ES2873509T3 - Biomarcadores de neurotraumatismo y traumatoma de astrocitos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar o monitorizar el estado de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto superviviente, comprendiendo el procedimiento: (a) poner en contacto una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto con reactivos para analizar un marcador de TBI seleccionado de aldolasa C (ALDOC), o un producto de degradación específico de traumatismo (BDP) de ALDOC, donde el BDP de ALDOC es seleccionado de entre el grupo que consiste en un fragmento de 38 kDa, un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa y un fragmento de 23 kDa; (b) medir la cantidad de marcador presente en la muestra en comparación con una muestra de control; y (c) determinar la presencia de TBI cuando está presente una cantidad elevada de marcador en la muestra en comparación con la muestra de control.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores de neurotraumatismo y traumatoma de astrocitos

Esta solicitud reivindica el beneficio de Estados Unidos número de solicitud de patente provisional 62/157.389, depositada el 5 de mayo de 2015.

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO A TRAVÉS DE EFS-WEB

El contenido del archivo de texto ASCII de la lista de secuencias denominada "UCLA217_SL", que tiene un tamaño de 3 kb, se creó el 5 de mayo de 2016 y se envió electrónicamente a través de EFS-Web.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones de materia, incluidos anticuerpos, sondas, kits y materiales relacionados, y su uso para la detección, la predicción temprana de la gravedad y el resultado, la monitorización de la progresión y el tratamiento del neurotraumatismo, incluida la lesión cerebral traumática (TBI, por sus siglas en inglés), la TBI leve (conmoción cerebral) y la lesión traumática de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés) y su distinción de las enfermedades neurodegenerativas crónicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Cada año, 1,7 millones de personas sufren una TBI en los EE.UU. Todos los años se producen entre 1,6 y 3,8 millones de conmociones cerebrales a menudo sin informar, lo que hace que la TBI sea una epidemia silenciosa de gran importancia. Un millón de pacientes más son evaluados por lesiones en la médula espinal cada año en los departamentos de emergencias de los EE.UU., y del 2 al 3 por ciento de los mismos sufre lesiones en la médula espinal. Las decisiones de tratamiento que salvan la vida de los pacientes con neurotraumatismo requieren un diagnóstico rápido y una evaluación de riesgos precisa y repetida debido a la evolución de la progresión de la lesión, ya que la condición de la víctima de un traumatismo cerebral generalmente cambia cada día después de una TBI. La evaluación de los pacientes con lesiones cerebrales y de la médula espinal traumáticas moderadas y graves es fundamental para una atención urgente segura, monitorizando la evolución de la lesión a fin de estar listos para responder a eventos adversos secundarios y para predecir el resultado que es una evaluación temprana del potencial de recuperación para los pacientes con neurotraumatismo. La evaluación del paciente con neurotraumatismo se ve desafiada por una amplia heterogeneidad en la gravedad entre los pacientes. La identificación de víctimas de conmociones cerebrales individuales en riesgo de complicaciones, estos son pacientes con TBI leve con síntomas persistentes o un resultado positivo en la tomografía computarizada, es una prioridad para los socorristas de atención urgente, así como para las operaciones deportivas y militares. Las lesiones cerebrales de bebés, niños y jóvenes constituyen la principal causa de muerte y discapacidad en niños en todo el mundo, sin embargo, el diagnóstico es un desafío porque los signos y síntomas de la TBI están ausentes o se superponen con enfermedades infantiles comunes. Como el cerebro en desarrollo es más sensible a la radiación ionizante de la tomografía computarizada, es imperativo reducir las tomografías computarizadas innecesarias proporcionando pruebas objetivas de biomarcadores. Además de los jóvenes, los ancianos son un grupo objetivo común de la TBI debido a las caídas, por lo que es deseable distinguir las señales de biomarcadores de la TBI de los perfiles de marcadores neurodegenerativos crónicos.

El diagnóstico y la monitorización de las víctimas de TBI es fundamental para evaluar la gravedad de la alteración cerebral y el nivel de riesgo con precisión, a fin de responder con el cuidado preventiva adecuada. En el caso de los pacientes con TBI grave, la intervención quirúrgica oportuna podría salvarles la vida. En el caso de los pacientes con TBI leve, la identificación de pacientes con conmociones cerebrales en riesgo de desarrollar dolor crónico y déficits cognitivos o psicológicos ayudará a brindar opciones de tratamiento y orientación en cuanto a las estrategias de afrontamiento, y a evitar la exposición del cerebro en recuperación a un segundo impacto. Las evaluaciones de gravedad actuales se basan principalmente en la profundidad y la duración del coma utilizando la Escala de coma de Glasgow, que varía diariamente con el curso de la lesión progresiva del paciente y está sujeta a los medicamentos que pueden ser necesarios para mantener el coma (Iankova, 2006). La TBI leve se evalúa por el momento de la inconsciencia, los síntomas cognitivos o psicológicos y de dolor que son subjetivos y pueden estar influenciados por motivos motivacionales. Las herramientas de neuroimagen, especialmente las modalidades avanzadas, son difíciles de administrar repetidamente a pacientes de cuidados intensivos y tienen diversos valores de lectura que carecen de estandarización, no están disponibles en todas partes y son de uso limitado para pacientes pediátricos y con TBI leve.

La medición de los niveles en sangre de biomarcadores químicos sustitutos puede proporcionar una herramienta más simple, objetiva y estandarizada más fácilmente como punto de partida de diagnóstico para clasificar el riesgo y las necesidades de los pacientes con TBI. Los biomarcadores de neurotraumatismo deben liberarse de forma aguda de las células cerebrales traumatizadas, ser específicos del traumatismo cerebral y mecánico, atravesar fácilmente la barrera hematoencefálica y mostrar niveles bajos o nulos en sujetos sanos.

Osuna y col. (Forensic Sci Int. 1992, 52 (2): 193-8) estudiaron índices bioquímicos post mortem en relación con estudios morfológicos en la identificación de lesiones cerebrales ante mortem. Pelsers y col. (Clin Chem. 200450 (9): 1568-75) investigaron la distribución tisular de proteínas de unión a ácidos grasos de tipo cerebral y cardíaco (B-FABP y H-FABP) en segmentos del cerebro humano y el potencial de cualquiera de las proteínas para que sirva como marcador plasmático para el diagnóstico de lesión cerebral. Hulscher y col. (Journal of Neurotrauma. 2014 31(4):4-11, carta al editor) analiza el valor diagnóstico de la proteína de unión a ácidos grasos del cerebro en la TBI. Feala y col. (J Neurotrauma. 2013 30(13):1101-16) revisaron las estrategias, bases de datos y herramientas de biología de sistemas disponibles para describir las oportunidades de aplicar la metodología actual a los conjuntos de datos de TBI existentes para identificar nuevos candidatos de biomarcadores y obtener información sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la respuesta a la TBI. El documento US2014045713 se refiere a biomarcadores útiles para diagnosticar lesiones cerebrales.

Actualmente, no existe una prueba de diagnóstico estandarizada, objetiva y sensible en uso clínico para pacientes con conmoción cerebral, que son la mayoría de los pacientes con t Bi, ni para pacientes pediátricos con sospecha de TBI. Ambas son poblaciones diana que necesitan una evaluación objetiva de riesgos para evitar que los golpes repetidos pongan al cerebro vulnerable en riesgo de sufrir daños cerebrales duraderos. Los pacientes con traumatismo de cráneo de la unidad de cuidados intensivos son otro grupo diana que puede beneficiarse del análisis repetido de muestras de sangre no invasivas para la monitorización, en lugar de complementar el tiempo y las imágenes que consumen mucho dinero, ya que se sabe que la progresión del traumatismo presenta un deterioro secundario en los días consecutivos posteriores a la lesión que podrían requerir una intervención informada. Además, sigue existiendo la necesidad de análisis repetidos de muestras de biofluidos de biomarcadores de lesiones cerebrales para determinar la evaluación de la gravedad posaguda a corto plazo y para determinar la eficacia del fármaco u otros paradigmas de tratamiento administrados a pacientes con TBI.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención satisface estas necesidades y otras, al proporcionar un procedimiento para la detección o la monitorización del estado de lesión cerebral traumática (TBI) en todo el espectro de gravedad, incluido el diagnóstico de TBI leve y/o la determinación de pacientes con TBI leve en riesgo de sufrir complicaciones, en un sujeto superviviente. El procedimiento comprende: poner en contacto una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto con reactivos para analizar un marcador de TBI seleccionado de aldolasa C (ALDOC), o un producto de degradación específico del traumatismo (BDP) de ALDOC, en donde el BDP de ALDOC se selecciona del grupo que consiste en un fragmento de 38 kDa, un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa y un fragmento de 23 kDa; medir la cantidad de marcador presente en la muestra en comparación con una muestra de control; y determinar la presencia de TBI cuando está presente una cantidad elevada de marcador en la muestra en comparación con la muestra de control. En una realización, el procedimiento comprende además poner en contacto una muestra de fluido corporal obtenido del sujeto con reactivos para analizar la proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP/FABP7), o un producto de degradación específico del traumatismo (BDP) de BLBP/FABP7. Opcionalmente, el procedimiento comprende además medir la cantidad de marcador presente en la muestra en comparación con una muestra de control, y determinar la presencia de TBI cuando está presente una cantidad elevada de marcador en la muestra en comparación con la muestra de control. Opcionalmente, el procedimiento comprende además medir la cantidad de glutamina sintetasa (GS), fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15), aB-cristalina (CRYAB/HSP27), un producto de escisión proteolítica específico del traumatismo de GS, PEA15 o CRYAB, o cualquier combinación de dos o más de las mismas. En una realización, el procedimiento comprende además medir la cantidad de un BDP de 20-30 kDa de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP).

Los ejemplos representativos del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de ALDOC incluyen un fragmento principal de 38 kDa, o un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa y un fragmento de 25 kDa. Un ejemplo del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo para BLBP/FABP7 es un producto de degradación de 3 kDa. Los ejemplos del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de GS incluyen un doblete de 37 35 kDa, un fragmento de 32 kDa, un fragmento de 23 kDa, un fragmento de 20 kDa y un fragmento de 18 kDa. Los ejemplos del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de PEA15 incluyen un doblete de 12 13 kDa y un fragmento de 8 kDa. Los ejemplos del producto de escisión proteolítica específico del traumatismo de aB-cristalina se seleccionan del grupo que consiste en un doblete de 18 19 kDa, un fragmento de 17 kDa, un doblete de 15 14 kDa y un fragmento de 8 kDa.

En una realización, el procedimiento comprende además medir la cantidad de una proteína específica de la sangre en una muestra de líquido cerebroespinal (CSF, por sus siglas en inglés) obtenida del sujeto. La detección y la monitorización de dichos marcadores se pueden utilizar para determinar el estado de hemorragia cerebral intraventricular posterior a la lesión. En una realización, la proteína específica de la sangre es la apolipoproteína B (APOB). En otra realización, el procedimiento comprende además medir la cantidad de prostaglandina sintasa (PTGDS) en una muestra de líquido cerebroespinal (CSF) obtenida del sujeto. La PTGDS, también conocida como proteína traza beta, es abundante en el CSF no de TBI de control, correlacionado positivamente con una composición de CSF saludable. La presencia de TBI se determina cuando se reduce la cantidad de PTGDS y aumenta con la recuperación. La detección y la monitorización de marcadores como una proteína sanguínea específica elevada o una proteína de CSF reducida después de una lesión cerebral traumática se puede usar para determinar, por lo tanto, el estado de recuperación para los niveles de control o normales después de la lesión. En algunas realizaciones del procedimiento, no se evalúan marcadores adicionales más allá de los enumerados en esta invención. En otras descripciones, solo se evalúan los marcadores enumerados en esta invención. En algunas descripciones, los marcadores adicionales conocidos por los expertos en la materia se evalúan en combinación con los marcadores enumerados en esta invención. En otras descripciones, solo se evalúa un subconjunto de posibles marcadores. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender evaluar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 o 20 marcadores. En una descripción particular, se evalúan no más de 4 marcadores.

Los reactivos para usar en el procedimiento de la invención pueden comprender anticuerpos u otras moléculas que se unen específicamente al marcador de TBI. En una realización, la medición comprende un inmunoensayo. Los ejemplos de inmunoensayos incluyen la transferencia de Western, la inmunofluorescencia, la inmunoluminiscencia, el radioinmunoensayo y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

En otra realización, los reactivos comprenden péptidos específicos de fragmento y secuencia de proteína. Dichos reactivos son útiles para procedimientos en los que la medición comprende espectrometría de masas cuantitativa dirigida. En una realización, la medición comprende la detección de señales cuantitativas de péptidos proteotípicos endógenos (en la muestra) que se comparan con cantidades conocidas añadidas ("enriquecidas") marcadas (por ejemplo, marcadas con isótopos pesados) de los mismos péptidos proteo-específicos (estándares internos) utilizando una espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples o paralelas.

En una realización, la muestra de control es una muestra previa a la lesión obtenida del sujeto. En otra realización, la muestra de control es representativa de sujetos sanos normales, tal como un valor medio obtenido de una cohorte de control de sujetos sanos.

Los ejemplos representativos de una muestra de fluido corporal para su uso en la invención incluyen, entre otros, plasma, suero, líquido cerebroespinal (CSF), líquido nasal, cerumen, orina, saliva, lágrimas lagrimales y microdialisato cerebral.

La descripción proporciona adicionalmente un kit que comprende agentes que se unen específicamente a un conjunto de biomarcadores para su uso en el procedimiento de cualquiera de las realizaciones anteriores de la invención. En una realización, los biomarcadores comprenden aldolasa C (ALDOC. por sus siglas en inglés) y, opcionalmente, proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP, por sus siglas en inglés). Los agentes son opcionalmente polinucleótidos o anticuerpos y opcionalmente están marcados con un marcador detectable. Opcionalmente, el kit consta además de al menos un recipiente para alojar los agentes y/o instrucciones de uso de los agentes para determinar el estado de lesión cerebral traumática en una muestra de prueba. En algunas realizaciones, el kit a usar comprende agentes que se unen específicamente a la fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15) y/o un fragmento de 20-30 kDalton de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP-BDP). En una realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En una descripción, el conjunto de biomarcadores consiste en hasta 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 biomarcadores.

La descripción proporciona además un procedimiento para determinar la expresión de los biomarcadores ALDOC y BLBP en una muestra de suero obtenida de un sujeto. En una descripción, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra de suero con un kit de la invención y medir la unión de los agentes a los biomarcadores.

También se proporciona un procedimiento para determinar el estado de lesión cerebral traumática en una muestra de suero obtenida de un sujeto. En una descripción, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra de suero con un kit aquí descrito, medir la unión de los agentes a los biomarcadores y comparar la unión a una muestra de control. A continuación, se determina la presencia de una TBI si la unión de los agentes a ALDOC y BLBP aumenta en la muestra de suero del sujeto en relación con la muestra de control. La invención proporciona además un procedimiento para detectar TBI en un sujeto. En una realización, el procedimiento comprende analizar una muestra de fluido corporal del sujeto para una cantidad elevada de ALDOC y BLBP, en comparación con una muestra de control. Una cantidad elevada de ALDOC y/o BLBP es indicativa de TBI. En una realización, el ensayo se realiza dentro de las 24 horas posteriores a la sospecha de lesión. El ensayo se puede realizar hasta una semana después de la lesión. En algunas descripciones, el análisis se realiza dentro de 1 a 3 horas, o tan pronto como dentro de los 15 a 30 minutos, de una sospecha de lesión. En algunas realizaciones, el sujeto es un bebé o un niño, que incluye, por ejemplo, un sujeto sospechoso de haber experimentado el síndrome del bebé sacudido. Para este uso, resulta adecuado un biomarcador expresado en el cerebro en desarrollo temprano, como ALDOC o BLBP. En otra descripción, el sujeto es un anciano y el procedimiento se usa para distinguir entre una TBI y una enfermedad neurodegenerativa crónica, midiendo una relación de ALDOC a su producto de degradación.

La descripción proporciona además un procedimiento para predecir el resultado de una TBI y/o la recuperación de la deambulación después de una SCI en un sujeto. El procedimiento puede comprender analizar una muestra de fluido corporal del sujeto para una cantidad elevada de PEA15 o pequeños BDP de GFAP en comparación con una muestra de control o con una muestra de un superviviente de una TBI, en donde una cantidad elevada de PEA15 o pequeños BDP de GFAP indican mortalidad. También se describe un procedimiento para tratar la TBI en un sujeto.

En una descripción, el procedimiento comprende analizar una muestra, obtenida del sujeto en múltiples puntos de tiempo después de la lesión (una serie de muestras longitudinales) para un marcador de TBI como se describe en esta invención; y tratar al paciente por TBI si el ensayo indica la presencia de TBI. Este procedimiento se puede utilizar para controlar el estado del paciente a lo largo del tiempo y determinar la eficacia del tratamiento farmacológico, o si estaría indicado un tratamiento intervencionista del paciente con TBI. Los expertos en la materia entenderán que cada uno de los procedimientos descritos en esta invención se puede realizar con cualquiera de los marcadores debido a su liberación muy temprana después de la lesión y su ventana de detección prolongada, así como a la cinética de aclaramiento de biofluidos variable: ALDOC, BLBP, GS, PEA- 15, CRYAB, un BDP de cualquiera de los anteriores; solo o en combinación con uno o más marcadores adicionales.

Los marcadores ALDOC y BLBP, así como PEA15 y CRYAB, se liberan de las células cerebrales humanas heridas, que son transitoriamente comprometidas y, por lo tanto, pueden usarse para rastrear un procedimiento fisiopatológico relevante para la conmoción cerebral, que es el estado vulnerable del cerebro después de una lesión. Esta asociación de estos marcadores con un estado de lesión potencialmente reversible proporciona información pato-mecanicista que puede ayudar a hacer el diagnóstico de TBI leve más sensible y puede ser valiosa para la monitorización farmacocinética de pacientes con TBI más allá y además de rastrear los marcadores de muerte celular liberados que reflejan la pérdida de tejido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Destinos de células de astrocitos neocorticales humanos después de un traumatismo mecánico ilustrado con gráficos de barras y fotomicrografías de células teñidas en vivo que representan núcleos de células viables, con células porosas y muertas.

Figura 2: Los astrocitos humanos traumatizados mecánicamente muestran una resistencia prolongada en un estado comprometido después de herir a los astrocitos de ratón, como se muestra con un gráfico de barras, una serie de fotomicrografías de videos de lapso de tiempo de células vivas fotografiadas en un escenario controlado por temperatura y gas a través de microscopía confocal y una ilustración esquemática del protocolo.

Figura 3: El traumatismo mecánico de los astrocitos humanos provoca una liberación significativa de marcadores astrogliales en los fluidos circundantes, como se ilustra con inmunotransferencias (A) y gráficos de barras que muestran cantidades de marcador en varios puntos de tiempo después de la lesión (B-G).

Figura 4: Biplots que muestran que los biomarcadores de neurotraumatismo están asociados con el destino celular de los astrocitos humanos traumatizados.

Figura 5: ilustración esquemática de la estrategia de selección de biomarcadores de lesión de astrocitos.

Figuras 6A-6K: Inmunotransferencias (6A-6C) y diagramas de dispersión trazados junto con diagramas de caja y bigote (6D-6K) con intervalos intercuartílicos (percentiles 90 y 10), mediana (línea) y media geométrica (línea discontinua) que muestran densidades ópticas logarítmicas escaladas y medidas a partir de señales de inmunotransferencia usando densitometría escalada (véase la Figura 3) en el CSF de 20-25 pacientes con TBI el día de la lesión y los 5 días posteriores a la lesión y 8-11 controles (n: número de sujetos por día), lo que muestra que los marcadores de lesión astrogliales están elevados en el CSF de los pacientes con TBI frente a los controles en una cohorte observacional retrospectiva el día de la lesión y los 5 días consecutivos posteriores a la lesión.

Figura 7: Correlación del resultado del paciente con TBI de las cantidades de CSF del biomarcador.

Figura 8: Evaluación del espectro de TBI utilizando factores de marcadores de lesión astrogliales agrupados. Figura 9: Herida celular sobre muerte celular: la proporción de BLBP sobre GFAP diferencia la gravedad del traumatismo en astrocitos humanos traumatizados y pacientes con TBI.

Figura 10: Correlación entre los niveles de ALDOC y el resultado del paciente con TBI.

Figura 11: Liberación aguda de marcadores astrogliales correlacionada con medidas de gravedad histopatológica, pérdida de tejido y hemorragia, después de una lesión de la médula espinal porcina.

Figura 12: Correlación de resultados de ALDOC y GFAP elevados de manera aguda después de una lesión de la médula espinal porcina.

Figura 13: La espectrometría de masas cuantitativa, la monitorización de reacciones múltiples, documenta la concentración de marcadores de TBI astrogliales y permite la comparación de la cantidad de marcadores independientemente de los anticuerpos.

Figura 14: Evaluación cuantitativa basada en anticuerpos de cantidades de ALDOC y BLBP e intervalos de concentración en el CSF y la sangre de una TBI usando cantidades conocidas de proteínas puras.

Figura 15: Biomarcadores astrogliales compatibles con sangre en muestras de sangre de pacientes con TBI grave, como se muestra mediante inmunotransferencias (A) y gráficos de la cantidad medida a lo largo del tiempo después de la lesión (B).

Figura 16: Las inmunotransferencias de la muestra de suero con TBI grave longitudinal muestran una ventana de detección extendida de ALDOC frente a GFAP.

Figura 17: Inmunotransferencias que muestran el producto de degradación de BLBP en el CSF y el plasma después de una TBI.

Figura 18: Evidencia de la apariencia circulatoria aguda de los marcadores de lesión astrogliales debido al paso directo a través de la barrera hematoencefálica dañada, como se muestra en las inmunotransferencias (A) y los gráficos de las cantidades medidas a lo largo del tiempo después de la lesión.

Figura 19: Los datos de inmunotransferencia que muestran marcadores de lesión astrogliales de nivel superior y PEA15 se detectan de manera sólida y temprana en el suero de pacientes con TBI leve después de conmociones cerebrales con o sin complicación (TC : con complicación - tomografía computarizada positiva; TC-: sin complicación, sin hallazgos en la tomografía computarizada).

Figura 20: Datos de inmunotransferencia que muestran una detección aguda y sólida de ALDOC sérico en TBI pediátricas, en bebés.

Figura 21: Datos de inmunotransferencia que muestran que la ALDOC de tamaño completo está presente en cantidades mayores que el BDP de 38 kDa en la TBI aguda, mientras que los dos tamaños de ALDOC están presentes en diferentes proporciones (dadas en la Tabla 2) en la condición neurodegenerativa crónica de la enfermedad de Alzheimer.

Figura 22: Ilustración de la partición de los umbrales de la Tabla 3.

Figura 23: Ilustración de la partición de los umbrales de la Tabla 4.

Figura 24: Niveles aumentados de marcadores de liberación de traumatismo gliales después de una lesión leve repetida en el modelo de cultivo de traumatismo humano, como lo indica el porcentaje de astrocitos con herida aguda en la membrana y muerte celular tardía (A), y niveles de GFAP y AldoC en un medio condicionado (CM, por sus siglas en inglés) después del estiramiento (B).

Figura 25: Dos exposiciones de película de GFAP, que muestran que la activación de calpaína y caspasa generó productos de degradación superior e inferior de GFAP después del traumatismo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona varios nuevos biomarcadores de TBI que se probaron inicialmente en el CSF, el plasma y el suero de pacientes y controles de TBI. Los nuevos marcadores de neurotraumatismo se definen por sus mecanismos de liberación para asociarse con heridas celulares y/o muerte celular de astroglia cerebral humana en un modelo de traumatismo. Los datos presentados en esta invención demuestran que los biomarcadores seleccionados muestran una cinética y una estabilidad muy interesantes en los fluidos corporales. Se muestra la detectabilidad inmunológica, la sensibilidad y la especificidad y se han seleccionado anticuerpos monoclonales adecuados. El momento de aparición de los marcadores en el CSF y el suero durante las primeras horas y días después de la TBI se presentan en los ejemplos adjuntos. Los resultados muestran que los marcadores descritos en esta invención y detectables en el suero o el plasma del paciente pueden usarse para identificar una TBI moderada y grave, así como una TBI leve y patrones indicativos de una TBI fatal. Los marcadores se resumen en la Tabla 1. Definiciones

Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen significados comúnmente usados en la técnica a menos que se especifique lo contrario. Tal como se utilizan en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en esta invención, "principal", como en "BDP principal", se refiere al producto de degradación observado más frecuente y consistentemente, por ejemplo, el BDP de 38 kDa de ALDOC es el BDP principal de la ALDOC.

Como se usa en esta invención, "agudo(a)" se refiere a un tiempo temprano posterior a la lesión, por lo general, para que la muestra de biofluido se considere aguda, fue recolectada el día de la lesión. Por ejemplo, de 15 a 30 minutos después de la lesión en modelos de traumatismo, de 1 a 2 horas después de la lesión en pacientes con TBI leve, de 3 a 24 horas después de la lesión en pacientes con TBI moderada y grave.

Como se usa en esta invención, la TBI leve complicada se usa para pacientes con conmoción cerebral con tomografía computarizada positiva, hallazgo de exploración TC/^t A^c , o más ampliamente con sintomatología duradera, según Buki y col., 2015.

Como se usa en esta invención, una "diferencia significativa" significa una diferencia que puede ser detectada de una manera que un experto en la técnica considere confiable, tal como una diferencia estadísticamente significativa, o una diferencia que sea de magnitud suficiente que, dadas las circunstancias, pueda detectarse con un nivel razonable de fiabilidad. En los ejemplos proporcionados en esta invención, los datos transformados logarítmicamente siguieron la distribución gaussiana y fueron utilizados para análisis estadísticos por un estadístico independiente. Se pueden utilizar análisis de varianza de medidas repetidas con varianza no constante, modelo mixto (Crowder y Hand, 1990). Como los datos son lineales cuando se transforman logarítmicamente, los cambios significativos suelen ser múltiples, incluso en órdenes de magnitud. En un ejemplo, se observa un aumento o disminución entre los pacientes de TBI y los controles que oscila entre 80 veces y 13.000 veces y se determina que es significativo. En otro ejemplo, los cambios en los diferentes días posteriores a la lesión entre 6 y 32 veces se consideran significativos. En incluso otro ejemplo, se observan cambios entre los supervivientes y los no supervivientes de TBI de entre 4 y 1.400 veces y se determina que son significativos. En incluso otro ejemplo, se considera significativo un aumento de dos veces con respecto a una muestra de referencia o de control.

Como se usa en esta invención, "control" o "muestra de control" se refiere a una muestra que es representativa de los niveles normales u obtenida de un sujeto que se sabe que está sano.

Como se usa en esta invención, "un" o "una" significa al menos uno, a menos que se indique claramente lo contrario.

Tabla 1: Marcadores de lesión astrogliales

Procedimientos de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la detección o monitorización del estado de lesión cerebral traumática (TBI), TBI leve, en un sujeto superviviente. El procedimiento se puede utilizar para determinar la presencia, progresión, predicción y discriminación de la gravedad de la TBI en un sujeto superviviente. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto con reactivos para analizar un marcador de TBI seleccionado de entre aldolasa C (ALDOC), o un producto de degradación específico de traumatismo (BDP) de ALDOC. El procedimiento comprende: poner en contacto una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto con reactivos para analizar un marcador de TBI seleccionado de aldolasa C (ALDOC), o un producto de degradación específico del traumatismo (BDP) de ALDOC, en donde el BDP de ALDOC se selecciona del grupo que consiste en un fragmento de 38 kDa, un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa y un fragmento de 23 kDa; medir la cantidad de marcador presente en la muestra en comparación con una muestra de control; y determinar la presencia de TBI cuando está presente una cantidad elevada de marcador en la muestra en comparación con la muestra de control. El procedimiento comprende además medir la cantidad de marcador presente en la muestra en comparación con una muestra de control, y determinar la presencia de TBI cuando está presente una cantidad elevada de marcador en la muestra en comparación con la muestra de control. En una realización, el procedimiento comprende además medir el valor de BLBP y/o un BDP del mismo. Opcionalmente, el procedimiento comprende además medir la cantidad de glutamina sintetasa (GS), fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15), aB-cristalina (CRYAB/HSP27), un producto de escisión proteolítica específico del traumatismo de GS, PEA15 o CRYAB, o cualquier combinación de dos o más de las mismas. En una realización, el procedimiento comprende además medir la cantidad de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP) o de un BDP de 20-30 kDa de GFAP.

La monitorización de la elevación de BLBP y/o PEA15 en los días posteriores a la TBI informa sobre los eventos adversos secundarios posteriores a la lesión. Por ejemplo, la detección de niveles elevados de ALDOC, BLBP, GS y PEA15 se puede utilizar para calcular el factor A, y los niveles de GFAP, S100beta y APOB se pueden utilizar para calcular el factor B, según las cargas de los marcadores para cada factor. El factor A y el factor B combinados se pueden utilizar para dividir a los pacientes por gravedad. Los umbrales de los factores A y B establecen límites entre los supervivientes de TBI, los no supervivientes y los controles. La evaluación de un paciente dentro de un ensayo o estudio clínico puede ser más sólida si se utiliza un kit que proporciona múltiples lecturas de biomarcadores y realiza análisis de factores. Esto proporciona una estrategia simplificada para rastrear pacientes individuales dentro de una cohorte muy variable, en lugar de requerir tamaños de cohorte muy grandes que pueden no ser viables en términos económicos o de otra manera. Los datos del panel de biomarcadores de cada ensayo clínico o cohorte de estudio se pueden ingresar en una base de datos, estandarizar y evaluar a cada paciente en función de la muerte/hemorragia del tejido frente a los factores de compromiso/herida del tejido. El uso de factores representativos de estas dos clases hace que la evaluación sea más sólida, ya que una lectura cero no evitará que el análisis de factores completo proporcione una salida de estado relativo para un paciente determinado. Los límites definen el espectro de gravedad de cada cohorte dentro del cual cada paciente tendrá un estado único en un momento dado después de la lesión.

En una descripción, el procedimiento comprende además calcular una relación entre las cantidades de BLBP, un ejemplo de un marcador de fuga celular, y GFAP, un marcador de muerte celular. Las cantidades se pueden medir usando densidades ópticas. Las relaciones entre las cantidades de BLBP y GFAP en el intervalo del modelo de traumatismo de 0,6-1,2 corresponden a un traumatismo leve/moderado, mientras que los intervalos de entre 0,1-0,4 corresponden a un traumatismo grave. Esto refleja el hallazgo en el modelo de traumatismo de cultivo humano de que, en el traumatismo severo, se encuentra proporcionalmente más GFAP que después de un traumatismo leve. Las relaciones de BLBP/GFAP en pacientes con TBI moderada oscilan entre 0,4 y 0,3, mientras que el intervalo en pacientes con TBI grave se ubica entre 0,01 y 0,05, expresando nuevamente una cantidad de GFAP proporcional más grande que la cantidad de BLBP en la categoría grave frente a los pacientes con TBI moderada. Como tal, el uso de esta relación proporciona una clasificación de gravedad del paciente más sólida. Al incluir dos marcadores, se alcanza la significación, mientras que un marcador solo requeriría un tamaño de cohorte mucho mayor. Por lo tanto, el uso de combinaciones de marcadores puede ayudar a evaluar el estado de la TBI y monitorizar la progresión de la TBI, al reducir el tamaño mínimo requerido de la inscripción de pacientes cuando se usa como herramienta de evaluación en estudios o ensayos clínicos.

El procedimiento para detectar y controlar el estado de TBI en un sujeto puede usarse para identificar a un sujeto en riesgo de complicaciones después de una TBI leve o una conmoción cerebral. Esta identificación se realiza mediante el uso de presencia aguda, como el uso de muestras obtenidas dentro de 1 a 2 horas y hasta 17 horas después de la lesión de BLBP y/o PEA15, además de ALDOC en muestras de suero. La elevación de ALDOC por sí sola puede identificar una conmoción cerebral, y la elevación del día de la lesión de ALDOC y BLBP y/o PEA15 se asocia con el riesgo de sufrir complicaciones.

Los ejemplos representativos del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de ALDOC incluyen un fragmento principal de 38 kDa que se encontró de manera más consistente, un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa y un fragmento de 23 kDa. Los ejemplos del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de GS incluyen un doblete de 37 35 kDa, un fragmento de 32 kDa, un fragmento de 23 kDa, un fragmento de 20 kDa y un fragmento de 18 kDa. Los ejemplos del producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de PEA15 incluyen un doblete de 12 13 kDa y un fragmento de 8 kDa. Los ejemplos del producto de escisión proteolítica específico del traumatismo de aB-cristalina se seleccionan del grupo que consiste en un doblete de 18 19 kDa, un fragmento de 17 kDa, un doblete de 15 14 kDa y un fragmento de 8 kDa.

La relación entre la cantidad de ALDOC de tamaño completo (40 kDa) y la cantidad de producto de escisión de ALDOC (38 kDa) es indicativa del tiempo posterior a la lesión, así como la distinción de lesión cerebral aguda frente a la subaguda, frente a la enfermedad crónica o enfermedad cerebral neurodegenerativa, incluida la enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés). Por consiguiente, en una realización, el procedimiento de detección y/o monitorización de TBI comprende determinar la relación de niveles de ALDOC de 40 kDa a niveles de ALDOC de 38 kDa en la muestra obtenida del sujeto. Una relación más grande que 1, que oscila de 3,6 a 8,6, indica una TBI (aguda o subaguda, en los días 1-5 después de la lesión), dado que el valor de ALDOC de tamaño completo es mucho más abundante que el BDP de ALDOC de 38 kDa. Una relación más pequeña que 1, que oscila de 0,4 a 0,6, indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer, ya que el BDP de ALDOC de 38 kDa fue similar o más abundante que la densidad de señal óptica de ALDOC de tamaño completo, porque una condición degenerativa crónica permite una degradación parcial a largo plazo y la acumulación del fragmento, a diferencia de la condición de lesión aguda.

En una realización, el procedimiento comprende además medir la cantidad de una proteína específica de la sangre en una muestra de líquido cerebroespinal (CSF) obtenida del sujeto. La detección y la monitorización de dichos marcadores se pueden utilizar para determinar el estado de hemorragia cerebral intraventricular posterior a la lesión. En una realización, la proteína específica de la sangre es la apolipoproteína B (APOB). En otra realización, el procedimiento comprende además medir la cantidad de prostaglandina sintasa (PTGDS) en una muestra de líquido cerebroespinal (CSF) obtenida del sujeto. La PTGDS, también conocida como proteína beta traza, se correlaciona positivamente con una composición saludable del CSF. La presencia de TBI se determina cuando se reduce la cantidad de PTGDS y aumenta con la recuperación. Por lo tanto, la detección y la monitorización de dichos marcadores se pueden utilizar para determinar el estado de recuperación a niveles saludables después de una lesión. En algunas descripciones, la recuperación de los niveles de PTGDS reducidos por traumatismo agudo se monitoriza durante los días posteriores a la lesión y predice la supervivencia, mientras que los niveles reducidos sostenidos de PTGDS predicen la mortalidad.

En algunas realizaciones del procedimiento, no se evalúan marcadores adicionales más allá de los enumerados en esta invención. En otras descripciones, solo se evalúan los marcadores enumerados en esta invención. En algunas descripciones, los marcadores adicionales conocidos por los expertos en la materia se evalúan en combinación con los marcadores enumerados en esta invención. En otras descripciones, solo se evalúa un subconjunto de posibles marcadores. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender evaluar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 o 20 marcadores. En una descripción particular, se evalúan no más de 4 marcadores.

Los reactivos para usar en el procedimiento de la invención pueden comprender anticuerpos u otras moléculas que se unen específicamente al marcador de TBI. En una realización, la medición comprende un inmunoensayo. Los ejemplos de inmunoensayos incluyen la transferencia de Western, la inmunofluorescencia, la inmunoluminiscencia, el radioinmunoensayo y ELISA. Los anticuerpos específicos de isoforma ALDOC están disponibles como clones de anticuerpos monoclonales 4A9, 1A1, 5C9 y E9 de EnCor Biotechnology Inc. (Gainesville, Florida). Los anticuerpos monoclonales específicos de BLBP también están disponibles de manos de EnCor Biotech Inc.

En otra realización, los reactivos comprenden péptidos específicos de fragmento y secuencia de proteína. Dichos reactivos son útiles para procedimientos en los que la medición comprende espectrometría de masas cuantitativa dirigida. En una realización, la medición comprende la detección de señales cuantitativas de péptidos proteotípicos endógenos (en la muestra) que se comparan con cantidades conocidas añadidas ("enriquecidas") marcadas (por ejemplo, marcadas con isótopos pesados) de los mismos péptidos proteo-específicos (estándares internos) utilizando una espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples o paralelas.

En una realización, la muestra de control es una muestra previa a la lesión obtenida del sujeto. En otra realización, la muestra de control es representativa de sujetos sanos normales, tal como un valor medio obtenido de una cohorte de control de sujetos sanos.

Los ejemplos representativos de una muestra de fluido corporal para su uso en la invención incluyen, entre otros, plasma, suero, líquido cerebroespinal (CSF), líquido nasal, cerumen, orina, saliva, lágrimas lagrimales y microdialisato cerebral.

La invención proporciona además un procedimiento para determinar la presencia de los biomarcadores ALDOC y BLBP en una muestra de suero o plasma obtenida de un sujeto. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra de suero o plasma con un kit de la presente descripción y medir la unión de los agentes a los biomarcadores.

También se proporciona un procedimiento para determinar el estado de lesión cerebral traumática en una muestra de suero o plasma obtenida de un sujeto. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra de suero/plasma con un kit aquí descrito, medir la unión de los agentes a los biomarcadores y comparar la unión a una muestra de control. A continuación, se determina la presencia de una TBI si la unión de los agentes a ALDOC y BLBP aumenta en la muestra de suero del sujeto en relación con la muestra de control. Para pacientes con TBI de moderada a grave, las cantidades y los intervalos de concentración para ALDOC y BLBP se dan en la Figura 14 y el Ejemplo 13, y las comparaciones de biomarcadores se dan con las concentraciones en la Figura 13 y el Ejemplo 12. La invención proporciona además un procedimiento para detectar TBI en un sujeto. En particular, se puede utilizar para detectar una TBI leve, donde el diagnóstico no es obvio de otra manera. En una realización, el procedimiento comprende analizar una muestra de fluido corporal del sujeto para una cantidad elevada de ALDOC y BLBP, en comparación con una muestra de control. Una cantidad elevada de ALDOC y/o BLBP es indicativa de TBI. En una realización, el ensayo se realiza dentro de las 24 horas posteriores a la sospecha de lesión. En algunas descripciones, el análisis se realiza dentro de 1 a 3 horas, o tan pronto como dentro de los 15 a 30 minutos, de una sospecha de lesión. En una descripción, la evaluación se realiza hasta 7 días después de una sospecha de lesión. En algunas realizaciones, el sujeto es un bebé o un niño, que incluye, por ejemplo, un sujeto sospechoso de haber experimentado el síndrome del bebé sacudido. El procedimiento permite evaluar la gravedad de la lesión y predecir el resultado en un sujeto, de manera aguda después de una lesión de la médula espinal.

La descripción proporciona además un procedimiento para predecir el resultado de una TBI en un sujeto. En una descripción, el procedimiento comprende analizar una muestra de fluido corporal del sujeto para una cantidad elevada de PEA15 y/o fragmentos de GFAP de 20-30 kDa (pequeños) en comparación con una muestra de control, donde una cantidad elevada de PEA15 y/o fragmentos pequeños de GFAP (es decir, inferiores) indica mortalidad. También se describe un procedimiento para tratar la TBI en un sujeto. En una descripción, el procedimiento comprende analizar una muestra, obtenida del sujeto para un marcador de TBI como se describe en esta invención; y tratar al paciente por TBI si el ensayo indica la presencia de TBI. La descripción proporciona además un procedimiento de monitorización para la orientación del tratamiento en un sujeto que está siendo tratado por una TBI. En una descripción, el procedimiento comprende analizar una muestra obtenida del sujeto para un marcador de TBI como se describe en esta invención; e iniciar un tratamiento del paciente para la TBI si el ensayo indica un deterioro del estado del paciente durante los días posteriores a la lesión, es decir, que muestra niveles elevados secundarios de cualquiera de los marcadores descritos en esta invención. Los procedimientos de la invención proporcionan adicionalmente aplicaciones farmacocinéticas (teragnósticas), es decir, su uso en la monitorización de fármacos u otros tratamientos de pacientes para la evaluación temprana de los efectos del tratamiento y para monitorizar la progresión de la TBI tras la lesión. Los expertos en la materia entenderán, dadas las diferentes cinéticas de liberación y eliminación de los marcadores descritos en esta invención, el beneficio de usar múltiples marcadores descritos en esta invención como un panel. Por consiguiente, la evaluación de los pacientes puede incluir cualquiera de los marcadores: ALDOC, BLBP, GS, PEA-15, CRYAB, un BDP de cualquiera de los anteriores; solo o en combinación con uno o más marcadores adicionales.

Algunas realizaciones contempladas por la presente descripción incluyen el uso de una combinación de marcadores de TBI, que incluyen aldolasa C (ALDOC), glutamina sintetasa (GS), fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15), aB­ cristalina (CRYAB ) o proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP/FABP7), un producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de ALDOC, GS, PEA15, CRYAB o BLBP/FABP7, o cualquier combinación de dos o más de los mismos. Por ejemplo, las realizaciones incluyen aquellas en las que el marcador de TBI es GS y aldolasa C, el marcador de TBI es GS y PEA15, el marcador de TBI es GS y aB-cristalina, el marcador de TBI es GS y BLBP, el marcador de TBI es aldolasa C y PEA15, el marcador de TBI es aldolasa C y aB-cristalina, el marcador de TBI es aldolasa C y BLBP, el marcador de TBI es PEA15 y aB-cristalina, el marcador de TBI es PEA15 y BLBP, el marcador de TBI es aB-cristalina y BLBP, el marcador de TBI es GS, aldolasa C y PEA15, el marcador de TBI es GS, BLBP y PEA15, el marcador de TBI es GS, aB-cristalina y PEA15, el marcador de TBI es GS, aB-cristalina y BLBP, el marcador de TBI es GS, aB-cristalina y aldolasa C, el marcador de TBI es GS, BLBP y aldolasa C, el marcador de TBI es aldolasa C, PEA15 y aB-cristalina, el marcador de TBI es aldolasa C, PEA15 y BLBP, el marcador de TBI es aldolasa C, aB-cristalina y BLBP, y el marcador de TBI es PEA15, aB-cristalina y BLBp . En los ejemplos anteriores, la TBI puede ser la proteína mencionada, un producto de degradación de la misma o ambos.

Kits

La descripción proporciona adicionalmente un kit que comprende agentes que se unen específicamente a un conjunto de biomarcadores para su uso en el procedimiento de cualquiera de las realizaciones anteriores de la invención. En una realización, los biomarcadores comprenden aldolasa C (ALDOC. por sus siglas en inglés) y, opcionalmente, proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP, por sus siglas en inglés). Los agentes son, por lo general, polinucleótidos o anticuerpos y opcionalmente están marcados con un marcador detectable. Opcionalmente, el kit consta además de al menos un recipiente para alojar los agentes y/o instrucciones de uso de los agentes para determinar el estado de lesión cerebral traumática en una muestra de prueba. En algunas realizaciones, el kit comprende además agentes que se unen específicamente a la fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15) y/o un fragmento de 20-30 kDalton de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP-BDP). En una realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En una descripción, el conjunto de biomarcadores consiste en hasta 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 biomarcadores.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a un experto con la fabricación y el uso de la misma. Estos ejemplos no pretenden limitar de forma alguna el alcance de la invención. Ejemplo 1: Destino de las células de astrocitos neocorticales humanos después de un traumatismo mecánico

Este ejemplo muestra puntajes de poblaciones de astrocitos humanos 30 minutos y 48 horas después de un estiramiento traumático de pulso de presión abrupto usando diferentes gravedades (Figura 1; intervalos de PSI de 2,6 a 4,0 para lesiones más leves y 4,4 a 5,3 para lesiones graves). Se aislaron astrocitos humanos de una muestra de cerebro neocortical fetal donada de 16 a 18 semanas, se purificaron y luego se diferenciaron en membranas deformables (Wanner, 2012). El daño/compromiso de la membrana celular, mecanoporación (Barbee, 2005), se determinó utilizando la captación de yoduro de propidio (PI) en cultivos vivos acompañada de una evaluación de la forma nuclear (imagen del medio, núcleos teñidos, tinción de Hoechst después de la fijación, con pequeños puntos rosados, nucléolos teñidos con PI). La muerte celular se determinó por captación de PI acompañada de núcleos condensados (núcleos picnóticos con cromatina compactada y tinciones brillantes de Hoechst y PI). Se muestra un porcentaje significativo del compromiso de la integridad celular 30 minutos después de la lesión (gráfico de la izquierda) mientras que la muerte celular significativa estuvo presente dos días después de la lesión (barras a la derecha).

Ejemplo 2: Los astrocitos humanos traumatizados mecánicamente muestran una resistencia prolongada en un estado comprometido

Este ejemplo demuestra que los astrocitos humanos traumatizados mecánicamente muestran una resistencia prolongada en un estado comprometido después de sufrir una herida frente a los astrocitos de ratón (Figura 2). La absorción del tinte (rhodamina de dextrán en 0,05 mM, 10 kDa) durante el estiramiento, así como también la muerte celular debido a la apoptosis (activación de caspasa usando un sustrato 3 de caspasa de 10 j M) se monitorizó usando imágenes de un lapso de tiempo en un microscopio confocal de disco giratorio con temperatura y humedad controladas (Levine y col., 2016). Las astroglias humanas heridas traumatizadas y reselladas muestran una resistencia prolongada después del compromiso de su integridad.

Como se muestra en la Figura 3, el traumatismo mecánico de los astrocitos humanos provoca una liberación significativa de marcador astroglial en los fluidos circundantes. La Figura 3A muestra inmunotransferencias de medios acondicionados desnaturalizados concentrados (Levine y col., 2016; Sondej y col., 2011) de astrocitos traumatizados que muestran diferentes perfiles de liberación de proteínas ácidas fibrilares gliales (GFAP) y sus productos de degradación conocidos y recientemente identificados (BDP) frente a la aldolasa C (ALDOC), la proteína de unión a lípidos cerebrales (BLPB), la fosfoproteína astrocítica (PEA15) y la a cristalina (CRYAB). Para capturar el intervalo completo de intensidad de la señal, las señales de múltiples exposiciones de inmunotransferencias se midieron densitométricamente (densidades ópticas) y se escalaron para que coincidieran con una sola exposición. Las densidades escaladas de señales del número indicado de donantes se trazan en un eje de espacio logarítmico en los gráficos que se muestran en la Figura 3B-G. Los BDP de GFAP superiores conocidos (entre 37 y 50 kDa) mostraron un aumento de la liberación con el tiempo (triángulos) y la gravedad (círculo a las 5 horas después de la lesión). Los nuevos BDP de GFAP más bajos se elevaron significativamente solo uno y dos días después de la lesión, asociándolos con la muerte celular (véase la Figura 1). Los valores de ALDOC, BLBP y PEA15 ya estaban significativamente elevados 30 minutos después de la lesión en dos órdenes de magnitud y dichos niveles elevados permanecieron en los fluidos en todos los tiempos medidos posteriores a la lesión. Los niveles de CRYAB mostraron una distinción de gravedad a las 5 horas y dos días después de la lesión.

Ejemplo 3: Biomarcadores de neurotraumatismo asociados con el destino celular de astrocitos humanos traumatizados

En la Figura 4A se muestran biplots de niveles de marcadores astrogliales liberados por el traumatismo (véase la Figura 3) para ALDOC, BLBP, PEA15 y CRYAB sobre el porcentaje de células permeables a la membrana (% de heridos, datos rojos, izquierda) también en correlación con el porcentaje de astrocitos humanos traumatizados muertos usando el ensayo de actualización de colorante PI y la morfología nuclear (véanse las Figuras 1 2). Las líneas de regresión (valor R2) y los valores de p indican la importancia de la correlación. Los valores de ALDOC, PEA15 y CRYAB muestran la mejor correlación con las heridas de las células astrogliales humanas. Los valores de CRYAB, BLBP y ALDOC también se correlacionaron con la extensión de la muerte celular después de un traumatismo.

La Figura 4B muestra biplots de liberación de traumatismo de GFAP, que muestran correlación de GFAP con la muerte celular infligida por un traumatismo mecánico y una correlación débil/nula con la herida celular. Los gráficos están separados por tamaños de fragmentos de GFAP agrupados (bandas superiores: 50-37 kD, bandas inferiores: 25-19 kD).

Ejemplo 4: Estrategia de selección de biomarcadores de lesión de astrocitos

Se seleccionaron biomarcadores de lesión de astrocitos candidatos mediante la siguiente estrategia (Figura 5). Se compiló un proteoma de CSF con TBI mediante espectrometría de masas ascendente utilizando muestras de CSF de 19 pacientes con TBI grave y se comparó con el proteoma del CSF de 9 sujetos de control (Crl). Este proteoma de CSF de TBI (483 proteínas) se superpuso con 252 proteínas del proteoma de control de CSF (402 proteínas), dejando 231 proteínas del CSF de TBI únicas. El sesenta por ciento de las proteínas del CSF de t Bi también estaban presentes en los proteomas plasmáticos publicados (Omenn y col., 2005; Schenk y col., 2008) y, si abundan, pueden no ser adecuados como biomarcadores de TBI. Para seleccionar marcadores de lesión cerebral candidatos, determinamos proteínas liberadas de astrocitos traumatizados utilizando una estrategia proteómica en un modelo de traumatismo simple. Se identificaron 79 proteínas liberadas diferencialmente después de estirar astrocitos de ratón por pulso de presión (Levine y col., 2015; Sondej y col., 2011).

De este "traumatoma", 48 proteínas (62 %) estaban presentes en el CSF de TBI. La selección de proteínas altamente enriquecidas en astrocitos (>/= enriquecimiento 5 veces superior a otros tipos de células, Cahoy y col., 2008) produjo un pequeño grupo de candidatos de 11 proteínas biomarcadores de daño (3 campos encerrados en negro). Estos incluyeron 3 proteínas GFAP y peroxiredoxina 6 (Prdx6, ambas presentes en plasma) y N, N-dimetil arginina dimetil aminohidrolasa (DDAH1, campo central de 3). Otras 3 proteínas fueron proteínas enriquecidas en astrocitos, "traumatomas" presentes en el CSF de TBI y también en el CSF de control que eran aldolasa C (ALDOC), clusterina (CLUS) y apolipoproteína E (APOE, campo inferior de 3). La clusterina y APOE son secretadas por los astrocitos y sus niveles disminuyen en el líquido después de un traumatismo (flecha). Otras 5 proteínas liberadas por traumatismos que estaban altamente enriquecidas en astrocitos no se incluyeron en la lista de proteomas de CSF de TBI basada en espectrometría de masas de escopeta. Estos 5 eran ezrin (Ezr), proteína 2 solo de caja F (FBX2), glutamina sintetasa (GS), fosfoproteína astrocítica 15 (PEA15) y proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP, campo superior de 5, contorno discontinuo). Las GFAP, ALDOC, GS, BLBP, PEA15 y CRYAB se incluyeron en las pruebas inmunológicas y de espectrometría de masas posteriores.

Ejemplo 5. Los marcadores de lesión astrogliales se elevan en el CSF de pacientes con TBI el día de la lesión y 5 días consecutivos después de la lesión.

Este ejemplo demuestra que los marcadores de lesión astrogliales están elevados en el CSF de pacientes con TBI frente a los controles en una cohorte de observación retrospectiva el día de la lesión y durante cinco días consecutivos después de la lesión. La Figura 6A muestra inmunotransferencias de GFAP (50 kDa con BDP de 37, 25, 20 y 18 kDa) y S100p y ALDOC (40 kDa), GS (45 kDa), BLBP (15 kDa) y PEA15 (15 kDa) de un conjunto longitudinal de 30 pl de muestras de CSF del día de la lesión (i) y 5 días posteriores a la lesión (i+1 a i+5) de un paciente masculino de 54 años con TBI grave (1a.-1f) junto con 30 pl de CSF de control (Crl). Los valores de BLBP y PEA15 mostraron señales más fuertes el día de la lesión y un segundo aumento en el tercer día posterior a la lesión, que se asoció con el episodio isquémico secundario de este paciente. El indicador de sangrado APOB (130 y 250 kDa) tuvo una intensidad variable a lo largo del tiempo después de la lesión y estuvo ausente en el CSF sano; La PTGDS del marcador de CSF (22 kDa) tenía una señal sólida en el CSF de Crl pero estaba ausente de forma aguda después de la TBI y un día después de la lesión y recuperaba las señales de forma escalonada en los días posteriores a la lesión.

La Figura 6B muestra seis muestras de CSF (30 pl/carril) de cuatro pacientes con TBI (2.-5.), que ilustran intensidades de señal variables de GFAP y BDP "superiores" entre 50 y 37 kDa y BDP de GFAP "inferiores/nuevos" incluyendo un doblete de 25/23 kDa, pequeños BDP de 20 kDa y 18 kDa el día de la lesión (pacientes 2, 3, 4a) y un día después de la lesión (4b, 5) junto con el CSF de control de un varón sano de 43 años. Las bandas individuales dentro de los BDP de GFAP superiores tienen intensidades similares entre sí, mientras que la abundancia relativa entre los BDP de GFAP inferiores fue claramente diferente entre los pacientes.

La Figura 6C muestra inmunotransferencias de CSF (30 pl/carril), que demuestran ALDOC de tamaño completo (40 kDa) en cinco pacientes con TBI (6.-10.) y BDP de ALDOC de 38 kDa de intensidad variable cuatro días después de la lesión en tres pacientes con TBI (8-10). Un sujeto de control sano no mostró ALDOC.

Los diagramas de dispersión (Figuras 6D-K, el mismo día y réplicas de pacientes promediadas) se trazan conjuntamente con diagramas de caja y bigote con intervalos intercuartílicos (percentiles 90 y 10), mediana (línea) y media geométrica (discontinua línea) que muestran densidades ópticas escaladas logarítmicas medidas a partir de señales de inmunotransferencia usando densitometría escalada (véase la Figura 3) en el CSF de 20-25 pacientes con TBI el día de la lesión y los 5 días posteriores a la lesión y 8-11 Controles (n: número de sujetos por día). (Fig. 6D) Las señales de GFAP superiores (50-37 kDa) se elevaron todos los días de la TBI, frente al Crl (P < 0,06) y se redujeron con el tiempo según lo indicado (P < 0,05, medidas ANOVA repetidas, véanse los Procedimientos) (Fig. 6E) Los BDP de GFAP inferiores (25-18 kD) se elevaron en la TBI, frente al Crl (P < 0,03) y se redujeron entre el primer día posterior a la lesión en los días que siguieron a la misma (P < 0,05). (Fig. 6F) ALDOC (P < 0,004) y (Fig. 6G) GS (P < 0,001) se elevaron cada día en el CSF de TBI, frente a los Crls, los cuales no se redujeron. (Fig. 6H) B^lB^p (P < 0,03) y (Fig. 6I) PEA15 (P < 0,004) tenían niveles elevados en la TBI, frente a los Crls en los días indicados, con intervalos de señal más grandes. La APOB de proteína sérica (Fig. 6J) se elevó en la TBI frente al CSF del Crl (P < 0,005), mientras que la PTGDS estándar del CSF fue más fuerte en el Crl frente a la TBI (P < 0,004) con niveles reducidos de manera aguda en varias medidas, seguido de la recuperación según el resultado (véase la Figura 7).

Ejemplo 6: Correlación de los resultados del paciente con TBI de las cantidades del CSF de los biomarcadores

Este ejemplo demuestra que los niveles en el CSF de nuevos productos de degradación de GFAP inferiores asociados con la muerte celular eran dos órdenes de magnitud más elevados en los no supervivientes frente a los supervivientes de TBI (Figura 7). Los niveles de PEA15 fueron más de 2-3 órdenes de magnitud elevados en los no supervivientes frente a los supervivientes después de una TBI, con un valor de p en el tercer día posterior a la lesión de p = 0,07. Los niveles del marcador de salud PTGDS, que disminuyó de manera aguda después de la lesión, mostraron una recuperación significativa en el tercer día posterior a la lesión en los supervivientes de TBI, mientras que los niveles permanecieron disminuidos en los no supervivientes.

Ejemplo 7: Evaluación del espectro de TBI utilizando factores de marcadores astrogliales agrupados

Este ejemplo demuestra la agrupación de marcadores de traumatismo astroglial para crear factores útiles en la evaluación de TBI en todo el espectro de lesiones. Para combinar los diversos datos que engloba el panel de marcadores, se utilizó un análisis multivariado de varianza que empleó un algoritmo de aprendizaje no supervisado basado en coeficientes de correlación de Spearman (análisis factorial, Fabrigar y Wegener, 2012; Tucker, 1997). Esta estrategia es nueva en el campo de los biomarcadores de neurotraumatismos y revela las condiciones subyacentes del neurotraumatismo al agrupar los marcadores aquí en función de sus señales del CSF de TBI. El marcador astroglial conocido S100p, los marcadores de mortalidad de GFAP con BDP nuevos y conocidos, y el indicador APOB de sangrado se agruparon en el Factor A (Fig. 8A, gris, con una carga combinada usando el coeficiente a de Cronbach = 0,921). Los nuevos marcadores de "fuga celular", ALDOC de heridas celulares con BDP, BLBP, GS y PEA15, se agruparon en el Factor B (a = 0,879). Como se muestra en la Fig. 8B, el perfil temporal del Factor A disminuyó significativamente durante los días posteriores a la lesión, mientras que la trayectoria del Factor B no lo hizo. Los datos del factor A mostraron una diferencia significativa entre los supervivientes y los no supervivientes en varios días posteriores a la lesión (Fig. 8C). Los datos del factor B no mostraron diferencias de supervivencia (Fig. 8D). Las lecturas de densidad de marcadores estandarizadas de 12 pacientes con TBI con señal presente para todos los marcadores se convirtieron en los Factores A y B utilizando las cargas mostradas en la Fig. 8A, y luego se representaron gráficamente entre sí (Fig. 8E). La heterogeneidad entre el espectro de TBI se refleja en la extensión de los datos de panel combinados en este biplot. El análisis del árbol de clasificación (Fig. 8F) determinó los límites que dividían a los controles, supervivientes y no supervivientes de TBI según umbrales de Factor dados (Breiman, 1984). Los umbrales de partición de pacientes que utilizan los niveles de biomarcadores agrupados en factores se ilustran mediante líneas en la Fig. 8E.

Esta estrategia matemática de aprendizaje no supervisada y multivariada combina los marcadores de este panel con cada marcador dado un peso (carga) que se deriva de los coeficientes de correlación y expresa cuánta varianza en la cohorte de pacientes es capturada por la contribución de este marcador. La carga alta general de los marcadores enumerados (0,8-0,95) documenta una sólida categorización en los dos factores. El factor A refleja los marcadores asociados con la muerte celular, la hemorragia y la pérdida de tejido. El factor B refleja los marcadores asociados con la fuga celular, las heridas y el compromiso tisular (véase Figura 8A). Los valores resultantes documentan una posición única de cada paciente en función de las lecturas de su panel de biomarcadores dentro de una cohorte determinada. Esta estrategia cubre de manera confiable la mayoría de las variaciones de pacientes observadas en esta cohorte de TBI. El análisis factorial proporciona un marco simplificado para capturar una gran heterogeneidad de pacientes observada en TBI utilizando solo unas pocas lecturas de biomarcadores (en comparación con un análisis de componentes principales más complejo que utilizó muchas entradas diferentes). En un ensayo clínico, estas lecturas del panel de biomarcadores de un kit de prueba se pueden ingresar en una base de datos en crecimiento que puede proporcionar información de monitorización valiosa de pacientes individuales con TBI en comparación con otros pacientes. Esta herramienta puede simplificar la evaluación del paciente y fortalecer la solidez de la evaluación continua del paciente mediante la firma de biofluidos del compromiso y la destrucción del tejido.

Ejemplo 8: Diferenciación de la gravedad del traumatismo en astrocitos humanos traumatizados y pacientes con TBI

Este ejemplo demuestra que la relación de niveles de BLBP a GFAP en la muestra de un sujeto puede usarse para diferenciar la gravedad del traumatismo en astrocitos humanos traumatizados y pacientes con TBI. Se muestran diferencias significativas en las proporciones del nivel de líquido del marcador de "fuga celular" BLBP sobre el marcador de "muerte celular" GFAP in vitro (Fig. 9, CM, medio acondicionado, izquierda) y en pacientes con TBI (CSF, panel derecho de la Fig.9) . Los astrocitos humanos de 6 donantes fueron traumatizados con diferentes gravedades usando los pulsos de presión PSI indicados. Los pacientes con TBI moderada frente a la grave se distinguen por una relación BLBP/GFAP 14 veces diferente en el CSF (n = 9). Los pacientes con TBI moderada se definen por la escala de coma de Glasgow posterior a la reanimación (GCS) > 8, mientras que los pacientes con TBI grave tenían una GCS < 8.

Ejemplo 9: Correlación entre los niveles de ALDOC y el resultado del paciente con TBI

Los datos presentados en la Figura 10 muestran los niveles de ALDOC y GFAP representados frente al resultado de pacientes con TBI grave, evaluados usando la puntuación de resultado de Glasgow extendida (GOSe) a los 6 meses después de la TBI. Los datos de 12 (11) pacientes con TBI muestran una elevación de ALDOC temprana (blanco, i, i+1, 2) y más tarde después de la lesión (negro, i+3, 4 y 5 días después de la lesión) en pacientes con un resultado desfavorable, mientras que los niveles de GFAP no mantuvieron niveles elevados en los días posteriores a la lesión.

Ejemplo 10: Correlación entre los marcadores de TBI y la gravedad y el resultado de la lesión de la médula espinal

Este ejemplo demuestra la correlación entre los marcadores de traumatismo astrogliales y la gravedad de la lesión de la médula espinal en un modelo animal porcino. Figura 11: Liberación aguda del marcador astroglial UCLA correlacionada con medidas de gravedad histopatológica, pérdida de tejido y hemorragia, después de una lesión de la médula espinal porcina. A) Las densidades de señal aguda (15-30 min después de la lesión) en el CSF de los marcadores de lesión astrogliales de UCLA ALDOC, BLBP y glutamina sintetasa (GS), así como GFAP, se grafican contra los diámetros de la cavidad rostro-caudal en la médula espinal porcina de Yucatán una semana después de la lesión por una contusión de la médula espinal utilizando un modelo de baja de peso de lesión establecido (Lee y col., 2013). Las correlaciones de Spearman indican una elevación aguda de estos niveles de marcadores de CSF astrogliales asociados significativamente con el aumento de la pérdida de tejido. Histopatología: Se midió la extensión rostro-caudal de la cavidad en secciones de médula espinal horizontales teñidas de negro de Sudán (valores p y valores R2 dados, n = 10 animales).B) Las densidades de señal de CSF aguda (15-30 min después de la lesión) de ALDOC y GS se asociaron significativamente con el sangrado del tejido intersticial de la sustancia blanca una semana después de la lesión que se midió con fluorescencia de inmunoglobulina porcina (IgG) en secciones de médula espinal horizontal lesionadas y se normalizó mediante secciones de médula espinal horizontales ilesas teñidas en paralelo. Dichas señales de fluorescencia de materia blanca normalizadas de imágenes en serie rostro-caudal se representaron gráficamente para cada animal (n = 8 animales) y se determinaron las áreas bajo las curvas (AUC) a distancias con los niveles de señal no dañados anteriores.

La Figura 12 muestra la correlación de ALDOC y GFAP muy elevadas con el resultado después de una lesión de la médula espinal porcina. La recuperación de la marcha se asocia con niveles agudos de ALDOC y GFAP en el líquido cerebroespinal después de una lesión de la médula espinal porcina. Se grafican los niveles agudos de CSF después de la lesión (15-30 min después de la lesión) de ALDOC (puntos negros) y GFAP (puntos blancos) que predice la recuperación de la marcha una semana después de la lesión utilizando la escala de comportamiento de lesión torácica porcina (PTIBS, por sus siglas en inglés), una prueba establecida para la recuperación de la deambulación en los cerdos que indica el nivel de recuperación de la marcha después de una lesión de la médula espinal en los cerdos de Yucatán (Lee y col., 2013). Existió una correlación inversa significativa con niveles más altos de ALDOC (R2 -0,88) y GFAP (R2 -0,89) en animales que deambulaban con dificultad, que arrastraban las extremidades traseras y gateaban en el mejor de los casos, y niveles agudos bajos de ALDOC y GFAP en animales que caminaban al cabo de una semana después de la lesión. Los umbrales de biomarcadores preliminares se indican mediante el color de fondo, lo que muestra la viabilidad de una partición muy temprana de los animales en recuperación.

Ejemplo 11: espectrometría de masas cuantitativa de marcadores de TBI astrogliales

Este ejemplo demuestra que la espectrometría de masas cuantitativa confirma los niveles aumentados de marcadores de TBI astrogliales después de una lesión, proporcionando comparaciones objetivas de cantidad de marcadores que son limitadas cuando se usan procedimientos inmunológicos, ya que estos no están estandarizados. La monitorización de reacciones múltiples, una estrategia de espectrometría de masas cuantitativa, simultánea e independiente de anticuerpos, se utilizó por primera vez en el campo de los biomarcadores de neurotraumatismo para comparar la abundancia de marcadores astrogliales nuevos y conocidos en el CSF de pacientes con TBI. Los péptidos específicos de marcador se miden en paralelo con cantidades definidas de péptidos marcados con isótopos añadidos (véase la Tabla 6). La Figura 13A muestra que ALDOC y GFAP tenían las concentraciones más altas en el CSF de TBI el día de la lesión, y ambos diferían significativamente de los niveles de otros marcadores mostrados. Además, los niveles de BLBP fueron significativamente más altos que los niveles de GS el día de la lesión. Como se muestra en la Figura 13B, 3 días después de la TBI, los niveles de ALDOC superaron significativamente las concentraciones de GFAP, difiriendo en un orden de magnitud.

Ejemplo 12: Inmunoensayo cuantitativo de ALDOC y BLBP en la sangre y el CSF de la TBI

Este ejemplo proporciona una evaluación cuantitativa basada en anticuerpos de los niveles de ALDOC y BLBP en el CSF y la sangre de muestras de TBI usando curvas estándar. Los diagramas de caja de la Figura 14 muestran los intervalos de concentración media e intercuartil de ALDOC (izquierda) y BLBP (derecha) y sus cantidades en el CSF y la sangre (suero y plasma). Los insertos muestran la respuesta a la dosis usando cantidades conocidas de proteínas recombinantes específicas de isoforma ALDOC y BLBP usando dos intervalos de concentración y condiciones de detección de inmunotransferencia (véase la Tabla 7).

Ejemplo 13: Detección de biomarcadores astrogliales en muestras de sangre de pacientes con TBI grave Este ejemplo demuestra que los marcadores de traumatismo astroglial son compatibles con los análisis de sangre, utilizando muestras obtenidas de pacientes que tienen un traumatismo cerebral grave. La Figura 15A muestra muestras de plasma longitudinales de 3 pacientes con TBI grave diferentes junto con una muestra de plasma de control (Crl). Las proteínas abundantes se eliminan utilizando albúmina de inmunoafinidad y columnas de depleción de inmunoglobulina (Sigma, ProteoPrep). El nuevo producto de degradación de GFAP de 25 kDa nunca se detectó el día de la lesión (i) pero apareció en los días posteriores a la lesión. La ALDOC estuvo presente de manera constante en todos los puntos temporales en los 3 pacientes. Los marcadores de corta duración PEA15 y BLBP estuvieron presentes de manera contundente el día de la lesión y mostraron diferentes perfiles temporales durante los días posteriores a la lesión en cada paciente. En la Figura 15B se representan las señales de densitometría escaladas para ALDOC (B1), BLBP (B2), GFAP/25 kDa BDP (B3) y PEA15 (B4) de 26 muestras de suero y 24 de plasma derivadas de 22 pacientes con TBI grave en comparación con hasta 11 muestras de sangre de control (Crl). Los mismos datos longitudinales del paciente están conectados por líneas grises. La ALDOC se elevó significativamente el día de la lesión y todos los días posteriores a la lesión, mientras que la GFAP se elevó significativamente a partir del primer día posterior a la lesión. Los valores de BLBP y PEA15 tuvieron una elevación significativa el día de la lesión frente a los niveles de control.

Ejemplo 14: Ventana de detección ampliada de ALDOC frente a GFAP

Este ejemplo demuestra, usando una muestra de suero de TBI grave longitudinal, la ventana de detección extendida de AlDo C frente a GFAP. ALDOC se detectó 19 horas antes de la primera detección de BDP de 25 kDa de GFAP y las señales de ALDOC estaban presentes durante dos días más allá de la última señal específica de GFAP, un BDP de 37 kDa de GFAP conocido (Figura 16).

Ejemplo 15: Producto de descomposición BLBP

Además del tamaño completo, BLBP de 15 kDa, se detectó un fragmento específico de BLBP de 3 kDa usando 2 anticuerpos en el CSF de TBI y plasma el día de la lesión y varios días posteriores a la lesión. Los resultados se muestran en la Figura 17.

Ejemplo 16: Apariencia circulatoria aguda de marcadores de TBI

La Figura 18 presenta pruebas de la aparición circulatoria aguda de nuevos marcadores de lesión astrogliales debido al paso directo a través de la barrera hematoencefálica dañada. El panel A de la Figura 18 muestra inmunotransferencias para GFAP BDP de 25 kDa junto con ALDOC, BLBP y PEA15 en el CSF y el suero del mismo paciente con TBI grave de forma aguda después de la TBI (3 horas después de la lesión), así como en el primer día posterior a la lesión. Mientras que la GFAP apareció primero en el CSF y con un día de retraso en el suero, la ALDOC estuvo presente en ambos biofluidos en ambos puntos de tiempo. La BLBP y la PEA15 aparecieron por primera vez en suero y aparecieron con retraso en el CSF. Las trazas en el eje espaciado logarítmicamente de los 4 marcadores astrogliales documentan el cambio del BDP de GFAP de 25 kDa del CSF al suero, una presencia más estable de ALDOC estable en biofluidos y la presencia de BLBP y PEA15 de corta duración en suero antes de su aparición y retraso elevación tardía en el CSF (Figura 18B).

Estas observaciones sugieren el paso directo de ALDOC, BLBP y PEA15 desde el sitio de la lesión a la circulación. Los tres marcadores están localizados en procedimientos astrogliales, con terminaciones finas que se sabe que envuelven por completo los capilares y los vasos sanguíneos (Mathiisen y col., 2010). La lesión traumática, incluso un traumatismo cerebral leve, provoca la rotura de las fibras astrogliales perivasculares, lo que permite que estos marcadores pasen directamente a la sangre (Barzo y col., 1996; Hicks y col., 1993; Korn y col., 2005). La GFAP no se localiza en las terminaciones astrogliales y, como se muestra en la Figura 3, el BDP de 25 kDa de GFAP tarda en generarse, lo que sugiere una liberación retardada durante la muerte celular que conduce a la acumulación primero en el CSF y la aparición posterior en el suero. La ventaja de un paso directo de los pies terminales astrogliales a través de la barrera hematoencefálica abierta reside en permitir análisis de sangre muy agudos después de la lesión.

Ejemplo 17: Detección temprana de marcadores de lesión astrogliales en suero de pacientes con TBI leve Este ejemplo demuestra una detección sólida y temprana de marcadores de lesión astrogliales de nivel superior en el suero de pacientes con TBI leve. En la Figura 19 se muestran 10 muestras de suero de 7 pacientes con TBI leve (mTBI) poco después de la lesión junto con un suero de control (Crl). Las muestras fueron analizadas para GFAP, ALDOC, BLBP y PEA15. Las señales específicas de GFAP fueron débiles y limitadas para 4 pacientes con TBI leve, y un paciente mostró un BDP de 25 kDa de GFAP 31 horas después de la lesión (paciente No. II). El BDP de 38 kDa de ALDOC fue constante y fuertemente elevada en todos los pacientes con TBI leve frente al control. Los valores de BLBP y PEA15 mostraron una intensidad variable y estuvieron presentes en 5 pacientes con TBI leve. Los valores de ALDOC, BLBP y PEA15 ya se detectaban una hora después de la lesión. Los pacientes con conmoción cerebral recibieron una tomografía computarizada (TC) y aquellos con hallazgos positivos de una lesión/sangrado se clasificaron como TC+ y pacientes con TBI leve potencialmente complicados, y aquellos sin heridas visibles fueron catalogados como TC negativos o como sin complicaciones (Buki y col., 2015). La presencia sólida de ALDOC y las señales diferenciales para BLBP y PEA15 son adecuadas para aumentar la identificación de riesgos entre los pacientes con conmoción cerebral.

Ejemplo 18: Detección aguda y sólida de ALDOC sérica en la TBI pediátrica

La Figura 20 muestra la detección aguda y sólida de ALDOC en muestras de suero de pacientes con TBI pediátrica. Las muestras de suero del día de la lesión de 5 bebés (1-4 meses de edad) que sufrieron una TBI se muestran junto a un suero de control de un niño de 22 meses. Las señales ALDOC sólidas se detectan en todos los casos de TBI en bebés frente a los casos de control, mientras que solo dos bebés mostraron una señal GFAP débil (BDP de 34 kDa, no descrito previamente, casos # I, III).

Ejemplo 19: ALDOC como marcador de TBI para la enfermedad de Alzheimer

Este ejemplo demuestra que las muestras de CSF de pacientes que sufren de la condición neurodegenerativa crónica de exposición de la enfermedad de Alzheimer exhiben niveles igualmente distintos de BDP de tamaño completo (40 kDa) y 38 kDa de ALDOC. Por el contrario, el valor de ALDOC detectado en el CSF de un paciente con TBI agudo muestra una preponderancia distinta de BDP de tamaño completo (40 kDa) frente a 38 kDa. En la Figura 21 se muestran 7 muestras de CSF de 5 pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD, estadio 0,5, casos No. II y III; estadio 1, casos No. IV y V; según Fagan y col., Science Transl. Med. 2014) en comparación con un paciente con TBI grave (caso No. I) y dos controles de la misma edad (casos No. VI y VII) y tinción de proteína para la carga (Ponceau S). El paciente con TBI tenía principalmente ALDOC de tamaño completo y un pequeño fragmento de 38 kDa el día 4 después de la lesión, mientras que las muestras de AD degenerativa crónica mostraron la misma presencia de BDP de ALDOC de tamaño completo y de 38 kDa. Los datos sugieren que la lesión cerebral aguda y crónica se puede distinguir sobre la base de la relación ALDOC/ALDOC BDP.

Tabla 2: Distinción entre la TBI y la enfermedad de Alzheimer, utilizando la relación entre ALDOC de tamaño m l fr m n r líi kD n l F l i n

La tabla muestra las proporciones promedio de ALDOC de tamaño completo (40 kDa) sobre su producto de degradación (38 kDa) en el CSF de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) y pacientes con TBI de moderada a grave. Diferentes anticuerpos de ALDOC contra diferentes epítopos de la proteína dieron como resultado un énfasis variable de las intensidades de señal de banda de 40 frente a 38 kDa. A la izquierda, los datos de todos los anticuerpos ALDOC se combinaron con un promedio de 20 muestras de AD y 25 muestras de TBI. La proporción promedio de AD fue 6 veces menor que la proporción promedio de TBI que fue significativa mediante la prueba T de dos colas. A la derecha, se analizaron 10 muestras de CSF de AD y 5 muestras de pacientes con TBI utilizando el mismo anticuerpo (E9) para la detección de ALDOC. De nuevo, hubo una diferencia significativa de 20 x entre TBI, que muestra más señal de tamaño completo, y AD que muestra más señal de ALDOC de BDP. Los ejemplos de los datos se muestran en la Figura 21. Esto proporciona una distinción entre una TBI y una enfermedad neurodegenerativa crónica. Ambas selecciones de datos dan como resultado proporciones significativamente diferentes basadas en el aumento de la abundancia de BDP de 38 kDa principales de ALDOC que significa la condición neurodegenerativa crónica. La TBI aguda se puede distinguir fácilmente por una mayor abundancia de ALDOC de 40 kDa de tamaño completo en forma aguda y hasta 5 días después de la TBI.

Ejemplo 20: Análisis discriminante multivariado

Se utilizó el Análisis de árbol de clasificación multivariante (Breiman, 1984) para determinar los marcadores que dividen con mayor precisión la cohorte de sujetos en pacientes con TBI de control y supervivientes o no supervivientes en la lesión, analizados por inmunotransferencia de 30 pl de muestra de c Sf en cada caso. Tras obtener una precisión del 100 % con solo dos marcadores, AldoC y PTGDS (Tabla 3), el análisis se repitió permitiendo solo aquellos marcadores que se sabe que son detectables en la sangre para futuros ensayos no invasivos (Tabla 4). Los marcadores utilizados para los datos presentados en la Tabla 3 fueron Aldo C y PTGDS, mientras que los marcadores considerados, pero no utilizados, fueron: GFAP, PEA15, GFAP inferior, S100B, BLBP, GS, APOB, PTGDS y AldoC 38 kD. Por consiguiente, la Tabla 3 resume la detección de TBI y la predicción de resultados de supervivencia utilizando todos los marcadores en el análisis del árbol de clasificación. Este análisis seleccionó ALDOC y PTGDS como los mejores marcadores de partición. Entre todos los marcadores inspeccionados, aquellos fueron utilizados por la estrategia de aprendizaje matemático no supervisado. Grupos, n = 21, todos los controles; y todas las TBI del día de la lesión de 30 muestras de TBI. El CSF de 7 ng/30 pl indicado equivale a una concentración de 233 ng/ml de CSF utilizando inmunotransferencia. La precisión fue excelente, ya que la agrupación y el resultado previsto coinciden en un 100 % correctamente. La Figura 22 brinda una ilustración de la partición de los umbrales de la Tabla 3.

T l : D i n TBI r i i n r l rviv n i

La Tabla 4 muestra la detección de TBI y la predicción del resultado de supervivencia usando los nuevos marcadores gliales compatibles con la sangre. Marcadores utilizados para la Tabla 4 (1): Aldo C total. Los marcadores considerados, pero no utilizados, fueron: GFAP inferior, BLBP, PEA 15, producto de degradación Aldo C 38 kD (BDP). Los marcadores NO considerados (omitidos) fueron: GFAP total, S100B, GS, APOB y PTGDS. Los grupos fueron: n = 21 todos los controles; y pacientes con TBI en el día de la lesión de un total de 30 en la cohorte completa. La precisión fue del 95 %; la probabilidad correcta no ponderada fue de 20/21 o 0,952. Hubo una probabilidad de prioridad igual al 96 % correcta = 0,96 = (1,0 1,0 0,875). La Figura 23 brinda una ilustración de la partición de los umbrales de la Tabla 4.

Tabla 4: Detección de TBI y predicción de resultados de supervivencia mediante marcadores de TBI usando marcadores de TBI

Gr n Aldo C total [OD] Predicción

A 4 0,078 a 0 Supervivient

B 3

0,22 a 0, No supervivi

C 3 Supervivient

D

11

< 0,078

Control (sujet

Matriz de clasificación de los datos de la Tabla 4:

Característica de funcionamiento del receptor (aplicable con n superior):

Ejemplo 21: Correlaciones de Spearman entre la densidad de la señal del marcador TOD! y los datos de imágenes de exploración TAC

La progresión de una TBI secundaria puede causar una presión intracraneal elevada (ICP, por sus siglas en inglés) que a menudo se asocia con una lesión secundaria. Se observa una correlación significativa entre los niveles de BDP inferiores del marcador de muerte celular GFAP (doblete de 19, 20, 25 kDa) e ICP. El marcador de sangrado APOB se correlaciona significativamente con el volumen de la lesión extra intraparenquimatosa y el desplazamiento de la línea media. Ambos hallazgos de la TC se asocian con hemorragia cerebral, que incluyen hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnoidea y lesiones intraparenquimatosas. Los marcadores de lesión glial BLBP y PEA15, así como los valores de BDP inferiores de GFAP del marcador glial de muerte celular, se correlacionan con lesiones intraparenquimatosas, que incluyen contusión de tejido cerebral, hemorragia intracraneal y lesión axonal difusa.

Tabla 5: Correlaciones de S earman entre la densidad de la señal del marcador los datos de ex loración or

Ejemplo 22: Niveles aumentados de marcadores de liberación de traumatismo gliales después de una lesión leve repetida en el modelo de cultivo de traumatismo humano

La Figura 24 muestra los resultados obtenidos usando un modelo para una lesión leve repetida. Los astrocitos humanos recibieron un pulso de presión leve simple (•) o doble (•-•) con 30 minutos de diferencia (30') o con un día de diferencia (1D). Las poblaciones celulares de muerte aguda, con fuga y tardía no cambiaron mucho en el caso del traumatismo repetido (Fig. 24A). Sin embargo, los niveles de líquido del medio condicionado (CM) de los marcadores de liberación de traumatismo GFAP y AldoC se elevaron después de una lesión leve repetida con poco tiempo de diferencia frente a un único estiramiento leve, y solo se elevaron ligeramente cuando las dos lesiones se produjeron con un día de diferencia. Los niveles de AldoC casi alcanzaron los de una única lesión grave (•) después de tramos leves con poco tiempo de diferencia, lo que indica su sensibilidad a las lesiones repetidas.

Ejemplo 23: La activación de calpaína y caspasa generó productos de degradación superior e inferior de GFAP después de un trauma

En la Figura 25 se muestran dos exposiciones de película de GFAP, productos de degradación superior e inferior 48 horas después de la lesión en muestras de medio acondicionado usando el anticuerpo policlonal anti-GFAP DAKO. Los cultivos estirados gravemente y no estirados recibieron ya sea ningún fármaco, el inhibidor de calpaína PD150606 (100 ^|j M, "Cali") o el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD FMK (8,8 j M, "Casi"). Los BDP superiores e inferiores de GFAP liberados por el traumatismo se redujeron tanto por la inhibición de la calpaína como de la caspasa, lo que sugiere la activación inducida por el traumatismo de ambas enzimas que degradan la GFAP después de la lesión. Parte de esta degradación enzimática se produce en las células, en parte de manera extracelular, como sugieren los análisis similares de fracciones de lisado celular de los mismos experimentos. La liberación menor de BDP de GFAP más bajos en cultivos sin estirar se debió a un pequeño número de muerte celular no traumática.

Ejemplo 24: Anticuerpos y proteínas utilizados para la transferencia Western de los marcadores de lesión astrogliales

[0085]

T l : Ani r r ín iliz r l r nf r ni W rn mr r

Ejemplo 25: Espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples

Las concentraciones de biofluidos de las proteínas biomarcadores de lesión por TBI se midieron mediante espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples (MRM) dirigida. Las muestras de biofluidos se digirieron primero usando endoproteinasa tripsina, escindiendo todas las proteínas en sus respectivos péptidos trípticos. Las señales de péptidos específicos de proteínas se utilizaron como medida sustituta para sus respectivas proteínas. En la MRM-MS, las señales peptídicas se miden por lo que se conoce como precursor ^ para las transiciones iónicas, como se muestra en la Tabla 7 a continuación (por ejemplo, 554,821 (2+) --> 924,514 (1+, y8)). La selección de iones precursores específicos de interés permite una mayor sensibilidad. Al medir la señal de iones de productos específicos de precursores seleccionados, la MRM permite un alto grado de especificidad del analito. Para la cuantificación, cantidades definidas de péptidos estándar marcados con isótopos estables (SIS) que contienen una lisina pesada [K(Etiqueta: 13C(6)15N(2))] o arginina pesada [R(Etiqueta: 13C(6)15N(4))] se agregan en muestras de biofluidos. Estos péptidos estándares pesados son químicamente idénticos a sus homólogos endógenos (ligeros) pero muestran un desplazamiento de masa de 8 y 10 Da (K y R respectivamente) para la diferenciación de los péptidos de biofluidos endógenos. La comparación de las relaciones del área de los picos entre las transiciones de MRM ligeras y pesadas permite la cuantificación absoluta de las concentraciones de biomarcadores. Para nuestro ensayo, los biofluidos digeridos por tripsina se separaron primero mediante cromatografía líquida de fase inversa, usando ácido fórmico al 0,1 % en agua y ácido fórmico al 0,1 % en un sistema de elución de acetonitrilo para reducir adicionalmente la complejidad de la muestra y mejorar la sensibilidad de la señal.

Tabla 7: Biomarcadores de TBI peptídica de espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples Nombre Secuencia de péptidos Transición de MRM medida

GFAP ALAAELNQLR (pesada) 554,821 (2+) --> 924,514 (1+,

y8)

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Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   I. Un procedimiento para detectar o monitorizar el estado de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto superviviente, comprendiendo el procedimiento:

   (a) poner en contacto una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto con reactivos para analizar un marcador de TBI seleccionado de aldolasa C (ALDOC), o un producto de degradación específico de traumatismo (BDP) de ALDOC, donde el BDP de ALDOC es seleccionado de entre el grupo que consiste en un fragmento de 38 kDa, un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa y un fragmento de 23 kDa;

   (b) medir la cantidad de marcador presente en la muestra en comparación con una muestra de control; y (c) determinar la presencia de TBI cuando está presente una cantidad elevada de marcador en la muestra en comparación con la muestra de control.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además medir la cantidad de proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP/FABP7) o un BDP de la misma.
3. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende además medir la cantidad de glutamina sintetasa (GS), fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15), aB-cristalina (CRYAB/HSP27), un producto de escisión proteolítica específico del traumatismo de GS, PEA15 o CRYAB, o cualquier combinación de dos o más de los mismos.
4. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el producto de escisión proteolítica específica de traumatismo de G^s se selecciona de entre el grupo que consiste en un doblete de 37+35 kDa, un fragmento de 32 kDa, un fragmento de 23 kDa, un fragmento de 20 kDa y un fragmento de 18 kDa; o

   donde el producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de PEA15 se selecciona de entre el grupo que consiste en un doblete de 12+13 kDa y un fragmento de 8 kDa; o

   donde el producto de escisión proteolítica específico de traumatismo de aB-cristalina se selecciona de entre el grupo que consiste en un doblete de 18+19 kDa, un fragmento de 17 kDa, un doblete de 15+14 kDa y un fragmento de 8 kDa.
5. 5. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende además medir la cantidad de una proteína específica de la sangre en una muestra de líquido cerebroespinal (CSF) obtenida del sujeto;

   donde, opcionalmente, la proteína específica de la sangre es apolipoproteína B (APOB).
6. 6. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende además medir la cantidad de prostaglandina sintasa (PTGDS) en una muestra de líquido cerebroespinal (CSF) obtenida del sujeto, y se determina la presencia de TBI cuando se reduce la cantidad de PTGDS; o que comprende además medir la cantidad de un BDP de 20-30 kDa de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP).
7. 7. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, donde los reactivos de la etapa (a) comprenden anticuerpos que se unen específicamente al marcador de TBI, y la medición comprende un inmunoensayo; donde, opcionalmente, el inmunoensayo comprende una transferencia Western o ELISA.
8. 8. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, donde la muestra de control es una muestra previa a la lesión obtenida del sujeto; o

   donde la muestra de control es un valor promedio obtenido de una cohorte de control de sujetos sanos.
9. 9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde no se evalúan marcadores adicionales.
10. 10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la muestra de fluido corporal comprende plasma, suero, fluido cerebroespinal (CSF), fluido nasal, cerumen, orina, saliva, lágrimas lagrimales o microdialisato cerebral.
11. I I . El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, donde los reactivos comprenden péptidos específicos de fragmentos y secuencias de proteínas, y donde la medición comprende una espectrometría de masas cuantitativa dirigida.
12. 12. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, donde la medición comprende una espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples o paralelas.
13. 13. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende además medir la cantidad de uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de entre PTGDS y APOB en una muestra de CSF obtenida del sujeto.
14. 14. El procedimiento de la reivindicación 1 para detectar una TBI en un sujeto, donde el ensayo se realiza dentro de las 24 horas posteriores a una sospecha de lesión.
15. 15. El procedimiento de la reivindicación 1 para detectar una TBI en un sujeto, donde el sujeto es un bebé o un niño.
16. 16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la TBI es una TBI leve.
17. 17. Uso de un kit que comprende agentes que se unen específicamente a un conjunto de biomarcadores en el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el conjunto de biomarcadores comprende: (a) aldolasa C (ALDOC) o un producto de degradación específico del traumatismo (BDP) de ALDOC, en el que el BDP de ALDOC se selecciona del grupo que consiste en un fragmento de 38 kDa, un fragmento de 35 kDa, un fragmento de 30 kDa, y un fragmento de 23 kDa; y, opcionalmente,

    (b) proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP) o un BDP de la misma;

    donde los agentes son opcionalmente polinucleótidos o anticuerpos, los agentes opcionalmente marcados con un marcador detectable, y donde el kit opcionalmente consta además de al menos un contenedor para albergar los agentes y/o instrucciones de uso de los agentes para determinar el estado de lesión cerebral traumática. en una muestra de prueba.
18. 18. El uso del kit de la reivindicación 17, que comprende además agentes que se unen específicamente a: (c) la fosfoproteína astrocítica PEA-15 (PEA15); y/o

    (d) un fragmento de 20-30 kDalton de proteína de ácido fibrilar glial (BDP de GFAP).
19. 19. El uso del kit de la reivindicación 17, donde los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
20. 20. El uso del kit de la reivindicación 17, donde el conjunto de biomarcadores comprende además PEA-15.