ES2600386B1 - Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo - Google Patents

Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo Download PDF

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Abstract

Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo.#La presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las etapas de: a) determinar en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) el contenido de mercaptoalbúmina (HMA); y b) comparar el contenido determinado con el contenido de HMA en LCR de sujetos sanos. Si el contenido de HMA es menor que el de los sujetos sanos es indicativo de la EA.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de diagnostico in vitro de la Enfermedad de Alzheimer basado en el nivel redox de la albumina en el liquido cefalorraquideo
La presente invencion se refiere al sector del diagnostico clfnico, y en particular se refiere a un metodo para el diagnostico in vitro de la Enfermedad de Alzheimer (EA) basado en la determinacion del nivel redox de la albumina en el liquido cefalorraquideo (LCR), en particular del contenido de mercaptoalbumina (HMA), que es la forma reducida de la albumina que tiene la cisteina Cys-34 en forma de grupo tiol libre.
La EA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que se caracteriza en su forma tipica por una perdida de la memoria inmediata y de otras capacidades mentales (tales como las capacidades cognitivas superiores), a medida que mueren las neuronas y se atrofian diferentes zonas del cerebro. La enfermedad suele tener una duracion media aproximada despues del diagnostico de 10 anos, aunque dicha duracion puede variar en proporcion directa con la severidad de la enfermedad al momento del diagnostico.
La EA es la forma mas comun de demencia, es incurable y terminal, y aparece con mayor frecuencia en personas mayores de 65 anos de edad, aunque tambien en raros casos puede desarrollarse desde los 40 anos.
Por lo general, el sintoma inicial es la inhabilidad de adquirir nuevos recuerdos, pero suele confundirse con actitudes relacionadas con la vejez o el estres. Ante la sospecha de EA, los procedimientos de diagnostico clfnico disponibles en vida del enfermo hasta la fecha se basan en directrices y criterios establecidos por el National Institute of Neurological Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related disorders Association (NINCDS- ADRDA) (Mc Khann y otros, 1984), fundamentados basicamente en el juicio clfnico segun los resultados de tests neuropsicologicos, informes del entorno del enfermo y evaluacion neurologica general. El examen neurologico puede incluir tambien un estudio de imagenes del cerebro (neuroimagen).
Actualmente, no existe un metodo de diagnostico definitivo de la EA, a excepcion del analisis histologico realizado post-mortem al cerebro del paciente.
Por otra parte, es conocido que la albumina humana es una proteina no glicosilada de 66 kDa. Cuantitativamente, es la proteina mas importante del plasma sanguineo y su concentracion en el plasma normal se encuentra entre 35 y 50 g/L, constituyendo hasta el 60% del total de las proteinas plasmaticas (Peters T. J.: All About Albumin; Biochemistry, Genetics and Medical Applications. Academic Press, San Diego, 1996). De igual modo, en el LCR la albumina es tambien la proteina mas abundante, constituyendo alrededor del 67% de las proteinas totales presentando una concentracion alrededor de 200 mg/L (Edward J. Thompson, 2005, The roster of CSF proteins, PROTEINS OF THE CEREBROSPINAL FLUID: Analysis and Interpretation in the Diagnosis and Treatment of Neurological Disease, 2nd Ed. London, UK: Elsevier Academic Press.: 13-31).
La estructura de la albumina humana consiste en un polipeptido de 585 aminoacidos y aproximadamente un 67% de helices alfa sin estar presentes hojas beta (Otagiri M., Chuang V.T. Pharmaceutically important pre- and posttranslational modifications of human serum albumin. Biol Pharm Bull 2009; 32:527-534). La albumina humana contiene 6 residuos de metionina y 35 de cisteina, estos ultimos implicados en la formacion de 17 enlaces disulfuro. La Cys-34 es la unica cisteina libre en toda la molecula. La albumina humana presenta
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funciones antioxidantes especificas debido a su capacidad de union a multiples ligandos y propiedades de captura de radicales, ambas estrechamente relacionadas con su estructura.
Aunque existen muchas posibilidades de oxidacion de la albumina, la Cys-34 es un sitio particularmente sensible a la oxidacion/reduccion. Por lo tanto, en general, es legitimo hablar del estado redox de la albumina en terminos de Cys-34. Mediante la separacion cromatografica de la albumina, se obtienen tres fracciones segun el estado redox de la Cys-34 (Peters, 1996 citado anteriormente):
(i) la forma reducida con la cisteina en forma de grupo tiol libre, denominada mercaptoalbumina humana (HMA);
(ii) la forma oxidada con la cisteina formando un enlace disulfuro con un compuesto pequeno que contenga un grupo tiol, principalmente cisteina o cisteinilglicina, aunque tambien con homocisteina y glutation, denominada no mercaptoalbumina humana 1 (HNA1); y
(iii) la forma mas oxidada con la cisteina como acido sulfinico o sulfonico, denominada no mercaptoalbumina humana 2 (HNA2).
En una persona sana saludable, aproximadamente el 61-69% de la albumina total en plasma se encuentra en forma de HMA, el 27-35% en forma de HNA1 y el 3-5% en forma de HNA2 (Oettl K., y otros. Oxidative damage of albumina in advanced liver disease. Biochim Biophys. Acta 2008; 1782: 469-473; Oettl K. y Marsche G. Redox State of Human Serum Albumin in Terms of Cysteine-34 in Health and Disease. Methods Enzymol. 2010; 474:181-95; y Oettl K. y otros. Oxidative albumina damage in chronic liver failure: relation to albumina binding capacity; liver dysfunction and survival. J Hepatol, 2013, 59:978-983). Por lo general, se cree que la oxidacion de HMA a HNA1 es reversible, mientras que la oxidacion a HNA2 resulta en un proceso irreversible.
La albumina puede sufrir diversas modificaciones estructurales, lo que hace que se modifique su conformacion y, por tanto, sus propiedades de union, asi como su estado redox (Oettl, K. y otros, 2010 citado anteriormente).
La presente invencion se basa en el descubrimiento sorprendente de que, en pacientes diagnosticados en vida con la EA, el contenido de la forma reducida de la albumina (HMA) en el liquido cefalorraquideo (LCR) es muy inferior en comparacion con sujetos sanos control de rango de edad equivalente. Este comportamiento no fue observado para el contenido de HMA en el plasma sanguineo, tambien comparandolo con sujetos sanos control de rango de edad equivalente. De esta manera, tambien se puede decir que se ha descubierto que en pacientes diagnosticados en vida con la EA, la diferencia o cociente entre el nivel de HMA en el LCR y en el plasma esta aumentada en comparacion con la misma diferencia en sujetos sanos control de rango de edad equivalente. Por tanto, los dos marcadores mencionados anteriormente, es decir el contenido de HMA en el LCR y la diferencia o cociente entre el nivel de HMA en el LCR y el plasma, son utiles para el diagnostico de la EA.
Tal y como se ha comentado anteriormente, el test diagnostico definitivo para la EA debe realizarse post-mortem, por lo que el diagnostico en vida se basa en el juicio clinico segun los resultados de test neurologicos, informes del entorno del enfermo y evaluacion neurologica general. Asi pues, el test de la presente invencion representa una herramienta de diagnostica objetiva, cuantificable, facilmente interpretable, fiable, reproducible entre distintos centros diagnosticos, de relativo bajo coste y no influenciada por aspectos culturales, como por ejemplo el nivel educacional del paciente, como ocurre con ciertos test neuropsicologicos.
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Tal como se utiliza en el presente documento “sujeto sano” y su plural, se refieren a sujetos que no padecen la EA.
Por lo tanto, la presente invencion, en un primer aspecto, se refiere a un metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
a) determinar en una muestra de liquido cefalorraquideo (LCR) humano de un paciente el contenido de mercaptoalbumina (HMA); y
b) comparar el contenido determinado en a) con el contenido de HMA en LCR en sujetos sanos.
En una realizacion preferente, en la etapa b) del metodo de la presente invencion si el contenido de HMA determinado en la etapa a) es menor al de los sujetos sanos, es indicativo de la EA, mas preferentemente, el paciente se diagnostica con la EA.
En una realizacion preferente, tanto el paciente como los sujetos sanos mencionados anteriormente son seres humanos, mas preferentemente seres humanos adultos.
En otra realizacion preferente, el contenido de HMA en LCR se mide mediante cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC) y deteccion por fluorescencia (FLD) utilizando como longitudes de onda de excitacion y emision 280 y 340 nm respectivamente, en base a la metodologia descrita por Oettl K., 2010 (supra). La cuantificacion de HMA se realiza teniendo en cuenta la altura del pico de interes obtenido en el correspondiente cromatograma.
El valor de corte, determinado mediante el calculo de la curva ROC tras ajustar a valores maximos los porcentajes de sensibilidad (91%) y especificidad (100%), por debajo del cual se considera que el contenido de HMA medido en la etapa a) es indicativo de la EA y/o que conduce al diagnostico de la EA en el paciente es, preferentemente, del 37% (p/v).
En una segunda realizacion la presente invencion se refiere a un metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
a) determinar el contenido de mercaptoalbumina (HMA) en una muestra de liquido cefalorraquideo (LCR) y una muestra de sangre o plasma de un paciente;
b) determinar una diferencia o cociente entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a); y
c) comparar la diferencia o cociente determinada en la etapa b) con la correspondiente diferencia o cociente en sujetos sanos.
En la etapa b) del metodo de acuerdo con esta segunda realizacion, se contempla que la diferencia determinada sea: la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a); o la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma y el contenido de HMA en la muestra de LCR determinados en la etapa a). En una realizacion preferente, en la etapa b) se determina la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a) en forma de cociente (valor de HMA en plasma/valor de HMA en LCR).
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Cuando en la etapa b) se determina la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a), en una realizacion preferente, en la etapa c) del metodo de la presente invencion si la diferencia determinada en la etapa b), tal como por ejemplo, el cociente del valor de HMA en plasma / valor de HMA en LCR (HMA plasma/HMA LCR) es mayor al de los sujetos sanos, es indicativo de la EA, mas preferentemente, el paciente se diagnostica con la EA. En caso de que la diferencia determinada sea otra, el experto en la materia realizara las adaptaciones necesarias al metodo de la presente invencion (por ejemplo, en relacion con la comparacion con el correspondiente valor de la diferencia en sujetos sanos).
Adicionalmente, y de forma preferente, la muestra de sangre o plasma es una muestra de plasma.
En una realizacion preferente, tanto el paciente como los sujetos sanos mencionados anteriormente son seres humanos, mas preferentemente seres humanos adultos.
En otra realizacion preferente, el contenido de HMA en LCR se mide mediante cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC) y deteccion por fluorescencia (FLD) utilizando como longitudes de onda de excitacion y emision 280 y 340 nm respectivamente, en base a la metodologia descrita por Oettl K., 2010 (supra). La cuantificacion de HMA se realiza teniendo en cuenta la altura del pico de interes obtenido en el correspondiente cromatograma.
El valor de corte, determinado mediante el calculo de la curva ROC tras ajustar a valores maximos (100%) los porcentajes de sensibilidad y especificidad, a partir del cual se considera que la diferencia determinada en la etapa b), tal como por ejemplo, el cociente del valor de HMA en plasma / valor de HMA en LCR (HMA plasma/HMA LCR) es indicativa de la EA y/o que conduce al diagnostico de la EA en el paciente es, preferentemente, es de 1,1.
Para una mejor comprension, la presente invencion se describe en mas detalle a continuacion en referencia a las figuras adjuntas, que se presentan a titulo de ejemplo, y en referencia a ejemplos ilustrativos y no limitativos.
La figura 1 muestra la cantidad de HMA, por medio de la altura del pico de la HMA (en porcentaje), obtenido para muestras de plasma y LCR de controles (sujetos sanos, de acuerdo a lo definido anteriormente) y de pacientes con la EA. En el eje de ordenadas (eje “y”) se muestra la altura del pico de la HMA (en porcentaje) y en el eje de abscisas (eje “x”) se muestra el grupo (a la izquierda los controles sanos y a la derecha los enfermos de EA). Adicionalmente, para cada uno de los grupos, a la izquierda se muestran los resultados obtenidos para las muestras de LCR y a la derecha los resultados obtenidos para las muestras de plasma.
Es evidente para un experto en la materia que si el contenido de HMA en LCR en pacientes que presentan la EA es inferior al contenido de HMA en LCR de pacientes sanos, el contenido de las dos fracciones restantes de albumina segun el estado redox de la Cys-34, es decir, de la HNA1 y/o de la HNA2, tambien se vera afectado y puede servir tambien como indicativo de la EA.
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EJEMPLO
Ejemplo 1. Estudio del diagnostico de la enfermedad de Alzheimer midiendo el contenido de HMA en LCR o la diferencia entre dicho contenido y el contenido de HMA en plasma.
En el marco de un estudio multicentrico, aleatorizado, a ciegas, controlado en 42 pacientes que estaban siendo tratados con albumina terapeutica y que fueron diagnosticados con EA de leve a moderada, se realizo el presente estudio para analizar el contenido de HMA en LCR y la diferencia entre dicho contenido y el contenido de HMA en plasma.
Para ello se midio el contenido de HMA en muestras basales (antes del inicio del estudio clinico) de los pacientes mencionados anteriormente, tanto en LCR (N=34) como en plasma (N=37), ademas de en LCR (N=16) y plasma (N=37) de sujetos sanos. Las muestras mencionadas anteriormente, en todos los casos se obtuvieron mediante puncion lumbar en el caso del LCR y mediante extraccion de sangre y posterior separacion del plasma, en el caso de las muestras plasmaticas, siempre siguiendo los procedimientos medicos estandar establecidos para este fin.
Las muestras de LCR y plasma mencionadas fueron alicuotadas y congeladas a una temperatura igual o menor a -70°C inmediatamente tras su extraccion. Previamente al analisis del contenido en HMA, las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente y en el caso de las muestras de plasma, la concentracion de albumina fue determinada por inmunonefelometria u otro metodo equivalente. El contenido de HMA se midio directamente en las muestras de LCR mientras que las muestras de plasma se diluyeron hasta una concentracion inferior a 10 mg/ml en tampon fosfato pH 6,87. Seguidamente se procedio al analisis de las formas oxidadas de la albumina por HPLC-FLD, tal como se ha descrito anteriormente.
Los resultados obtenidos aparecen resumidos en la figura 1. Tal como se puede observar en dicha figura, los pacientes con EA presentan una gran disminucion en el contenido de HMA en LCR en comparacion con los sujetos sanos, mientras que en plasma la disminucion es ligeramente menor. De lo anterior se deduce no solo el potencial diagnostico del contenido de HMA en LCR sino tambien de la diferencia entre dicho contenido y el contenido de HMA en plasma.
La mediana del contenido de HMA obtenido para los pacientes con EA en LCR es del 9,6%, mientras que la mediana del contenido en plasma es del 54,1%, siendo el cociente de (HMA plasma/HMA LCR) de 5,64. Para los sujetos sanos en cambio, la mediana del contenido de HMA en LCR es del 77,4% y la de plasma del 65,6%, siendo el cociente (HMA plasma/HMA LCR) de 0,85.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
    a) determinar en una muestra de lfquido cefalorraqudeo (LCR) el contenido de mercaptoalbumina (HMA); y
    b) comparar el contenido determinado en a) con el contenido de HMA en LCR en sujetos sanos.
  2. 2. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 1, caracterizado porque en la etapa b) si el contenido de HMA determinado en la etapa a) es menor al de los sujetos sanos es indicativo de la EA.
  3. 3. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 2, caracterizado porque en la etapa b) si el contenido de HMA determinado en la etapa a) es menor al de los sujetos sanos el paciente se diagnostica con la EA.
  4. 4. Metodo de diagnostico in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el valor de corte de contenido de HMA por debajo del cual se considera que es indicativo de la EA y/o que conduce al diagnostico de la EA es de 37%.
  5. 5. Metodo de diagnostico in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra proviene de un ser humano.
  6. 6. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 5, caracterizado porque dicho ser humano es un ser humano adulto.
  7. 7. Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende las siguientes etapas:
    a) determinar el contenido de mercaptoalbumina (HMA) en una muestra de lfquido cefalorraqufdeo (LCR) y en una muestra de sangre o plasma de un paciente;
    b) determinar una diferencia o cociente entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a); y
    c) comparar la diferencia o cociente determinada en la etapa b) con la correspondiente diferencia o cociente en sujetos sanos.
  8. 8. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 7, caracterizado porque en la etapa b) se determina la diferencia entre el contenido de HMA en la muestra de LCR y el contenido de HMA en la muestra de sangre o plasma determinados en la etapa a) en forma de cociente del valor de HMA en plasma / HMA en LCR (HMA plasma/HMA LCR).
  9. 9. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 7, caracterizado porque en la etapa c) del metodo de la presente invencion si la diferencia determinada en la etapa b) es mayor al de los sujetos sanos, es indicativo de la EA.
  10. 10. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 9, caracterizado porque en la etapa c) del metodo de la presente invencion si la diferencia determinada en la etapa b) es mayor al de los sujetos sanos el paciente se diagnostica con la EA.
  11. 11. Metodo de diagnostico in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque el valor de corte del cociente (HMA plasma/HMA LCR) por encima del cual se considera que es indicativo de la EA y/o que conduce al diagnostico de la EA es de 1,1.
    5 12. Metodo de diagnostico in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la
    muestra de sangre o plasma es una muestra de plasma.
  12. 13. Metodo de diagnostico in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la muestra proviene de un ser humano.
    10
  13. 14. Metodo de diagnostico in vitro, segun la reivindicacion 13, caracterizado porque dicho ser humano es un ser humano adulto.
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