CN105548561A - 阿尔茨海默病的诊断药和诊断方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供确定阿尔茨海默病的试剂，其包括抗S38AA抗体；确定试验动物中的阿尔茨海默病的方法，其包括对采集自所述动物的样品中的S38AA片段进行检测；以及治疗或预防阿尔茨海默病的物质的筛选方法，其包括使试验物质和允许测定S38AA片段产生的细胞接触，测定细胞中S38AA片段的产生量，将该产生量与没有接触试验物质的对照细胞中S38AA片段的产生量进行对比，以及基于该对比结果，选择可以下调S38AA片段的产生量的试验物质来作为能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质。

Description

阿尔茨海默病的诊断药和诊断方法

本申请是2011年12月28日提出的发明名称为“阿尔茨海默病的诊断药和诊断方法”、国家申请号为201180063707.1的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及阿尔茨海默病的确定试剂，阿尔茨海默病的确定方法，以及治疗或预防阿尔茨海默病的物质的筛选方法。

背景技术

阿尔茨海默病是一种进行性痴呆，开始表现为短期记忆减退和轻微的学习障碍，接着发展为大脑高度功能失调，特别是视觉空间失认证，观念性失用症，结构性失用症等等，并且最终发展至运动障碍以及所谓的人格毁灭，对此，迄今为止还未发现根治方法。据预测，到2040年，全世界将有240万阿尔茨海默病患者，因此，其根治方法或其早期诊断方法的重要性日愈增加。其疾病进程与通常发现于日本的血管性痴呆也并不相同，被认为会持续数年至十年或更长时间。在作为阿尔茨海默病之一的由异常基因突变所导致的家族阿尔茨海默病的情况中，许多患者的症状会在数年内迅速恶化，该病的特征在于早期发病，因为发病年龄是30多岁至40多岁期间。年龄、家族病史、基因型、高血压、糖尿病、抽烟等都是除基因突变之外已知的阿尔茨海默病风险因子，其中，该疾病与APOE基因型的关系已经明确。特别地，已经报道了ApoE4等位基因是阿尔茨海默病的一个风险因子(非专利文献-1)。

作为阿尔茨海默病特征性的病理学改变，广泛已知发生的有：包含淀粉样蛋白β作为主要组成成分的淀粉样蛋白斑的细胞外累积，和磷酸化的tau蛋白在神经细胞中的累积。至于大脑中空间上和时间上的病理学改变，因为在早期发病的阿尔茨海默病患者中观察到磷酸化的tau在海马、尤其是在被称为CA1的区域中的椎体细胞中累积，因而这个区域中的椎体细胞被认为在早期阶段就在空间上和时间上暴露于阿尔茨海默病的强力影响之下，即显示出脆弱性(非专利文献2)。另一方面，如上所提及的，由于运动性障碍几乎都是出现于阿尔茨海默病的最后阶段，因而小脑中的浦肯野细胞被认为对阿尔茨海默病最具有抵抗性。

阿尔茨海默病的发生率被认为是在75岁之后快速上升的，早期检测以及早期治疗对于通过对症药物疗法来抑制疾病的进展是重要的。

由于目前阿尔茨海默病并没有根治治疗，因此对用于早期检测阿尔茨海默病的诊断标记物进行了大力寻找，从而认为对血液或脑脊液中的淀粉样蛋白β(Aβ40，Aβ42)以及磷酸化tau蛋白的测定是最有希望的。然而，即使单独使用或组合使用这些标记物(例如，Aβ40和Aβ42的比值)，仍然很难清晰地判断将来是否会患上阿尔茨海默病，即阿尔茨海默病的潜在患者。

[文献列表]

[非专利文献]

非专利文献1：Science.(1993)261：921-3

非专利文献2：ExpGerontol.(2000)35：851-64

发明概述

本发明所要解决的问题

本发明所要解决的问题是提供阿尔茨海默病的确定试剂，阿尔茨海默病的确定方法，以及治疗或预防阿尔茨海默病的物质的筛选方法。

解决问题的方法

本发明人进行了深入的研究并且发现，相比于正常人，阿尔茨海默病患者脑脊液和血浆中的S38AA片段的量增多，该S38AA片段是含有S38AA异构体1的细胞膜外结构域的多肽。

进而，本发明人测定了非阿尔茨海默病(正常人)、疑似阿尔茨海默病(潜在阿尔茨海默病)以及严重阿尔茨海默病患者的脑脊液中的S38AA片段的量，发现随着阿尔茨海默病病状(进程)的恶化，S38AA片段的量增加，由于阿尔茨海默病中S38AA片段量的这种病状-依赖性增加与ApoE4携带者表现出正相关，而与ApoE2携带者表现出负相关，因此，作为阿尔茨海默病的确定指标，该S38AA片段具有高的可靠性。

基于这些发现，本发明人确信抗S38AA抗体作为阿尔茨海默病的确定试剂是有用的，可通过测定S38AA片段来检测阿尔茨海默病，从而完成了本发明。

因此，本发明涉及如下：

[1]阿尔茨海默病的确定试剂，其包括抗S38AA的抗体。

[2]如[1]中的确定试剂，其中所述抗S38AA抗体是识别S38AA细胞膜外结构域的抗体。

[3]如[2]中的确定试剂，其中所述S38AA细胞膜外结构域是S38AA异构体1的膜外结构域。

[4]确定阿尔茨海默病的试剂盒，其包括[1]-[3]中任意一项的确定试剂。

[5]确定试验动物中的阿尔茨海默病的方法，其包括对采集自所述动物的样品中的S38AA片段进行检测。

[6]如[5]中的方法，其中所述试验动物是人。

[7]如[5]或[6]中的方法，其中所述S38AA片段是来源于S38AA异构体1的片段。

[8]如[5]或[6]中的方法，其中所述S38AA片段是多肽，该多肽包括SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。

[9]如[5]-[8]中任一项的方法，其中所述样品是血液，脑脊液或尿液。

[10]如[5]-[8]中任一项的方法，其中所述样品是脑脊液。

[11]如[5]-[10]中任一项的方法，其进一步包括检测阿尔茨海默病的一种或多种其它诊断标志物。

[12]寻找能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质的方法，其包括如下步骤：

(1)使试验物质与允许测定S38AA片段产生的细胞接触；

(2)测定与试验物质接触的细胞中S38AA片段的产生量，并将该产生量与没有接触试验物质的对照细胞中S38AA片段的产生量进行比较；以及

(3)基于上述(2)的比较结果，选择下调S38AA片段产生量的试验物质作为能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质。

发明效果

根据本发明，可以提供阿尔茨海默病的确定试剂，以及阿尔茨海默病的确定方法。

此外，根据本发明的筛选方法，可以提供能够治疗或预防阿尔茨海默病的试剂。

附图简述

图1展示了正常例子中的代表性海马CA1区域的免疫染色图像。图1的神经细胞中染色强的部分(箭头)表示S38AA的强表达。右下的方框是用虚线框住部分的放大视图。标尺是20μm。

图2展示了确诊阿尔茨海默病例子中的代表性海马CA1区域的免疫染色图像。右下方的方框是用虚线框住部分的放大视图。标尺是20μm。

图3在方框中展示了S38AA异构体1的氨基酸序列的预测的膜外结构域。通过鸟枪法蛋白质组学对免疫共沉淀S38AA片段进行分析，由此鉴定的多肽片段序列和其位置用下划线标出。

图4展示了脑脊液中S38AAWestern印迹分析的实例以及检测到的S38AA片段的分子量分析结果。

图5展示了非阿尔茨海默病患者，疑似阿尔茨海默病患者以及确诊阿尔茨海默病患者的脑脊液中的S38AA片段的Western印迹定量分析结果。Y轴显示的是每组的信号强度，其已用标准脑脊液进行了标准化。

图6展示了相应各患者组的脑脊液中的S38AA片段量，该患者组是将所有患者根据APOE基因型来进行划分的(划分成4种基因型：ApoE2/3，ApoE3/3，ApoE3/4，ApoE4/4)。

图7展示了S38AA片段的量与11名非阿尔茨海默病患者的APOE基因型之间的关系。Y轴显示的是每组的信号强度，其已用标准脑脊液进行标准化。

图8展示的是利用抗S38AA抗体(HPA021374，HPA023161)通过免疫共沉淀法而特异性地分离出的S38AA片段的分子量分析的结果。

图9展示的是人血浆中S38AA片段的Western印迹分析实例以及所检出的S38AA片段的分子量分析的结果。

具体实施方式

因此，本发明涉及如下内容。

1、用于确定阿尔茨海默病的本发明的试剂

本发明人发现：(1)相比于正常人，阿尔茨海默病患者脑脊液和血浆中的S38AA片段量增加，(2)即使在疑似阿尔茨海默病患者中，S38AA片段的量也要比正常人中增加，并且S38AA片段的量随着阿尔茨海默病病状恶化(进展)而增加，(3)由于阿尔茨海默病中S38AA片段量的这种病状-依赖性增加与ApoE4携带者表现出正相关，而与ApoE2携带者表现出负相关，因而S38AA片段作为阿尔茨海默病的确定指标具有高可靠性。

因此，本发明提供阿尔茨海默病的确定试剂，其包括抗S38AA抗体。

本发明的确定试剂不仅能确定人是否患有阿尔茨海默病，还能确定人是否倾向于患有阿尔茨海默病，即此人在不远的将来是否具有较高的可能性患上该疾病，尽管此人现在还没有患上该疾病。

因此，本发明中的阿尔茨海默病的“确定”不仅用于指确定某人是否已经患有阿尔茨海默病，还包括判断某人在不远的将来是否具有较高的可能性患上该疾病，尽管此人现在还没有患上该疾病。

在本说明中，“疑似阿尔茨海默病”是指与将来有较高可能性患病(确诊)所相关的状况，尽管还没有做出阿尔茨海默病的确诊。其特定实例包括通过诊断中的严重程度分类为轻度或中度水平的状况、轻度认知受损的状态等，该诊断是依据淀粉样蛋白成像，MRI，CT，SPET或临床症状来进行的。

对于S38AA而言，已知的氨基酸序列例如：人S38AA异构体1(UniProtKB/Swiss-Prot编号：Q9HBR0-1，SEQIDNO：2)，大鼠S38AA异构体1(NCBI参考序列编号：XP_002727892.1)，小鼠S38AA异构体1(NCBI参考序列编号：NP_077211.4)，人S38AA异构体2(UniProtKB/Swiss-Prot编号：Q9HBR0-2)等等。

此外，作为编码S38AA的核苷酸序列(以下称为“S38AA基因”)，已知例如：人S38AA异构体1cDNA序列(NCBI参考序列编号：NM_001037984.1，SEQIDNO：1)。

根据UniProtKB/Swiss-Prot数据库，预测S38AA是一个十次跨膜的蛋白质，并推测从第399个氨基酸开始(异构体1中至第1119个氨基酸残基，异构体2中则是至第780个氨基酸残基)的氨基酸序列为膜外区域。

在本说明书中，“S38AA”并不只是包括由这些已知序列所示的“蛋白”或“(多)肽”，还包括例如，其等同物(同源物和剪接变体)，变体，衍生物，成熟形式，以及氨基酸修饰体等，只要它们和显示人S38AA异构体1的特定氨基酸序列(SEQIDNO：2)具有等同的生物学功能。在这里，同源物的例子包括例如小鼠，大鼠等其它生物物种的蛋白，这些蛋白对应于人蛋白。它们能够从HomoloGene所鉴定的基因的碱基序列中推断出来(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene)。剪接变体的例子包括人S38AA异构体2(689-780位氨基酸序列与异构体1不同，781-1119位氨基酸序列缺失)。此外，变体包括自然发生的等位基因变体(多态性)，非自然存在的变体，以及具有通过缺失、替换、添加或插入进行了人工改变的氨基酸序列的变体。上述变体的实例包括那些与没有突变的蛋白或(多)肽具有至少70％，优选80％，更优选95％，进一步优选97％同一性的变体。自然发生的等位基因变体(多态性)的实例包括：其中第559位的Lys被Arg替换的SEQIDNO：2的变体(ddbSNP：rs35546507)以及其中第831位的Ala被Gly替换的变体(dbSNP：rs2725405)。此外，氨基酸修饰体包括自然发生的氨基酸修饰体和非自然存在的氨基酸修饰体，并且特别地，也包括氨基酸磷酸化体(例如，SEQIDNO：2的磷酸化体，其中第889位的Ser被磷酸化)。

通过使用例如，UniProtKB/Swiss-Prot数据库中描述的预测数据，以及已知的预测工具和软件如TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)等，可以容易地预测蛋白质的膜外结构域和跨膜区域等。

本说明书中的“S38AA片段”只需是包括S38AA膜外结构域的(多)肽。这里的“S38AA膜外结构域”是指含有上述任意S38AA的C末端的全部或部分膜外区域、或例如高尔基体等的细胞器中的S38AA的C末端的全部或部分膜外区域的肽区域。此外，本说明书中的“S38AA片段”的特征在于，其被抗S38AA抗体HPA024631识别(AtlasAntibodies；使用由SEQIDNO：2中402-491位氨基酸序列构成的肽作为免疫原而产生的)。

优选地，S38AA片段包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。SEQIDNO：3所示的氨基酸序列对应于人S38AA异构体1的761-770部分氨基酸序列(在异构体2中，由于不同的剪接方式，689位以后的氨基酸序列并不相同)。因此，尽管S38AA片段优选是来源于S38AA异构体1的片段，由于根据SDS-PAGE中S38AA片段的表观分子量预测S38AA的剪切位点应该位于两个异构体的共同氨基酸序列(直至SEQIDNO：2的第688位氨基酸)中，因而如果剪切反应只在剪切位点的氨基酸序列的识别时发生，那么本发明的S38AA片段也包括来源于异构体2的片段。

尽管S38AA片段的分子量不受限制，优选在SDS-PAGE中表观分子量为约76-约102kDa。因此，更优选的是在SEQIDNO：2所示氨基酸序列的第161个氨基酸后剪切得到的片段(由161-1119位氨基酸序列构成的片段的分子量(计算)为约102kDa)。此外，根据pull-down实验以及下述的鸟枪法MS分析的结果，本发明的S38AA片段更优选为包括SEQIDNO：2所示氨基酸序列的505-1014位氨基酸序列的片段。

本发明的“抗S38AA抗体”是识别S38AA膜外结构域的抗体，优选为识别S38AA异构体1的膜外结构域的抗体。所述膜外结构域可以在异构体1特有的氨基酸区域(在SEQIDNO：2中是689-1119位氨基酸区域)中，也可以在与异构体2共同的氨基酸区域(399-688位氨基酸区域)中，或者横跨这两个区域。此外，该膜外结构域可以是S38AA膜外区域的连续的部分氨基酸序列，或者是由两个或更多个断续的部分氨基酸序列所形成的构造。

抗S38AA抗体也可以是，例如，多克隆抗体或单克隆抗体，其由已知方法生产，例如可商业获得的抗S38AA抗体(例如，HPA024631，HPA023161，HPA021374(各自由AtlasAntibodies生产))等等，或其片段(例如Fab，F(ab’)₂，scFV，小抗体等)。

作为用于本发明中的抗S38AA抗体，优选来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体。

来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体的实例包括：产生在动物血液中的抗体，由杂交瘤产生的抗体，以及由转染有表达载体的宿主产生的抗体(所述表达载体包含由基因工程技术得到的抗体基因)，利用最优抗体的基因在CHO细胞工厂大量生产的抗体(所述最优抗体是利用噬菌体展示从由1000000000000个分子组成的庞大克隆文库中筛选出来的)，或者利用产生人抗体的转基因小鼠直接产生的人抗体，等等。

单克隆抗体和多克隆抗体可以利用本领域技术人员已知的方法来生产。

(1)单克隆抗体的制造

将S38AA单独或者与载体和稀释液一起给予至哺乳动物的能够产生抗体的部位。为了提高给予所产生的抗体量，可以给予完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。通常每2-6周给予一次，总共给予约2-10次。可使用的哺乳动物包括猴子，兔子，狗，豚鼠，小鼠，大鼠，绵羊和山羊，优选为小鼠和大鼠。

对于单克隆抗体产生细胞的制作，从哺乳动物、例如经抗原免疫的小鼠选择被发现显示抗体效价的个体，在最终免疫后2-5天收集脾脏或淋巴结，将其中所包含的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，由此可制备产生单克隆抗体的杂交瘤。例如，通过将下述的进行了标记的S38AA与抗血清进行反应，并且对结合到抗体上的标记的活性进行测定，可以测定抗血清中的抗体效价。融合操作可以用已知的方法进行，例如，Kohler和Milstein的方法[Nature，256，495(1975)]。作为融合刺激物，例如，可以提及聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选使用PEG。

作为骨髓瘤细胞，例如，可以提及NS-1，P3U1，SP2/0等，优选使用P3U1。抗体产生细胞(脾脏细胞)与所用骨髓瘤细胞的数目的优选比率约为1∶1-20∶1，加入浓度约为10-80％的PEG(优选PEG1000-PEG6000)，通过在约20-40℃、优选约30-37℃下孵育约1-10分钟，可以高效地进行细胞融合。

可以使用不同的方法来筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。其实例包括下述方法：一种方法，其包括将杂交瘤培养上清加入到直接或与载体一起吸附有如蛋白质等的抗原的固相(例如，微板)上，加入用放射性物质或酶等进行了标记的抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞来自于小鼠时，则使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白质A，并检测结合到该固相上的单克隆抗体；一种方法，其包括将杂交瘤培养上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白质A的固相上，加入用放射性物质、酶类等进行了标记的蛋白质，并检测结合到该固相上的单克隆抗体，等等。

可用使用本身已知的方法或类似的方法来选择单克隆抗体，通常可以使用添加有HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶)的动物细胞用培养基等来进行选择。作为选择和生长用培养基，只要杂交瘤能够生长，则任何培养基都能使用。例如，可以使用含有1-20％、优选10-20％胎牛血清的RPMI1640培养基，含有1-10％胎牛血清的GIT培养基(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.)，用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101，NissuiPharmaceuticalCo.，Ltd)等等。培养温度通常是20-40℃，优选为约37℃。培养时间一般是5天-3周，优选为1周-2周。通常在5％二氧化碳气供应下进行培养。可以对杂交瘤培养上清中的抗体效价进行测定，其方法与上述的测定抗血清中抗体效价的方法相同。

可以根据免疫球蛋白的分离和纯化方法对单克隆抗体进行分离和纯化，该方法与多克隆抗体一般的分离和纯化方法相同(例如，盐析法，醇沉淀法，等电点沉淀法，电泳法，利用离子交换体的吸附和解吸附(例如，DEAE)，超速离心法，凝胶过滤法，包括利用如抗原结合固相，蛋白质A，蛋白质G等活性吸附剂仅收集抗体，并且使该结合解离以产生抗体的特异性纯化方法)。

(2)多克隆抗体的制造

可用使用本身已知的方法或类似的方法来制造针对S38AA的多克隆抗体。例如，通过制造免疫抗原(抗原例如蛋白质等)与载体蛋白质的复合体，并用与上述单克隆抗体制造方法相同的方式免疫哺乳动物或免疫鸡，从进行了免疫的动物中收集含有针对S38AA的抗体的物质，并分离和纯化该抗体，由此可制造多克隆抗体。

作为用于免疫哺乳动物或鸡的免疫抗原和载体蛋白质的复合体，只要针对通过与载体蛋白质交联而用于免疫的半抗原可以高效地产生抗体，则载体蛋白的种类以及载体与半抗原的混合比率可以是任何种类和任意比率。例如，采用的方法包括将牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白等以约0.1-20、优选约1-5的重量比率与1份半抗原结合。

尽管可使用各种浓缩试剂来使半抗原与载体结合，但可使用含有戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化酯、硫醇基团和二硫吡啶基团等的活化酯试剂。

将浓缩产物单独或与载体和稀释剂一起给予至哺乳动物或鸡的能够产生抗体的部位。为了提高给予所致的抗体产生能力，也可以给予完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。通常每2-6周给予一次，总共给予约3-10次。

可以从用上述方法免疫的哺乳动物的血液、腹水、母乳等中收集多克隆抗体，优选从血液中收集，如果是鸡时，则可以从血液和卵黄中收集。

可以用与上述测定抗血清中抗体效价的方法相同的方式来测定抗血清中多克隆抗体的效价。根据免疫球蛋白的分离和纯化方法对单多克隆抗体进行分离和纯化，该方法与上述的单克隆抗体的分离和纯化方法相同。

2、用于确定阿尔茨海默病的试剂盒

本发明提供用于确定阿尔茨海默病的试剂盒。本发明的试剂盒含有测定S38AA片段的量的试剂。通过使用本发明的试剂盒测定S38AA片段的量，可以确定阿尔茨海默病。

本发明的试剂盒特特别含有识别S38AA的抗S38AA抗体。抗S38AA抗体的例子包括如前面“1、用于确定阿尔茨海默病的本发明的试剂”中所详述的抗S38AA抗体。该抗体可以是荧光标记的抗体、酶标记的抗体、链霉亲和素标记的抗体、生物素标记的抗体或放射性标记的抗体。

包含在本发明试剂盒中的抗S38AA抗体通常是以合适浓度溶于水或合适缓冲液(例如，TE缓冲液，PBS等)中的其水溶液形式、或冻干品形式。

根据S38AA片段的测定方法，本发明的试剂盒在其组成中可进一步含有实施该方法所需的其它成分。例如，为了通过Western印迹进行测定，本发明试剂盒可进一步含有印迹缓冲液、标记试剂、印迹膜等、确定试剂、标准溶液等等。这里，“标准溶液”的例子包括水溶液，其是通过将上述“S38AA片段”的纯化标准品以特定的浓度溶解于水或合适缓冲液(例如，TE缓冲液，PBS等)中得到的。

为了通过三明治ELISA进行测定，除了上述之外，本发明的试剂盒可进一步含有固定化抗体测定板、洗涤溶液等等。为了通过包括乳胶凝集法的凝集法来进行测定，可以含有涂布有抗体的乳胶、凝胶等等。为了通过化学荧光法或化学荧光电子法进行测定，可含有结合有抗体的磁性颗粒和合适的缓冲液。为了通过LC/MS，LC/MS/MS或免疫色谱法检测S38AA，可以含有涂布有抗体的柱或微柱，以及大型芯片(macrochip)来作为检测装置的一部分。此外，在时间分辨荧光测定法或其类似测定方法中，在组成中还可含有多种进行了标记的抗S38AA抗体和其它的必要成分。

3、用于确定阿尔茨海默病的方法本发明人已经发现：(1)相比于正常人，阿尔茨海默病患者的脑脊液和血浆中的S38AA片段量增加，(2)甚至在患有轻度阿尔茨海默病的患者中，S38AA片段的量也被发现比正常人增高更多，并且S38AA片段的量是随着阿尔茨海默病病状的恶化(进展)而增加，和(3)由于阿尔茨海默病中S38AA片段量的这种病状-依赖性增加与ApoE4携带者表现出正相关，而与ApoE2携带者表现出负相关，因而S38AA片段作为阿尔茨海默病的确定指标具有高可靠性。

因此，本发明提供用于确定阿尔茨海默病的方法，其包括对采集自试验动物的样品中的S38AA片段进行检测。

本发明的确定方法不仅可确定某人是否患有阿尔茨海默病，还可确定此人在不远的将来是否具有很高的可能性患上该疾病，尽管此人现在还未患有该疾病。

本发明的方法包括下述步骤：对采集自试验动物的样品中的S38AA片段进行检测的步骤，以及基于S38AA片段量与阿尔茨海默病的正相关来确定阿尔茨海默病的步骤。

能够成为本发明确定方法试验对象的动物并没有特别的限制，只要它产生S38AA即可，可提及例如：哺乳动物(例如，人，猴子，牛，猪，马，狗，猫，绵羊，山羊，兔子，仓鼠，豚鼠，小鼠，大鼠等)，鸟类(如鸡，等)等。优选为哺乳动物，更优选为人。

作为样品的来自于试验动物的生物学样品并不特别限定，可提及例如：血液，血清，血浆，唾液，尿液，脑脊液等。更优选为血浆或脑脊液。

根据常规方法从实验动物中采集血液，并分离液体成分，由此可制备血清和血浆。可以利用已知的方法例如脊椎穿刺等来采集脑脊液。

可利用已知的方法来检测样品中的S38AA片段。例如，可通过进行下述来检测：Western印迹，凝胶电泳(例如，SDS-PAGE，二维凝胶电泳等)，各种分离和纯化方法(例如，离子交换色谱，疏水色谱，凝胶过滤色谱，亲和色谱，反相色谱，等电点色谱，毛细管电泳等)，离子化法(例如，电子冲击离子化法，场解吸法，二次离子化法，高速原子轰击法，基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)法，电喷射离子化法等)，质谱仪(例如，双聚焦质谱仪，四级质谱仪，飞行时间质谱仪，傅里叶变换质谱仪，离子回旋加速质谱仪等)等。

此外，还可以利用已知的免疫化学方法来检测S38AA片段(浊度测定法，竞争结合法，免疫测定法，化学荧光法，化学荧光电子法，三明治法等)。对于这些免疫化学方法，可以参考如下文献，例如：HiroshiIrie编写的“Radioimmunoassay”(Kodansha，1974年出版)，HiroshiIrie编写的“radioimmunoassay(sequel)”(Kodansha，1979年出版)，EijiIshikawa等编写的“EnzymeImmunoassay”(第三版，Igaku-Shoin，1987年出版)，“MethodsinENZYMOLOGY”，第121卷(ImmunochemicalTechniques(PartI：HybridomaTechnologyandMonoclonalAntidodies))(AcademicPress出版)等等。

能够特异性检测S38AA的抗S38AA抗体的实例包括“1、用于确定阿尔茨海默病的本发明的试剂”中详述的抗S38AA抗体。

接着，根据检测到的S38AA片段的浓度，可以检测阿尔茨海默病。如下述的实施例2所示，阿尔茨海默病患者以及疑似阿尔茨海默病患者脑脊液中S38AA片段的浓度要高于正常人，并且阿尔茨海默病患者血浆中S38AA片段的浓度也高于正常人。基于S38AA片段浓度与阿尔茨海默病间的正相关，当样品中S38AA片段的浓度高时，可以作出阿尔茨海默病的诊断。

此外，即便是对于正常人，相比于人ApoE3基因型组，作为阿尔茨海默病的敏感等位基因的ApoE4携带者组(阿尔茨海默病高风险组)在脑脊液中也显示出更高的S38AA片段浓度。相反，相比于人ApoE3基因型组，作为阿尔茨海默病的抗性等位基因的ApoE2携带者组在脑脊液中显示出较低的S38AA片段浓度。因此，样品中S38AA片段的高浓度可被判定为在将来患上阿尔茨海默病的可能性高。

除了S38AA片段之外，通过测定阿尔茨海默病其它诊断标记物的变化，本发明的确定方法能够更精确地确定阿尔茨海默病。阿尔茨海默病的其它诊断标记物的实例包括已知的标记物，例如淀粉样蛋白β(Aβ40，Aβ42)，磷酸化tau蛋白等等。这些标记物都能够根据常规熟知的检测方法来检测。

4、寻找能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质的方法

本发明还提供了寻找能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质的方法以及可通过该方法得到的物质，所述方法包括评价试验物质是否抑制S38AA片段的产生。在本发明的寻找方法中，将下调S38AA片段产生的物质选择作为治疗或预防阿尔茨海默病的物质。

可供于本发明的寻找方法的试验物质可以是任何已知的或新的化合物。其实例包括核酸，碳水化合物，脂质，蛋白质，肽，有机低分子化合物，利用组合化学技术产生的化合物文库，随机肽文库，源自微生物、动物和植物、海洋生物等的天然成分，等等。

本发明的寻找方法包括如下步骤：

(1)使试验物质与允许测定S38AA片段产生的细胞接触；

(2)测定与试验物质接触的细胞中S38AA片段的产生量，并将该产生量与没有接触试验物质的对照细胞中S38AA片段的产生量进行比较；以及

(3)基于上述(2)的比较结果，选择下调S38AA片段产生量的试验物质作为能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质。

用于本发明的寻找方法的“细胞”是指允许评估测定靶标、即S38AA片段的产生水平的细胞。该细胞的实例包括能够天然产生测定靶标S38AA片段的细胞，能够通过刺激而产生S38AA片段的S38AA表达细胞，以及能够产生S38AA片段的基因工程细胞。

测定靶标、即能够天然产生S38AA片段的细胞并不特别限定，作为此类细胞，可使用哺乳动物(例如，人，小鼠等)的原代培养细胞，由所述原代培养细胞诱导产生的细胞系等。

已知S38AA在U251细胞和SHSY-5Y细胞中表达，也在BE(2)-C细胞和SK-N-MC细胞中表达。此外，也可以利用已知的技术来制作使S38AA或具有FLAG标签的标记化S38AA等过表达的基因工程细胞。通过培养，S38AA从S38AA表达细胞中切断，并释放出所产生的S38AA片段。当产生的S38AA片段量小时，可通过适宜地在易于引起S38AA切断的条件下培养来测定S38AA片段的产生。

易于引起S38AA切断的条件的实例包括：在葡萄糖缺失的培养基或者含有已知在生理上刺激大脑的物质的培养基中进行培养。此类物质的具体实例包括细胞因子，例如TNFα，干扰素-γ，白介素-1，白介素-6等，淀粉样蛋白β或其聚集体等。

在培养基中使试验物质与允许测定S38AA片段产生的细胞接触。根据允许测定S38AA片段产生的细胞来选择合适的培养基。其实例包括：最低基础培养基(MEM)，含有约5-20％的胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基等。以同样的方式来适宜确定培养条件。例如，培养基的pH为约6-约8，培养温度通常为约30-约40℃，培养时间为约0.1-约72小时。

根据项目(3、用于确定阿尔茨海默病的方法)中描述的方法，通过测定释放在细胞培养上清液中的S38AA片段的量，可以测定S38AA片段的产生量。

可优选基于是否存在显著性差异来比较产生量。可以在与试验物质进行了接触的细胞中的S38AA片段产生量的测定之前或同时，对没有与试验物质接触的对照细胞中的S38AA片段产生量进行测定。

因此，通过比较而得到的下调S38AA片段产生量的物质被选择作为能够治疗或预防阿尔茨海默病的试剂。

通过本发明的寻找方法获得的化合物可以用作候选物质，用于开发阿尔茨海默病的新型的治疗或预防试剂。

实施例

以下通过参考实施例对本发明进行说明，但本发明并不受实施例的任何方式的限定。

参考实施例1脑组织中S38AA表达量的研究

使用保藏在瑞典脑银行(BrainPower)中的脑切片，其使用是经过Karolinska研究院伦理委员会允许的。从用福尔马林固定、并用石蜡包埋的脑组织块中切出海马切片(5微米厚)，粘附至盖玻片上。用二甲苯-醇进行去石蜡化和亲水处理后，在DivaDecloaker(BIOCAREMEDICAL)中于121℃加热25分钟以恢复抗原。冷却之后，用稀释在Tris缓冲盐水(pH7.6)中的3％山羊全血清封闭非特异性反应，之后将在Tris缓冲盐水中稀释了200倍的抗38AA抗体(产品目录号：HPA024631，AtlasAntibodies)与样本在4℃下孵育过夜。用Tris缓冲盐水洗涤样本之后，将样本与稀释了300倍的生物素化山羊抗兔IgG抗体在室温下孵育1小时。之后，为了进行显色，用VectastainEliteABS试剂盒(VectorLaboratories)处理样本30分钟，并进一步用3-3-二氨基联苯胺-4HCl(DAB/H₂O₂)进行显色。对于反向染色，使用了苏木精。

图1展示了正常例子的代表性海马CA1区域的免疫染色图像，图2展示了阿尔茨海默病确定例中代表性的海马CA1区域的免疫染色图像。图中标尺的长度相当于200μm。如图1的箭头所示，细胞中染色较深的部分表示S38AA的强表达。在重度阿尔茨海默病病例中，在神经细胞中几乎找不到染色。由于所使用的抗S38AA抗体的识别位点是S38AA异构体1和S38AA异构体2的膜外结构域，因此该结果显示的是在确诊阿尔茨海默病的病例中，海马CA1区域中S38AA膜外结构域的降低。由这些结果明确，在重度阿尔茨海默病病例中，S38AA表达量急剧下降。

参考实施例2利用重氧标记法对海马CA1锥形细胞中S38AA蛋白质的定量质 谱分析

在获得Karolinska研究院伦理委员会的使用批准之后，由储藏于瑞典脑银行(BrainPower)的患者死后脑制备冷冻切片，根据Aoki等已经报道的方法(Neuroreport(2008)19：1085-9)通过激光捕获法回收海马CA1锥形细胞。

从阿尔茨海默病确诊患者和非阿尔茨海默病患者中分离并收集海马CA1锥形细胞(各12000个细胞)。回收于管中的细胞用1μL0.5％的RapiGestSF(Waters)溶液裂解，在95℃下孵育90分钟。然后，通过真空离心系统除去溶剂，再加入2μL的4mM氯化钙，1％RapiGestSF，360mM碳酸氢钠混合溶液和5μL的蒸馏水，将混合物超声处理5分钟。为了对来源于神经细胞的蛋白质进行限制性胰蛋白酶水解，进一步加入3μL的0.1mg/mL的胰蛋白酶，将混合物在37℃下孵育24小时。之后，收集到样品(1μL)，并在4-12％的梯度SDS-PAGE凝胶中电泳，进行银染色，确认限制性分解的完成。将来源于阿尔茨海默病确诊患者的限制性分解样品用重氧进行标记。该方法的详细步骤在下面描述。

在限制性胰蛋白酶水解后，加入浓盐酸来化学分解RapiGestSF。通过在13000rpm离心10分钟使分解产物沉淀，并分离上清。将得到的上清吸附到ZipTipC₁₈(Millipore)柱，用0.3％的甲酸溶液洗涤三次，用80％乙腈/0.3％甲酸溶液洗脱来进行纯化。通过真空离心系统除去纯化样品中的溶剂，将残留物重新溶解于0.3M的醋酸钠氘溶液(pH5.2，1.7μL)，50mM的氯化钙(1μL)和重氧水(47.3μL)中。然后向其中加入0.5mg/mL的胰蛋白酶(TrypsinGold，Promega，1μL)，混合物在37℃下孵育48小时。为了终止标记反应，加入稀释于重氧水中的5％甲酸溶液(8μL)，混合物在95℃下孵育90分钟。终样品保藏在-80℃下。来源于非阿尔茨海默病患者的样品与来源于阿尔茨海默病确诊患者的样品用相同的方式进行处理，使用蒸馏水代替重氧水。将来源于阿尔茨海默病确诊患者的重氧化样品与来源于非阿尔茨海默病患者的样品各20μL等量混合，并注射至分析柱中(Zorbax300SB，0.1×150mm，AgilentTechnologiesInc.)，之后立即进行质谱分析。作为流动相，使用的是0.1％乙酸(流动相A)和0.1％乙酸-甲醇(流动相B)，其中使用了在90分钟内线性地将流动相B的浓度从5％增加至75％，然后在95％的流动相B中保持不变10分钟的梯度程序。作为质谱仪，使用了ThermoFisher，LTQ-Orbitrap系统。质量测定范围设定为400-2000m/z。根据所得数据，用Mascot软件版本2.2和Swiss-Prot数据库(release55)来鉴定肽，并且进一步用Xome软件(MitsuiKnowledgeIndustryCo.，Ltd.)进行定量分析。Mascot软件的分析参数如下设定。使用单一同位素质量进行分析，肽质量公差设定为10ppm，片段离子MS/MS公差设定为0.8Da。作为消化酶，具体使用胰蛋白酶，漏切数目最大设定为1。分析靶标仅为C末端双标记，并且允许甲硫氨酸氧化。

根据上述的蛋白质组学分析，成功鉴定出S38AA。此外，还研究了阿尔茨海默病患者(AD)和非阿尔茨海默病患者(对照)之间S38AA表达量的差异(表1)。MASCOT肽检索所确定的序列对应于S38AA异构体1的膜外结构域(SEQIDNO：2所示氨基酸序列的761-770位氨基酸区域)，肽的鉴定在统计学上是显著性的。

相比于非阿尔茨海默病对照，阿尔茨海默病患者锥形细胞中的S38AA膜外结构域的量降低至1/20。在免疫组织学研究中使用的抗体的识别位点是膜外结构域，由于即便在那种情况下表达量也降低，因而该结果与免疫组织学研究得到的结果相符。即，表明在阿尔茨海默病患者海马CA1区域的神经细胞中，至少S38AA膜外结构域是降低的。

表1

实施例1脑脊液中S38AA片段的检测及分子量预测

使用阿尔茨海默病确诊患者(10例，病理得分9-12：Swedish脑银行中的病理得分)，阿尔茨海默病疑似患者(6例，病理得分3-7)和正常患者(11例，病理得分0-4)的脑脊液。根据Alafuzoff等的评估方法来进行打分(ActaNeuropathol(Berl)(1987)74：209-225)。确定病理时考虑到了病理得分以及临床医生进行的死前检查。通过向3体积的脑脊液中加入1体积的LDS样品缓冲液(Invitrogen)制备SDS样品，混合物在70℃下加热10分钟。利用制备好的样品，在4-12％的梯度SDS-PAGE凝胶上分离S38AA。之后，使用MiniTrans-Blot系统(Bio-RadLaboratories)将分离的总蛋白转移至PVDF膜上，并进行抗体染色的步骤。在用抗体检测S38AA之前，用含有5％脱脂奶粉的磷酸缓冲盐水(pH7.4)封闭非特异性反应，在室温下封闭1小时。用磷酸缓冲盐水将一抗(产品目录号：HPA024631，AtlasAntibodies)稀释1000倍，在4℃下孵育过夜。之后，将膜与5000倍稀释的HRP-连接山羊抗兔IgG抗体(GEhealthcare)在室温下共同孵育1小时，充分洗涤并用SuperSignal(注册商标)WestDura(ThermoFisherScientific)处理，以使之显色。

可以通过Western印迹来检测来自于脑脊液中S38AA片段的信号，并发现在阿尔茨海默病中该信号有上升趋势(图4)。所检测到的分子量是76-102kDa，对应于S38AA异构体2的全长。然而，异构体2是十次跨膜蛋白，全长蛋白分泌在脑脊液中的可能性非常低。因此，检测了S38AA的部分切断和分泌的可能性。

S38AA异构体1的氨基酸序列可从UniProtKB数据库的注册信息中获得。用TMHMM软件预测其膜外区域，预测得到的膜外区域展示在方框中(图3)。膜外区域由从399位至第1119位的721个氨基酸组成，其分子量经计算为约76kDa。另一方面，由Western印迹估算脑脊液中S38AA的分子量为约76-102kDa(图4)，这与膜外区域的预测分子量大小几乎吻合。从分子量方面来看，这表明脑脊液中检测到的S38AA即包含异构体1的膜外区域的(多)肽(S38AA片段)。

实施例2患者背景，脑脊液中S38AA片段的定量分析及其与APOE等位基因 的关系

对于定量分析，预先将数例的脑脊液混合，用作所有分析的标准脑脊液。所有样品都用相同的方式处理，对于每个SDS-PAGE凝胶都绘出标准曲线。用与实施例1中相同的方法来对S38AA片段进行Western印迹的定量分析。用LAS3000图像分析器(FujifilmCorp.)对来自S38AA抗体的信号强度进行图像分析，并用MultiGaugeV3.0软件(FujifilmCorp.)进行定量。通过标准曲线标准化每个信号强度，该标准曲线是由同时转移至每个膜上的标准脑脊液制备的。

至于患者背景，从保护个人信息的角度，在本试验中给予患者特定的号码，该号码与瑞典脑银行中使用的参考号码并不匹配。根据瑞典脑银行的标准操作手册来分析APOE基因型。27例患者的基因型都是已知的(表2)，使用它们来进行分析。

表2

N.D.：未确定

得分：Alafuzoff等的评估方法(ActaNeuropathol(1987)74：209-225)。

如图5所示，可知在阿尔茨海默病中，脑脊液中的S38AA片段的量上升，即便在阿尔茨海默病疑似患者中，S38AA片段的量也趋于上升。这表明，S38AA片段从阿尔茨海默病的早期或潜伏期开始增高，在阿尔茨海默病确诊患者中观察到了明显的增高。

所有患者都根据APOE基因型进行分类(4种类型：ApoE2/3，ApoE3/3，ApoE3/4，ApoE4/4，见表2)，每组的脑脊液中的S38AA量在图表中显示(图6)。在具有ApoE4的纯合患者(ApoE4/4)中，S38AA片段的量特别显著地增高。ApoE4是阿尔茨海默病的发病风险基因，而ApoE2则被认为是阿尔茨海默病的发病抗性因子。即，图6中显示，APOE基因型的阿尔茨海默病发病风险因子与脑脊液中S38AA片段的量相关。

至于11例非阿尔茨海默病患者中S38AA片段的量与APOE基因型的关系，如图7所示，脑脊液中S38AA片段的量以ApoE2/3，ApoE3/3，ApoE3/4的顺序增加。

这些相关表明，脑脊液中的S38AA与阿尔茨海默病将来的发病风险相关，进一步暗示即便是在潜伏期阿尔茨海默病的患者中，S38AA可能会成为评估阿尔茨海默病的将来发病风险的生物标记物。虽然认为阿尔茨海默病的早期检测和早期治疗是重要的，但是还未找到能够早期确定阿尔茨海默病的诊断标记物。因此，对于疑似阿尔茨海默病的检测非常有用。

实施例3确定脑脊液中的S38AA片段包含S38AA膜外区域

(1)基于用于免疫沉淀的抗体来确认S38AA片段

向来自于阿尔茨海默病患者的脑脊液(500μL)中加入用于免疫沉淀的抗S38AA抗体(HPA023161或HPA021374，AtlasAntibodies，2μL)，混合物在4℃下孵育20小时，之后与蛋白GMagSepharose(GEhealthcare)在4℃下共同孵育1小时，由此使S38AA片段免疫沉淀。之后，向磁珠中加入LDS样品缓冲液(Invitrogen，10μL)，以提供用于SDS-PAGE的样品(蛋白GMagSepharose结合组分)。另外，取出9μL没有被蛋白GMagSepharose沉淀的上清组分，加入LDS样品缓冲液(3μL)以提供未结合组分的样品(未被蛋白GMagSepharose结合的组分)。

用与实施例1中相同的方式进行SDS-PAGE，之后用HPA024631作为一抗进行Western印迹。

结果，在用于免疫沉淀的HPA023161和HPA021374中，通过Western印迹均可检测到一个免疫沉淀物，其分子量与在脑脊液中发现的物质相似(图8：结合泳道)。另一方面，在免疫沉淀物的上清中并没有检测到S38AA片段(图8：未结合泳道)。

由于用于产生抗体HPA023161和HPA021374的肽的氨基酸序列分别是：MKPKQVSRDLGLAADLPGGAEGAAAQPQAVLRQPELRVISDGEQGGQQGHRLDHGGHLEMRKA(SEQIDNO：4；对应于SEQIDNO：2中的926-988位氨基酸区域)和PVPHDKVVVDEGQDREVPEENKPPSRHAGGKAPGVQGQMAPPLPDSEREKQEPEQGEVGKRPGQAQALEEAGDLPEDPQKVPEADGQPA(SEQIDNO：5；对应于SEQIDNO：2中500-588位氨基酸区域)，因而表明，至少脑脊髓中的S38AA片段包含作为这些S38AA膜外结构域序列的一部分的氨基酸序列。

(2)通过鸟枪法MS分析来确认S38AA片段

为了展示实施例3(1)的免疫沉淀样品包含S38AA膜外结构域，向两种免疫沉淀样品中加入MilliQ水(90μL)，1M的Tris缓冲液(pH8，5μL)，尿素(48mg)和0.5M的二硫苏糖醇(1μL)，混合物在30℃下孵育2小时。之后，加入0.5M的碘乙酰胺(2μL)，混合物在室温下处理1小时以使硫醇残基烷基化。之后，加入50mM的碳酸铵(750μL)，加入胰蛋白酶(Promege，2μg)，混合物在37℃下孵育过夜，得到胰蛋白酶消化物。用三氟醋酸处理所得到的胰蛋白酶消化物，以将pH降低至1-2，根据操作手册用TopTip200柱(GlygenCorp.)进行纯化。

用HPA023161或HPA021374对胰蛋白酶消化物进行免疫沉淀，将产物溶解于0.1％的三氟醋酸溶液中(20μL)，将其中的5μL注射进分析柱(Zorbax300SB，0.1×150mm，AgilentTechnologies)中。对于分析的流动相，使用0.1％的甲酸(流动相A)和0.1％甲酸-甲醇(流动相B)。使用在30分钟内将流动相B的浓度线性地从5％增加至75％，之后为98％的流动相B(31分钟)，并维持5分钟(36分钟)的梯度程序。所使用的质谱仪是ThermoFisher，LTQvelos系统。质量测定范围设定为400-1400m/z。利用所得数据，使用Mascot软件2.2版本和Swiss-Prot数据库(20110804)来鉴定肽。

Mascot软件的分析参数条件如下设定；

选择单一同位素质量

肽质量公差：15Da

片段离子MS/MS公差：0.8Da

消化酶：特定为胰蛋白酶

漏切数目：最大为1

甲硫氨酸氧化：允许

基于HPA023161和HPA021374的免疫沉淀物的鸟枪法MS分析结果是，成功鉴定出共计6个来源于S38AA膜外结构域的肽序列(图3，下划线部分，SEQIDNOs：6-11)。因此，表明免疫沉淀物确实包含S38AA膜外结构域。

实施例4血浆中S38AA片段的检测及分子量预测

研究了在人血浆中是否也能检测到S38AA片段。从阿尔茨海默病患者和非阿尔茨海默病患者分离出肝素血浆。将PureProteome白蛋白去除磁珠(Millipore，500μL)和蛋白GMagSepharose(GEhealthcare，60μL)置于Eppendorf离心管中，用磷酸缓冲盐水洗涤。之后，向混合的磁珠中加入血浆(20μL)和磷酸缓冲盐水(60μL)，混合物在4℃下孵育2小时。用SDS-PAGE确定所获得的血浆中没有白蛋白和免疫球蛋白。向该样品(60μL)中加入LDS样品缓冲液(Invitrogen，20μL)以得到SDS-PAGE用样品，利用与上述实施例3中相同的方式，用HPA024631作为一抗通过Western印迹对该样品进行分析。

结果如图9所示，观察到被认为与脑脊液中的情形具有相同分子量的条带，相应条带的量在阿尔茨海默病患者中增大。

因此，S38AA片段也存在于人血浆之中，并且表明相比于正常人，S38AA片段的量在阿尔茨海默病患者的血浆中增加。

实施例5培养细胞上清中产生的S38AA片段的检测实施例1

在含有10％胎牛血清的D-MEM(Invitrogen)中培养BE(2)-C细胞、SK-N-MC细胞、SHSY-5Y细胞和SHSY-5Y(APP)细胞(通过将人APP基因引入SHSY-5Y细胞所得到的细胞系)2天，然后，回收培养基。大鼠胚胎原代神经细胞在包含B27的Neurobasal培养基(Invitrogen)中培养7天，回收培养基。向各回收的培养基(1mL)中加入HPA021374抗体，混合物在4℃下孵育20小时。之后，加入蛋白GMagSepharose(30μL)，并将混合物在4℃下孵育2小时。用PBS(-)洗涤磁珠，加入4倍稀释的LDS样品缓冲液(20μL)，得到SDS-PAGE用样品。用与前述实施例3中相同的方式，利用HPA024631作为一抗通过Western印迹对样品进行分析。

结果，观察到被认为与脑脊液和血浆中的情形均具有相同分子量的条带。因此，表明与人神经细胞类似，在培养细胞和大鼠原代培养细胞中也都能够检测到S38AA的切断，即S38AA片段的产生和分泌。

实施例6培养细胞上清中产生的S38AA片段的检测实施例2

构建表达载体，该表达载体包含在S38AA的C末端添加有Flag-标签(DYKDDDDK；SEQIDNO：12)的DNA序列，将该载体引入SHSY-5Y细胞中。48小时后，回收培养基(75μL)，加入LDS样品缓冲液(25μL)，得到SDS-PAGE用样品。本次使用抗FlagM2单克隆抗体(Sigma-AldrichCorp.)作为一抗通过Western印迹对样品进行分析。

结果，与实施例5不同，未经免疫沉淀就检测到与脑脊液和血浆中的情形都具有相同分子量的条带。因此表明，即便是在培养细胞的上清中，基因引入也可使S38AA片段更容易被检测到。

产业实用性

根据本发明，提供阿尔茨海默病的确定试剂和确定方法，其不仅能确定患有阿尔茨海默病的患者，还能确定在将来具有较高风险患上阿尔茨海默病的患者。

另外，根据本发明，还提供筛选治疗或预防阿尔茨海默病的物质的方法。

本申请基于在日本申请的专利申请No.2010-293891(申请日：12月28日，2010年)，该申请的内容被全文引入本文。

序列表

<110>DainipponSumitomoPharmaCo.,Ltd.

<120>阿尔茨海默病的诊断试剂盒诊断方法

<130>091796

<150>JP2010-293891

<151>2010-12-28

<160>12

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>4303

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(376)..(3735)

<400>1

cgccgcggcggcagctgagttgggctgaggtgtccctagctggctctgcggctcttccgg60

gtctgggctcggagattcacaggcggcccgcgaggccgagcgagggacgcatggccctga120

ggcggccgcagggcttggcggggtccggaggttgacctcgcccccgcagccggccttcga180

ggctgcctcctccaggcagcctctggggcccgcgcccgcgcctgctcaggctcccgtgtt240

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415420425

tcagcccaggatccggttgtggccgtggctgaggatggccgggagaag1707

SerAlaGlnAspProValValAlaValAlaGluAspGlyArgGluLys

430435440

ccgaagctgccgaaggagagagaggagctggagcaggcccagatcaag1755

ProLysLeuProLysGluArgGluGluLeuGluGlnAlaGlnIleLys

445450455460

gggcccgtggatgtgcctggacgggaagatggcaaggaggcaccggag1803

GlyProValAspValProGlyArgGluAspGlyLysGluAlaProGlu

465470475

gaggcacagctcgatcgccctgggcaagggattgctgtgcctgtgggc1851

GluAlaGlnLeuAspArgProGlyGlnGlyIleAlaValProValGly

480485490

gaggcccaccgccacgagcctcctgttcctcacgacaaggtggtggta1899

GluAlaHisArgHisGluProProValProHisAspLysValValVal

495500505

gatgaaggccaagaccgagaggtgccagaagagaacaaacctccatcc1947

AspGluGlyGlnAspArgGluValProGluGluAsnLysProProSer

510515520

agacacgcgggcggaaaggctccaggggtccagggccagatggcgccg1995

ArgHisAlaGlyGlyLysAlaProGlyValGlnGlyGlnMetAlaPro

525530535540

cctctgcccgactcagaaagagagaaacaagagccggagcagggagag2043

ProLeuProAspSerGluArgGluLysGlnGluProGluGlnGlyGlu

545550555

gttgggaagaggcctggacaggcccaggccttggaggaggcgggtgat2091

ValGlyLysArgProGlyGlnAlaGlnAlaLeuGluGluAlaGlyAsp

560565570

cttcctgaagatccccagaaagttccagaagcagatggtcagccagct2139

LeuProGluAspProGlnLysValProGluAlaAspGlyGlnProAla

575580585

gtccagcctgcaaaggaggacctggggccaggagacaggggcctgcat2187

ValGlnProAlaLysGluAspLeuGlyProGlyAspArgGlyLeuHis

590595600

cctcggccccaggcagtgctgtctgagcagcagaacggcctggcggtg2235

ProArgProGlnAlaValLeuSerGluGlnGlnAsnGlyLeuAlaVal

605610615620

ggtggaggggaaaaggccaaggggggaccgccgccaggcaacgccgcc2283

GlyGlyGlyGluLysAlaLysGlyGlyProProProGlyAsnAlaAla

625630635

ggggacacagggcagcccgcagaggacagcgaccacggtgggaagcct2331

GlyAspThrGlyGlnProAlaGluAspSerAspHisGlyGlyLysPro

640645650

cccctcccagcggagaagccggctccagggcctgggctgccgcccgag2379

ProLeuProAlaGluLysProAlaProGlyProGlyLeuProProGlu

655660665

cctcgcgagcagagggacgtggagcgagcgggtggaaaccaggcggcc2427

ProArgGluGlnArgAspValGluArgAlaGlyGlyAsnGlnAlaAla

670675680

agccagctggaggaagctggcagggcggagatgctggaccacgccgtc2475

SerGlnLeuGluGluAlaGlyArgAlaGluMetLeuAspHisAlaVal

685690695700

ctgcttcaggtgatcaaagaacagcaggtgcagcaaaagcgcttgctg2523

LeuLeuGlnValIleLysGluGlnGlnValGlnGlnLysArgLeuLeu

705710715

gaccagcaggagaagctgctggcggtgatcgaggagcagcacaaggag2571

AspGlnGlnGluLysLeuLeuAlaValIleGluGluGlnHisLysGlu

720725730

atccaccagcagaggcaggaggacgaggaggataaacccaggcaggtg2619

IleHisGlnGlnArgGlnGluAspGluGluAspLysProArgGlnVal

735740745

gaggtgcatcaagagcccggggcagcggtgcccagaggccaggaggcc2667

GluValHisGlnGluProGlyAlaAlaValProArgGlyGlnGluAla

750755760

cctgaaggcaaggccagggagacggtggagaatctgcctcccctgcct2715

ProGluGlyLysAlaArgGluThrValGluAsnLeuProProLeuPro

765770775780

ttggaccctgtcctcagagctcctgggggccgccctgctccatcccag2763

LeuAspProValLeuArgAlaProGlyGlyArgProAlaProSerGln

785790795

gaccttaaccagcgctccctggagcactctgaggggcctgtgggcaga2811

AspLeuAsnGlnArgSerLeuGluHisSerGluGlyProValGlyArg

800805810

gaccctgctggccctcctgacggcggccctgacacagagcctcgggca2859

AspProAlaGlyProProAspGlyGlyProAspThrGluProArgAla

815820825

gcccaggccaagctgagagatggccagaaggatgccgcccccagggca2907

AlaGlnAlaLysLeuArgAspGlyGlnLysAspAlaAlaProArgAla

830835840

gctggcactgtgaaggagctccccaagggcccggagcaggtgcccgtg2955

AlaGlyThrValLysGluLeuProLysGlyProGluGlnValProVal

845850855860

ccagaccccgccagggaagccgggggcccagaggagcgcctcgcagag3003

ProAspProAlaArgGluAlaGlyGlyProGluGluArgLeuAlaGlu

865870875

gaattccctgggcaaagtcaggacgttactggcggttcccaagacagg3051

GluPheProGlyGlnSerGlnAspValThrGlyGlySerGlnAspArg

880885890

aaaaaacctgggaaggaggtggcagccactggcaccagcattctgaag3099

LysLysProGlyLysGluValAlaAlaThrGlyThrSerIleLeuLys

895900905

gaagccaactggctcgtggcagggccaggagcagagacgggggaccct3147

GluAlaAsnTrpLeuValAlaGlyProGlyAlaGluThrGlyAspPro

910915920

cgcatgaagcccaagcaagtgagccgagacctgggccttgcagcggac3195

ArgMetLysProLysGlnValSerArgAspLeuGlyLeuAlaAlaAsp

925930935940

ctgcccggtggggcggaaggagcagctgcacagccccaggctgtgtta3243

LeuProGlyGlyAlaGluGlyAlaAlaAlaGlnProGlnAlaValLeu

945950955

cgccagccggaactgcgggtcatctctgatggcgagcagggtggacag3291

ArgGlnProGluLeuArgValIleSerAspGlyGluGlnGlyGlyGln

960965970

cagggccaccggctggaccatggcggtcacctggagatgagaaaggcc3339

GlnGlyHisArgLeuAspHisGlyGlyHisLeuGluMetArgLysAla

975980985

cgcgggggggaccatgtgcctgtgtcccacgagcagccgagaggcggg3387

ArgGlyGlyAspHisValProValSerHisGluGlnProArgGlyGly

9909951000

gaggacgctgctgtccaggagcccaggcagaggccagagccagag3432

GluAspAlaAlaValGlnGluProArgGlnArgProGluProGlu

100510101015

ctggggctcaaacgagctgtcccggggggccagaggccggacaat3477

LeuGlyLeuLysArgAlaValProGlyGlyGlnArgProAspAsn

102010251030

gccaagcccaaccgggacctgaaactgcaggctggctccgacctc3522

AlaLysProAsnArgAspLeuLysLeuGlnAlaGlySerAspLeu

103510401045

cggaggcgacggcgggaccttggccctcatgcagagggtcagctg3567

ArgArgArgArgArgAspLeuGlyProHisAlaGluGlyGlnLeu

105010551060

gccccgagggatggggtcatcattggccttaaccccctgcctgat3612

AlaProArgAspGlyValIleIleGlyLeuAsnProLeuProAsp

106510701075

gtccaggtgaacgacctccgtggcgccctggatgcccagctccgc3657

ValGlnValAsnAspLeuArgGlyAlaLeuAspAlaGlnLeuArg

108010851090

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GlnAlaAlaGlyGlyAlaLeuGlnValValHisSerArgGlnLeu

109511001105

agacaggcgcctgggcctccagaggagtcctagcacctgctgg3745

ArgGlnAlaProGlyProProGluGluSer

11101115

ccatgagggccacgccagccactgccctcctcggccagcagcaggtctgtctcagccgca3805

tcccagccaaactctggaggtcacactcgcctctccccagggtttcatgtctgaggccct3865

caccaagtgtgagtgacagtataaaagattcactgtggcatcgtttccagaatgttcttg3925

ctgtcgttctgttgcagctcttagtctgaggtcctctgacctctagactctgagctcact3985

ccagcctgtgaggagaaacggcctccgctgcgagctggctggtgcactcccaggctcagg4045

ctggggagctgctgcgtctgtggtcaggcctcctgctcctgccagggagcacgcgtggtc4105

ttcgggttgagctcggccgtgcgtggaggtgcgcatggctgctcatggtcccaacacagg4165

ctactgtgagagccagcatccaaccccacgcttgcagtgactcagaatgataattattat4225

gactgtttatcgatgcttcccacagtgtggtagaaagtcttgaataaacacttttgcctt4285

cacccagaaaaaaaaaaa4303

<210>2

<211>1119

<212>PRT

<213>智人

<400>2

MetThrAlaAlaAlaAlaSerAsnTrpGlyLeuIleThrAsnIleVal

151015

AsnSerIleValGlyValSerValLeuThrMetProPheCysPheLys

202530

GlnCysGlyIleValLeuGlyAlaLeuLeuLeuValPheCysSerTrp

354045

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505560

LysArgArgThrTyrAlaGlyLeuAlaPheHisAlaTyrGlyLysAla

65707580

GlyLysMetLeuValGluThrSerMetIleGlyLeuMetLeuGlyThr

859095

CysIleAlaPheTyrValValIleGlyAspLeuGlySerAsnPhePhe

100105110

AlaArgLeuPheGlyPheGlnValGlyGlyThrPheArgMetPheLeu

115120125

LeuPheAlaValSerLeuCysIleValLeuProLeuSerLeuGlnArg

130135140

AsnMetMetAlaSerIleGlnSerPheSerAlaMetAlaLeuLeuPhe

145150155160

TyrThrValPheMetPheValIleValLeuSerSerLeuLysHisGly

165170175

LeuPheSerGlyGlnTrpLeuArgArgValSerTyrValArgTrpGlu

180185190

GlyValPheArgCysIleProIlePheGlyMetSerPheAlaCysGln

195200205

SerGlnValLeuProThrTyrAspSerLeuAspGluProSerValLys

210215220

ThrMetSerSerIlePheAlaSerSerLeuAsnValValThrThrPhe

225230235240

TyrValMetValGlyPhePheGlyTyrValSerPheThrGluAlaThr

245250255

AlaGlyAsnValLeuMetHisPheProSerAsnLeuValThrGluMet

260265270

LeuArgValGlyPheMetMetSerValAlaValGlyPheProMetMet

275280285

IleLeuProCysArgGlnAlaLeuSerThrLeuLeuCysGluGlnGln

290295300

GlnLysAspGlyThrPheAlaAlaGlyGlyTyrMetProProLeuArg

305310315320

PheLysAlaLeuThrLeuSerValValPheGlyThrMetValGlyGly

325330335

IleLeuIleProAsnValGluThrIleLeuGlyLeuThrGlyAlaThr

340345350

MetGlySerLeuIleCysPheIleCysProAlaLeuIleTyrLysLys

355360365

IleHisLysAsnAlaLeuSerSerGlnValValLeuTrpValGlyLeu

370375380

GlyValLeuValValSerThrValThrThrLeuSerValSerGluGlu

385390395400

ValProGluAspLeuAlaGluGluAlaProGlyGlyArgLeuGlyGlu

405410415

AlaGluGlyLeuMetLysValGluAlaAlaArgLeuSerAlaGlnAsp

420425430

ProValValAlaValAlaGluAspGlyArgGluLysProLysLeuPro

435440445

LysGluArgGluGluLeuGluGlnAlaGlnIleLysGlyProValAsp

450455460

ValProGlyArgGluAspGlyLysGluAlaProGluGluAlaGlnLeu

465470475480

AspArgProGlyGlnGlyIleAlaValProValGlyGluAlaHisArg

485490495

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500505510

AspArgGluValProGluGluAsnLysProProSerArgHisAlaGly

515520525

GlyLysAlaProGlyValGlnGlyGlnMetAlaProProLeuProAsp

530535540

SerGluArgGluLysGlnGluProGluGlnGlyGluValGlyLysArg

545550555560

ProGlyGlnAlaGlnAlaLeuGluGluAlaGlyAspLeuProGluAsp

565570575

ProGlnLysValProGluAlaAspGlyGlnProAlaValGlnProAla

580585590

LysGluAspLeuGlyProGlyAspArgGlyLeuHisProArgProGln

595600605

AlaValLeuSerGluGlnGlnAsnGlyLeuAlaValGlyGlyGlyGlu

610615620

LysAlaLysGlyGlyProProProGlyAsnAlaAlaGlyAspThrGly

625630635640

GlnProAlaGluAspSerAspHisGlyGlyLysProProLeuProAla

645650655

GluLysProAlaProGlyProGlyLeuProProGluProArgGluGln

660665670

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675680685

GluAlaGlyArgAlaGluMetLeuAspHisAlaValLeuLeuGlnVal

690695700

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705710715720

LysLeuLeuAlaValIleGluGluGlnHisLysGluIleHisGlnGln

725730735

ArgGlnGluAspGluGluAspLysProArgGlnValGluValHisGln

740745750

GluProGlyAlaAlaValProArgGlyGlnGluAlaProGluGlyLys

755760765

AlaArgGluThrValGluAsnLeuProProLeuProLeuAspProVal

770775780

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785790795800

ArgSerLeuGluHisSerGluGlyProValGlyArgAspProAlaGly

805810815

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820825830

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835840845

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850855860

ArgGluAlaGlyGlyProGluGluArgLeuAlaGluGluPheProGly

865870875880

GlnSerGlnAspValThrGlyGlySerGlnAspArgLysLysProGly

885890895

LysGluValAlaAlaThrGlyThrSerIleLeuLysGluAlaAsnTrp

900905910

LeuValAlaGlyProGlyAlaGluThrGlyAspProArgMetLysPro

915920925

LysGlnValSerArgAspLeuGlyLeuAlaAlaAspLeuProGlyGly

930935940

AlaGluGlyAlaAlaAlaGlnProGlnAlaValLeuArgGlnProGlu

945950955960

LeuArgValIleSerAspGlyGluGlnGlyGlyGlnGlnGlyHisArg

965970975

LeuAspHisGlyGlyHisLeuGluMetArgLysAlaArgGlyGlyAsp

980985990

HisValProValSerHisGluGlnProArgGlyGlyGluAspAlaAla

99510001005

ValGlnGluProArgGlnArgProGluProGluLeuGlyLeuLys

101010151020

ArgAlaValProGlyGlyGlnArgProAspAsnAlaLysProAsn

102510301035

ArgAspLeuLysLeuGlnAlaGlySerAspLeuArgArgArgArg

104010451050

ArgAspLeuGlyProHisAlaGluGlyGlnLeuAlaProArgAsp

105510601065

GlyValIleIleGlyLeuAsnProLeuProAspValGlnValAsn

107010751080

AspLeuArgGlyAlaLeuAspAlaGlnLeuArgGlnAlaAlaGly

108510901095

GlyAlaLeuGlnValValHisSerArgGlnLeuArgGlnAlaPro

110011051110

GlyProProGluGluSer

1115

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>3

GlyGlnGluAlaProGluGlyLysAlaArg

1510

<210>4

<211>63

<212>PRT

<213>智人

<400>4

MetLysProLysGlnValSerArgAspLeuGlyLeuAlaAlaAspLeu

151015

ProGlyGlyAlaGluGlyAlaAlaAlaGlnProGlnAlaValLeuArg

202530

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354045

GlyHisArgLeuAspHisGlyGlyHisLeuGluMetArgLysAla

505560

<210>5

<211>89

<212>PRT

<213>智人

<400>5

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

ValProGluAlaAspGlyGlnProAla

85

<210>6

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>6

LysValValValAspGluGlyGlnAspArgGlu

1510

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>7

LysLeuLeuAlaValIleGluGluGlnHisLysGlu

1510

<210>8

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>8

ArgSerLeuGluHisSerGluGlyProValGlyArgAsp

1510

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>9

LeuProLysGlyProGluGlnValProValProAspProAlaArgGlu

151015

<210>10

<211>15

<212>PRT

<213>智人

<400>10

ArgLeuAspHisGlyGlyHisLeuGluMetArgLysAlaArgGly

151015

<210>11

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>11

ArgGlyGlyGluAspAlaAlaValGlnGluProArgGln

1510

<210>12

<211>8

<212>PRT

<213>智人

<400>12

AspTyrLysAspAspAspAspLys

15

Claims (12)

1.阿尔茨海默病的确定试剂，其包含抗S38AA抗体。

2.如权利要求1所述的确定试剂，其中所述抗S38AA抗体是识别S38AA膜外结构域的抗体。

3.如权利要求2所述的确定试剂，其中所述S38AA细胞膜外结构域是S38AA异构体1的膜外结构域。

4.确定阿尔茨海默病的试剂盒，其包含如权利要求1-3中任一项所述的确定试剂。

5.确定试验动物中的阿尔茨海默病的方法，其包括对采集自所述动物的样品中的S38AA片段进行检测。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述试验动物是人。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述S38AA片段是来源于S38AA异构体1的片段。

8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述S38AA片段是多肽，该多肽包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。

9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述样品是血液，脑脊液或尿液。

10.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述样品是脑脊液。

11.如权利要求5-10中任一项所述的方法，其中进一步包括检测阿尔茨海默病的一种或多种其它诊断标志物。

12.寻找能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质的方法，其包括如下步骤：

(1)使试验物质与允许测定S38AA片段产生的细胞接触；

(2)测定与试验物质接触的细胞中S38AA片段的产生量，并将该产生量与没有接触试验物质的对照细胞中S38AA片段的产生量进行比较；以及

(3)基于上述(2)的比较结果，选择下调S38AA片段产生量的试验物质作为能够治疗或预防阿尔茨海默病的物质。