ES2706539T3 - Método de diagnóstico in vitro de la Enfermedad de Alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo - Google Patents

Método de diagnóstico in vitro de la Enfermedad de Alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo Download PDF

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Abstract

Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas: a) determinar en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) el contenido de mercaptoalbúmina (HMA); y b) comparar el contenido determinado en a) con el contenido de HMA en LCR en sujetos sanos.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de diagnóstico in vitro de la Enfermedad de Alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo
La presente invención se refiere al sector del diagnóstico clínico, y en particular se refiere a un método para el diagnóstico in vitro de la Enfermedad de Alzheimer (EA) basado en la determinación del nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo (LCR), en particular del contenido de mercaptoalbúmina (HMA), que es la forma reducida de la albúmina que tiene la cisteína Cys-34 en forma de grupo tiol libre.
La EA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que se caracteriza en su forma típica por una pérdida de la memoria inmediata y de otras capacidades mentales (tales como las capacidades cognitivas superiores), a medida que mueren las neuronas y se atrofian diferentes zonas del cerebro. La enfermedad suele tener una duración media aproximada después del diagnóstico de 10 años, aunque dicha duración puede variar en proporción directa con la severidad de la enfermedad al momento del diagnóstico.
La EA es la forma más común de demencia, es incurable y terminal, y aparece con mayor frecuencia en personas mayores de 65 años de edad, aunque también en raros casos puede desarrollarse desde los 40 años.
Por lo general, el síntoma inicial es la inhabilidad de adquirir nuevos recuerdos, pero suele confundirse con actitudes relacionadas con la vejez o el estrés. Ante la sospecha de EA, los procedimientos de diagnóstico clínico disponibles en vida del enfermo hasta la fecha se basan en directrices y criterios establecidos por el National Institute of Neurological Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related disorders Association (NINCDS-ADRDA) (Mc Khann y otros, 1984), fundamentados básicamente en el juicio clínico según los resultados de tests neuropsicológicos, informes del entorno del enfermo y evaluación neurológica general. El examen neurológico puede incluir también un estudio de imágenes del cerebro (neuroimagen).
Actualmente, no existe un método de diagnóstico definitivo de la EA, a excepción del análisis histológico realizado post-mortem al cerebro del paciente.
Por otra parte, es conocido que la albúmina humana es una proteína no glicosilada de 66 kDa. Cuantitativamente, es la proteína más importante del plasma sanguíneo y su concentración en el plasma normal se encuentra entre 35 y 50 g/L, constituyendo hasta el 60% del total de las proteínas plasmáticas (Peters T. J.: All About Albumin; Biochemistry, Genetics and Medical Applications. Academic Press, San Diego, 1996). De igual modo, en el LCR la albúmina es también la proteína más abundante, constituyendo alrededor del 67% de las proteínas totales presentando una concentración alrededor de 200 mg/L (Edward J. Thompson, 2005, The roster of CSF proteins, PROTEINS OF THE CEREBROSPINAL FLUID: Analysis and Interpretation in the Diagnosis and Treatment of Neurological Disease, 2nd Ed. London, UK: Elsevier Academic Press.: 13-31).
La estructura de la albúmina humana consiste en un polipéptido de 585 aminoácidos y aproximadamente un 67% de hélices alfa sin estar presentes hojas beta (Otagiri M., Chuang V.T. Pharmaceutically important pre- and posttranslational modifications of human serum albumin. Biol Pharm Bull 2009; 32:527-534). La albúmina humana contiene 6 residuos de metionina y 35 de cisteína, estos últimos implicados en la formación de 17 enlaces disulfuro. La Cys-34 es la única cisteína libre en toda la molécula. La albúmina humana presenta funciones antioxidantes específicas debido a su capacidad de unión a múltiples ligandos y propiedades de captura de radicales, ambas estrechamente relacionadas con su estructura.
Aunque existen muchas posibilidades de oxidación de la albúmina, la Cys-34 es un sitio particularmente sensible a la oxidación/reducción. Por lo tanto, en general, es legítimo hablar del estado redox de la albúmina en términos de Cys-34. Mediante la separación cromatográfica de la albúmina, se obtienen tres fracciones según el estado redox de la Cys-34 (Peters, 1996 citado anteriormente):
(i) la forma reducida con la cisteína en forma de grupo tiol libre, denominada mercaptoalbúmina humana (HMA); (ii) la forma oxidada con la cisteína formando un enlace disulfuro con un compuesto pequeño que contenga un grupo tiol, principalmente cisteína o cisteinilglicina, aunque también con homocisteína y glutatión, denominada no mercaptoalbúmina humana 1 (HNA1); y
(iii) la forma más oxidada con la cisteína como ácido sulfínico o sulfónico, denominada no mercaptoalbúmina humana 2 (HNA2).
En una persona sana saludable, aproximadamente el 61-69% de la albúmina total en plasma se encuentra en forma de HMA, el 27-35% en forma de HNA1 y el 3-5% en forma de HNA2 (Oettl K., y otros. Oxidative damage of albúmina in advanced liver disease. Biochim Biophys. Acta 2008; 1782: 469-473; Oettl K. y Marsche G. Redox State of Human Serum Albumin in Terms of Cysteine-34 in Health and Disease. Methods Enzymol. 2010; 474:181-95; y Oettl K. y otros. Oxidative albúmina damage in chronic liver failure: relation to albúmina binding capacity; liver dysfunction and survival. J Hepatol, 2013, 59:978-983). Por lo general, se cree que la oxidación de HMA a HNA1 es reversible, mientras que la oxidación a HNA2 resulta en un proceso irreversible. La albúmina puede sufrir diversas modificaciones estructurales, lo que hace que se modifique su conformación y, por tanto, sus propiedades de unión, así como su estado redox (Oettl, K. y otros, 2010 citado anteriormente).
El documento WO 2013/024100 da a conocer el diagnóstico, prevención o tratamiento de condiciones médicas asociadas al estrés oxidativo, en particular enfermedades hepáticas, mediante la cuantificación del nivel de no mercaptoalbúmina humana-2 (la fracción de albúmina que se oxida de forma irreversible en la cisteína 34).
El documento WO 2006/110621 da a conocer un método para el diagnóstico del estado de la Enfermedad de Alzheimer en un individuo. El método implica proporcionar una base de datos que contiene información relacionada con los niveles de expresión de proteínas asociadas y no asociadas con la EA.
La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que, en pacientes diagnosticados en vida con la EA, el contenido de la forma reducida de la albúmina (HMA) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) es muy inferior en comparación con sujetos sanos control de rango de edad equivalente. Este comportamiento no fue observado para el contenido de HMA en el plasma sanguíneo, también comparándolo con sujetos sanos control de rango de edad equivalente. De esta manera, también se puede decir que se ha descubierto que en pacientes diagnosticados en vida con la EA, la diferencia o cociente entre el nivel de HMA en el LCR y en el plasma está aumentada en comparación con la misma diferencia en sujetos sanos control de rango de edad equivalente. Por tanto, los dos marcadores mencionados anteriormente, es decir el contenido de HMA en el LCR y la diferencia o cociente entre el nivel de HMA en el LCR y el plasma, son útiles para el diagnóstico de la EA.
Tal y como se ha comentado anteriormente, el test diagnóstico definitivo para la EA debe realizarse post-mortem, por lo que el diagnóstico en vida se basa en el juicio clínico según los resultados de test neurológicos, informes del entorno del enfermo y evaluación neurológica general. Así pues, el test de la presente invención representa una herramienta de diagnóstica objetiva, cuantificable, fácilmente interpretable, fiable, reproducible entre distintos centros diagnósticos, de relativo bajo coste y no influenciada por aspectos culturales, como por ejemplo el nivel educacional del paciente, como ocurre con ciertos test neuropsicológicos.
Tal como se utiliza en el presente documento “sujeto sano” y su plural, se refieren a sujetos que no padecen la EA.
Por lo tanto, la presente invención, en un primer aspecto, se refiere a un método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
(a) determinar en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente el contenido de mercaptoalbúmina (HMA); y
(b) comparar el contenido determinado en a) con el contenido de HMA en LCR en sujetos sanos.
En una realización preferente, en la etapa b) del método de la presente invención si el contenido de HMA determinado en la etapa a) es menor al de los sujetos sanos, es indicativo de la EA, más preferentemente, el paciente se diagnostica con la EA.
En una realización preferente, tanto el paciente como los sujetos sanos mencionados anteriormente son seres humanos, más preferentemente seres humanos adultos.
En otra realización preferente, el contenido de HMA en LCR se mide mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y detección por fluorescencia (FLD) utilizando como longitudes de onda de excitación y emisión 280 y 340 nm respectivamente, en base a la metodología descrita por Oettl K., 2010 (supra). La cuantificación de HMA se realiza teniendo en cuenta la altura del pico de interés obtenido en el correspondiente cromatograma.
El valor de corte, determinado mediante el cálculo de la curva ROC tras ajustar a valores máximos los porcentajes de sensibilidad (91%) y especificidad (100%), por debajo del cual se considera que el contenido de HMA medido en la etapa a) es indicativo de la EA y/o que conduce al diagnóstico de la EA en el paciente es, preferentemente, del 37% (p/v).
En una segunda realización la presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
a) determinar el contenido de mercaptoalbúmina (HMA) en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) y una muestra de sangre o plasma de un paciente;
b) determinar una diferencia o cociente entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a); y
c) comparar la diferencia o cociente determinada en la etapa b) con la correspondiente diferencia o cociente en sujetos sanos.
En la etapa b) del método de acuerdo con esta segunda realización, se contempla que la diferencia determinada sea: la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a); o la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma y el contenido de HMA en la muestra de LCR determinados en la etapa a). En una realización preferente, en la etapa b) se determina la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a) en forma de cociente (valor de HMA en plasma/valor de HMA en LCR).
Cuando en la etapa b) se determina la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a), en una realización preferente, en la etapa c) del método de la presente invención si la diferencia determinada en la etapa b), tal como por ejemplo, el cociente del valor de HMA en plasma / valor de HMA en LCR (HMA plasma/HMA LCR) es mayor al de los sujetos sanos, es indicativo de la EA, más preferentemente, el paciente se diagnostica con la EA. En caso de que la diferencia determinada sea otra, el experto en la materia realizará las adaptaciones necesarias al método de la presente invención (por ejemplo, en relación con la comparación con el correspondiente valor de la diferencia en sujetos sanos).
Adicionalmente, y de forma preferente, la muestra de sangre o plasma es una muestra de plasma.
En una realización preferente, tanto el paciente como los sujetos sanos mencionados anteriormente son seres humanos, más preferentemente seres humanos adultos.
En otra realización preferente, el contenido de HMA en LCR se mide mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y detección por fluorescencia (FLD) utilizando como longitudes de onda de excitación y emisión 280 y 340 nm respectivamente, en base a la metodología descrita por Oettl K., 2010 (supra). La cuantificación de HMA se realiza teniendo en cuenta la altura del pico de interés obtenido en el correspondiente cromatograma.
El valor de corte, determinado mediante el cálculo de la curva ROC tras ajustar a valores máximos (100%) los porcentajes de sensibilidad y especificidad, a partir del cual se considera que la diferencia determinada en la etapa b), tal como por ejemplo, el cociente del valor de HMA en plasma / valor de HMA en LCR (HMA plasma/HMA LCR) es indicativa de la EA y/o que conduce al diagnóstico de la EA en el paciente es, preferentemente, es de 1,1.
Para una mejor comprensión, la presente invención se describe en más detalle a continuación en referencia a las figuras adjuntas, que se presentan a título de ejemplo, y en referencia a ejemplos ilustrativos y no limitativos.
La figura 1 muestra la cantidad de HMA, por medio de la altura del pico de la HMA (en porcentaje), obtenido para muestras de plasma y LCR de controles (sujetos sanos, de acuerdo a lo definido anteriormente) y de pacientes con la EA. En el eje de ordenadas (eje “y”) se muestra la altura del pico de la HMA (en porcentaje) y en el eje de abscisas (eje “x”) se muestra el grupo (a la izquierda los controles sanos y a la derecha los enfermos de EA). Adicionalmente, para cada uno de los grupos, a la izquierda se muestran los resultados obtenidos para las muestras de LCR y a la derecha los resultados obtenidos para las muestras de plasma.
Es evidente para un experto en la materia que si el contenido de HMA en LCR en pacientes que presentan la EA es inferior al contenido de HMA en LCR de pacientes sanos, el contenido de las dos fracciones restantes de albúmina según el estado redox de la Cys-34, es decir, de la HNA1 y/o de la HNA2, también se verá afectado y puede servir también como indicativo de la EA.
EJEMPLO
Ejemplo 1. Estudio del diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer midiendo el contenido de HMA en LCR o la diferencia entre dicho contenido y el contenido de HMA en plasma.
En el marco de un estudio multicéntrico, aleatorizado, a ciegas, controlado en 42 pacientes que estaban siendo tratados con albúmina terapéutica y que fueron diagnosticados con EA de leve a moderada, se realizó el presente estudio para analizar el contenido de HMA en LCR y la diferencia entre dicho contenido y el contenido de HMA en plasma.
Para ello se midió el contenido de HMA en muestras basales (antes del inicio del estudio clínico) de los pacientes mencionados anteriormente, tanto en LCR (N=34) como en plasma (N=37), además de en LCR (N=16) y plasma (N=37) de sujetos sanos. Las muestras mencionadas anteriormente, en todos los casos se obtuvieron mediante punción lumbar en el caso del LCR y mediante extracción de sangre y posterior separación del plasma, en el caso de las muestras plasmáticas, siempre siguiendo los procedimientos médicos estándar establecidos para este fin. Las muestras de LCR y plasma mencionadas fueron alicuotadas y congeladas a una temperatura igual o menor a -70°C inmediatamente tras su extracción. Previamente al análisis del contenido en HMA, las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente y en el caso de las muestras de plasma, la concentración de albúmina fue determinada por inmunonefelometría u otro método equivalente. El contenido de HMA se midió directamente en las muestras de LCR mientras que las muestras de plasma se diluyeron hasta una concentración inferior a 10 mg/ml en tampón fosfato pH 6,87. Seguidamente se procedió al análisis de las formas oxidadas de la albúmina por HPLCFLD, tal como se ha descrito anteriormente.
Los resultados obtenidos aparecen resumidos en la figura 1. Tal como se puede observar en dicha figura, los pacientes con EA presentan una gran disminución en el contenido de HMA en LCR en comparación con los sujetos sanos, mientras que en plasma la disminución es ligeramente menor. De lo anterior se deduce no solo el potencial diagnóstico del contenido de HMA en LCR sino también de la diferencia entre dicho contenido y el contenido de HMA en plasma.
La mediana del contenido de HMA obtenido para los pacientes con EA en LCR es del 9,6%, mientras que la mediana del contenido en plasma es del 54,1%, siendo el cociente de (HMA plasma/HMA LCR) de 5,64. Para los sujetos sanos en cambio, la mediana del contenido de HMA en LCR es del 77,4% y la de plasma del 65,6%, siendo el cociente (HMA plasma/HMA LCR) de 0,85.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
a) determinar en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) el contenido de mercaptoalbúmina (HMA); y b) comparar el contenido determinado en a) con el contenido de HMA en LCR en sujetos sanos.
2. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 1, caracterizado por que en la etapa b) si el contenido de HMA determinado en la etapa a) es menor al de los sujetos sanos es indicativo de la EA.
3. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 2, caracterizado por que en la etapa b) si el contenido de HMA determinado en la etapa a) es menor al de los sujetos sanos el paciente se diagnostica con la EA.
4. Método de diagnóstico in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el valor de corte de contenido de HMA por debajo del cual se considera que es indicativo de la EA y/o que conduce al diagnóstico de la EA es de 37%.
5. Método de diagnóstico in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la muestra proviene de un ser humano.
6. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho ser humano es un ser humano adulto.
7. Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
a) determinar el contenido de mercaptoalbúmina (HMA) en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) y en una muestra de sangre o plasma de un paciente;
b) determinar una diferencia o cociente entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a); y
c) comparar la diferencia o cociente determinada en la etapa b) con la correspondiente diferencia o cociente en sujetos sanos.
8. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 7, caracterizado por que en la etapa b) se determina la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a) en forma de cociente del valor de HMA en plasma / HMA en LCR (HMA plasma/HMA LCR).
9. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 7, caracterizado por que en la etapa c) del método de la presente invención si la diferencia determinada en la etapa b) es mayor al de los sujetos sanos, es indicativo de la EA.
10. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 9, caracterizado por que en la etapa c) del método de la presente invención si la diferencia determinada en la etapa b) es mayor al de los sujetos sanos el paciente se diagnostica con la EA.
11. Método de diagnóstico in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por que el valor de corte del cociente (HMA plasma/HMA LCR) por encima del cual se considera que es indicativo de la EA y/o que conduce al diagnóstico de la EA es de 1,1.
12. Método de diagnóstico in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por que la muestra de sangre o plasma es una muestra de plasma.
13. Método de diagnóstico in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por que la muestra proviene de un ser humano.
14. Método de diagnóstico in vitro, según la reivindicación 13, caracterizado por que dicho ser humano es un ser humano adulto.
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