TWI521204B - 阿茲海默症之分子指標 - Google Patents

Description

阿茲海默症之分子指標

本發明係關於一種阿茲海默症的早期診斷方法，特別是一種以活性依賴神經保護同源匣蛋白(簡稱ADNP)作為早期評估阿茲海默症依據的診斷方法。

阿茲海默症(Alzheimer’s disease，簡稱AD)係一種神經退化性疾病，好發於65歲以上的人，在臨床組織病理診斷上，AD患者的腦細胞或神經細胞有退化、萎縮及凋亡的情形，例如，患者腦組織中可觀察到類澱粉蛋白(Amyloid β)沉積及神經纖維糾結的病理特徵。

腦組織隨時都有類澱粉蛋白的產生，而正常腦組織具有清除類澱粉蛋白的能力，以保護腦組織不受類澱粉蛋白的沉積而損害腦區正常功能，當清除類澱粉蛋白的速率低於生成類澱粉蛋白的速率時，腦組織中類澱粉蛋白的沉積量越來越多，更加劇了神經纖維糾結的情形，因而破壞腦部的各區域細胞，進而影響其記憶力、注意力、定向力、構圖能力、語言能力、計算力、判斷力、知覺力或情緒控制力等。

目前臨床上習用診斷AD的方法，係以如簡單智能狀態檢查量表(Mini-mental status examination，簡稱MMSE)、臨床失智評分表(Clinical dementia rating，簡稱CDR)、阿茲海默症評估量表(Alzheimer’s disease assessment scale，簡稱ADAS)、阿茲海默症聯合登錄暨研 究組織所設計之試驗(Consortium to establish a registry for Alzheimer’s disease，簡稱CERAD)或認知功能篩檢工具(Cognitive abilities screening instrument，簡稱CASI)等失智症評量方式，初步判斷受測者的精神智能，獲得一評分值，舉例而言，可由如第1表所示之MMSE評分值或CDR評分值評估受測者的認知能力是否有退化的現象。

根據該受測者的認知能力初步評估，可再進行如血液、生化檢查、腦部的電腦斷層掃描(Computer tomography，簡稱CT)或磁振造影(Magnetic resonance imaging，簡稱MRI)等檢查，供醫師判斷該受測者是否罹患AD。

然而，由於AD患者在早期發病時，其行為能力異常的情形較不明顯，無法藉由習用方法加以診斷，往往延誤治療時程。更甚者，即使以CDR判斷為輕度(CDR=1)或中度(CDR=2)AD時，由組織病理及藥理學而言，其腦損傷的程度雖尚不及影響其行為能力，但就給予藥物的時機已稍嫌太遲，由此可知，習用診斷AD的方法靈敏度低，且無法及時給予藥物治療或控制損傷區域的擴張，因 而造成AD患者的病程惡化速度無法受到控制。

再者，當受測者被迫與診斷醫師面對面進行檢測時，可能會對受測者造成緊迫的心理狀態，而影響評估結果；對於高教育程度的受測者而言，其退化程度又較不易區分，相對來說此評估結果無鑑別力，因此，習用診斷AD方法較不具指標性。

此外，MCI族群中每年約有10~15%會轉變成失智症，相較於正常對照組僅有1~2%。由此可知，MCI可視為退化成失智症的過渡時期，且阿茲海默症的發生與年齡具有高度正相關性，特別係該MCI族群於未來有極高的比例會發生AD，然而，習用診斷AD方法卻沒有一種具有指標性的判斷標準，而無法及早發現AD的發生，更無法進行早期AD的初步篩檢，以提早對輕度AD患者、甚至是極早期的AD患者施予適當的治療手段，才能夠延緩AD發病的病程。

有鑑於此，確實有必要提供一種評估AD之檢測方法，係能夠針對可能發生AD的族群(例如65歲以上的人口)進行初步的篩檢，以即早施予適當的治療手段。

本發明之主要目的係提供一種阿茲海默症之分子指標，其係對於早期評估阿茲海默症之高風險族群具有高指標性及靈敏度者。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有： 一種阿茲海默症之分子指標，係以源自於活性依賴神經保護同源匣蛋白(Activity-dependent neuroprotector homeobox protein，簡稱ADNP)之胺基酸片段，作為早期診斷其為阿茲海默症高風險族群之判斷指標。

本發明阿茲海默症之分子指標中，該源自於ADNP之胺基酸片段較佳係包含如SEQ ID NO：1、2、3、4或7所示之胺基酸序列。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之阿茲海默症之分子指標係以源自於「活性依賴神經保護同源匣蛋白(Activity-dependent neuroprotector homeobox protein，簡稱ADNP)」之胺基酸片段，作為早期評估阿茲海默症的分子指標，特別係以「受試者血液或腦脊液(CSF)中ADNP的含量，低於正常人血液或腦脊液中ADNP的含量」作為早期診斷阿茲海默症患者之判斷依據，且本發明ADNP之胺基酸片段係包含如SEQ ID NO：1、2、3、4或7所示之胺基酸序列作為診斷阿茲海默症之高風險族群之分子指標，其中，該SEQ ID NO：1為ADNP之整段序列，而SEQ ID NO：2、3、4或7為ADNP之部分序列。

更詳言之，正常人的腦細胞可表現ADNP，藉由ADNP來抑制腦部的類澱粉蛋白沉積，一但腦部ADNP含量降 低，其類澱粉蛋白的沉積情形加劇，進而導致AD的發生，因此，AD的發生與ADNP的負調控(Down-regulation)具有高度相關性。此外，在發生類澱粉蛋白沉積，但尚未對腦部造成重大影響而影響其行為能力之前，腦部ADNP的含量便已下降，藉由比較正常人與AD患者的ADNP含量，即可用以判斷受試者是否屬於AD之高風險族群。

本發明之阿茲海默症之早期診斷方法所指「正常人」，係指其個人病史上並無失智症相關記錄，且以MMSE、CDR、ADAS、CERAD或CASI等失智症評量方式評估後，判斷為正常的族群。

請參照第1圖所示，係本發明阿茲海默症之早期診斷方法的步驟方塊圖，其包含：一採檢步驟S1及一判斷步驟S2。

該採檢步驟S1，係採取一受試者之檢體，於體外測量該檢體中的ADNP含量，其中，該檢體為血液或腦脊液。更詳言之，腦部的ADNP係主要抑制腦部類澱粉蛋白沉積的作用者，因此，可合理推得藉由擴散作用而存在於血液或腦脊液的ADNP，係能夠作為間接測量腦細胞中ADNP含量的參數。該ADNP含量係指源自於ADNP之胺基酸片段，較佳係包含如SEQ ID NO：1、2、3、4或7所示之胺基酸序列，其中，該SEQ ID NO：1為ADNP之整段序列，而SEQ ID NO：2、3、4或7為ADNP之部分序列。

舉例而言，本實施例係可選擇以西方墨點法(Western blotting)或酵素連結免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)來測量該檢體中的 ADNP含量。

該判斷步驟S2，該受試者檢體之ADNP含量與一正常人的血液或腦脊液檢體之ADNP含量的比值，做為該受試者之一AD風險值，該AD風險值小於0.3者，則判斷該受試者屬於阿茲海默症患者之高風險族群。更詳言之，正常細胞中會表現ADNP，藉由體內的循環及擴散作用，正常人的血液及腦脊液中亦包含有一相對應含量的ADNP，當血液或腦脊液檢體中的ADNP含量減少，則代表腦部抑制類澱粉蛋白沉積的效果變差，則該受試者屬於容易發生阿茲海默症的高風險族群。據此，比較正常人與AD患者之血液或腦脊液檢體中的ADNP含量，係能夠做為判斷該受試者為阿茲海默症的高風險族群的指標。

為證實本發明之阿茲海默症之分子指標確實能夠做為高指標性及高靈敏度之阿茲海默症判斷指標，遂進行以下試驗：(A)西方墨點法、(B)酵素連結免疫吸附法及(C)ADNP部分片段之定性試驗。

(A)西方墨點法

本實施例係由高雄醫學大學神經內科醫師尋找受試者，並根據受試者之個人病史區分成預期患者及正常人，其中有45名為預期患者(經MMSE評量確認為輕度AD患者，年齡為63至84歲，平均年齡為77.2歲)以及20名正常人(無相關失智症病史且經MMSE評量確認為正常人，年齡為55至84歲，平均年齡為72.3歲)之血液，其中，該20名正常人並無任何失智徵狀，且於採血前2週內並未服用阿斯匹靈或任何非類固醇類抗發炎藥物 (nonsteroidal anti-inflammatory)等藥物。

本實施例係分別取得45個預期患者及20個正常人之血液檢體後，在不添加任何抗凝血劑的情況下盡快進行離心作業，該離心作業係於溫度為4℃環境中，以1000×g離心10分鐘，共獲得65個血清樣本，並將該血清樣本儲藏於-20℃。

將上述該65個血清樣本以商用蛋白質定量套組(Bio-Rad Bradford total protein assay kit,Bio-Rad Laboratories,Inc.,Redmond,WA,USA)對各該血清樣本進行蛋白質定量後，將該血清樣本(將其定量至5μg)以一10%之電泳膠(Tris-glycine gel,Mini-Protein cell,Bio-Rad,Hercules,CA)於100伏特3小時進行蛋白質電泳，再將該電泳膠上的蛋白質藉由一蛋白質轉印器(Criterion Blotter,Bio-Rad)於100伏特之電壓下進行轉印60分鐘，使該電泳膠上的蛋白質轉印至PVDF膜(Polyvinyldifluoride membrane，購自Millipore,Bedford,CA)上，接著以一固定液(5克之奶粉定量至100毫升之PBS溶液中，該PBS溶液中含有0.05%之Tween20，且酸鹼值為7.4)，再以一級抗體標定該PVDF膜上的ADNP後，再以二級抗體標定該一級抗體，並以一蛋白質偵測系統(Enhanced chemiluminescence system)偵測，再以一圖片分析軟體(ImageQuant-TL7.0 software,version 2010,Amersham Biosciences)定量該目標蛋白-ADNP；本實施例之一級抗體係選擇為兔抗ADNP抗體(A300-104A,Bethyl,USA，其濃度配製為1μg/ml)與該經固定之PVDF膜於室溫下共 培養18~24小時，該二級抗體係選擇為羊抗兔之IgG抗體(111-035-003,Immuno Research,USA，其濃度配製為1μg/ml)於於室溫下共培養1小時。

請參照第2圖，係本實施45預期患者之血清樣本及20個正常人血清樣本之ADNP蛋白質西方墨點圖，由此可知，正常血清樣本中的ADNP含量係明顯高於預期患者之ADNP含量，且該預期患者的ADNP含量幾乎無法被偵測。以此計算「該預期患者血清樣本之ADNP含量平均值」比「該正常血清樣本之ADNP含量平均值」約為20%，即以本實施例之西方墨點法確認該預期患者的AD風險值約為0.2。

(B)酵素連結免疫吸附法

本實施例係採取45名預期患者及20名正常人之血液，在不添加任何抗凝血劑的情況下對該65個血液樣本盡快進行離心作業，該離心作業係於溫度為4℃環境中，以1000×g離心10分鐘，分別獲得65個血清樣本，並將該65個血清樣本儲藏於-20℃。

將上述該65個血清樣本以商用蛋白質定量套組(Bio-Rad Bradford total protein assay kit,Bio-Rad Laboratories,Inc.,Redmond,WA,USA)對各該血清樣本進行蛋白質定量後，各血清樣本皆以一ELISA套組及一ADNP抗體(ADNP,E9867Hu,Uscn Life Science Inc.,USA)測試其ADNP含量(各血清樣本皆為二重複)，其中，該預期患者血清樣本中有9個樣本的ADNP含量低於偵測極限。

請參照第3圖，係以一ELISA讀取機(Multiskan EX,Thermo scientific,Vantaa,Finland)獲得該45個預期患者之血清樣本及該20個正常血清樣本中ADNP含量後，以XY散佈圖表示各血清樣本之ADNP含量，並分別計算該預期患者血清樣本之ADNP含量平均值為0.43±0.052μg/ml，及該正常血清樣本之ADNP含量平均值為1.53±0.096μg/ml，並以該二平均值計算其AD風險值約為0.28。據此，以本實施例之ELISA所獲得該預期患者之AD風險值係低於0.3。

綜上所述，本實施例之西方墨點法或酵素連結免疫吸附法所獲得之AD風險值皆低於0.3，証實該預期患者之ADNP含量確實與AD具有正相關性，且與正常人之ADNP含量相較，具有顯著差異(p<0.05)。

另請參照第4圖，以接受特徵曲線(Receiver operating characteristic curve，又稱ROC曲線)分析該預期患者與該正常人的ADNP含量關係落於95%信賴區間中，其值為0.972，亦代表本發明之ADNP確實可作為判斷該預期患者屬於AD高風險族群的分子指標，達到提早評估一預期患者的AD罹患風險，進而達到及早預防AD病徵的發生，並達到抑制AD進程之功效。

(C)ADNP部分片段之定性試驗

本實施例係取45名預期患者之血液樣本，以前述試驗(A)或(B)之離心作業及蛋白質定量處理，獲得各該預期患者之血清樣本，藉由二維電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，簡稱2DE)分析各該血清樣本中的蛋白質。

本實施例之IEF電泳條(pH4-7,IPGphor,Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)係置於電壓環境下(30V下16小時，500V下1小時，1000V下1小時，8000V下4小時，總功率為34k V-hr)進行第一維之等電法電泳分離，該第一維之等電法電泳係包含有二階段，第一階段之緩衝溶液包含6M尿素、30%之甘油、2%之SDS、50mM之Tris-HCl(pH8.8)及1%(w/v)之Dithiothreitol；該第二階段之緩衝溶液係將1%(w/v)之Dithiothreitol替換為2.5%(w/v)之iodoacetamide。再將該IEF電泳條移至一8-16%之梯度SDS-PAGE膠體進行第二維電泳，完成電泳後再以銀染標記膠體上的蛋白質。

請參照第5圖，係以上述二維電泳法所獲得預期患者血清樣本的2DE電泳圖，以ImageMaster 2D(Version 2002.1,Amersham Biosciences)將預期患者及正常血清樣本之2DE電泳圖進行比較，並分析該預期患者及正常的血清樣本的2DE電泳圖上的數個差異墨點(Spot)，如箭頭標示處，其中該差異墨點P01特別係於正常血清樣本中有表現，而預期患者之血清樣本中之表現量降低之差異墨點。

本實施例以HPLC-ESI-MS/MS對該差異墨點P01所含有的蛋白質進行定性，再根據胺基酸序列以Mascot軟體(Version 2.2.1,Matrix Science,London,UK)比對人類蛋白質序列資料庫(Swiss-Prot,Release 52.0 of 22-Dec-09)。

經分析獲得該差異墨點P01中含有3個胺基酸片段，係如SEQ ID NO：2至4所示，該4個胺基酸片段於正常血清樣本中的表現量，確實高於該預期患者之血清樣本中 的表現量，且具有顯著差異(Mascot分數大於50者，p<0.05)。

此外，已知NAP為ADNP的常見具有神經保護作用的重要序列，如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列，NAP雖未於本實施例之試驗(C)中被定性出來，但仍可合理推得NAP亦可作為本發明阿茲海默症之分子指標之一。

綜上所述，本發明確實能夠以ADNP之全部或部份序列作為阿茲海默症之分子指標，並藉由比較一受試者與正常人的血清或腦脊液中，源自於ADNP的全部或部份胺基酸序列之含量，並以該含量計算該受試者的AD風險值，特別係當該受試者之AD風險值小於0.3者，則可判斷為AD的高風險族群，並應持續追蹤該受試者之智能變化情況，並即時施予適當的AD治療藥物。如此，本發明阿茲海默症之早期診斷方法確實能夠提高對於極早期AD患者的靈敏度及篩檢準確率，供醫師準確判斷該受試者的腦損傷情況，及時給予適當的治療藥物，以延緩受試者中可能為AD高風險族群者的AD病程進展。

本發明阿茲海默症之分子指標，係對於早期評估阿茲海默症之高風險族群具有高指標性及靈敏度，能夠達到提高早期評估的準確率之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

S1‧‧‧採檢步驟

S2‧‧‧判斷步驟

第1圖：本發明阿茲海默症之早期診斷方法之步驟方塊圖。

第2圖：本實施例試驗(A)西方墨點法之ADNP蛋白質電泳圖。

第3圖：本實施例試驗(B)ELISA之ADNP含量XY散佈圖。

第4圖：本實施例試驗(B)之ROC曲線關係圖。

第5圖：本實施例試驗(C)預期患者血清樣本之二維電泳圖。

<110>　高雄醫學大學

<120>　一種阿茲海默症之分子指標及一種阿茲海默症的早期診斷方法

<160> 7

<210> 1

<211>

<212> PRT

<213>　人工序列

<220>

<400> SEQUENCE:1

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213>　人工序列

<220>

<400> SEQUENCE:2

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213>　人工序列

<220>

<400> SEQUENCE:3

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> SEQUENCE：4

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> SEQUENCE：7

S1‧‧‧採檢步驟

S2‧‧‧判斷步驟

Claims (1)

1. 一種阿茲海默症之分子指標，係以源自於活性依賴神經保護同源匣蛋白(以下簡稱ADNP)之胺基酸片段，作為早期診斷其為阿茲海默症高風險族群之判斷指標，受試者血液或腦脊液檢體之該ADNP含量較低時，則判斷該受試者屬於阿茲海默症患者之高風險族群；其中，該源自於ADNP之胺基酸片段的胺基酸序列係為如SEQ ID NO：2、3或4所示之序列。