ES2630905T3 - Proteínas inmunitarias innatas como biomarcadores para lesiones del SNC - Google Patents

Abstract

Un método de evaluación de un paciente del que se sospecha que tiene una lesión del sistema nervioso central (SNC) que comprende: medir el nivel de al menos una proteína inflamasoma en una muestra biológica obtenida de un paciente que presenta síntomas clínicos coherentes con una lesión del SNC, siendo la muestra biológica líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, suero o plasma, y siendo la al menos una proteína inflamasoma una proteína con contenido de dominios de unión a nucleótidos, de repetición rica en leucina y de pirina 1 (NLRP1), proteína puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC), caspasa-1 o la subunidad p20 de la caspasa-1; determinar la presencia o la ausencia de un nivel elevado de al menos una proteína inflamasoma con respecto (i) al nivel de la al menos una proteína inflamasoma en una muestra de control o (ii) al valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia; y seleccionar al paciente si el paciente muestra, con la presencia de un nivel elevado de la al menos una proteína inflamasoma, que tiene una lesión del SNC o una lesión más grave del SNC, obteniéndose la muestra biológica, opcionalmente, en menos de una semana, cinco días o tres días después de la presunta lesión.

Description

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DESCRIPCION

Protemas inmunitarias innatas como biomarcadores para lesiones del SNC Campo de la invencion

La presente invencion versa en general sobre los campos de la neurologfa, la inmunolog^a y los diagnosticos. En particular, la presente invencion versa sobre la identificacion de biomarcadores en muestras biologicas que pueden predecir la gravedad de una lesion neuronal, tal como una lesion de la medula espinal y cerebral traumatica, en pacientes. Los biomarcadores identificados tambien pueden ser usados en la determinacion pronostica, en la direccion de esfuerzos terapeuticos y de rehabilitacion y en la monitorizacion de la respuesta al tratamiento para pacientes con una lesion del sistema nervioso central.

Antecedentes de la invencion

Los receptores de tipo dominio de oligomerizacion de union a nucleotidos (NOD) —que contiene protemas— (NLR) son una clase recientemente descubierta de receptores inmunitarios innatos que desempenan un papel crucial en el inicio de las respuestas inflamatorias tras una lesion tisular en el sistema nervioso central (SNC) (Abulafia et al., 2009, Silverman et al., 2009). El trabajo previo demuestra que la NLRP1 (tambien denominada protema de repeticion rica en leucina NAcht 1 (NALP-1)) forma un complejo de inflamasoma que comprende NLRP1, la protema adaptadora protema puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y la enzima caspasa-1 que orquestan los primeros procesos inflamatorios tras una lesion de la medula espinal (SCI) y una lesion cerebral traumatica (TBI) mediante la activacion de la IL-1p (de Rivero Vaccari et al., 2008; 2009). La formacion de inflamasomas es inducida por el dano ffsico a la membrana plasmatica, y por ciertos ligandos endogenos denominados patrones moleculares asociados a peligro (DAMP) o ligandos exogenos denominados patrones moleculares asociados a patogenos (PAMP) (Bianchi, 2007, Wakefield et al., 2010). Sin embargo, la respuesta plena de la IL-1p tambien depende de la activacion de los receptores de tipo Toll (TLR) y/o de los receptores purinergicos regulados por ATP, que inducen la transcripcion de la pro-IL-1p.

Las respuestas hiperinflamatorias asociadas con la lesion tisular puede promover la patogenesis de la SCI y la TBI a traves de una produccion excesiva de IL-1p y de otros productos potencialmente neurotoxicos. La produccion excesiva de IL-1p mediada por inflamasomas esta implicada en la patogenesis de la diabetes de tipo 2, de lesiones hepaticas y distrofia muscular (Kufer y Sansonetti, 2011). Ademas, evidencia genetica creciente sugiere que la activacion de inflamasomas tambien podna llevar a una inmunidad adaptativa en tipos de dermatitis, alergias de tipo dermico y asma (Kufer y Sansonetti, 2011). Ademas, los componentes de los inflamasomas pueden ser segregados al entorno extracelular mediante un mecanismo que implica la red de exosomas (Bianchi, 2007). Por lo tanto, el inflamasoma tiene una conexion compleja con el control de respuestas inmunologicas adaptativas que se ha convertido en objeto de intensa investigacion. Que los inflamasomas esten asociados con procesos inflamatorios destructivos de tejidos despues de una SCI y una TBI en seres humanos no se ha investigado.

Se calcula que la TBI afecta a 1,5 millones de personas cada ano y que causa la tercera parte de los fallecimientos relacionados con lesiones. Hoy, aproximadamente 5,3 millones de estadounidenses viven con una minusvalfa permanente relacionada con la TBI. Predecir la gravedad y el desenlace de una TBI, asf como de una SCI, resulta diflcil, dada la falta de biomarcadores objetivos basados en pruebas de laboratorio. En la actualidad, la puntuacion de la Escala de Coma de Glasgow (GCS) (Teasdale et al., 1974) es el mejor predictor clmico disponible de la gravedad de las lesiones; sin embargo, su valor es limitado en pacientes sometidos a una paralisis farmacologica para su intubacion, ya que no puede obtenerse una puntuacion motriz (Brain Trauma Foundation, American Association of Neurological Surgeons, 2000). La prediccion de un desenlace se complica adicionalmente por la heterogeneidad de la patologfa en pacientes con una puntuacion GCS similar. Por lo tanto, resulta imperativa la identificacion de biomarcadores diagnosticos y pronosticos que reflejen directamente la lesion de las celulas de SNC. Tales biomarcadores de TBI y SCI permitiran que los clmicos evaluen el grado de lesion del cerebro o la medula espinal, comuniquen informacion pronostica a los familiares del paciente y seleccionen tratamientos agudos y cronicos para mecanismos espedficos de lesion del SNC. Por lo tanto, una prueba diagnostica temprana precisa disenada para seleccionar estrategias neuroprotectoras sena una herramienta pronostica sumamente deseable.

Aunque se ha hecho un progreso significativo en cuanto a la verificacion y el ensayo de diversos biomarcadores despues de una apoplejfa y una TBI, se dispone de datos limitados en cuanto a que biomarcadores son apropiados para una SCI. Los biomarcadores S-100p, la enolasa espedfica de neurona, la cadena ligera de neurofilamentos y la protema acida glial fibrilar aumentan significativamente en casos de SCI en estudios animales experimentales (Skouen et al, 1999, Ma et al., 2001, Nagy et al., 2002, Cornefjord et al., 2004, Loy et al., 2005, Cao et al., 2008, Pouw et al., 2009). Aunque algunos biomarcadores muestran resultados prometedores, estos no proporcionan todavfa una herramienta pronostica sensible. Deben desarrollarse y validarse estandares cuantitativos para determinar el grado de SCI y TBI durante la fase aguda.

Un nuevo planteamiento para evaluar la lesion medular primaria y cerebral en la fase aguda es la evaluacion de biomarcadores en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR). Dado que el lCr rodea la medula espinal y el cerebro, la lesion de la medula o el cerebro puede conducir a la liberacion en el LCR de protemas y moleculas provenientes de las

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celulas del sistema nervioso central que pueden servir como biomarcadores para SCI y TBI en el LCR. Se han realizado varios estudios sobre S-100p, la enolasa espedfica de neurona, la cadena ligera de neurofilamentos y la protema acida glial fibrilar (GFAP) en LCR y suero de modelos animales de SCI (Pouw et al., 2009). Sin embargo, solo un estudio ha investigado la protema de neurofilamentos y la GFAP en LCR despues de una SCI en seres humanos (Guez et al., 2003). Asf, existe la necesidad en la tecnica de identificar biomarcadores de lesion neuronal tras una lesion del sistema nervioso central en seres humanos que pueden ser usados para determinar la gravedad de la lesion y facilitar la seleccion de una estrategia terapeutica apropiada para maximizar la recuperacion.

Sanchez Mejfa et al. llevaron a cabo un analisis inmunohistoqmmico del tejido cerebral de ratones sometidos a una lesion cerebral traumatica y documentaron que hay presentes caspasa-1 y caspasa-3 activadas en neuronas 24 horas despues de la lesion, ubicandose espedficamente dentro de las neuronas. Se descubrio que la administracion intraperitoneal de minociclina reduda la lesion tisular y los defectos neurologicos resultantes de la TBI experimental, lo que se sugirio que se produda mediante un mecanismo dependiente de la caspasa-1 (Sanchez Mejfa et al., Neurosurgery 48:1393-1401 2001).

Loane y Faden resenaron modelos animales y terapias experimentales en desarrollo para una lesion cerebral traumatica. Identificaron varios agentes neuroprotectores efectivos, incluyendo tratamientos antiinflamatorios tales como la minociclina (Loane y Faden, Trends in Pharmacological Sciences 31(12):596-604 2010).

Vink y Nimmo tambien resenaron farmacos para tratar la lesion cerebral traumatica, incluyendo estatinas, progesterona y minociclina (Vink y Nimmo, Neurotherapeutics 6:28-42 2009).

Onose et al. resenaron informes publicados sobre la neuroproteccion en la lesion de la medula espinal, que descridan los tipos de lesion que pueden ocurrir al cerebro y la medula espinal e intentaron catalogar los diversos planteamientos terapeuticos, incluyendo los tratamientos establecidos y nuevas terapias en desarrollo (Onose et al., Spinal Cord 47(10):716-726 2009).

El documento US2009/104200 (Keane et al.) expuso el papel del inflamasoma en la patogenesis de TBI y SCI y describio compuestos, incluyendo anticuerpos neutralizantes, para unirse con los componentes del inflamasoma e inhibirlos para tratar tales lesiones.

El documento US2011/0082203 (Wang y Hayes) describio metodos de diagnostico y tratamiento de una lesion cerebral sometiendo a ensayo muestras biologicas tales como lfquido cefalorraqrndeo o suero para determinar la presencia o uno o mas biomarcadores.

Compendio de la invencion

La presente invencion esta basada, en parte en el descubrimiento de que los componentes de inflamasoma de la NLRP1 (NALP-1) son segregados en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR) de forma aguda despues de una SCI y una lesion cerebral traumatica (TBI) en seres humanos. Los niveles de la protema inflamasoma en el LCR tras una lesion del sistema nervioso central (SNC) representan el grado de neuroinflamacion en el tejido del SNC y reflejan el grado de lesion inducida por la inflamacion. Los niveles en LCR de la protema inflamasoma tras una lesion se correlacionan con el grado de recuperacion funcional en los pacientes y, asf, pueden ser usados como biomarcadores agudos para predecir el diagnostico de los pacientes y dirigir las intervenciones terapeuticas. En consecuencia, la presente invencion proporciona un metodo de evaluacion de la gravedad de una lesion del SNC en un paciente.

En una realizacion, la invencion proporciona un metodo de evaluacion de un paciente del que se sospecha que tiene una lesion del SNC, segun se expone en la reivindicacion 1 adjunta.

Se describen metodos diagnosticos que, ademas, comprenden la administracion de un tratamiento neuroprotector al paciente en funcion del nivel medido de una o mas protemas inflamasoma, y el seguimiento de cambios en el nivel de una o mas protemas inflamasoma como mecanismo para monitorizar la respuesta al tratamiento.

En algunas realizaciones, los niveles de una o mas protemas inflamasoma en la muestra del paciente pueden ser usados para preparar un perfil de protema inflamasoma asociado con la lesion del SNC. Los niveles de protemas inflamasoma en el perfil pueden ser determinados con respecto a los niveles de las protemas en muestras de control o valores predeterminados de referencia o intervalos de valores de referencia. Los perfiles de la protema inflamasoma son, en algunas realizaciones, indicativos de la presencia o la gravedad de una lesion del SNC en un paciente. Cuando se preparan tales perfiles protemicos a partir de muestras obtenidas de pacientes tras la administracion de un tratamiento neuroprotector, los perfiles de la protema inflamasoma son indicativos de la eficacia terapeutica del tratamiento neuroprotector en el paciente.

La presente invencion tambien proporciona un metodo de determinacion de un pronostico para un paciente con una lesion del sistema nervioso central, segun se expone en la reivindicacion 8 adjunta. En realizaciones particulares, un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es indicativo de un peor pronostico o de un desenlace desfavorable para el paciente. Por ejemplo, los niveles elevados de la protema inflamasoma son predictivos de que el paciente tenga una

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puntuacion de 1 a 3 en la Escala de Desenlace de Glasgow (GOS) tras una evaluacion de seguimiento. En otras realizaciones, un nivel reducido de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de un desenlace favorable para el paciente (por ejemplo, una puntuacion GOS de 4 o 5 tras una evaluacion de seguimiento). En ciertas realizaciones, el metodo proporciona un pronostico para un paciente con una lesion de la medula espinal o cerebral traumatica.

Tambien se describen equipos de reactivos para preparar un perfil de protema inflamasoma asociado con una lesion del SNC. Un equipo de reactivos puede comprender un ligando marcado, tal como un anticuerpo marcado o un fragmento del mismo, que se una espedficamente a una o mas protemas inflamasoma, seleccionandose dichas una

0 mas protemas inflamasoma del grupo constituido por NLRP1, ASC, caspasa-1 y combinaciones de los mismos.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. La NLRP1, el ASC y la caspasa-1 son biomarcadores que predicen el desenlace despues de una SCI. Muestras de LCR fueron sometidas a inmunotransferencia con anticuerpos contra la NLRP1, la caspasa-1 y el ASC. Como controles se usaron muestras de LCR procedentes de pacientes no lesionados. El analisis de inmunotransferencia de 6 casos diferentes de pacientes con SCI indica que los pacientes (2, 3 y 4) que expresan de forma aguja bajos niveles de caspasa-1 despues de una SCI tienen mejor pronostico que los sujetos (1, 5 y 6) que tienen niveles elevados de esta protema en el LCR.

Figura 2. Las protemas inflamasoma de la NLRP1 son expresadas en celulas del SNC. Se obtuvieron secciones de la medula espinal de fallecidos que teman lesion en la medula espinal. El analisis Inmunohistoqmmico combinado con la microscopfa optica indica que la NLRP1 se expresa en las neuronas de los axones mielinados (puntas de flecha negras) del asta ventricular (flechas negras) y en los oligodendrocitos (flechas amarillas) (panel superior). La caspasa-1 se expresa en axones hinchados (esferoides, flechas azules), neuronas motoras (flechas negras) y en oligodendrocitos (flechas amarillas) (panel central). El ASC esta presente en neuronas del asta ventricular (flechas negras), en oligodendrocitos de sustancia blanca (flecha amarilla) y en macrofagos/microglia (puntas de flecha azules) (panel inferior).

Figura 3. Diagramas de dispersion de la expresion de protemas inflamasoma en controles y pacientes con TBI. Se sometieron muestras a inmunotransferencia para ASC (A), caspasa-1 (B) y NALP-1 (C). Los valores p de la esquina superior izquierda representan resultados de una prueba U de Mann-Whitney. El analisis densitometrico revelo un aumento significativo en la expresion de ASC, caspasa-1 (p20) y NALP-1 en el LCR de pacientes con TBI en comparacion con controles sin traumatismo. Las lmeas continuas denotan valores medios para cada grupo. Formas diferentes corresponden a desenlaces para los pacientes 5 meses despues de la lesion. Se muestran inmunotransferencias representativas. Las muestras fueron sometidas a ensayo en el mismo gel, pero no fueron contiguas. N = numero de muestras de TBI analizadas; ★ = puntuacion GOS 5; ■ = puntuacion GOS 4; O = puntuacion GOS 3; V = puntuacion GOS 1.

Figura 4. Diagramas de cajas de la expresion de protemas inflamasoma clasificada por categoria de desenlace. Los extremos de los bigotes representan el dato menor en 1,5 veces el rango intercuartflico del cuartil inferior y el dato mayor en 1,5 veces el rango intercuartflico del cuartil superior. Los asteriscos representan los casos atfpicos. Las pruebas U de Mann-Whitney indican que la mayor expresion de ASC (A), caspasa-1 (p20) (B) y NALP-

1 (C) esta significativamente asociada con un desenlace desfavorable 5 meses despues de la lesion (p < 0,0001). Se muestran inmunotransferencias representativas para cada protema. Las muestras fueron sometidas a ensayo en el mismo gel, pero no fueron contiguas.

Figura 5. Diagramas de dispersion y regresion lineal estimada de la expresion de ASC (A), caspasa-1 (p20) (B) y NALP-1 (C) en el LCR con puntuacion GOS. Los valores de probabilidad de la regresion lineal son mostrados en la parte superior izquierda de cada grafico. La expresion de cada protema se correlaciono significativamente con la puntuacion GOS 5 meses despues de la lesion. Los valores p del eje x representan comparaciones post hoc de una prueba de Kruskal-Wallis. Se muestran inmunotransferencias representativas. Las muestras fueron sometidas a ensayo en el mismo gel, pero no fueron contiguas.

Figura 6. Niveles de caspasa-1 en LCR uno, dos y tres dfas tras una TBI en pacientes pediatricos receptores de un tratamiento de hipotermia o de ningun tratamiento (normotermia).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que los inflamasomas de la NLRP1 desempenan un papel importante en las respuestas inflamatorias despues de una SCI y una TBI en los seres humanos. En particular, los presentes inventores han descubierto con sorpresa que la protema con contenido de dominios de union a nucleotidos, de repeticion rica en leucina y de pirina 1 (NLRP1), la protema adaptadora protema puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y la caspasa-1 son segregadas al lfquido cefalorraqrndeo (LCR) de pacientes humanos tras una SCI y una TBI. Asf, estas protemas inflamasoma representan biomarcadores sensibles de la gravedad de una lesion del sistema nervioso central en pacientes humanos. En consecuencia, la presente invencion proporciona un metodo de evaluacion de la gravedad

de una lesion del sistema nervioso central en un paciente midiendo el nivel de al menos una protema inflamasoma en una muestra biologica obtenida del paciente, siendo el nivel medido de dicha al menos una protema inflamasoma indicativo de la gravedad de la lesion del sistema nervioso central en el paciente.

Segun se lo usa en la presente memoria, el termino “inflamasoma” se refiere a un complejo multiproteico que activa 5 la actividad de la caspasa-1, la cual, a su vez, regula el procesamiento y la activacion de la IL-1p, la IL-18 y la IL-33. Veanse Arend et al. 2008; Li el al. 2008; y Martinon et al. 2002. Una “protema inflamasoma” es un componente proteico de complejos de inflamasoma y puede incluir, sin limitaciones, un miembro de la familia (por ejemplo, NLRP1) con contenido de dominios de union a nucleotidos, de repeticion rica en leucina (NLR), el ASC, la caspasa- 1, la caspasa-11, la protema inhibidora de la apoptosis ligada al cromosoma X (XIAP) y la panexina-1. La NLRP1 10 tambien es denominada protema de repeticion rica en leucina NAcht 1 (NALP-1). Asf, los terminos “NLRP1” y “NALP-1” son usados de forma intercambiable en toda la divulgacion. En ciertas realizaciones, el metodo comprende la medicion de una protema inflamasoma seleccionada del grupo constituido por NLRP1 (NALP-1), ASC, caspasa-1 o combinaciones de los mismos. En una realizacion, se mide la subunidad p20 de la caspasa-1 activa.

Los terminos “paciente” o “sujeto” son usados de forma intercambiable en la presente memoria, y se quiere decir un 15 sujeto mairnfero que ha de ser tratado, prefiriendose los pacientes humanos. En ciertas realizaciones, el paciente es

un paciente pediatrico. Los pacientes pediatricos incluyen recien nacidos (del nacimiento a 1 mes de edad), bebes (de 1 mes a 2 anos de edad), ninos (de 2 a 12 anos de edad) y adolescentes (12-21 anos de edad). En algunos casos, los metodos de la invencion encuentran uso en animales para experimentos y en aplicaciones veterinarias, y en el desarrollo de modelos animales para enfermedades, incluyendo, sin limitacion, roedores —incluyendo ratones, 20 ratas y hamsteres— y primates.

En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona un metodo de evaluacion de un paciente del que se sospecha que tiene una lesion del sistema nervioso central (SNC), segun se expone en la reivindicacion 1 adjunta.

Puede que se sospeche que un paciente tenga una lesion del SNC en funcion de smtomas neurologicos (motores, sensoriales, cognitivos) y/o de una evaluacion radiologica (MRI, tomograffa axial computadorizada, rayos X) 25 coherentes con una lesion del SNC, por ejemplo, despues de un examen medico. En algunas realizaciones, un paciente del que se sospeche que tiene una lesion del SNC, en particular una lesion de la medula espinal, puede tener una valoracion A o B en la escala de minusvalfa de la Asociacion Estadounidense de Lesiones de la Medula Espinal (ASIA). La escala de minusvalfa ASIA es una herramienta diagnostica estandar que evalua la funcion motora y sensorial de un paciente. Las valoraciones de clasificacion y las oportunas descripciones de la escala de 30 minusvalfa ASIA son las siguientes:

Clasificacion/Valoracion

Descripcion

A

Completa: no se conserva ninguna funcion motora ni sensorial por debajo del nivel de la lesion, incluyendo los segmentos sacros S4-S5

B

Incompleta: se conserva la funcion sensorial, pero no la motora, por debajo del nivel neurologico y cierta sensacion en los segmentos sacros S4-S5

C

Incompleta: se conserva la funcion motora por debajo del nivel neurologico; sin embargo, mas de la mitad de los musculos clave por debajo del nivel neurologico tiene un grado muscular inferior a 3 (es decir, no lo suficientemente fuerte para moverse contra la gravedad)

D

Incompleta: se conserva la funcion motora por debajo del nivel neurologico y al menos la mitad de los musculos clave por debajo del nivel neurologico tiene un grado muscular de 3 o mas (es decir, las articulaciones pueden moverse contra la gravedad)

E

Normal: las funciones motora y sensorial son normales

Asf, un paciente que presente una valoracion de clasificacion de A o B en la escala de minusvalfa ASIA no tiene ninguna funcion motora por debajo del nivel de la lesion.

En otras realizaciones, un paciente del que se sospeche que tiene una lesion del SNC puede tener una puntuacion < 35 12 (por ejemplo, de 3 a 12) en la Escala de Coma de Glasgow (GCS). En otras realizaciones adicionales, el paciente

puede tener una puntuacion GCS < 8 (por ejemplo, de 3 a 8). La GCS es una escala neurologica comunmente usada para evaluar el nivel de consciencia de los pacientes despues de una lesion o un traumatismo. La escala esta compuesta de tres pruebas (respuestas ocular, verbal y motriz), a cada una de las cuales se le asigna un valor en una escala de hasta 6. Se consideran los tres valores por separado, asf como su suma. La puntuacion GCS menor 40 posible (la suma) es 3 (coma profundo o defuncion), mientras que el mas alto es 15 (persona completamente despierta). Una puntuacion GCS < 9 es indicativa de una lesion cerebral grave, mientras que una puntuacion GCS >

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13 es indicativa de una lesion cerebral menor. Una puntuacion GCS de 9-12 es generalmente indicativa de una lesion cerebral moderada.

Un paciente del que se sospeche que tiene una lesion del SNC puede tener uno o mas signos o smtomas de lesion del SNC, tales como perdida temporal de la conciencia, confusion, desorientacion, problemas de la memoria o la concentracion, dolor de cabeza, mareo, perdida del equilibrio, nausea o vomito, alteraciones sensoriales (por ejemplo, vision borrosa, zumbido en los ofdos, mal sabor de boca, perdida de sensacion en las extremidades), perdida de la funcion motora, sensibilidad a la luz o al sonido, cambios de humor o altibajos emocionales, depresion o ansiedad, fatiga, somnolencia y alteraciones del sueno.

En algunas realizaciones, se mide el nivel, la concentracion o la abundancia de una o mas protemas inflamasoma en una muestra biologica obtenida de un paciente (por ejemplo, un paciente del que se sospeche que tiene o padece una lesion del SNC). En realizaciones particulares, los niveles, las concentraciones o la abundancia de una o mas protemas inflamasoma son indicativos de la gravedad de una lesion del SNC en el paciente. Una lesion del SNC incluye, sin limitacion, una lesion cerebral traumatica, una lesion relacionada con una apoplejfa, una lesion relacionada con un aneurisma cerebral, una lesion de la medula espinal (por ejemplo, contusiones, compresiones, laceraciones), una lesion relacionada con una conmocion cerebral (incluyendo el smdrome post-conmocion), la isquemia cerebral, una lesion resultante de enfermedades neurodegenerativas (incluyendo la enfermedad de Parkinson, la demencia pugilfstica, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob), lesiones relacionadas con convulsiones, esclerosis multiple, esclerosis lateral amiotrofica y otros traumas del SNC. En ciertas realizaciones, los niveles, las concentraciones o la abundancia de una o mas protemas inflamasoma son indicativos de la gravedad de la lesion cerebral traumatica o de la lesion de la medula espinal en el paciente.

Segun se usa en la presente memoria, “muestra biologica” se refiere a cualquier lfquido o tejido corporal obtenido de un paciente o sujeto. Una muestra biologica puede incluir, sin limitacion, sangre completa, hematies, plasma, suero, celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC), orina, saliva, lagrimas, frotis bucales, LCR, microdializado del SNC y tejido nervioso. En una realizacion, la muestra biologica es LCR, suero o plasma. En ciertas realizaciones, la muestra biologica es LCR.

En algunas realizaciones, el nivel medido, la concentracion o la abundancia de una o mas protemas inflamasoma en la muestra biologica son usados para preparar un perfil de protema inflamasoma, siendo el perfil indicativo de la gravedad de una lesion del SNC en el paciente o del pronostico del paciente o del potencial de recuperacion de una lesion del SNC. El perfil de la protema inflamasoma puede comprender el nivel, la abundancia o la concentracion de una o mas protemas inflamasoma medidos en la muestra del paciente opcionalmente en relacion con un valor predeterminado o un intervalo de valores de referencia, segun se describe en la presente memoria. Las protemas inflamasoma en el perfil incluyen NLRP1 (NALP-1), ASC, y/o caspasa-1 (por ejemplo, la subunidad p20 de la caspasa-1). En una realizacion particular, el perfil de protema inflamasoma comprende el nivel, la abundancia o la concentracion de cada uno de la NLRP1 (NALP-1), el ASC y la caspasa-1 (por ejemplo, la subunidad p20 de la caspasa-1).

En un aspecto de la invencion, el metodo de evaluacion de un paciente del que se sospecha que tiene una lesion del SNC comprende determinar la presencia o la ausencia de una firma de protema asociada con una lesion del SNC o una lesion mas grave del SNC en funcion del nivel medido, la abundancia o la concentracion de una o mas protemas inflamasoma en la muestra del paciente o en el perfil de protema inflamasoma preparado a partir de la muestra del paciente. En ciertas realizaciones, la firma de la protema comprende un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma. El nivel de dicha al menos una protema inflamasoma en la firma de la protema puede ser potenciado con respecto al nivel de la protema en una muestra de control o con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia, segun se describe ulteriormente en la presente memoria. La firma de la protema puede comprender, en ciertas realizaciones, un nivel elevado para cada uno de la caspasa-1 (por ejemplo, la subunidad p20 de la caspasa-1), la NLRP1 y el ASC. Los pacientes que tienen una lesion del SNC o una lesion mas grave del SNC pueden ser seleccionados o identificados por presentar la firma de la protema.

El nivel o concentracion de al menos una protema inflamasoma puede ser evaluado en un unico punto temporal (por ejemplo, despues de una lesion potencial del SNC) y comparado con un valor predeterminado de referencia o con un intervalo de valores de referencia o puede ser evaluado en multiples puntos temporales (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o mas) despues de una lesion potencial del SNC y comparado con un valor predeterminado de referencia o con valores evaluados previamente. Por ejemplo, una muestra biologica para medir niveles o concentraciones de protemas inflamasoma puede ser obtenida de un paciente menos de una hora despues de una lesion potencial del SNC hasta dos semanas despues de una lesion potencial del SNC. En algunas realizaciones, la muestra biologica se obtiene menos de un dfa, dos dfas, tres dfas, cuatro dfas, cinco dfas, seis dfas, siete dfas, diez dfas o doce dfas despues de una lesion o una lesion potencial del SNC.

Segun se usa en la presente memoria, “valor predeterminado de referencia” se refiere a un valor predeterminado del nivel de concentracion de una protema inflamasoma establecido a partir de una muestra conocida. Por ejemplo, el valor predeterminado de referencia puede reflejar el nivel o concentracion de una protema inflamasoma en una muestra obtenida de un sujeto de control (es decir, un sujeto sano no lesionado). En algunas realizaciones, puede

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hacerse que el sujeto de control coincida en edad con los pacientes a los que se este evaluando. Asf, en realizaciones particulares, el nivel o concentracion medido de al menos una protema inflamasoma es comparado o determinado con respecto al nivel o concentracion de dicha al menos una protema inflamasoma en una muestra de control (es decir, obtenida de un sujeto no lesionado).

En otras realizaciones, el valor predeterminado de referencia o el intervalo de valores de referencia puede reflejar el nivel o concentracion de una protema inflamasoma en una muestra obtenida de un paciente con una gravedad de lesion del SNC conocida evaluada por medidas clmicas o analisis post mortem. Un valor predeterminado de referencia tambien puede ser una cantidad o concentracion conocida de una protema inflamasoma. Tal cantidad o concentracion conocida de una protema inflamasoma puede correlacionarse con un nivel o una concentracion medios de la protema inflamasoma de una poblacion de sujetos de control o una poblacion de pacientes con niveles conocidos de lesion. En otra realizacion, el valor predeterminado de referencia puede ser un intervalo de valores que, por ejemplo, pueda representar una media mas o menos una desviacion tfpica o intervalo de confianza. Un intervalo de valores de referencia tambien se puede referir a valores individuales de referencia para una protema inflamasoma particular en diversos niveles de gravedad de la lesion del SNC. En ciertas realizaciones, un aumento en el nivel de una o mas protemas inflamasoma (por ejemplo, NLRP1 (NALP-1), ASC o caspasa-1) con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es indicativo de una lesion mas grave del sistema nervioso central.

En algunas realizaciones, el metodo de evaluacion de la gravedad de una lesion del SNC comprende, ademas, medir el nivel o concentracion de una o mas protemas descritas en la publicacion de patente estadounidense n° 2011/0177974, ademas de medir el nivel o concentracion de una o mas protemas inflamasoma. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el metodo comprende, ademas, medir el nivel o concentracion de una o mas protemas seleccionadas entre ubiquitina C-terminal hidrolasa L1; protema de membrana vesicular p-24, sinuclema; protema asociada a microtubulos; sinaptofisina, vimentina; sinaptotagmina; sinaptojanina-2; sinapsina2; CRMP1,2; anfifisina- 1; PSD95; PSD-93; protema quinasa dependiente de calmodulina II (CAMPK)-alfa, beta, gamma; protema basica de mielina (MBP); protema de proteolfpidos de mielina (PLP); protema espedfica de oligodendrocitos de mielina (MOSP); glicoprotema de oligodendrocitos de mielina (MOG); protema asociada a la mielina (MAG); NF-H; NF-L; NF-M; BIII-tubulina-1 o combinaciones de las mismas en la muestra biologica obtenida del paciente ademas de medir el nivel o concentracion de una o mas protemas inflamasoma. Asf, la firma de la protema puede comprender un nivel elevado de una o mas de estas protemas, ademas del nivel elevado de una o mas protemas inflamasoma. En otras realizaciones, el metodo comprende, ademas, medir el nivel o concentracion de una o mas protemas seleccionadas entre S-100p, enolasa espedfica de neurona, cadena ligera de neurofilamentos, protema acida glial fibrilar (GFAP) o combinaciones de las mismas en la muestra biologica obtenida del paciente, ademas de medir el nivel o concentracion de una o mas protemas inflamasoma. En una realizacion, la firma de la protema asociada con una lesion del SNC o una lesion mas grave del SNC comprende un nivel elevado de una o mas protemas seleccionadas entre S-100p, enolasa espedfica de neurona, cadena ligera de neurofilamentos, protema acida glial fibrilar (GFAP), ademas de un nivel elevado de una o mas protemas inflamasoma (por ejemplo, NLRP1 (NALP-1), ASC o caspasa-1).

Los metodos de evaluacion de la gravedad de una lesion del SNC en un paciente o de evaluacion de un paciente del que se sospecha que tiene una lesion del SNC pueden comprender, ademas, administrar un tratamiento neuroprotector al paciente en funcion del nivel medido de dicha al menos una protema inflamasoma, o cuando se identifica una firma de protema asociada con una lesion del SNC o una lesion mas grave del SNC. Tales tratamientos neuroprotectores incluyen farmacos que reducen la excitotoxicidad, el estres oxidativo y la inflamacion. Asf, los tratamientos neuroprotectores adecuados incluyen, sin limitacion metilprednisolona, 17a-estradiol, 17p- estradiol, ginsenosido, progesterona, simvastatina, deprenilo, minociclina, resveratrol y otros antagonistas del receptor de glutamato (por ejemplo, antagonistas del receptor NMDA) y antioxidantes. En algunas realizaciones, los tratamientos neuroprotectores son anticuerpos neutralizantes contra una protema inflamasoma o fragmentos de union de los mismos, tales como los descritos en la publicacion de patente estadounidense n° 2009/0104200. Por ejemplo, en una realizacion, el tratamiento neuroprotector es un anticuerpo anti-ASC o un fragmento del mismo. Los anticuerpos anti-ASC incluyen anticuerpos que se unen espedficamente a los residuos aminoacidos 178-193 de ASC de rata (numero de registro BAC43754) —por ejemplo, la secuencia de aminoacidos ALRQTQPYLVTDLEQS (ID SEC N° 1)—, o anticuerpos que se unen espedficamente con la secuencia de aminoacidos RESQSYLVEDLERS (ID SEC N° 2) del ASC humano. En otra realizacion, el tratamiento neuroprotector es un anticuerpo anti-NLRP1 o un fragmento del mismo. Los anticuerpos anti-NLRP1 neutralizantes adecuados o fragmentos de los mismos incluyen anticuerpos que se unen espedficamente con la secuencia de aminoacidos CEYYTEIREREREKSEKGR (ID SEC N° 3) de NLRP1 humana o la secuencia de aminoacidos MEESQSKEESNTEG (ID SEC N° 4) de la NLRP1 de rata. Los anticuerpos neutralizantes o fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, fragmentos monoclonales variables (scFvs) y similares. Los aptameros que se unen espedficamente con una protema inflamasoma o con un epftopo de la misma (por ejemplo, ID SEC Nos 1-4) tambien pueden ser tratamientos neuroprotectores adecuados. Los tratamientos neuroprotectores tambien abarcan regfmenes terapeuticos o procedimientos de rehabilitacion, tales como un tratamiento de hipotermia.

El exito del tratamiento o la respuesta al mismo tambien pueden ser monitorizados midiendo los niveles de al menos una protema inflamasoma. En consecuencia, en algunas realizaciones, los metodos de evaluacion de un paciente

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comprenden, ademas, medir el nivel de al menos una protema inflamasoma en una muestra biologica obtenida del paciente tras el tratamiento neuroprotector, preparar una firma de la protema de tratamiento asociada con una respuesta positiva al tratamiento neuroprotector, comprendiendo la firma de la protema de tratamiento un nivel reducido de al menos una protema inflamasoma, e identificar a los pacientes que muestran la presencia de la firma de la protema de tratamiento por responder positivamente al tratamiento neuroprotector. Una reduccion en el nivel, la abundancia o la concentracion de una o mas protemas inflamasoma (por ejemplo, NLRP1, ASC y caspasa-1) es indicativa de la eficacia del tratamiento neuroprotector en el paciente. Las una o mas protemas inflamasoma medidas en la muestra obtenida tras el tratamiento pueden ser iguales o diferentes de las protemas inflamasoma medidas en la muestra obtenida antes del tratamiento. Los niveles de protema inflamasoma tambien pueden ser usados para regular la dosificacion o la frecuencia de un tratamiento neuroprotector.

La presente invencion tambien proporciona un metodo de determinacion de un pronostico para un paciente con una lesion del sistema nervioso central, segun se expone en la reivindicacion 8 adjunta. En ciertas realizaciones preferentes, la muestra biologica se obtiene del paciente en menos de cinco dfas o en menos de tres dfas despues de la lesion. En algunas realizaciones, un aumento en el nivel de una o mas protemas inflamasoma (por ejemplo, NLRP1, ASC, caspasa-1 o combinaciones de las mismas) con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es indicativo de un pronostico peor. Por ejemplo, un aumento de entre aproximadamente 20% y aproximadamente 300% en el nivel de una o mas protemas inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es indicativo de un pronostico peor. En una realizacion, mayores niveles de caspasa-1, particularmente de la subunidad p20 de la caspasa-1 activa, con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia, de forma aguda despues de la lesion (es decir, en menos de una semana despues de la lesion) son indicativos de un pronostico peor.

En realizaciones particulares, un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo del potencial de recuperacion del paciente o el resultado a largo plazo evaluado por la Escala de Desenlace de Glasgow (GOS). La GOS es una escala que permite la evaluacion objetiva de la recuperacion de un paciente tras una lesion cerebral. La escala comprende puntuaciones que oscilan entre 1 y 5 con las siguientes descripciones:

Puntuacion/Categoria

Descripcion

1-Defuncion

Lesion grave o defuncion sin recuperacion de la conciencia

2-Estado vegetativo persistente

Lesion grave con estado prolongado de impasibilidad y falta de funciones mentales superiores

3-Minusvalfa grave

Lesion grave con necesidad permanente de asistencia en la vida cotidiana

4-Minusvalfa moderada

Ninguna necesidad de asistencia en la vida cotidiana, empleabilidad posible, pero pueden requerirse equipos especiales

5-Minusvalfa leve

Lesion leve con deficits neurologicos y psicologicos menores

En una realizacion, un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de que el paciente tenga una puntuacion GOS de 1 a 3 tras una evaluacion de seguimiento (es decir, de que el paciente tenga un desenlace desfavorable, tal como defuncion o una minusvalfa grave). En otra realizacion, un nivel reducido de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de que el paciente tenga una puntuacion GOS de 4 o 5 tras una evaluacion de seguimiento (es decir, de que el paciente tenga un desenlace favorable, tal como una minusvalfa moderada a leve). Los inventores han descubierto que los niveles en LCR de una o mas protemas inflamasoma en menos de tres dfas despues de una lesion del SNC son utiles para predecir el desenlace a largo plazo o el potencial de recuperacion del paciente. Los niveles elevados de protemas inflamasoma se correlacionan con desenlaces desfavorables para el paciente, mientras que los niveles reducidos o bajos de la protema inflamasoma se correlacionan con desenlaces favorables para el paciente (Ejemplo 3).

Las protemas inflamasoma de la invencion y otras protemas marcadoras pueden ser medidas en una muestra biologica mediante diversos metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las protemas pueden medirse mediante metodos que incluyen, sin limitacion, cromatograffa lfquida, cromatograffa de gases, espectrometna de masas, radioinmunoanalisis, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos a base de FRET, inmunotransferencia, ELISA o cromatograffa lfquida seguida por espectrometna de masas (por ejemplo, MALDI MS). Un experto en la tecnica puede determinar otros metodos adecuados para medir y cuantificar cualquier protema biomarcadora particular de la invencion.

Tambien se describen equipos de reactivos para preparar un perfil de protema inflamasoma asociado con una lesion del SNC, tal como una lesion de la medula espinal o una lesion cerebral traumatica. Los equipos de reactivos pueden incluir un reactivo para medir al menos una protema inflamasoma e instrucciones para medir dicha al menos una protema inflamasoma para evaluar la gravedad de una lesion del sistema nervioso central en un paciente.

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Segun se usa en la presente memoria, un “reactivo” se refiere a los componentes necesarios para detectar o cuantificar una o mas protemas mediante uno cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los equipos de reactivos para medir una o mas protemas inflamasoma pueden incluir reactivos para realizar cromatograffa de lfquidos o gases, espectrometna de masas, inmunoensayos, inmunotransferencias o electroforesis para detectar una o mas protemas inflamasoma, segun se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el equipo de reactivos incluye reactivos para medir una o mas protemas inflamasoma seleccionadas entre NLRP1, ASC, caspasa-1 o combinaciones de las mismas.

En una realizacion, el equipo de reactivos comprende un ligando marcado que se une espedficamente con una o mas protemas inflamasoma, seleccionandose dichas una o mas protemas inflamasoma del grupo constituido por NLRpI, ASC, caspasa-1 y combinaciones de las mismas. Los ligandos adecuados para unirse espedficamente con protemas inflamasoma incluyen, sin limitacion, anticuerpos y fragmentos de los mismos, aptameros, peptidos y similares. En ciertas realizaciones, los ligandos para detectar la NLPR1 son anticuerpos o fragmentos de los mismos, aptameros o peptidos que se unen espedficamente con la secuencia de aminoacidos de ID SEC N° 3 o ID SEC N° 4 de la NLRpI humana y la NLRP1 de rata, respectivamente. En otras realizaciones, los ligandos para detectar el ASC son anticuerpos o fragmentos de los mismos, aptameros o peptidos que se unen espedficamente con la secuencia de aminoacidos de ID SEC N° 1 o ID SEC N° 2 de ASC de rata y ASC humano, respectivamente. Las marcas que pueden conjugarse con el ligando incluyen nanopartfculas metalicas (por ejemplo, nanopartfculas de oro, plata, cobre, platino, cadmio y materiales compuestos), marcas fluorescentes (por ejemplo, fluorescema, Texas Red, protema fluorescente verde, protema fluorescente amarilla, protema fluorescente turquesa, moleculas de tincion Alexa, etc.), y marcas enzimaticas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, beta- galactosidasa, beta-lactamasa, galactosa oxidasa, lactoperoxidasa, luciferasa, mieloperoxidasa y amilasa).

En algunas realizaciones, el equipo de reactivos puede incluir reactivos para medir una o mas protemas inflamasoma en muestras de LCR. En otras realizaciones, los equipos de reactivos pueden incluir reactivos para medir una o mas protemas inflamasoma en otras muestras de paciente, incluyendo tejido nervioso, microdializado del SNC, sangre, saliva, suero, plasma u orina. En otras realizaciones adicionales, los equipos de reactivos comprenden, ademas, un conjunto de valores de referencia con el que puede compararse el nivel medido de una o mas protemas inflamasoma.

Ejemplos

Ejemplo 1. Se segregan protemas inflamasoma al liquido cefalorraquideo despues de una lesion de la medula espinal

Para determinar si habna presentes protemas inflamasoma NLRP1 en el lfquido cefalorraquideo (LCR) tras una lesion de la medula espinal (SCI), se analizaron muestras de LCR de siete pacientes con SCI o pacientes de control en busca de los niveles de protema con contenido de dominios de union a nucleotidos, de repeticion rica en leucina y de pirina 1 (NLRP1; tambien denominada protema de repeticion rica en leucina NAcht 1 (NALP-1)), protema puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y caspasa-1. La escala de la Asociacion Estadounidense de Lesiones de la Medula Espinal (ASIA) de los pacientes con sCi en el momento del ingreso a Urgencias oscilo de la EAL (Escala Abreviada de Lesiones) A a B. La Tabla 1 muestra informacion relativa al diagnostico, a los procedimientos y a los desenlaces de los pacientes. Ninguno de los pacientes tuvo ninguna complicacion. Se obtuvo LCR de individuos no lesionados como control de tres varones y dos hembras que oscilaban entre 67 y 91 anos de edad.

Para la deteccion de protemas inflamasoma, se prepararon muestras de LCR con tampon de Laemali. Se realizo un analisis de inmunotransferencia con el sistema Criterion (Bio-Rad) segun se ha descrito previamente (de Rivero Yaccari et al., 2008) usando anticuerpos (disolucion 1:1000) de la NLRP1 (Bethyl Laboratories), de la caspasa-1 (Imgenex) y del ASC (Santa Cruz). Las protemas fueron resueltas en geles premoldeados Criterion TGX al 14-20% (Bio-Rad), transferidas a membranas de transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Tropifluor - Applied Biosystems) y puestas en tampon de bloqueo (PBS, Tween-20 al 0,1%, I-Block al 0,4% (Applied Biosystems)) y luego incubadas durante una hora con anticuerpos primarios. A continuacion, las membranas fueron incubadas con anticuerpos ligados a la peroxidasa de rabano picante (HRP) antirraton, antirrata o anticonejo durante una hora. La visualizacion de senales se llevo a cabo mediante quimioluminiscencia mejorada.

El analisis de inmunotransferencia de muestras de LCR de control (n=5) revelo niveles muy bajos de protemas inflamasoma NLRP1 (Figura 1). En cambio, el analisis de inmunotransferencia de muestras de 6 pacientes diferentes con SCI mostro un aumento en los niveles de NLRP1, caspasa-1 y ASC en el LCR cuando se lo comparo con el LCR de sujetos de control. Debena hacerse notar que los pacientes 2, 3 y 4 (Figura 1) no presentaron niveles mayores de caspasa-1 de manera aguda (dfa 0 a dfa 2) despues de una SCI. Curiosamente, estos pacientes mostraron una mejora motora completa 2 dfas despues de la SCI. Los pacientes 1, 5 y 6 mostraron mayores niveles de protemas inflamasoma caspasa-1, ASC y NLRP1 de forma aguda despues de una SCI, y estos individuos tuvieron un mal pronostico y no mostraron mejoras motoras. Asf, parece que los individuos que presentan niveles bajos de caspasa-1 en LCR de forma aguda despues de una SCI pueden tener mejor pronostico que los individuos que mostraron mayores niveles de este biomarcador.

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Los resultados de estos experimented demuestran que los niveles de protema de NLRP1, ASC y caspasa-1 en LCR aumentan tras una lesion del sistema nervioso central y sugieren que los niveles de estas protemas inflamasoma pueden servir como biomarcadores de la gravedad de la lesion neuronal tras una lesion, dirigiendo con ello el tratamiento y los esfuerzos de rehabilitacion, monitorizando la respuesta al tratamiento y contribuyendo en el determinacion del pronostico de la recuperacion en pacientes lesionados.

Ejemplo 2. Expresion immunohistoquimica de protemas inflamasoma NLRP1 en medulas espinales despues de una lesion

Se obtuvieron secciones de medula espinal de nueve fallecidos (8 varones y 1 hembra, con edades que oscilaban entre 20 y 77 anos) que teman una lesion en la medula espinal debida a fracturas vertebrales. La lesion de la medula espinal fue evaluada microscopicamente, usando optica en campo claro, examinando una seccion tincionada con H&E o H&E/DAB del centro de la lesion de cada caso o de secciones cervicales, toracicas y lumbares de los casos de control. Las lesiones de medula espinal fueron clasificadas en funcion de su aspecto histologico como “contusion/quiste,” compresion masiva o laceracion (Fleming et al., 2006). Las lesiones contusionales se caracterizaron por una piamadre intacta y por la relativa conservacion de las relaciones anatomicas de diversos elementos de la medula espinal, y grados variables de lesion que oscilaban entre implicacion de toda el area en seccion transversal y grandes areas, habitualmente asimetricas, de lesion tisular. Las lesiones de compresion masiva se caracterizaron por la alteracion de la piamadre y una grave distorsion y alteracion del parenquima de la medula espinal. Las lesiones de laceracion que, por definicion, eran lesiones perforantes y penetrantes causadas por armas o proyectiles, estuvieron asociadas con la ruptura de la piamadre y el desgarro lineal del tejido medular.

Todas las muestras tisulares habfan sido extrafdas menos de 24 h despues del fallecimiento y fijadas en formol tamponado neutro. Los bloques procedentes de las medulas espinales fueron deshidratados, embebidos en cera de parafina, cortados en secciones de 6 pm de grosor y puestos en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Un conjunto de secciones fue tincionado con hematoxilina-eosina (H&E) y los conjuntos restantes fueron usados para los estudios inmunohistoqmmicos. Las secciones embebidas en parafina fueron tincionadas con anti-NLRPI (Bethyl Laboratories, segun se describe en de Rivero Vaccari et al. 2008), anti-caspasa-1 (Upstate) y anti-ASC (Chemicon) usando diaminobencidina (DAB) —como cromoforo— y hematoxilina. Los controles negativos incluyeron secciones en las que el anticuerpo primario fue omitido y secciones incubadas con anticuerpos emparejados por isotipo (1:1001:10.000 IgG). Estos controles positivos y negativos fueron procesados con cada tanda de portaobjetos inmunohistoqmmicos.

En todos los casos, se obtuvieron muestras tisulares del centro de la lesion y a diversas distancias por encima y por debajo de la lesion. Los datos del tejido del centro de la lesion fueron usados para comparar las respuestas inflamatorias entre casos, mientras que los de los segmentos remotos no lesionados de la medula espinal sirvieron como controles dentro del propio caso. No fue posible una comparacion entre casos de las muestras remotas porque, para casos diferentes, la distancia de estas muestras desde el centro de la lesion era variable.

El analisis inmunohistoqmmico combinado con microscopfa optica indico que la NLRP1 se expresa en las neuronas del asta ventricular (flechas negras), en los axones mielinados (puntas de flecha) y en los oligodendrocitos (flechas amarillas) en medulas espinales lesionadas (Figura 2). Ademas, la inmunorreactividad de la NLRP1 en areas de la penumbra (C7) era mayor que en areas distantes del epicentro (L2).

Se detecto inmunorreactividad de la DAB hacia la caspasa-1 en axones hinchados (esferoides, flechas azules) (Figura 2), y arteriolas (no mostradas). En areas de la penumbra, hay presente tincion de caspasa-1 en las neuronas motoras (flechas negras) del asta ventricular, y en la sustancia blanca en los oligodendrocitos (flechas amarillas). La inmunorreactividad de la caspasa-1 en oligodendrocitos (flechas amarillas) fue igual en todos los niveles de la medula espinal examinados, con independencia de la proximidad al epicentro. En areas distantes del epicentro (T12), tambien habfa presente caspasa-1 en las neuronas motoras (flechas negras), pero con menor inmunorreactividad que la penumbra (C7). Este hallazgo indica que la inmunorreactividad de la caspasa-1 en las neuronas disminuye cuando aumenta la distancia al epicentro, de modo similar que la NLRP1.

En areas de la penumbra (C7) y distantes al epicentro (L2), las neuronas del asta ventricular (flechas negras) y los oligodendrocitos de sustancia blanca (flecha amarilla) mostraron inmunorreactividad del ASC. Ademas, el ASC tambien estuvo presente en macrofagos/microglia en el epicentro (puntas de flecha azules). Ademas, la inmunorreactividad del ASC tambien fue detectada en la sustancia gelatinosa (asta dorsal) en C7 y L2 (no mostrado).

Se ha considerado que la neuroinflamacion desempena un papel cntico en la patogenesis de una SCI y una TBI, pero no se ha examinado directamente el papel de la respuesta inmunitaria innata. El sistema inmunitario innato detecta patrones moleculares asociados con patogenos microbianos y virales y senales de peligro liberadas desde celulas danadas o estresadas para desencadenar redes de senalizacion intracelular conservadas que conducen respuestas proinflamatorias que son cnticas para una inmunidad innata y adaptativa productiva. Un exceso de respuestas inflamatorias se vuelve perjudicial, llevando a la destruccion tisular. Los resultados de este experimento proporcionan evidencia que demuestra que el sistema de senalizacion del inflamasoma NLRP1 es activado en la respuesta inmunitaria innata en la medula espinal y el tejido cerebral humanos lesionados despues de un

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traumatismo. Estos hallazgos apoyan la idea de que la activacion del sistema de senalizacion del inflamasoma NLRP1 es un acontecimiento temprano en la patologfa de la medula espinal y el cerebro y de que estas protemas pueden servir como biomarcadores para la SCI y la TBI in seres humanos.

Ejemplo 3. Las protemas inflamasoma en el liquido cefalorraquideo de pacientes con lesion cerebral son biomarcadores del desenlace funcional

Para determinar si las protemas inflamasoma pueden servir como biomarcadores para otros tipos de lesion del sistema nervioso central, se recogieron un total de 45 muestras de LCR de 23 pacientes con lesion cerebral traumatica (TBI) en el dfa de la lesion y hasta tres dfas despues de la lesion y fueron analizadas mediante inmunotransferencia en busca de los niveles de la NALP-1 (tambien denominada NLRP1), el ASC y la caspasa-1. Cada uno de los pacientes presentaba los siguientes criterios de inclusion: traumatismo craneal grave o moderado (puntuacion de la Escala de Coma de Glasgow (GCS) < 12), edad de 1 mes a 65 anos y ventriculostoirna. Veintidos de los pacientes sufrieron traumatismo craneal grave (puntuacion GCS < 8) y 1 sufrio traumatismo craneal moderado (la puntuacion GCS de la TBI moderada esta en el intervalo 9-12). Nueve pacientes (5 hombres y 4 mujeres) con una edad media de 66,3 anos (intervalo de 29-91 anos) sirvieron como controles. Los pacientes de control requirieron una ventriculostomfa para una patologfa no traumatica. Se excluyo a pacientes con meningitis aguda, vasculitis cerebral u otra infeccion reciente del SNC. La Tabla 2 muestra informacion relativa a la demograffa, la patologfa intracraneal, la puntuacion GCS en el momento del ingreso y la puntuacion de los pacientes en la Escala de Desenlace de Glasgow (GOS) 5 meses despues de la lesion.

Las muestras de lfquido cefalorraquideo se recogieron menos de 12 horas despues de la lesion y hasta 72 horas despues de la lesion. Las muestras fueron centrifugadas a 2000g durante 10 minutos a 4°C para encapsular cuerpos celulares y restos. Los sobrenadantes fueron resueltos mediante electroforesis en gel y sometidos a inmunotransferencia segun se ha descrito previamente (de Rivero Vaccari et al., 2008). La cuantificacion de la densidad de las bandas se llevo a cabo con soporte logico de digitalizacion en gel UNSCAN-IT (Silk Scientific). Debido al bajo volumen de muestra disponible, la NALP-1 fue analizada en 6 de los 9 controles, la caspasa-1 fue analizada en 43 de las 45 muestras de TBI, y la NALP-1 fue analizada en 42 de las 45 muestras de TBI. El analisis de inmunotransferencia muestra que las protemas inflamasoma ASC, caspasa-1 (p20) y NALP-1 estan presentes en el LCR de pacientes con TBI y controles sin traumatismo. En la Figura 3 se muestran los datos cuantitativos de un analisis densitometrico. La expresion de la isoforma del ASC de 22-kD (Fig. 3A), la subunidad p20 de la caspasa-1 escindida (Fig. 3B) y la NALP-1 (Fig. 3C) se eleva significativamente en el LCR de pacientes con TBI en comparacion con los controles sin traumatismo (p < 0,0001, p = 0,0029 y p = 0,0202, respectivamente).

Para determinar si los niveles de los componentes de inflamasomas se correlacionan con el desenlace, los inventores agruparon a los participates en el estudio por categona de desenlace (puntuaciones GOS 1 y 3, desenlace desfavorable; puntuaciones GOS 4 y 5, desenlace favorable). A los 5 meses de la lesion, 3 pacientes teman una puntuacion GOS de 1 (defuncion), 11 pacientes teman una puntuacion GOS de 3 (minusvalfa grave), 6 pacientes teman una puntuacion GOS de 4 (minusvalfa moderada), y 3 pacientes teman una puntuacion GOS de 5 (buena recuperacion). Dentro de la muestra de pacientes con TBI, no quedo ningun paciente con una puntuacion GOS de 2 (estado vegetativo persistente). Los inventores detectaron niveles significativamente mayores de ASC (Fig. 4A), caspasa-1 (p20) (Fig. 4B) y NALP-1 (Fig. 4C) en el LCR de pacientes con TBI con desenlaces desfavorables, incluyendo el fallecimiento y la minusvalfa grave con total dependencia de otros para las actividades de la vida cotidiana (p < 0,0001).

Para entender mejor la relacion entre el desenlace y las protemas inflamasoma, los inventores construyeron diagramas de dispersion modificados de los niveles de expresion del ASC, la caspasa-1 (p20) y la NALP-1 y la GOS (Figura 5). Para cada grafico se muestra una lmea de regresion lineal. El analisis de regresion lineal muestra que la expresion del ASC (Fig. 5 A; p < 0,05), de la caspasa-1 (p20) (Fig. 5B; p < 0,01) y de la NALP-1 (Fig. 5C; p < 0,05) se correlaciona significativamente con el desenlace a los 5 meses. Post hoc, las pruebas de comparacion multiple de Dunn tras una prueba de Kruskal-Wallis demostraron que los niveles de ASC son significativamente mas altos en pacientes con minusvalfa grave (puntuacion GOS 3) en comparacion con pacientes con minusvalfa moderada (puntuacion GOS 4) (p < 0,001) y con pacientes entre una minusvalfa leve y sin minusvalfa (puntuacion GOS 5) (p < 0,05). De modo similar, la expresion de niveles de caspasa-1 (p20) y NALP-1 es significativamente mas alta en pacientes con minusvalfa grave (puntuacion GOS 3) que en aquellos que tienen una minusvalfa moderada (puntuacion GOS 4) (p < 0,001).

Los resultados de este estudio demuestran que las protemas inflamasoma (por ejemplo, ASC, NALP-1 y caspasa-1) se elevan de forma aguda (por ejemplo, en menos de 72 horas) en el LCR de pacientes con TBI en comparacion con los controles sin traumatismo. La elevacion de estas protemas probablemente refleje el grado de neuroinflamacion, sugiriendo que las protemas inflamasoma puedan servir como biomarcadores agudos de una lesion del SNC. Estos hallazgos son clmicamente relevantes, ya que los biomarcadores del LCR son indicadores mas espedficos de neuropatologfa que los biomarcadores del suero. El lfquido cefalorraquideo bana directamente el cerebro, reflejando estrechamente el medio extracelular y los cambios bioqmmicos que son espedficos al SNC. El muestreo del LCR elimina las influencias del traumatismo multiorganico o de otra patologfa sistemica representadas en el suero, que son significativas, ya que los pacientes con TBI presentan a menudo traumatismo en otros sistemas organicos.

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Los resultados tambien demuestran que los niveles de protemas inflamasoma son significativamente mayores en el LCR de pacientes que han fallecido y en aquellos que tienen una minusvalfa grave que en pacientes con una minusvalfa entre moderada y sin minusvalfa, sugiriendo que la activacion de inflamasomas produce neuroinflamacion cronica, contribuyendo a una lesion secundaria y a un mal desenlace 5 meses despues de la TBI. El grado de elevacion aguda de estas protemas puede predecir un desenlace desfavorable en contraposicion con uno favorable. Tales marcadores tambien podnan dirigir el tratamiento y los esfuerzos de rehabilitacion. El clmico seleccionana terapias para pacientes identificados por tener mayor riesgo de una lesion secundaria arbitrada por la inflamacion.

La respuesta al tratamiento podna ser monitorizada siguiendo los niveles de ASC, caspasa-1 activa y NALP-1 en el LCR. Un tratamiento tal, la hipotermia terapeutica, atenua la respuesta inflamatoria endogena del SNC a la TBI disminuyendo la produccion de citocinas y reduciendo la activacion de astrocitos y microglia (Aibiki el al., 1999; Goss et al., 1995; Kumar et al., 1997; Truettner et al., 2005), y las neuronas corticales expuestas a hipotermia moderada en cultivo muestran una disminucion en la activacion del inflamasoma (Tomura et al., en imprenta). Asf, el ASC, la caspasa-1 activa y la NALP-1 pueden servir como indicadores bioqmmicos objetivos de la eficacia de un tratamiento para pacientes con una lesion del SNC.

Ejemplo 4. La hipotermia disminuye la activacion de la caspasa-1 despues de una lesion cerebral traumatica en pacientes pediatricos

Para evaluar si las protemas inflamasoma, tales como la caspasa-1, tambien pueden ser usadas para monitorizar la eficacia de un tratamiento en pacientes con TBI, se compararon los niveles de caspasa-1 en el LCR obtenidos de pacientes pediatricos que recibieron tratamiento de hipotermia tras una TBI con los obtenidos de pacientes pediatricos que no recibieron tratamiento tras la TBI. Se obtuvo lfquido cefalorraqmdeo de pacientes pediatricos (edades entre 0,1 y 16 anos) en diferentes momentos despues de una lesion cerebral traumatica (dfas 1, 2 y 3). Los pacientes fueron divididos en aquellos que recibieron tratamiento de hipotermia y aquellos que no (normotermia). Segun se muestra en la Figura 6, los datos indican que en menos de 24 horas despues de la lesion, los niveles de caspasa-1 eran menores en el grupo con hipotermia en comparacion con el grupo con normotermia. Asf, la hipotermia terapeutica post-traumatica disminuye los niveles de activacion de la caspasa-1 despues de una lesion cerebral, en coherencia con los hallazgos de que los pacientes que reciben tratamiento de hipotermia presentan desenlaces mejores en comparacion con los pacientes que no reciben el tratamiento de hipotermia.

Tabla 1. Sujetos con lesion de la medula espinal

Paciente

Edad Sexo Raza Mecanismo de lesion Lesion medular Categoria EAL Nivel Cirugia Hipotermia Otras lesiones Examen en rehabilitacion D/C

1

43 V Negra Atropello de peaton por automovil Carillas saltadas bilaterales de C7/T1 A C7 Laminectomia con fusion instrumentada de C4-T2 Si Ninguna C7 ASIA A

2

38 V Hispanica Precipitacion Fracturas por estallido de T3 y T4 B T3 Laminectomia con fusion instrumentada de T1-6 No Ninguna T3 ASIA D

3

21 V Blanca Accidente de trafico Luxacion por fractura de C5/6 A C5 Disectomia y fusion anteriores de C5/6 Si Ninguna C5 ASIA C

4

19 V Negra Accidente de trafico Carillas saltadas bilaterales de C4/5 B C4 Disectomia y fusion anteriores de C4/5 No Ninguna C4 ASIA D

5

22 V Blanca Accidente de rugby Carillas saltadas bilaterales de C5/6 A C5 Disectomia y fusion anteriores de C5/6 Si Ninguna C6 ASIA A

6

48 V Hispanica Atropello de peaton por motocicleta Luxacion por fractura de T1/2 A T3 Laminectomia con fusion instrumentada de C5-T2 No Lesion de avulsion y fracturas del rostro T3 ASIA B

Tabla 2. Compendio de datos demograficos en pacientes con TBI*

Caso n°

Edad (anos), sexo Raza Mecanismo de lesion Puntuacion GCSf Puntuacion GOSt Patologia intracraneal

1

26, V Blanca AT 3 4 contusiones corticales temporales bilaterales, SAH, SDH

2

22, V Hispanica Accidente de motocicleta 3 4 SDH, SAH difusa

3

19, H Hispanica AT 7 3 contusiones hemorragicas de ganglios frontoparietales, temporoparietales y basales, SAH frontoparietal

4

30, H Hispanica AT 8 4 SAH dispersa, edema cerebral difuso

5

21, V Hispanica Accidente de motocicleta 5 3 SDH y SAH frontales

6

17, H Hispanica AT 4 3 hemorragia extraaxial e intraparenquimal difusa

7

26, V Hispanica AT 8 3 SAH difusa, IVH y contusiones hemorragicas parenquimales

8

36, V Blanca Accidente de VTT 3 5 SDH, SAH y edema cerebral difuso

9

16, V Hispanica AT 7 5 SDH frontotemporal, contusion del lobulo frontal, edema cerebral

10

22, V Hispanica AT 3 3 SDH

11

36, V Negra Herida de bala 3 1 SDH, fragmentos de bala en el lobulo frontal

12

54, V Hispanica Caida 3 3 contusiones hemorragicas frontales, contusion hemorragica parietooccipital, SDH, edema cerebral

13

62, V Negra AT 8 3 hemorragia frontoparietal difusa, contusiones hemorragicas de los lobulos frontal y parietal

14

49, H Blanca Agresion 8 3 contusiones hemorragicas de los lobulos temporal y frontal, SAH frontotemporal, hematoma dural frontal

15

20, V Hispanica Accidente de motocicleta 6 4 fragmentos oseos en el parenquima cerebral frontoparietal, SAH frontoparietal dispersa, contusiones hemorragicas

16

28, V Hispanica Accidente de motocicleta 4 3 SDH

17

21, V Negra AT 5 4 edema cerebral leve

18

45, V Hispanica Herida de bala 8 3 fragmentos de bala en el lobulo occipital, SDH occipital, pneumocefalia parietal y occipital minima

19

21, V Blanca AT 3 3 lesion axonal difusa, SAH dispersa, SDH parietal, hidrocefalia leve

20

17, V Hispanica Lesion deportiva 4 4 SDH, SAH, edema cerebral difuso

21

19, H Hispanica AT 11 5 fragmentos oseos en el parenquima del lobulo frontal, contusion del lobulo frontal, edema, pneumocefalia

22

65, V Blanca AT 7 1 SDH parietal, SAH, contusion hemorragica parietal, hernia lineal

23

18, V Blanca AT 3 1 lesion axonal difusa, contusiones hemorragicas dispersas en los lobulos frontal, temporal y parietal y en el cuerpo calloso, IVH

* IVH = hemorragia intraventricular; SAH=hemorragia subaracnoidea; SDH = hematoma subdural. AT=accidente de trafico; VTT=vehnculo todoterreno fObtenida en el momento del ingreso. fEvaluada 5 meses despues de la lesion.

5 Referencias

Abulafia DP, de Rivero Vaccari JP, Lozano JD, Lotocki G, Keane RW, Dietrich WD. Inhibition of the inflammasome complex reduces the inflammatory response after thromboembolic stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab 29:534544,2009.

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Aibiki M, Maekawa S, Ogura S, Kinoshita Y, Kawai N, Yokono S: Effect of moderate hypothermia on systemic and internal jugular plasma IL-6 levels after traumatic brain injury in humans. J Neurotrauma 16:225-232, 1999.

Arend WP, Palmer G, Gabay C. IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines. Immunol Rev 223:20-38,2008.

Bianchi ME. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J Leukoc Biol 81:1-5,2007.

Brain Trauma Foundation, American Association of Neurological Surgeons, Joint Section on Neurotrauma and Critical Care: Initial management. J Neurotrauma 17:463-469, 2000.

Cao F, Yang XF, Liu WG, Hu WW, Li G, Zheng XJ, Shen F, Zhao XQ, Lv ST. Elevation of neuron-specific enolase and S-100beta protein level in experimental acute spinal cord injury. J ClinNeurosci 15:541-544, 2008.

Comefjord M, Nyberg F, Rosengren L, Brisby H. Cerebrospinal fluid biomarkers in experimental spinal nerve root injury. Spine (Filadelfia, Pensilvania 1976) 29:1862-1868, 2004.

de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Alonso OF, Bramlett HM, Dietrich WD, Keane RW. Therapeutic neutralization of the NLRP1 inflammasome reduces the innate immune response and improves histopathology after traumatic brain injury. J Cereb Blood Flow Metab 29:1251-1261,2009.

de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Marcillo AE, Dietrich WD, Keane RW. A molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J Neurosci 28:3404-3414, 2008.

Goss JR, Styren SD, Miller PD, Kochanek PM, Palmer AM, Marion DW, et al: Hypothermia attenuates the normal increase in interleukin 1 beta RNA and nerve growth factor following traumatic brain injury in the rat. JNeurotrauma 12: 159-167, 1995.

Guez M, Hildingsson C, Rosengren L, Karlsson K, Toolanen G. Nervous tissue damage markers in cerebrospinal fluid after cervical spine injuries and whiplash trauma. J Neurotrauma 20:853-858,2003.

Kufer TA, Sansonetti PJ. NLR functions beyond pathogen recognition. Nat Immunol 12:121-128,2011.

Kumar K, Wu X, Evans AT: GFAP-immunoreactivity following hypothermic forebrain ischemia. Metab Brain Dis 12:21-27, 1997.

Li H, Willingham SB, Ting JP, Re F. Cutting edge: inflammasome activation by alum and alum's adjuvant effect are mediated by NLRP3. J Immunol 181:17-21,2008.

Loy DN, Sroufe AE, Pelt JL, Burke DA, Cao QL, Talbott JF, Whittemore SR. Serum biomarkers for experimental acute spinal cord injury: rapid elevation of neuron-specific enolase and S-100beta. Neurosurgery 56:391-397; discussion 391-397, 2005.

Ma J, Novikov LN, Karlsson K, Kellerth JO, Wiberg M. Plexus avulsion and spinal cord injury increase the serum concentration of S-100 protein: an experimental study in rats. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg 35:355-359, 2001.

Martinon F, Bums K, Tschopp J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell 10:417-426, 2002.

Nagy G, Dzsinich C, Selmeci L, Sepa G, Dzsinich M, Kekesi V, Juhasz-Nagy A. Biochemical alterations in cerebrospinal fluid during thoracoabdominal aortic cross-clamping in dogs. Ann Vase Surg 16:436-441,2002.

Pouw MH, Hosman AJ, van Middendorp JJ, Verbeek MM, Vos PE, van de Meent H. Biomarkers in spinal cord injury. Spinal Cord 47:519-525, 2009.

Qu Y, Franchi L, Nunez G, Dubyak GR. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J Immunol 179:19131925, 2007.

Silverman WR, de Rivero Vaccari JP, Locovei S, Qiu F, Carlsson SK, Scemes E, Keane RW, Dahl G. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. J Biol Chem 284:18143-18151, 2009.

Skouen JS, Brisby H, Otani K, Olmarker K, Rosengren L, Rydevik B. Protein markers in cerebrospinal fluid in experimental nerve root injury. A study of slow-onset chronic compression effects or the biochemical effects of nucleus pulposus on sacral nerve roots. Spine (Filadelfia, Pensilvania 1976) 24:2195-2200, 1999.

Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale. Lancet 2:81-84, 1974.

Tomura S, de Rivero Vaccari JP, Keane RW, Bramlett HM, Dietrich WD: Effects of therapeutic hypothermia on inflammasome signaling after traumatic brain injury. J Cereb Blood Flow Metab [en imprenta], 2012.

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Truettner JS, Suzuki T, Dietrich WD: The effect of therapeutic hypothermia on the expression of inflammatory

response genes following moderate traumatic brain injury in the rat. Brain Res Mol Brain Res 138:124-134, 2005.

Tambien se describen:

A. Un metodo de evaluacion de un paciente del que se sospecha que tiene una lesion del sistema nervioso central (SNC) que comprende: proporcionar una muestra biologica de un paciente que presenta smtomas clmicos coherentes con una lesion del SNC; medir el nivel de al menos una protema inflamasoma en la muestra biologica; determinar la presencia o la ausencia de una firma de protema asociada con una lesion del SNC o una lesion mas grave del SNC, comprendiendo la firma de la protema un nivel elevado de dicha al menos una protema inflamasoma; y seleccionar pacientes que muestran, con la presencia de la firma de la protema, que tienen una lesion del sNc o una lesion mas grave del SNC.

B. El metodo de la declaracion A en el que el nivel de dicha al menos una protema inflamasoma en la firma de la protema esta potenciado con respecto al nivel de dicha al menos una protema inflamasoma en una muestra de control.

C. El metodo de la declaracion A en el que el nivel de dicha al menos una protema inflamasoma en la firma de la protema esta potenciado con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia.

D. El metodo de la declaracion A en el que la lesion del SNC es una lesion de la medula espinal o una lesion cerebral traumatica.

E. El metodo de la declaracion A en el que dicha al menos una protema inflamasoma es protema con contenido de dominios de union a nucleotidos, de repeticion rica en leucina y de pirina 1 (NLRPI), protema puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC), caspasa-1 o combinaciones de las mismas.

F. El metodo de la declaracion F en el que la firma de la protema comprende un nivel elevado para cada uno de la caspasa-1, la NFRP1 y el ASC.

G. El metodo de la declaracion F en el que la firma de la protema comprende un nivel elevado para la subunidad p20 de la caspasa-1.

H. El metodo de la declaracion A en el que dicha muestra biologica es obtenida en menos de una semana despues de la presunta lesion.

I. El metodo de la declaracion A en el que dicha muestra biologica es obtenida en menos de cinco dfas despues de la presunta lesion.

J. El metodo de la declaracion A en el que dicha muestra biologica es obtenida en menos de tres dfas de la presunta lesion.

K. El metodo de la declaracion A en el que dicha muestra biologica es lfquido cefalorraqrndeo (LCR), microdializado del SNC, saliva, suero, plasma u orina.

L. El metodo de la declaracion A en el que el paciente tiene una valoracion A o B en la escala de minusvalfa de la Asociacion Estadounidense de Lesiones de la Medula Espinal (ASIA).

M. El metodo de la declaracion A en el que el paciente tiene una puntuacion de 3 a 12 en la Escala de Coma de Glasgow (GCS).

N. El metodo de la declaracion M en el que el paciente tiene una puntuacion GCS de 3 a 8.

O. El metodo de la declaracion A en el que el paciente es un paciente pediatrico.

P. El metodo de la declaracion A en el que el nivel de dicha al menos una protema inflamasoma es medido por inmunotransferencia o ELISA.

Q. El metodo de la declaracion A que, ademas, comprende administrar al paciente un tratamiento neuroprotector cuando se identifica la firma de dicha protema.

R. El metodo de la declaracion Q en el que el tratamiento neuroprotector es hipotermia, metilprednisolona, 17a- estradiol, 17p-estradiol, ginsenosido, progesterona, simvastatina, deprenilo, minociclina y resveratrol.

S. El metodo de la declaracion Q que, ademas, comprende: medir el nivel de dicha al menos una protema inflamasoma en una muestra biologica obtenida del paciente tras el tratamiento neuroprotector; preparar una firma de la protema de tratamiento asociada con una respuesta positiva al tratamiento neuroprotector, comprendiendo la firma de la protema de tratamiento un nivel reducido de al menos una protema inflamasoma;

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e identificar a los pacientes que muestran, con la presencia de la firma de la protema de tratamiento, que responden positivamente al tratamiento neuroprotector.

T. Un equipo de reactivos para preparar un perfil de protema inflamasoma asociado con una lesion del SNC que comprende un ligando marcado que se une espedficamente a una o mas protemas inflamasoma, seleccionandose dichas una o mas protemas inflamasoma del grupo constituido por NLRP1, ASC, caspasa-1 y combinaciones de los mismos.

U. El equipo de reactivos de la declaracion T en el que el equipo de reactivos comprende ligandos marcados que se unen espedficamente a cada uno de una NLRpI, un aSc y una caspasa-1.

V. El equipo de reactivos de la declaracion T en el que el ligando marcado es un anticuerpo marcado o un fragmento del mismo, un aptamero o un peptido.

W. El equipo de reactivos de la declaracion T en el que el ligando esta marcado con nanopartmulas metalicas, una marca fluorescente o una marca enzimatica.

X. Un metodo de determinacion de un pronostico para un paciente con una lesion del SNC que comprende: proporcionar una muestra biologica obtenida del paciente en menos de una semana despues de la lesion; y medir el nivel de al menos una protema inflamasoma en la muestra biologica para preparar un perfil de protema inflamasoma, siendo el perfil de protema inflamasoma indicativo del pronostico del paciente.

Y. El metodo de la declaracion X en el que un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de que el paciente tenga una puntuacion de 1 a 3 en la Escala de Desenlace de Glasgow (GOS) tras una evaluacion de seguimiento.

Z. El metodo de la declaracion X en el que dicha al menos una protema inflamasoma es NLRP1, ASC, caspasa-1 o combinaciones de los mismos.

AA. El metodo de la declaracion Z en el que dicha al menos una protema inflamasoma es la subunidad p20 de la caspasa-1.

AB. El metodo de la declaracion X en el que la lesion del SNC es una lesion de la medula espinal o una lesion cerebral traumatica.

AC. El metodo de la declaracion X en el que un nivel reducido de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de que el paciente tenga una puntuacion GOS de 4 o 5 tras una evaluacion de seguimiento.

AD. El metodo de la declaracion X en el que dicha muestra biologica es LCR, microdializado del SNC, saliva, suero, plasma u orina.

AE. El metodo de la declaracion X en el que el nivel de dicha al menos una protema inflamasoma es medido por inmunotransferencia o ELISA.

AF. El metodo de la declaracion X en el que el paciente es un paciente pediatrico.

Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de evaluacion de un paciente del que se sospecha que tiene una lesion del sistema nervioso central (SNC) que comprende:

   medir el nivel de al menos una protema inflamasoma en una muestra biologica obtenida de un paciente que presenta smtomas clmicos coherentes con una lesion del SNC, siendo la muestra biologica lfquido cefalorraqrndeo (LCR), sangre, suero o plasma, y siendo la al menos una protema inflamasoma una protema con contenido de dominios de union a nucleotidos, de repeticion rica en leucina y de pirina 1 (NLRP1), protema puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC), caspasa-1 o la subunidad p20 de la caspasa-1;

   determinar la presencia o la ausencia de un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma con respecto (i) al nivel de la al menos una protema inflamasoma en una muestra de control o (ii) al valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia; y

   seleccionar al paciente si el paciente muestra, con la presencia de un nivel elevado de la al menos una protema inflamasoma, que tiene una lesion del SNC o una lesion mas grave del SNC,

   obteniendose la muestra biologica, opcionalmente, en menos de una semana, cinco dfas o tres dfas despues de la presunta lesion.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1 en el que el paciente tiene una valoracion A o B en la escala de minusvalfa de la Asociacion Estadounidense de Lesiones de la Medula Espinal (ASIA) o una puntuacion de 3 a 12 en la Escala de Coma de Glasgow (GCS).
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 en el que el paciente es seleccionado para el tratamiento neuroprotector cuando se identifica la firma de la protema.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3 en el que el tratamiento neuroprotector es hipotermia, metilprednisolona, 17a- estradiol, 17 -estradiol, ginsenosido, progesterona, simvastatina, deprenilo, minociclina o resveratrol.
5. 5. Una composicion que comprende un tratamiento neuroprotector para su uso en un metodo de tratamiento de la lesion del SNC o de la lesion mas grave del SNC en el paciente que muestra la presencia de un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma, en la que el metodo comprende seleccionar al paciente segun el metodo de la reivindicacion 1 y administrar al paciente la composicion que comprende el tratamiento neuroprotector.
6. 6. Una composicion para ser usada segun la reivindicacion 5 en la que el tratamiento neuroprotector es metilprednisolona, 17a-estradiol, 17 -estradiol, ginsenosido, progesterona, simvastatina, deprenilo, minociclina o resveratrol.
7. 7. Una composicion para ser usada segun la reivindicacion 5 en la que el metodo de tratamiento de la lesion del SNC o de la lesion mas grave del SNC comprende, ademas:

   medir el nivel de la al menos una protema inflamasoma en una muestra biologica obtenida del paciente tras el tratamiento neuroprotector, siendo la muestra biologica lfquido cefalorraqrndeo (LCR), sangre, suero o plasma; e

   identificar a los pacientes que muestran la presencia de un nivel reducido de la al menos una protema inflamasoma por responder positivamente al tratamiento neuroprotector.
8. 8. Un metodo de determinacion de un pronostico para un paciente con una lesion del SNC que comprende:

   medir el nivel de al menos una protema inflamasoma en una muestra biologica obtenida del paciente despues de menos de una semana de la lesion del SNC, siendo el nivel de la al menos una protema inflamasoma indicativo del pronostico del paciente, siendo la muestra biologica lfquido cefalorraqrndeo (LCR), sangre, suero o plasma, y siendo la al menos una protema inflamasoma protema con contenido de dominios de union a nucleotidos, de repeticion rica en leucina y de pirina 1 (NLRP1), protema puntiforme asociada a la apoptosis con contenido de un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC), caspasa-1 o la subunidad p20 de la caspasa-1.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8 en el que un nivel elevado de al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de que el paciente tenga una puntuacion de 1 a 3 en la Escala de Desenlace de Glasgow (GOS) tras una evaluacion de seguimiento.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 1 u 8 en el que la lesion del SNC es una lesion de la medula espinal o una lesion cerebral traumatica.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 8 en el que un nivel reducido de la al menos una protema inflamasoma con respecto a un valor predeterminado de referencia o a un intervalo de valores de referencia es predictivo de que el paciente tiene una puntuacion GOS de 4 o 5 tras una evaluacion de seguimiento.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 1 u 8 en el que el nivel de la al menos una protema inflamasoma es medida por

    5 inmunotransferencia o ELISA.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 1 u 8 en el que el paciente es un paciente pediatrico.
14. 14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8 a 13 en el que la muestra biologica es LCR.