ES2689753T3 - Fármaco de diagnóstico y método de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Fármaco de diagnóstico y método de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer Download PDF

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Abstract

El uso de un anticuerpo anti-S38AA en la determinación de la enfermedad de Alzheimer in vitro o ex vivo.

Description

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DESCRIPCION
Fármaco de diagnóstico y método de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer Campo técnico
La presente invención es definida por las reivindicaciones. Se refiere al uso de un anticuerpo anti-S38AA en la determinación de la enfermedad de Alzheimer, un método de determinación de la enfermedad de Alzheimer en un animal, que comprende la detección de un fragmento de S38AA en una muestra recogida de dicho animal, y un método de investigación para una sustancia capaz de tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, como se define por las reivindicaciones.
Técnica anterior
La enfermedad de Alzheimer es una demencia progresiva que comienza con la reducción de la memoria a corto plazo y la leve capacidad de aprendizaje, desarrolla mayor disfunción cerebral, particularmente agnosia visuoespacial, apraxia ideacional, apraxia constructiva y similares, y finalmente alcanza el trastorno del movimiento y la denominada destrucción de la personalidad, para lo cual hasta la fecha no se ha encontrado un método de tratamiento radical. Se ha previsto que serán 2,4 millones de pacientes con enfermedad de Alzheimer en el mundo en 2040, y está creciendo la importancia de un método de tratamiento radical para la misma o un diagnóstico temprano de la misma. Su progresión es diferente de la demencia angiopática con frecuencia encontrada en Japón y se considera que continua durante varios años hasta diez años o más. En el caso de una enfermedad de Alzheimer familiar causada por mutación génica anormal, que es una de las enfermedades de Alzheimer, la condición de muchos de los pacientes empeora rápidamente en varios años, y la enfermedad se caracteriza por una aparición temprana puesto que la edad de aparición está en sus 30 a 40 años. La edad, el historial familiar, el genotipo, la hipertensión, la diabetes, fumar y similares son conocidos como los factores de riesgo de la enfermedad de Alzheimer además de la mutación génica, de lo cual la relación con el genotipo APOE está clara. En particular, el alelo ApoE4 ya ha sido publicado como un factor de riesgo de la enfermedad de Alzheimer (documento de no patente 1).
Como cambios patológicos característicos en la enfermedad de Alzheimer, es ampliamente conocido que se da acumulación extracelular de la placa amiloide que contiene beta amiloide como componente constitutivo principal, y acumulación de la proteína tau altamente fosforilada en las células nerviosas. Con respecto a los cambios patológicos espaciales y temporales en el cerebro, puesto que la acumulación de tau fosforilada en las células piramidales en el hipocampo, particularmente la región denominada CA1, ya se observa en pacientes con enfermedad de Alzheimer con aparición temprana, las células piramidales en esta región se consideran que están espacial y temporalmente expuestas a la fuerte influencia de la enfermedad de Alzheimer en fases tempranas, principalmente muestran fragilidad (documento de no patente 2). Por otro lado, puesto que el trastorno de movimiento surge casi en la fase final de la enfermedad de Alzheimer como se mencionó anteriormente, se considera que la célula de Purkinje en el cerebelo es la más resistente a la enfermedad de Alzheimer.
La tasa de incidencia de la enfermedad de Alzheimer se considera que incrementa rápidamente después de los 75 años de edad, y la detección temprana y el inicio de un tratamiento temprano son importantes para suprimir la progresión patológica mediante una terapia con fármaco sintomático.
Debido a la ausencia en la actualidad de una cura radical para la enfermedad de Alzheimer, se investiga energéticamente un marcador diagnóstico para la detección temprana de la enfermedad de Alzheimer, y la medición de la beta amiloide (Ap40, Ap42) y la proteína tau fosforilada en sangre o fluido cerebroespinal se considera que es lo más prometedor. Sin embargo, aún es difícil encontrar claramente la adquisición de la enfermedad de Alzheimer en el futuro, es decir, pacientes potenciales con enfermedad de Alzheimer, incluso cuando estos marcadores se usan solos o en combinación (por ejemplo, relación de Ap40 y Ap42).
Lista de documento
Documentos de no patente
Documento de no patente 1: Science. (1993) 261:921-3 Documento de no patente 2: Exp. Gerontol. (2000) 35:851-64 Compendio de la invención Problema técnico
El problema de la presente invención es proporcionar un agente para determinar la enfermedad de Alzheimer, un método de determinación de la enfermedad de Alzheimer, y un método de investigación de una sustancia para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer.
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Medios para resolver el problema
Los presentes inventores han conducido estudios intensos y han encontrado que la cantidad de fragmento de S38Aa se incrementa en el fluido cerebroespinal y el plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer en comparación con persona normal, y este fragmento de S38AA es un polipéptido que contiene el dominio extramembranoso de la isoforma 1 de S38AA.
Además, los presentes inventores han medido la cantidad del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal de sin enfermedad de Alzheimer (persona normal), y pacientes con enfermedad de Alzheimer presunta (enfermedad de Alzheimer potencial) y enfermedad de Alzheimer grave, y han encontraron que la cantidad del fragmento de S38AA se incrementa con el empeoramiento de la patología (progresión) de la enfermedad de Alzheimer y, puesto que este incremento dependiente de patología en la cantidad del fragmento de S38AA en la enfermedad de Alzheimer muestra una correlación positiva con el portador de ApoE4 y una correlación negativa con el portador de ApoE2, el fragmento de S38AA tiene alta fiabilidad como índice para la determinación de la enfermedad de Alzheimer.
Basándose en estos descubrimientos, los presentes inventores se han convencido de que un anticuerpo anti-S38AA es útil como agente determinante de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Alzheimer se puede detectar midiendo el fragmento de S38AA, lo cual da como resultado la conclusión de la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a lo siguiente.
[1] Uso de un anticuerpo anti-S38AA en la determinación de la enfermedad de Alzheimer in vitro o ex vivo.
[2] Un método de determinación de la enfermedad de Alzheimer en un animal, que comprende la detección de un fragmento de S38AA en una muestra recogida de dicho animal.
[3] El método según [2], en donde el animal es un ser humano.
[4] El método según [2] o [3], en donde el fragmento de S38AA es un fragmento derivado de la isoforma 1 de S38AA.
[5] El método según la reivindicación [2] o [3], en donde el fragmento de S38AA es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 3.
[6] El método según una cualquiera de las reivindicaciones [2] a [5], en donde la muestra es sangre, fluido cerebroespinal u orina.
[7] El método según una cualquiera de las reivindicaciones [2] a [5], en donde la muestra es fluido cerebroespinal.
[8] El método según una cualquiera de las reivindicaciones [2] a [5], en donde la muestra es sangre.
[9] El método según una cualquiera de las reivindicaciones [2] a [5], en donde la muestra es plasma.
[10] El método según una cualquiera de las reivindicaciones [2] a [9], que comprende además la detección de uno o más marcadores de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer.
[11] Un método de investigación de una sustancia candidata para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, que comprende las siguientes etapas:
(1) poner en contacto una sustancia de ensayo con una célula permitiendo la medición de la producción de un fragmento de S38AA;
(2) medir la cantidad de producción del fragmento de S38AA en la célula puesta en contacto con la sustancia de ensayo, y comparar la cantidad de producción con la del fragmento de S38AA en una célula control libre de contacto con la sustancia de ensayo; y
(3) seleccionar una sustancia de ensayo que regula a la baja la cantidad de producción del fragmento de S38AA como sustancia candidata para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, basándose en los resultados de comparación del anteriormente mencionado punto (2).
[12] El método según [4], en donde la isoforma 1 de S38AA es un polipéptido de los siguientes (a) o (b):
(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2, o
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2.
[13] El método según [5], en donde el fragmento de S38AA es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del 505° al 1.014° mostrada por la SEQ ID NO: 2.
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Efecto
En la presente memoria también se describe un agente para determinar la enfermedad de Alzheimer y un método de determinación de la enfermedad de Alzheimer.
Además, según el método de investigación descrito en la presente memoria, se puede proporcionar un agente capaz de tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una imagen de inmunotinción de una región CA1 del hipocampo representativa de un ejemplo normal. Las partes intensamente teñidas (flechas) en la célula nerviosa de la Figura 1 muestran la expresión fuerte de S38AA. El panel inferior derecho es una vista ampliada de la parte rodeada por una línea discontinua. La barra de escala muestra 20 pm.
La Figura 2 muestra una imagen de inmunotinción de una región CA1 del hipocampo representativa de un ejemplo de enfermedad de Alzheimer definitiva. El panel inferior derecho es una vista ampliada de la parte rodeada por una línea discontinua. La barra de escala muestra 20 pm.
La Figura 3 muestra una región extramembrana prevista de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de S38AA en el recuadro. El fragmento de S38AA inmunoprecipitado se analizó por proteómica aleatoria (“shotgun”), y la secuencia del fragmento peptídico identificado y su posición están subrayadas.
La Figura 4 muestra un ejemplo del análisis de transferencia Western de S38AA en el fluido cerebroespinal y los resultados del análisis del peso molecular del fragmento de S38AA detectado.
La Figura 5 muestra los resultados de cuantificación de los fragmentos S38AA en el fluido cerebroespinal de pacientes sin enfermedad de Alzheimer, pacientes con enfermedad de Alzheimer presunta y pacientes con enfermedad de Alzheimer definitiva, mediante el método de transferencia Western. El eje Y muestra la intensidad de señal de cada grupo, lo cual está estandarizado por el fluido cerebroespinal estándar.
La Figura 6 muestra la cantidad de un fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal de grupos representativos de todos los pacientes divididos según el genotipo APOE (dividido en 4 tipos de genotipos de ApoE2/3, ApoE3/3, ApoE3/4, ApoE4/4).
La Figura 7 muestra la relación entre la cantidad de fragmento de S38AA y genotipo APOE de 11 pacientes sin enfermedad de Alzheimer. El eje Y muestra la intensidad de señal de cada grupo, lo cual está estandarizado por el fluido cerebroespinal estándar.
La Figura 8 muestra los resultados del análisis del peso molecular del fragmento de S38AA específicamente separado por un método de inmunoprecipitación que usa un anticuerpo anti-S38AA (HPA021374, HPA023161).
La Figura 9 muestra un ejemplo del análisis de transferencia Western del fragmento de S38AA en plasma humano y los resultados del análisis del peso molecular del fragmento de S38AA determinado.
Descripción de las realizaciones
Por consiguiente, lo descrito en la presente memoria es lo siguiente.
1. Agente para determinar la enfermedad de Alzheimer
Los presentes inventores han encontrado que (1) la cantidad de fragmento de S38AA se incrementa en el fluido cerebroespinal y el plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer en comparación con persona normal, (2) se encuentra que la cantidad del fragmento de S38AA se incrementa incluso en pacientes con enfermedad de Alzheimer presunta más que en persona normal, y la cantidad del fragmento de S38AA se incrementa con el empeoramiento de patología (progresión) de la enfermedad de Alzheimer, y (3) puesto que este incremento dependiente de patología en la cantidad del fragmento de S38AA en la enfermedad de Alzheimer muestra una correlación positiva con el portador de ApoE4 y una correlación negativa con el portador de ApoE2, el fragmento de S38AA tiene alta fiabilidad como índice para la determinación de la enfermedad de Alzheimer.
Por consiguiente, en la presente memoria se describe un agente para determinar la enfermedad de Alzheimer, que comprende un anticuerpo anti-S38AA.
El agente determinante descrito en la presente memoria no solamente puede determinar si una persona está afectada con la enfermedad de Alzheimer sino también si una persona es sospechosa de estar afectada con la enfermedad de Alzheimer, es decir, si la persona tiene una alta posibilidad de estar afectada con la enfermedad en el futuro cercano, aunque la persona aún no esté padeciendo de la enfermedad.
Por lo tanto, la “determinación” de la enfermedad de Alzheimer en la presente invención se usa no solamente para
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querer decir la determinación de si una persona está ya afectada con la enfermedad de Alzheimer, sino que abarca el dictamen de si una persona tiene una alta posibilidad de estar afectada en el futuro cercano, aunque la persona aún no esté padeciendo de la enfermedad.
En la presente memoria, “enfermedad de Alzheimer presunta” se refiere a una condición asociada con una alta posibilidad de estar afectado (definitivamente diagnosticado) en el futuro, aunque no se ha hecho un diagnóstico definitivo de la enfermedad de Alzheimer. Ejemplos específicos de la misma incluye la condición a clasificar en nivel leve o moderado mediante la clasificación de gravedad en el diagnóstico según la realización de imagen amiloide, MRI, CT, SPET o síntoma clínico, el estado de deficiencia cognitiva leve y similares.
Como S38AA, se conocen, por ejemplo, secuencias de aminoácidos tales como la isoforma 1 de S38AA humana (número de UniProtKB/Swiss-Prot: q9hBR0-1, SEQ ID NO: 2), isoforma 1 de S38AA de rata (número de secuencia de referencia de NCBI: XP_002727892.1), isoforma 1 de S38AA de ratón (número de secuencia de referencia de NCBI: NP_077211.4), isoforma 2 de S38AA humana (número de UniProtKB/Swiss-Prot: Q9HBR0-2) y similares.
Además, como secuencia de un ácido nucleico que codifica S38AA (más adelante referido como “gen S38AA”), se conoce, por ejemplo, la secuencia de ADNc de la isoforma 1 de S38AA humana (número de secuencia de referencia de NCBI: NM_001037984.1, SEQ ID NO: 1).
Se predice que S38AA es una proteína diez-transmembrana según la base de datos de UniProtKB/Swiss-Prot, y se asume que la secuencia de aminoácidos desde el 399° inclusive (al 1.119° en la isoforma 1, y al 780° en la isoforma 2) es la región extramembrana.
“S38AA” en la presente memoria abarca no solamente la “proteína” o el “(poli)péptido” mostrado por estas secuencias conocidas, sino también, por ejemplo, sus equivalentes (homólogos y variantes de corte y empalme), variantes, derivados, formas maduras, formas modificadas por aminoácido y similares siempre que tengan funciones biológicas equivalentes a aquellas de una secuencia de aminoácidos particular que muestra la isoforma 1 de S38AA humana (SEQ ID NO: 2). En la presente memoria, ejemplos del homólogo incluyen proteínas de otras especies biológicas tales como ratón, rata y similares, que corresponden a proteína humana. Se pueden identificar deductivamente a partir de la secuencia de bases de un gen identificado por HomoloGene (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). Ejemplos de la variante de corte y empalme incluyen la isoforma 2 de S38AA humana (la secuencia de aminoácidos del 689° al 780° es diferente de la isoforma 1, y la secuencia de aminoácidos del 781° al 1.119° está eliminada). Además, la variante abarca variantes alélicas de origen natural (polimorfismo), variantes no presentes en la naturaleza, y variantes que tienen secuencias de aminoácidos alteradas artificialmente mediante deleción, sustitución, adición o inserción. Ejemplos de la variante anteriormente mencionada incluyen aquellos que tienen al menos 70 %, preferiblemente 80 %, más preferiblemente 95 %, además más preferiblemente 97 %, de identidad con una proteína o (poli)péptido libre de mutación. Ejemplos de la variante alélica de origen natural (polimorfismo) incluyen, una variante de la SEQ ID NO: 2 en donde la 559° Lys está sustituida por Arg (ddbSNP: rs35546507) y una variante en donde la 831° Ala está sustituida por Gly (dbSNP: rs2725405). Además, la forma modificada por aminoácido abarca las formas modificadas por aminoácido de origen natural y las formas modificadas por aminoácido no presentes en la naturaleza, y específicamente, se pueden incluir las formas fosforiladas por aminoácido (por ejemplo, la forma fosforilada de la SEQ ID NO: 2 en donde la 889° Ser está fosforilada).
Fácilmente se puede asumir que el dominio extramembranoso y la región transmembrana y similares de una proteína usan, por ejemplo, los datos de predicción descritos en las bases de datos de UniProtKB/Swiss-Prot, y una herramienta de predicción conocida y programa informático tal como TMHMM (
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) y similares.
El “fragmento de S38AA” en la presente memoria solamente necesita ser un (poli)péptido que contenga el dominio extramembranoso de S38AA. El “dominio extramembranoso de S38AA” en la presente memoria significa una región peptídica que contiene la región extramembrana completa o parcial en el lado C-terminal de cualquiera de los anteriormente mencionados S38AA, o la región extramembrana completa o parcial en el lado C-terminal de S38AA en el orgánulo celular tal como Golgi y similares. Además, el “fragmento de S38AA” en la presente memoria se caracteriza por que es reconocido por el anticuerpo anti-S38AA HPA024631 (Atlas Antibodies; producido usando un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del 402° al 491° de la SEQ ID NO:2 como inmunogen).
Preferiblemente, el fragmento de S38AA contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia de aminoácidos parcial del 761° al 770° de la isoforma 1 de S38AA humana (en la isoforma 2, la secuencia de aminoácidos desde el 689° inclusive es diferente debido al corte y empalme alternativo). Por lo tanto, aunque el fragmento de S38AA preferiblemente es un fragmento derivado de la isoforma 1 de S38AA, puesto que se predice que el sitio de escisión de S38AA, a partir del peso molecular aparente del fragmento de S38AA por SDS-PAGE, está en la secuencia de aminoácidos (hasta el aminoácido 688° de la SEQ ID NO: 2) común a las dos isoformas, si la reacción de escisión se da tras el reconocimiento de solamente la secuencia de aminoácidos en el sitio de escisión, un fragmento derivado de la isoforma 2 también puede estar incluido en el fragmento de S38AA descrito en la presente memoria.
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Aunque el peso molecular del fragmento de S38AA no está limitado, es preferiblemente de aproximadamente 76 a aproximadamente 102 kDa en el peso molecular aparente por SDS-PAGE. Por lo tanto, un fragmento escindido después del 161° aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2 es más preferible (peso molecular (calculado) del fragmento que consiste en la secuencia de aminoácidos del 161° al 1.119° es de aproximadamente 102 kDa). Además, a partir de los resultados del ensayo de precipitación (“pull-down”) y análisis por MS por corte aleatorio (“shotgun”) mencionados más adelante, el fragmento de S38AA descrito en la presente memoria es más preferiblemente un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos del 505° al 1.014° de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2.
El “anticuerpo anti-S38AA” a usar en la presente invención es un anticuerpo que reconoce el dominio extramembranoso de S38AA, con preferencia dada a un anticuerpo que reconoce el dominio extramembranoso de la isoforma 1 de S38AA. Dicho dominio extramembranoso puede estar en la región de aminoácidos específica a la isoforma 1 (en la SEQ ID NO: 2, la región de aminoácidos del 689° al 1.119°), en la región de aminoácidos común con la isoforma 2 (la región de aminoácidos del 399° al 688°) o atraviesa ambas regiones. Además, el dominio extramembranoso puede ser una secuencia de aminoácidos parcial continua en la región extramembrana de S38AA
0 una conformación formada por dos o más secuencias de aminoácidos parciales separadas y posteriores.
El anticuerpo anti-S38AA también puede ser, por ejemplo, el anticuerpo policlonal o monoclonal producido usando un método conocido, tal como anticuerpos anti-S38AA comercialmente disponibles (por ejemplo, HPA024631, HPA023161, HPA021374 (cada uno fabricado por Atlas Antibodies)) y similares, o sus fragmentos (por ejemplo, Fab, F(ab')2, ScFv, minicuerpo, etc.).
Como anticuerpo anti-S38AA a usar en la presente invención, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal derivado de mamíferos son preferibles.
Ejemplos del anticuerpo monoclonal y el anticuerpo policlonal derivados de mamíferos incluyen aquellos producidos en la sangre de animal, aquellos producidos por hibridomas, y aquellos producidos por un hospedador transformado con un vector de expresión que contiene un gen anticuerpo mediante un medio de ingeniería genética, aquellos producidos en grandes cantidades en una fábrica de célula CHO mediante el gen de un anticuerpo óptimo investigado a partir de una biblioteca de clon enorme que consiste en 1.000.000.000.000 moléculas por presentación en fago (“phage display”), o anticuerpo humano directamente producido usando ratón transgénico que produce anticuerpo humano, y similares.
El anticuerpo monoclonal y el anticuerpo policlonal se pueden producir por un método conocido por los expertos en la técnica.
(1) Producción del anticuerpo monoclonal
S38AA se administra solo o junto con un portador y un diluyente a un sitio donde se puede producir un anticuerpo mediante la administración a un animal. Para incrementar la producibilidad del anticuerpo mediante la administración, también se puede administrar un adyuvante completo de Freund o un adyuvante incompleto de Freund. La administración generalmente se realiza uva vez cada 2 a 6 semanas, y aproximadamente 2 a 10 veces en total. Ejemplos del mamífero a usar incluyen mono, conejo, perro, cobaya, ratón, rata, oveja y cabra, con preferencia dada a ratón y rata.
Para la producción de células productoras de anticuerpo monoclonal, se seleccionan a partir de mamíferos, por ejemplo, ratón inmunizado con un antígeno, individuos encontrados que muestran un título de anticuerpo, el bazo o el nódulo linfático se recoge 2 a 5 días después de la inmunización final, las células productoras de anticuerpo contenidas en el mismo se fusionan con células de mieloma, de ese modo se puede preparar un hibridoma productor de anticuerpo. El título de anticuerpo en el antisuero se puede medir, por ejemplo, haciendo reaccionar la S38AA marcada mencionada más adelante con antisuero, y midiendo la actividad de un marcador unido al anticuerpo. Una operación de fusión se puede realizar mediante un método conocido, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Como estimulante de la fusión se pueden mencionar, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), virus Sendai y similares, y se usa preferiblemente PEG.
Como célula de mieloma, por ejemplo, se pueden mencionar NS-1, P3U1, SP2/0 y similares, y preferiblemente se usa P3U1. Una relación preferible de los números de las células productoras de anticuerpo (células del bazo) y células de mieloma a usar es de aproximadamente 1:1 a 20:1, PEG (preferiblemente PEG 1000-PEG 6000) se añade a una concentración de aproximadamente 10 a 80 %, y la fusión celular se puede realizar eficazmente incubando a aproximadamente 20 a 40 °C, preferiblemente aproximadamente 30 a 37 °C, durante aproximadamente
1 a 10 min.
Para investigar un hibridoma productor de anticuerpo monoclonal, se pueden usar diversos métodos. Sus ejemplos incluyen un método que comprende añadir un sobrenadante de cultivo de hibridoma a una fase sólida (por ejemplo, microplaca) adsorbida con un antígeno tal como una proteína y similares directamente o junto con un portador, añadir un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado con una sustancia radioactiva, una enzima o similares (cuando la célula usada para la fusión celular es de un ratón, se usa un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón) o proteína A, y detectar un anticuerpo monoclonal unido a la fase sólida, un método que comprende añadir un sobrenadante de
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cultivo de hibridoma a una fase sólida adsorbida con un anticuerpo anti-inmunoglobulina o proteína A, añadir una proteína marcada con una sustancia radioactiva, una enzima, etc., y similares, y detectar un anticuerpo monoclonal unido a la fase sólida, y similares.
Se puede seleccionar el anticuerpo monoclonal mediante un método conocido por sí mismo o un método análogo al mismo, y generalmente se puede seleccionar usando un medio para células animales que se añaden con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), y similares. Como medio para la selección y el crecimiento, se puede usar cualquier medio siempre que los hibridomas puedan crecer. Por ejemplo, se pueden usar el medio RPMI 1640 que contiene 1 a 20 %, preferiblemente 10 a 20 %, de suero fetal bovino, medio GIT que contiene 1 a 10 % de suero fetal bovino (Wako Pure Chemical Industries, Ltd ), un medio libre de suero para el cultivo de hibridoma (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y similares. La temperatura de cultivo generalmente es de 20 a 40 °C, preferiblemente aproximadamente 37 °C. El tiempo de cultivo generalmente es de 5 días a 3 semanas, preferiblemente 1 semana a 2 semanas. El cultivo en general se puede realizar generalmente en gas de dióxido de carbono al 5 %. El título del anticuerpo del sobrenadante de cultivo de hibridoma se puede medir de la misma manera que en la medición anteriormente mencionada del título del anticuerpo del antisuero.
El anticuerpo monoclonal se puede separar y purificar según un método de separación y purificación de inmunoglobulina, de la misma manera que en la separación general y purificación del anticuerpo policlonal [por ejemplo, método de precipitación salina (“salting out”), método de precipitación por alcohol, método de precipitación por punto isoeléctrico, electroforesis, método de adsorción y desorción por intercambio iónico (por ejemplo, DEAE), método de ultracentrifugación, método de filtración en gel, método de purificación específica incluyendo la recogida solamente de un anticuerpo mediante un adsorbente activo tal como la fase sólida unida a antígeno, proteína A, proteína G o similares, y disociación del enlace para dar el anticuerpo].
(2) Producción del anticuerpo policlonal
El anticuerpo policlonal a S38AA se puede producir mediante un método conocido por sí mismo o un método análogo al mismo. Por ejemplo, un anticuerpo policlonal se puede producir produciendo un complejo de un antígeno de inmunización (antígeno tal como proteína y similares) y una proteína portadora, inmunizando un mamífero de la misma manera que en el método de producción anteriormente mencionado del anticuerpo monoclonal o pollo, recogiendo una sustancia que contiene un anticuerpo a S38AA del animal inmunizado, y separando y purificando el anticuerpo.
Con respecto al complejo de un antígeno de inmunización y una proteína portadora a usar para la inmunización de un mamífero o pollo, el tipo de la proteína portadora y la relación de mezcla del portador y hapteno puede ser cualquiera y cualquier relación siempre que el anticuerpo se pueda producir eficazmente frente a hapteno usado para la inmunización por entrecruzamiento con el portador. Por ejemplo, se usa un método que incluye el acoplamiento de albúmina de suero bovino, tiroglobulina bovina, hemocianina de “lapa californiana” y similares a una relación en peso de aproximadamente 0,1 a 20, preferiblemente aproximadamente 1 a 5, a hapteno de 1.
Aunque se pueden usar diversos agentes de condensación para el acoplamiento de hapteno con un portador, se pueden usar un reactivo de éster activado que contiene glutaraldehído, carbodiimida, éster activado con maleimida, un grupo tiol y un grupo ditiopiridilo, y similares.
El producto de condensación se administra a un mamífero o pollo solo o junto con un portador y un diluyente a un sitio en donde se puede producir un anticuerpo. Para incrementar la productibilidad del anticuerpo mediante la administración, también se puede administrar un adyuvante completo de Freund o un adyuvante incompleto de Freund. La administración generalmente se realiza una vez cada 2 a 6 semanas, y aproximadamente 3 a 10 veces en total.
El anticuerpo policlonal se puede recoger de la sangre, ascitis, leche materna y similares del mamífero inmunizado por el método anteriormente mencionado, preferiblemente de la sangre, y en el caso del pollo, se puede recoger de la sangre y de la yema de huevo.
El título del anticuerpo policlonal en el antisuero se puede medir de la misma manera que en la medición anteriormente mencionada del título del anticuerpo del antisuero. El anticuerpo policlonal se puede separar y purificar según un método de separación y purificación de inmunoglobulina, de la misma manera que en la separación y purificación anteriormente mencionada del anticuerpo monoclonal.
2. Kit para determinar la enfermedad de Alzheimer
En el presente documento también se describe un kit para determinar la enfermedad de Alzheimer. El kit descrito en la presente memoria contiene un reactivo para medir la cantidad del fragmento de S38AA. Al medir la cantidad del fragmento de S38AA usando el kit descrito en el presente documento, se puede determinar la enfermedad de Alzheimer.
El kit descrito en la presente memoria específicamente contiene un anticuerpo anti-S38AA que reconoce S38AA. Ejemplos del anticuerpo anti-S38AA incluyen el anticuerpo anti-S38AA descrito en detalle en el anteriormente
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mencionado punto “1. Agente para determinar la enfermedad de Alzheimer”. El anticuerpo puede ser un anticuerpo marcado con fluorescencia, anticuerpo marcado con enzima, anticuerpo marcado con estreptavidina, anticuerpo marcado con biotina o anticuerpo marcado con radioactividad.
El anticuerpo anti-S38AA generalmente está contenido en el kit descrito en la presente memoria en forma de una solución acuosa del mismo disuelto en agua o un tampón adecuado (por ejemplo, tampón TE, PBS etc.) a una concentración adecuada o un producto liofilizado.
El kit descrito en la presente memoria además puede contener, en su constitución, otros componentes necesarios para la realización del método, según el método de medición del fragmento de S38AA. Por ejemplo, para la medición por transferencia Western, el kit descrito en la presente memoria además puede contener un tampón de transferencia, un reactivo de marcación, una membrana de transferencia y similares, un reactivo de determinación, una solución estándar y similares. Ejemplos de la “solución estándar” en la presente memoria incluyen una solución acuosa obtenida disolviendo un producto estándar purificado del “fragmento de S38AA” anteriormente mencionado en agua o un tampón adecuado (por ejemplo, tampón TE, PBS y similares) a una concentración particular.
Para la medición por ELISA tipo sándwich, el kit descrito en la presente memoria además puede contener, además de lo anterior, una placa de medición de anticuerpo inmovilizado, una solución de lavado y similares. Para la medición mediante un método de aglutinación que incluye el método de aglutinación por látex, se puede contener un látex revestido con anticuerpo, gelatina o similares. Para la medición mediante un método de fluorescencia química o un método de electrón de fluorescencia química, se pueden contener partículas magnéticas conjugadas a anticuerpo y un tampón adecuado. Para la detección de S38AA usando Lc/MS, LC-MS/MS o un método de inmunocromatografía, se pueden contener una columna o microcolumna revestida con anticuerpo, y un macro chip como parte del instrumento de detección. Además, en un método de medición de fluorescencia resuelta en el tiempo o un método de medición de fluorescencia similar al mismo, se puede contener en la constitución una pluralidad de anticuerpos anti-S38AA marcados y otros componentes necesarios.
3. Método para determinar la enfermedad de Alzheimer
Los presentes inventores han encontrado que (1) la cantidad de fragmento de S38AA se incrementa en el fluido cerebroespinal y el plasma de los pacientes con enfermedad de Alzheimer en comparación con la persona normal, (2) se encuentra que la cantidad del fragmento de S38AA se incrementa incluso en pacientes con enfermedad de Alzheimer leve más que en persona normal, y la cantidad del fragmento de S38AA se incrementa con el empeoramiento de la patología (progresión) de la enfermedad de Alzheimer, y (3) puesto que este incremento dependiente de patología en la cantidad del fragmento de S38AA en la enfermedad de Alzheimer muestra una correlación positiva con el portador ApoE4 y una correlación negativa con el portador ApoE2, el fragmento de S38AA tiene alta fiabilidad como índice para la determinación de la enfermedad de Alzheimer.
Por tanto, la presente invención proporciona un método para determinar la enfermedad de Alzheimer que comprende detectar un fragmento de S38AA en una muestra recogida de un animal.
El método de determinación de la presente invención puede determinar no solamente si una persona está afectada con la enfermedad de Alzheimer sino también si la persona tiene una alta posibilidad de estar afectada con la enfermedad en el futuro cercano, aunque la persona aún no esté padeciendo de la enfermedad.
El método de detección de la presente invención contiene una etapa de detección de un fragmento de S38AA en una muestra de ensayo recogida de un animal, y una etapa de determinación de la enfermedad de Alzheimer basada en la correlación positiva entre la cantidad del fragmento de S38AA y la enfermedad de Alzheimer.
Aunque el animal que puede ser un sujeto de ensayo para el método de determinación de la presente invención no está particularmente limitado siempre que produzca S38AA, se pueden mencionar, por ejemplo, mamíferos (por ejemplo, ser humano, mono, bovino, cerdo, caballo, perro, gato, oveja, cabra, conejo, hámster, cobaya, ratón, rata, etc.), aves (por ejemplo, pollo, etc.) y similares. Preferido es un mamífero, y más preferido es un ser humano.
Aunque una muestra biológica derivada de un animal de ensayo para ser la muestra no está particularmente limitada, por ejemplo, se pueden mencionar sangre, suero, plasma, saliva, orina, fluido cerebroespinal y similares. Más preferido es el plasma o el fluido cerebroespinal.
El suero y el plasma se puede preparar recogiendo sangre de un animal de ensayo según un método convencional, y separando el componente líquido. El fluido cerebroespinal se puede recoger mediante un medio conocido tal como punción lumbar y similares.
Se puede detectar un fragmento de S38AA en una muestra mediante un método conocido. Se puede detectar sometiendo a, por ejemplo, transferencia Western, electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE, electroforesis en gel bidimensional y similares), diversos métodos de separación y purificación (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía por filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, cromatografía por punto isoeléctrico, electroforesis capilar y similares), método de ionización (por ejemplo, método de ionización por impacto de electrones, método de desorción de campo, método de
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ionización secundario, bombardeo atómico rápido, desorción/ionización por láser asistida en matriz (MALDI, del inglés “Matrix Assited Laser Desorption/ionization”), método de ionización por electropulverización y similares), espectrómetro de masas (por ejemplo, espectrómetro de masas de doble enfoque, espectrómetro de masas cuadrupolo, espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (“time-of-fight”), espectrómetro de masas de transformación Fourier, espectrómetro de masas ciclotrón iónico y similares) y similares.
Además, el fragmento de S38AA se puede detectar según un método inmunoquímico conocido (nefelometría, método competitivo, método inmunométrico, método de fluorescencia química, método de electrón de fluorescencia química, método tipo sándwich, etc.). En cuanto a estos métodos inmunoquímicos, la referencia se puede hacer a, por ejemplo, “Radioimmunoassay” editado por Hiroshi Irie (Kodansha, publicado en 1974), “radioimmunoassay (sequel)” editado por Hiroshi Irie (Kodansha, publicado en 1979), “Enzyme Immunoassay” editado por Eiji Ishikawa et al. (la 3a edición, Igaku-Shoin, publicado en 1987), “Methods in Enzymology” Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (publicado por Academic Press) y similares.
Ejemplos del anticuerpo anti-S38AA capaces de detectar específicamente S38AA incluyen el anticuerpo anti-S38AA descrito en detalle en el punto “1. Agente para determinar la enfermedad de Alzheimer”.
Entonces, basándose en la concentración del fragmento de S38AA detectado, se puede detectar la enfermedad de Alzheimer. Como se muestra en el Ejemplo 2 mencionado más adelante, la concentración del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal de los pacientes con enfermedad de Alzheimer y pacientes con enfermedad de Alzheimer presunta es mayor que la de la persona normal, y la concentración del fragmento de S38AA en el plasma es también mayor en pacientes con enfermedad de Alzheimer que en persona normal. Por lo tanto, basándose en la correlación positiva entre la concentración del fragmento de S38AA y la enfermedad de Alzheimer, se puede hacer un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer cuando la concentración del fragmento de S38AA en la muestra es alta.
Además, incluso para personas normales, un grupo portador de ApoE4, el cual es un alelo sensible a enfermedad de Alzheimer (grupo de alto riesgo de enfermedad de Alzheimer), muestra una alta concentración del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal en comparación con un grupo de genotipo homo ApoE3. A la inversa, un grupo portador de ApoE2, el cual es un alelo resistente a la enfermedad de Alzheimer, muestra una concentración baja del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal en comparación con el grupo del genotipo homo ApoE3. Por lo tanto, una alta concentración del fragmento de S38AA en la muestra se puede juzgar que muestra una alta posibilidad de estar afectado por la enfermedad de Alzheimer en el futuro.
El método de determinación de la presente invención puede determinar la enfermedad de Alzheimer con mayor precisión midiendo, además del fragmento de S38AA, la alteración de otros marcadores diagnósticos para la enfermedad de Alzheimer. Ejemplos de otros marcadores diagnósticos para la enfermedad de Alzheimer incluyen marcadores conocidos tales como beta amiloide (Ap40, Ap42), proteína tau fosforilada y similares. Estos se pueden detectar según un método de detección bien conocido convencional.
4. Método para investigar la sustancia capaz de tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer
La presente invención también proporciona un método para investigar una sustancia que trata o previene la enfermedad de Alzheimer como se define por las reivindicaciones, el cual comprende evaluar si una sustancia de ensayo suprime la producción de un fragmento de S38AA, y una sustancia obtenible por dicho método. En el método de investigación de la presente invención, una sustancia que regula a la baja la producción de un fragmento de S38AA se selecciona como una sustancia que trata o previene la enfermedad de Alzheimer.
La sustancia de ensayo para someter al método de investigación de la presente invención puede ser cualquier compuesto conocido o nuevo. Ejemplos de esta incluyen ácido nucleico, carbohidrato, lípido, proteína, péptido, compuesto de bajo peso molecular orgánico, biblioteca de compuesto producida usando una técnica química combinatoria, biblioteca de péptidos aleatoria, compuesto natural derivado de microorganismo, animales y plantas, organismo marino, etc., y similares.
El método de investigación de la presente invención comprende las siguientes etapas:
(1) poner en contacto una sustancia de ensayo con una célula permitiendo la medición de la producción de un fragmento de S38AA;
(2) medir la cantidad de producción del fragmento de S38AA en la célula puesta en contacto con la sustancia de ensayo, y comparar la cantidad de producción con la del fragmento de S38AA en una célula control libre de contacto con la sustancia de ensayo; y
(3) seleccionar una sustancia de ensayo que regula a la baja la cantidad de producción del fragmento de S38AA como una sustancia capaz de tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, basándose en los resultados de comparación del anteriormente mencionado punto (2).
La “célula” a usar para el método de investigación de la presente invención significa una célula que permite la evaluación del nivel de producción del objeto de medición, un fragmento de S38AA. Ejemplos de la célula incluyen
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una célula capaz de producir naturalmente el fragmento de S38AA del objeto de medición, una célula que expresa S38AA capaz de producir un fragmento de S38AA mediante la estimulación, y una célula modificada por ingeniería genética para ser capaz de producir un fragmento de S38AA.
El objetivo de medición, es decir, la célula capaz de producir naturalmente un fragmento de S38AA, no está particularmente limitado y, como tal célula, se pueden usar una célula cultivada primaria de un mamífero (por ejemplo, ser humano, ratón, etc.), una línea celular inducida a partir de dicha célula cultivada primaria y similares.
Se sabe que S38AA se expresa en célula U251 y célula SHSY-5Y, y también se expresa en célula BE(2)-C y célula SK-N-MC. Además, una célula modificada por ingeniería genética que sobreexpresa S38AA o S38AA marcado con etiqueta FLAG, etc., y similares también se pueden producir usando una técnica conocida. Mediante el cultivo, S38AA se escinde de la célula que expresa S38AA y se libera el fragmento de S38AA producido. Cuando la cantidad del fragmento de S38AA producido es pequeña, la producción del fragmento de S38AA se puede medir cultivando, como sea apropiado, bajo condiciones que causan fácilmente la escisión de S38AA.
Ejemplos de las condiciones que causan fácilmente la escisión de S38AA incluyen cultivar en un medio de eliminación de glucosa o un medio que contiene una sustancia conocida para estimular fisiológicamente el cerebro. Ejemplos específicos de tal sustancia incluyen citoquinas tales como TNFa, interferón-Y, interleuquina-1, interleuquina-6 y similares, beta amiloide o su agregado y similares.
La sustancia de ensayo y la célula que permite la medición de la producción de un fragmento de S38AA se ponen en contacto en un medio de cultivo. El medio de cultivo se selecciona apropiadamente según la célula que permite la medición de la producción de un fragmento de S38AA. Sus ejemplos incluyen medio esencial mínimo (MEM), medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, del inglés “Dulbecco's modified Eagle médium”), que contienen aproximadamente 5 a 20 % de suero fetal bovino, y similares. Las condiciones de cultivo se determinan apropiadamente de la misma manera. Por ejemplo, el pH del medio es de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, la temperatura de cultivo generalmente es de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 °C, y el tiempo de cultivo es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 72 horas.
La cantidad de producción del fragmento de S38AA se puede medir midiendo la cantidad del fragmento de S38AA liberado en el sobrenadante del cultivo celular según el método descrito en el punto de (3. Método para determinar la enfermedad de Alzheimer).
La cantidad de producción se puede comparar preferiblemente basándose en la presencia o ausencia de una diferencia significativa. La cantidad de producción de un fragmento de S38AA en la célula control libre de contacto con la sustancia de ensayo se puede medir antes o simultáneamente con la medición de la cantidad de producción del fragmento de S38AA en la célula en contacto con la sustancia de ensayo.
Por lo tanto, una sustancia obtenida por comparación que regula a la baja la cantidad de producción del fragmento de S38AA, se selecciona como un agente capaz de tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer.
El compuesto obtenido por el método de investigación de la presente invención es útil como sustancia candidata para el desarrollo de un nuevo agente terapéutico o preventivo para la enfermedad de Alzheimer.
Ejemplos
La presente invención se explica en lo siguiente en referencia a los Ejemplos, los cuales de ninguna manera limitan la presente invención.
Ejemplo de referencia 1. Estudio de la cantidad de expresión de S38AA en tejido cerebral
Se usó una sección de cerebro conservado en el banco de cerebro sueco (Brain Power), cuyo uso fue permitido por el Comité Ético del “Karolinska Institute”. Se partió en rodajas una sección del hipocampo (5 micras de grosor) a partir de un bloque de tejido cerebral fijado con formalina e incrustado en parafina, y se adhirió a un portaobjetos de vidrio. Después de una desparafinización y tratamiento hidrófilo con xileno-alcohol, se recuperó el antígeno calentando a 121 °C durante 25 min en Diva Decloaker (Biocare Medical). Después del enfriamiento, se bloqueó una reacción no específica con suero completo de cabra al 3 % diluido con solución salina tamponada Tris (pH 7,6), y después de eso un anticuerpo anti-S38AA (número de catálogo: HPA024631, Atlas Antibodies) diluido 200 veces con solución salina tamponada con Tris se incubó durante la noche con el espécimen a 4 °C. Después de lavar con solución salina tamponada Tris, el espécimen se incubó con un anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra biotinilado diluido 300 veces, a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de eso, para el desarrollo de color, el espécimen se trató con el kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) durante 30 min y además con HCl de 3-3- diaminobenzidina-4 (DAB/H2O2) para desarrollar color. Para el recuento de la tinción, se usó hematoxilina.
La Figura 1 muestra una imagen de inmunotinción de una región CA1 del hipocampo representativa de un ejemplo normal, y la Figura 2 muestra una imagen de inmunotinción de una región CA1 del hipocampo representativa de un caso con enfermedad de Alzheimer definitiva. La longitud de la barra en la Figura corresponde a 200 pm. Como se muestra con las flechas en la Figura 1, las partes profundamente teñidas en la célula muestran fuerte expresión de
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S38AA. En el caso de enfermedad de Alzheimer grave, la tinción a penas se encuentra en las células nerviosas. Puesto que el sitio de reconocimiento del anticuerpo anti-S38AA usado es el dominio extramembranoso de la isoterma 1 de S38AA y la isoterma 2 de S38AA, los resultados muestran un descenso en el dominio extramembranoso de S38AA en la región CA1 del hipocampo en un caso de enfermedad de Alzheimer con diagnóstico definitivo. A partir de estos resultados, está claro que la cantidad de expresión de S38AA desciende drásticamente en el caso de enfermedad de Alzheimer grave.
Ejemplo de Referencia 2. Espectrometría de masas cuantitativa de la proteína S38AA en célula piramidal de CA1 del hipocampo mediante método de marcación con oxígeno pesado
Después de obtener permiso de uso del Comité Ético del “Karolinska Institute”, se preparó una sección congelada del cerebro post mortem de pacientes conservado en el banco de cerebro sueco (Brain Power), y las células piramidales de CA1 del hipocampo se recuperaron por un método de captura por láser según el método de Aoki et al. ya publicado (Neuroreport (2008) 19:1.085-9).
Las células piramidales de CA1 del hipocampo (cada 12.000 células) se separaron y recogieron de un paciente con enfermedad de Alzheimer definitiva y un paciente sin enfermedad de Alzheimer. Las células recuperadas en un tubo se sometieron a lisis con 1 pl de solución de RapiGest SF (Waters) al 0,5 %, y se incubaron a 95 °C durante 90 min. Después de eso, el disolvente se separó mediante un sistema al vacío centrífugo, además se añadieron solución mezclada de 2 pl de cloruro de calcio 4 mM, RapiGest SF al 1 %, hidrogenocarbonato de sodio 360 mM y 5 pl de agua destilada, y la mezcla se sometió a un tratamiento de sonicación durante 5 min. Para tripsinolisis limitada de una proteína derivada de la célula nerviosa, se añadieron además 3 pl de 0,1 mg/ml de tripsina, y la mezcla se incubó a 37 °C durante 24 horas. Después de eso, se recogió una muestra (1 pl) y se sometió a electroforesis en gel de SDS-PAGE en gradiente del 4 al 12 %, sometido a tinción con plata, y se confirmó la finalización de la degradación limitada. La muestra de degradación limitada derivada del paciente con enfermedad de Alzheimer definitiva se marcó con oxígeno pesado. Los detalles del método están descritos a continuación.
Después de la tripsinolisis limitada, se añadió ácido clorhídrico concentrado (3 pl) a RapiGest SF químicamente degradado. El producto de degradación resultante se precipitó mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min, y se separó el sobrenadante. El sobrenadante obtenido se adsorbió a la columna ZipTipC-is (Millipore), se lavó tres veces con solución de ácido fórmico al 0,3 %, y se purificó eluyendo con solución de acetonitrilo al 80 %/ácido fórmico al 0,3 %. El disolvente en la muestra purificada se separó mediante un sistema al vacío centrífugo, y el residuo se disolvió de nuevo en solución de deuterio acetato de sodio 0,3 M (pH 5,2, 1,7 pl), cloruro de calcio 50 mM (1 pl) y agua con oxígeno pesado (47,3 pl). Se añadió a la misma 0,5 mg/ml de tripsina (Trypsin Gold, Promega, 1 pl) y la mezcla se incubó a 37 °C durante 48 horas. Para parar la reacción de marcaje, se añadió solución de ácido fórmico al 5 % (8 pl) diluida con agua con oxígeno pesado y la mezcla se incubó a 95 °C durante 90 min. La muestra final se conservó a -80 °C. Aunque la muestra derivada del paciente sin enfermedad de Alzheimer se trató de la misma manera que la muestra derivada del paciente con enfermedad de Alzheimer definitiva, se usó agua destilada en lugar de agua con oxígeno pesado. Inmediatamente antes de llevar a cabo la espectrometría de masas, una cantidad igual de 20 pl de cada una de la muestra con oxígeno pesado derivada del paciente con enfermedad de Alzheimer definitiva y la muestra derivada del paciente sin enfermedad de Alzeheimer se mezclaron, y se inyectaron a una columna de análisis (Zorbax 300SB, 0,1x150 mm, Agilent Technologies Inc.). Como fase móvil para el análisis, se usaron ácido acético al 0,1 % (fase móvil A) y ácido acético al 0,1 %-metanol (fase móvil B), en donde se usó un programa de gradiente de incrementar la concentración de la fase móvil B linealmente desde 5 % a 75 % durante 90 min, y después de eso mantener igual en la fase móvil B al 95 % durante 10 min. Como espectrómetro de masas, se usó Thermo Fisher, sistema LTQ-Orbitrap. El intervalo de medición de masas se fijó a 400 a 2.000 m/z. Usando los datos obtenidos, el péptido se identificó mediante el programa informático Mascot versión 2.2 y la base de datos Swiss-Prot (versión 55), y además, cuantitativamente se analizó por el programa informático Xome (Mitsui Knowledge Industry Co., Ltd.). El parámetro de análisis en el programa informático Mascot es como sigue. La masa monoisotópica se usó para el análisis, la tolerancia de masa peptídica se fijó en 10 ppm y la tolerancia de la MS/MS iónica del fragmento se fijó en 0,8 Da. Como enzima digestiva, se especificó la tripsina, y el número de escisión perdida se fijó en 1 como máximo. El objetivo de análisis era solo el marcador doble de C-terminal, y se permitió la oxidación de metionina.
Según el análisis de proteoma anteriormente mencionado, S38AA se identificó con éxito. Además, la diferencia en la cantidad de expresión de S38AA se estudió entre pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y pacientes sin enfermedad de Alzheimer (control) (Tabla 1). La secuencia identificada por la investigación peptídica MASCOT corresponde al dominio extramembranoso de la isoforma 1 de S38AA (la región de aminoácidos del 761° al 770° de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2), y la identificación peptídica era estadísticamente significativa.
La cantidad del dominio extramembranoso de S38AA en las células piramidales descendió a 1/20 en pacientes con enfermedad de Alzheimer en comparación con el control sin enfermedad de Alzheimer. El sitio de reconocimiento del anticuerpo usado en el estudio inmunohistológico era un dominio extramembranoso, y puesto que la cantidad de expresión también descendió incluso en ese caso, los resultados se igualaron con aquellos del estudio inmunohistológico. Es decir, está claro que al menos el dominio extramembranoso de S38AA desciende en las células nerviosas de la región CA1 del hipocampo en la enfermedad de Alzheimer
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Tabla 1
Relación de la cantidad de expresión de paciente con la enfermedad de Alzheimer/ paciente sin la enfermedad de Alzheimer
Secuencia peptídica identificada Nivel de significancia de la identificación
0,053
GQEAPEGKAR (SEQ ID NO: 3) 0,032
Ejemplo 1. Detección y predicción del peso molecular del fragmento de S38AA en fluido cerebroespinal
Se usaron los fluidos cerebroespinales de pacientes diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer (10 casos, puntuación patológica 9 a 12: puntuación patológica en el banco de cerebros suecos), enfermedad de Alzheimer presunta (6 casos, puntuación patológica 3 a 7) y normal (11 casos, puntuación patológica 0 a 4). La puntuación se realizó según el método de evaluación de Alafuzoff et al. (Acta Neuropathol. (Berl) (1987) 74:209-225). La determinación de la patología se realizó teniendo en consideración la puntuación patológica y el examen ante mortem por los médicos. La muestra de SDS se preparó añadiendo 1 volumen de un tampón de muestra LDS (Invitrogen) por 3 volúmenes de fluido cerebroespinal y calentando la mezcla a 70 °C durante 10 min. Usando la muestra preparada (10 jl), S38AA se separó en gel de SDS-PAGE en gradiente del 4 al 12 %. Después de eso, usando el sistema Mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories), se transfirió la proteína total separada a membrana PVDF, y se aplicó a la etapa de tinción por anticuerpo. Antes de la detección de S38AA con el anticuerpo, la membrana PVDF se bloqueó de las reacciones no específicas con solución salina tamponada con fosfato que contenía leche desnatada al 5 % (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 1 hora. El anticuerpo primario (número de catálogo: HPA024631, Atlas Antibodies) se diluyó 1.000 veces con solución salina tamponada con fosfato y se incubó a 4 °C durante la noche. Después de eso, la membrana se incubó con anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra conjugado con HRP (GE healthcare) diluido 50.000 veces a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavó suficientemente y se trató con SuperSignal (marca registrada) West Dura (Thermo Fisher Scientific) para permitir el desarrollo de color.
Una señal derivada del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal se pudo detectar mediante transferencia Western, y se encontró que su intensidad tendía a incrementarse en la enfermedad de Alzheimer (Figura 4). El peso molecular detectado era de 76 a 102 kDa, que correspondía a la longitud total de la isoforma 2 de S38AA. Sin embargo, la isoforma 2 es un proteína diez-transmembrana que tiene una posibilidad considerablemente baja de que la proteína de longitud completa se secrete en el fluido cerebroespinal. Por lo tanto, se examinó la posibilidad de escisión parcial y secreción de S38AA.
La secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de S38AA se obtuvo a partir de la información registrada de la base de datos de UniProtKB. La región extramembrana se predijo usando el programa informático TMHMM, y la región extramembrana prevista obtenida se muestra en un recuadro (Figura 3). La región extramembrana consistía en 721 aminoácidos desde el 399° al 1.119° y el peso molecular se calculó que era de aproximadamente 76 kDa. Por otro lado, se estimó que el peso molecular de S38AA en el fluido cerebroespinal era de aproximadamente 76 a 102 kDa mediante transferencia Western (Figura 4), lo cual casi se igualaba con el tamaño de peso molecular asumido de la región extramembrana. A partir del aspecto del peso molecular, se sugirió que la S38AA detectada en el fluido cerebroespinal era un (poli)péptido (fragmento de S38AA) que contenía el dominio extramembranoso de la isoforma 1.
Ejemplo 2. Antecedentes del paciente, análisis cuantitativo del fragmento de S38AA en fluido cerebroespinal y correlación con el alelo APOE
Para el análisis cuantitativo, los fluidos cerebroespinales de varios casos se mezclaron con antelación, y se usaron como el fluido cerebroespinal patrón para todos los análisis. Todas las muestras se trataron de la misma manera, y se dibujó una curva patrón para cada gel de SDS-PAGE. La transferencia Western para el análisis cuantitativo del fragmento de S38AA se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 1. La intensidad de señal derivada del anticuerpo S38AA se analizó en imagen por el analizador de imagen LAS3000 (Fujifilm Corp.) y se cuantificó usando el programa informático MultiGauge V3.0 (Fujifilm Corp.). Cada intensidad de señal se normalizó mediante la curva patrón preparada a partir del fluido cerebroespinal patrón transferido simultáneamente sobre cada membrana.
En cuanto a los antecedentes del paciente, los números de paciente específicos se concedieron en el presente ensayo desde el aspecto de protección de la información personal, la cual no correspondía con los números de referencia usados por el banco de cerebro sueco. El genotipo APOE se analizó según el manual de procedimiento estándar del banco de cerebro sueco. Se conocía el genotipo para los pacientes de los 27 casos (Tabla 2) y el análisis se realizó usando el mismo.
Tabla 2
Clasificación de la
gravedad de la enfermedad de
N° Paciente Diagnóstico Puntuación Alelo ApoE
Alzheimer
normal
1 Sin enfermedad de Alzheimer 01 3/3
2 Sin enfermedad de Alzheimer 04 2/3
3 Sin enfermedad de Alzheimer 02 2/3
4 Sin enfermedad de Alzheimer 00 3/4
5 Sin enfermedad de Alzheimer 00 3/3
6 Sin enfermedad de Alzheimer 01 3/3
7 Sin enfermedad de Alzheimer 04 3/4
8 Sin enfermedad de Alzheimer 02 3/3
9 Sin enfermedad de Alzheimer 00 2/3
10 Sin enfermedad de Alzheimer 00 2/3
11 Sin enfermedad de Alzheimer 00 3/3
leve o moderada
12 enfermedad de Alzheimer presunta 06 3/4
13 enfermedad de Alzheimer presunta 03 3/3
14 enfermedad de Alzheimer presunta 07 3/4
15 enfermedad de Alzheimer presunta 07 3/4
16 enfermedad de Alzheimer presunta 07 3/3
17 enfermedad de Alzheimer presunta ND 3/3
grave
18 Enfermedad de Alzheimer definitiva 10 3/3
19 Enfermedad de Alzheimer definitiva 10 3/4
20 Enfermedad de Alzheimer definitiva 12 3/4
21 Enfermedad de Alzheimer definitiva 11 3/4
22 Enfermedad de Alzheimer definitiva 10 3/4
23 Enfermedad de Alzheimer definitiva 11 4/4
24 Enfermedad de Alzheimer definitiva 09 4/4
25 Enfermedad de Alzheimer definitiva 09 3/4
26 Enfermedad de Alzheimer definitiva 10 3/4
27 Enfermedad de Alzheimer definitiva ND 4/4
ND: no determinado
puntuación: método de evaluación de Alafuzoff et al. (Acta Neuropathol (1987) 74:209-225).
Como se muestra en la Figura 5, está claro que la cantidad del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal se 5 incrementa en la enfermedad de Alzheimer, y la cantidad del fragmento de S38AA tiende a incrementarse incluso en pacientes con enfermedad de Alzheimer presunta. Esto muestra que el fragmento de S38AA se incrementa desde las fases tempranas o preclínicas de la enfermedad de Alzheimer, y se observa un claro incremento en pacientes con enfermedad de Alzheimer definitiva.
Todos los pacientes se clasificaron por el genotipo APOE (4 tipos de ApoE2/3, ApoE3/3, ApoE3/4, ApoE4/4; véase
5
10
15
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25
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40
45
50
la Tabla 2), y la cantidad de S38AA en el fluido cerebroespinal de cada grupo se muestra en una gráfica (Figura 6). La cantidad del fragmento de S38AA notablemente se incrementó particularmente en los pacientes homocigotos (ApoE4/4) que tenían ApoE4. ApoE4 es un gen de riesgo de aparición de la enfermedad de Alzheimer, y ApoE2 se considera que es un factor de resistencia de la aparición de la enfermedad de Alzheimer. Es decir, la Figura 6 muestra que los factores de riesgo de aparición de la enfermedad de Alzheimer del genotipo APOE y la cantidad del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal están correlacionados.
En cuanto a la relación entre la cantidad del fragmento de S38AA en 11 pacientes sin enfermedad de Alzheimer y el genotipo APOE, la cantidad del fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal se incrementó en el orden de ApoE2/3, ApoE3/3 y ApoE3/4, como se muestra en la Figura 7.
Estas correlaciones indican que S38AA en el fluido cerebroespinal está correlacionada con el riesgo de la aparición de la enfermedad de Alzheimer en el futuro, y además sugiere que S38AA tiene una posibilidad de ser un biomarcador para estimar el riesgo de la aparición de la enfermedad de Alzheimer en el futuro incluso en pacientes con enfermedad de Alzheimer preclínica. Aunque se considere que la detección temprana y el inicio de un tratamiento temprano son importantes en la enfermedad de Alzheimer, no se ha encontrado un marcador diagnóstico capaz de la detección temprana de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la detección de la enfermedad de Alzheimer presunta es extremadamente útil.
Ejemplo 3. Confirmación de que el fragmento de S38AA en el fluido cerebroespinal contiene la región extramembrana de S38AA
(1) Confirmación del fragmento de S38AA basándose en el anticuerpo usado para la inmunoprecipitación
Un anticuerpo anti-S38AA (HPA023161 o HPA021374, Atlas Antibodies, 2 jl) para la inmunoprecipitación se añadió al fluido cerebroespinal (500 jl) derivado del paciente con enfermedad de Alzheimer y la mezcla se incubó durante 20 horas a 4 °C, y después de eso se incubó junto con ProteinG Mag Sepharose (GE healthcare) durante 1 hora a 4 °C, de ese modo se inmunoprecipitó un fragmento de S38AA. Después de eso, se añadió tampón de muestra LDS (Invitrogen, 10 jl) a perlas magnéticas para dar una muestra para SDS-PAGE (fracción unida a ProteinG Mag Sepharose). Además, se tomó 9 jl de la fracción sobrenadante libre de precipitación por ProteinG Mag Sepharose, y el tampón de muestra LDS (3 jl) se añadió para dar una muestra de una fracción no unida (fracción no unida a ProteinG Mag Sepharose).
Después de realizar la SDS-PAGE de la misma manera que en el Ejemplo 1, se realizó transferencia Western usando HPA024631 como anticuerpo primario.
Como resultado, en tanto HPA023161 como HPA021374 usado para inmunoprecipitación, se pudo detectar un inmunoprecipitado que tenía un peso molecular similar al encontrado en el fluido cerebroespinal mediante transferencia Western (Figura 8: línea unido). Por otro lado, el fragmento de S38AA no se detectó en el sobrenadante del inmunoprecipitado (Figura 8: línea no unido).
Puesto que las secuencias de aminoácidos de los péptidos usados para la producción de los anticuerpos de HPA023161 y HPA021374 eran
MKÍlApVPIAMAlAAnUAGAÍAiAAAGlVAVUAA-EPUVIPP' ;iv', >M¡ A>,lil A,] ü ;<;| 11 .PMUKA (SEQ |D NO: 4; correspondiente a la región de aminoácidos del 926° al 988° en la SEQ ID NO: 2) y
PVPHDKVVVDEGQDREVPEENKPPSRHAGGKAPGVQGQMAPPLPDSEREKQEPEQGEVGKRPG
QAQALEEAGDLPEDPQKVPEADGQPA
(SEQ ID NO: 5; correspondiente a la región de aminoácidos del 500° al 588° en la SEQ ID NO: 2), respectivamente, se ha demostrado que al menos el fragmento de S38AA en el cordón cerebroespinal contiene una secuencia de aminoácidos que es una parte de estas secuencias de dominio extramembranoso de S38AA.
(2) Confirmación del fragmento de S38AA por análisis por MS por corte aleatorio (“shotgun”)
Para mostrar que la muestra de inmunoprecipitación del Ejemplo 3(1) contiene el dominio extramembranoso de S38AA, agua MilliQ (90 jl), tampón Tris 1 M (pH 8, 5 jl), urea (48 mg) y ditiotreitol 0,5 M (1 jl) se añadieron a los dos tipos de muestras de inmunoprecipitación, y las mezclas se incubaron a 30 °C durante 2 horas. Después de eso, se añadió yodoacetamida 0,5 M (2 jl), y la mezcla se trató a una temperatura ambiente durante 1 hora para someter a alquilación el resto tiol. Después de eso, se añadió carbonato de amonio 50 mM (750 jl), se añadió tripsina (Promega, 2 jg), y la mezcla se incubó a 37 °C durante la noche para dar una digestión tríptica. La digestión tríptica obtenida se trató con ácido trifluoroacético para disminuir el pH a 1 a 2, y se purificó por columna TopTip200 (Glygen Corp.) según el manual de funcionamiento.
La digestión tríptica inmunoprecipitada por HPA023161 o HPA021374 se disolvió en solución de ácido trifluoroacético al 0,1 % (20 jl), y 5 jl del mismo se inyectó en una columna de análisis (Zorbax 300SB, 0,1x150 mm,
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20
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30
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40
45
50
55
Agilent Technologies). Para la fase móvil del análisis, se usaron ácido fórmico al 0,1 % (fase móvil A) y ácido fórmico al 0,1 %-metanol (fase móvil B). Se usó un programa de gradiente de incrementar la concentración de la fase móvil B linealmente de 5 % a 75 % durante 30 min, y después de eso a fase móvil B al 98 % (31 min), y mantener durante 5 min (36 min). El espectrómetro de masas usado era Thermo Fisher, LTQ velos sistema. El intervalo de medición de masas se fijó a 400 a 1.400 m/z. Usando los datos obtenidos, el péptido se identificó usando el programa informático Mascot versión 2.2 y la base de datos de Swiss-Prot (20110804).
Las condiciones de parámetro de análisis en el programa informático Mascot eran las siguientes:
se seleccionó masa monoisotópica
tolerancia de masa peptídica: 15 Da
tolerancia de MS/MS iónica del fragmento: 0,8 Da
enzima digestiva: se especificó la tripsina
número de escisión perdida: 1 como máximo
oxidación de metionina: permitida
Como resultado del análisis por MS por corte aleatorio (“shotgun”) de los inmunoprecipitados por HPA023161 y HPA021374, se pudo identificar un total de 6 secuencias peptídicas derivadas del dominio extramembranoso de S38AA (Figura 3, parte subrayada, SEQ ID NO: 6-11). Por lo tanto, se ha demostrado que los inmunoprecipitados ciertamente contienen el domino extramembranoso de S38AA
Ejemplo 4. Detección y predicción del peso molecular del fragmento de S38AA en plasma
Si también se puede detectar o no el fragmento de S38AA se estudió en plasma humano. El plasma con heparina se separó de pacientes con enfermedad de Alzheimer y pacientes sin enfermedad de Alzheimer. Se colocaron perlas magnéticas de separación de albumina PureProteoma (Millipore, 500 jl) y ProteinG Mag Sepharose (GE healthcare, 60 jl) en un tubo Eppendorf, y se lavó con solución salina tamponada. Después de eso, el plasma (20 jl) y la solución salina tamponada con fosfato (60 jl) se añadieron a las perlas magnéticas mezcladas, y la mezcla se incubó a 4 °C durante 2 horas. Se confirmó por SDS-PAGE que el plasma obtenido estaba libre de albúmina e inmunoglobulina. A esta muestra (60 jl) se añadió el tampón de muestra LDS (Invitrogen, 20 jl) para dar una muestra para SDS-PAGE, la cual se analizó por transferencia Western usando HPA024631 como anticuerpo primario de la misma manera que en el Ejemplo 3 anteriormente mencionado.
Como resultado, se encontró un banda considerada por tener el mismo peso molecular que el del fluido cerebroespinal como se muestra en la Figura 9, y la cantidad de la correspondiente banda incrementada en pacientes con enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, el fragmento de S38AA también está presente en plasma humano, y se aclaró que la cantidad del fragmento de S38AA en plasma se incrementa en pacientes con enfermedad de Alzheimer en comparación con la persona normal.
Ejemplo 5. Ejemplo de detección 1 del fragmento de S38AA producido en el sobrenadante de la célula cultivada
Se cultivaron célula BE(2)-C, célula SK-N-MC, célula SHSY-5Y y célula SHSY-5Y (APP) (línea celular obtenida mediante la introducción del gen APP humano en célula SHSY-5Y) en D-MEM (Invitrogen) que contenía suero fetal bovino al 10 % durante 2 días, y después de eso, se recuperó el medio. Se cultivó célula nerviosa primaria fetal de rata en medio Neurobasal (Invitrogen) que contenía B27 durante 7 días, y el medio se recuperó. El anticuerpo HPA021374 se añadió a cada medio recuperado (1 ml), y la mezcla se incubó a 4 °C durante 20 horas. Después de eso, se añadió ProteinG Mag Sepharose (30 jl) y la mezcla se incubó a 4 °C durante 2 horas. Las perlas magnéticas se lavaron con PBS(-), y se añadió tampón de muestra LDS (20 jl) diluido 4 veces para dar una muestra para SDS- PAGE. De la misma manera que en el Ejemplo 3 anteriormente mencionado, la muestra se analizó mediante transferencia Western usando HPA024631 como un anticuerpo primario.
Como resultado, se observó una banda considerada por tener el mismo peso molecular que el del fluido cerebroespinal y el plasma. Por lo tanto, se ha aclarado que la escisión de S38AA, principalmente, la producción y secreción del fragmento de S38AA, también se puede detectar en células cultivadas y células cultivadas primarias de rata, igual que la célula nerviosa humana.
Ejemplo 6. Ejemplo de detección 2 del fragmento de S38AA producido en el sobrenadante de la célula cultivada
Se construyó un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN añadida con etiqueta Flag (dykddddk; SEQ ID nO: 12) al C-terminal de S38Aa, y se introdujo en la célula SHSY-5Y. Después de 48 horas, el medio se recuperó (75 jl), y el tampón de muestra LDS (25 jl) se añadió para dar una muestra para SDS-PAGE. Esta vez, la

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. El uso de un anticuerpo anti-S38AA en la determinación de la enfermedad de Alzheimer in vitro o ex vivo.
  2. 2. Un método de determinación de la enfermedad de Alzheimer en un animal, que comprende detectar un fragmento de S38AA en una muestra recogida de dicho animal.
  3. 3. El método según la reivindicación 2, en donde el animal es un ser humano.
  4. 4. El método según la reivindicación 2 o 3, en donde el fragmento de S38AA es un fragmento derivado de la isoforma 1 de S38AA.
  5. 5. El método según la reivindicación 2 o 3, en donde el fragmento de S38AA es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 3.
  6. 6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la muestra es sangre, fluido cerebroespinal u orina.
  7. 7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la muestra es fluido cerebroespinal.
  8. 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la muestra es sangre.
  9. 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la muestra es plasma.
  10. 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, que comprende además detectar uno u otros
    más marcadores diagnósticos para la enfermedad de Alzheimer.
  11. 11. Un método de investigación para una sustancia candidata para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, que comprende las siguientes etapas:
    (1) poner en contacto una sustancia de ensayo con una célula que permite la medición de la producción de un fragmento de S38AA;
    (2) medir la cantidad de producción del fragmento de S38AA en la célula puesta en contacto con la sustancia de ensayo, y comparar la cantidad de producción con la del fragmento de S38AA en una célula control libre de contacto con la sustancia de ensayo; y
    (3) seleccionar una sustancia de ensayo que regula a la baja la cantidad de producción del fragmento de S38AA como una sustancia candidata para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, basándose en los resultados de comparación del anteriormente mencionado punto (2).
  12. 12. El método según la reivindicación 4, en donde la isoforma 1 de S38AA es un polipéptido de la siguiente (a) o (b):
    (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2, o
    (b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 2.
  13. 13. El método según la reivindicación 5, en donde el fragmento de S38AA es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del 505° al 1.014° mostrada por la SEQ ID NO: 2.
    imagen1
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    10 20 30 40 50 60
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    1 i tn ívnsi v gvsvltmpfc fkqcgiviga 111vfcswmt hqscmfIvks
    70
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    130
    140 150 160 170 180
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    430
    440 450 í 30 470 480
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    490
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    670
    S80 690 700 710 720
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    730
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    860 870 880 890 900
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    910
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    Cantidad de S38AA en fluido
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    Cantidad S38AA en fluido cerebroespinal (valor estandarizado por fluido cerebroespinal patrón)
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    imagen3
    Pig
    genotipo APOE
    Cantidad S38AA en fluido cerebroespinal (valor estandarizado por fluido cerebroespinal patrón)
    imagen4
    rq
    H-
    tQ
    en
    imagen5
    Fig. 9
    marcador
    no enfermedad de
    Alzheimer enfermedad de Alzheimer
    100kDa
    80kDa
    imagen6
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