つの非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーを測定することを含む、非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
- 生体試料中の請求項3および4のいずれか1項に記載の少なくとも1つの非アルコール性脂肪性肝炎バイオマーカーを測定することを含む、非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
- 生体試料中の請求項1および2のいずれか1項に記載の少なくとも1つの非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患していると判断する非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
- 生体試料中の請求項3および4のいずれか1項に記載の少なくとも1つの非アルコール性脂肪性肝炎バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患していると判断する非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
- 検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる請求項5および7のいずれか1項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
- 検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる請求項6および8のいずれか1項に記載の非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
- 請求項1および2のいずれか1項に記載の少なくとも1つのバイオマーカーを測定するための非アルコール性脂肪性肝疾患の検出キット。
- 請求項3および4のいずれか1項に記載の少なくとも1つのバイオマーカーを測定するための非アルコール性脂肪性肝炎の検出キット。
- 請求項1および2のいずれか1項に記載の少なくとも1つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む非アルコール性脂肪性肝疾患の検出キット。
- 請求項3および4のいずれか1項に記載の少なくとも1つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む非アルコール性脂肪性肝炎の検出キット。
- 抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている請求項13または14に記載の検出キット。
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