ES2332136T3

ES2332136T3 - Evaluacion de daño neuronal a partir de muestras de sangre.

Info

Publication number: ES2332136T3
Application number: ES04758954T
Authority: ES
Inventors: Gerry Shaw; Brian R. Pike; Sonal S. Tuli
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2024-03-26
Also published as: AU2004229317A1; EP1613204A4; US20160349272A1; AU2004229317B2; JP2006522336A; CA2520945A1; US20040241762A1; HK1085538A1; EP1613204B1; US20100184105A1; EP1613204A2; CA2520945C; DK1613204T3; WO2004091379A3; DE602004022645D1; ATE440286T1; JP4557971B2; WO2004091379A2

Abstract

Un método para detectar una lesión neuronal en un sujeto, comprendiendo el método los pasos de: (a) poner en contacto una muestra de sangre, suero o plasma obtenida del sujeto con un anticuerpo que se une específicamente a NF-H en la muestra; (b) detectar la presencia o cantidad de NF-H en la muestra; y (c) correlacionar la presencia o cantidad de NF-H en la muestra con la lesión neuronal.

Description

Evaluación de daño neuronal a partir de muestras de sangre.

Declaración respecto a la investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con ayuda del gobierno de los Estados Unidos con la subvención número DAMD17-01-0765 concedida por el Ejercito de los Estados Unidos, y la subvención número AA012151-02 concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención.

Campo de la invención

La invención se refiere en general a los campos de la biología y la medicina. Más en particular, la invención se refiere a detectar daño a las células neuronales analizando una muestra biológica para la proteína H de neurofilamentos (NF) liberada de las neuronas dañadas.

Antecedentes

En los últimos años se ha enfocado mucho interés en la detección de proteínas marcadoras específicas en sangre para diagnosticar con rapidez varios tipos de daños y enfermedades. Esos denominados biomarcadores, cuando se estudian en detalle, tienen el potencial de proporcionar el diagnóstico rápido y sencillo de una variedad de daños y enfermedades. Por ejemplo, durante muchos años se ha sabido que la presencia del antígeno polipeptídico de tejido (TPA) en suero humano es un biomarcador útil para varias formas de carcinoma, y que el nivel de expresión de TPA se correlaciona negativamente con el pronóstico del cáncer. TPA se identificó inicialmente produciendo antisueros contra los residuos insolubles de tumores humanos extraídos, y la presunción a partir de los primeros trabajos fue que los componentes de TPA serían proteínas específicas de tumor (Bjorklund, B, Antibiot. Chemother. 22:16-31, 1978). Sin embargo, estudios posteriores indicaron que TPA era realmente un complejo de queratinas 8, 18 y 19 parcialmente degradadas, que son componentes abundantes del citoesqueleto de células epiteliales normales en diferenciación así como de células de carcinoma (Weber et al., Embo. J. 3:2707-2714, 1984). Aparentemente las células de carcinoma que se dividen con rapidez liberan algunos de sus componentes citoplásmicos al suero donde son de alguna manera resistentes a las proteasas séricas y de este modo se pueden detectar mediante pruebas inmunológicas apropiadas. Por lo tanto, los individuos con carcinomas del tipo apropiado tienen cantidades mucho mayores de estos fragmentos proteicos circulantes que los individuos normales. Puesto que el nivel de expresión de TPA en suero refleja fielmente la carga de células de carcinoma, las determinaciones de TPA tienen valor tanto de diagnóstico como de pronóstico. Otro ejemplo de este tipo de planteamiento es el seguimiento del infarto de miocardio, en el que se miden los niveles de creatina quinasa cardiaca y troponina I cardiaca. El contenido en suero de estas proteínas, liberadas de las células cardiacas dañadas, proporciona información médicamente útil que va en el tamaño del infarto que tiene valor pronóstico. Estos tipos de descubrimientos y muchos otros establecen el principio de que las proteínas normales de las células se pueden expresar a niveles mucho más altos en suero en ciertos tipos específicos de daños y enfermedades, y su detección inmunológica puede ser de uso diagnóstico y de pronóstico.

Aunque las enfermedades asociadas con lesión neuronal son una preocupación sanitaria principal en todo el mundo, no se ha encontrado un biomarcador específico fiable y conveniente de lesión neuronal, incluso aunque tal marcador tenga una gran utilidad científica y clínica potencial (Ingebrigtsen y Romner, J. Trauma 52:798-808, 2002). Se han descrito algunos marcadores potenciales de lesión cerebral pero todos tienen desventajas. Por ejemplo, estudios previos han propuesto que S100-\beta, enolasa específica de neuronas (NSE) (Persson et al., Stroke 18:911-918, 1987) y más recientemente productos de degradación de la espectrina (SBP, Pike et al., J Cereb Blood Flow Metab 24:98-106, 2004) en muestras biológicas podían ser útiles para medir la lesión cerebral. Sin embargo ni S100-\beta ni los SBP son específicos para el daño neuronal o incluso del sistema nervioso. La enolasa específica de neuronas parece más prometedora, ya que se expresa en grandes cantidades solo en neuronas, pero no se ha usado ampliamente tal vez porque la NSE es una proteína relativamente inestable. La proteína asociada a microtúbulos (MAP) tau también se ha propuesto como un biomarcador de lesión neuronal (Zemlan et al., J Neurochem 72:741-750, 1999). Sin embargo, no es una proteína particularmente abundante y también se expresa en células no neuronales (por ejemplo, células gliales astrocíticas reactivas (Togo y Dickson, Acta Neuropathol. 104:398-402, 2002)). Por lo tanto existe una necesidad para un ensayo de diagnóstico rápido y fiable que se pueda usar para evaluar de forma conveniente el daño neuronal. Tal ensayo sería útil para evaluar el daño neuronal en animales de experimentación y para controlar los efectos de fármacos que pueden ser neuroprotectores en estos animales. Tal ensayo sería particularmente útil si se pudiera detectar la molécula relevante en sangre más que líquido cefalorraquídeo (LCR), ya que obtener sangre no es solo rutinario en contextos de investigación y médicos, sino que también es mucho más fácil, menos agresivo y potencialmente menos peligroso que obtener LCR. El biomarcador potencial sería particularmente útil si se pudiera detectar en sangre a las pocas horas del traumatismo, ya que esto permitiría que se usara en el servicio de urgencias para controlar víctimas humanas de accidentes con lesión neuronal potencial en la médula espinal o el cerebro. Es difícil determinar cuánta lesión neuronal se ha producido en víctimas de accidentes usando la actual tecnología de rayos X, TAC e IRM. La detección y cuantificación de un biomarcador de lesión neuronal puede tener por lo tanto un considerable valor de diagnóstico y pronóstico en seres humanos.

Hu Y-Y et al. "Elevated levels of phosphorylated neurofilament proteins in cerebrospinal fluid of Alzheimer disease patients", Neuroscience Letters, Limerick, IE, vol. 320, no. 3, 8 de marzo de 2002, pp. 156-160, divulgan que los niveles de NF-H/M no fosforiladas y NF-L son significativamente mayores en pacientes con enfermedad de Alzheimer y demencia vascular. Además divulgan que un nivel aumentado de NF-H/M fosforilada y NF-L sola también está ligado a la enfermedad de Alzheimer y usan un ELISA sándwich para subunidades de NF, incluyendo NF-H, en líquido cefalorraquídeo.

Hashimoto Ryota et al., "Quantitative analysis of neurofilament proteins in Alzheimer brain by enzyme linked immunosorbent assay system", Psychiatry and Clinical Neurosciences, vol. 53, no. 5, Octubre 1999, pp. 587-591, describen la detección de dos subunidades de NF (L y H) en cerebro con Alzheimer e informan de que la NF-H fosforilada aumenta en los cerebros.

Skuoen J S et al., "Protein markers in cerebrospinal fluid in experimental nerve root injury. A study of slow-onset chronic compression effects or the biochemical effects of nucleus pulposus on sacral nerve roots", Spine, 1 Nov. 1999, vol. 24, no. 21, 1 Noviembre 1999 (01-11-1999), pp. 2195-2200, describen que se usó un ELISA sándwich para demostrar que los niveles de NF-L están aumentados en líquido cefalorraquídeo después de lesión neuronal traumática (compresión de la raíz nerviosa).

Compendio

La solicitud se refiere al descubrimiento de que una lesión al tejido del sistema nervioso central (SNC) tales como la médula espinal o el cerebro en un animal de experimentación produce la liberación de proteínas que se originan en los NF que se pueden detectar en líquidos biológicos tales como sangre y LCR del animal. La presencia de estas proteínas derivadas de NF se puede detectar usando ensayos que utilizan anticuerpos que se unen específicamente a NFDP (proteínas y péptidos derivados de NF) particulares. Puesto que la expresión de los NF está completamente restringida a neuronas, la medida de las NFDP proporciona una manera de detectar de forma específica e inequívoca el daño neuronal.

Los NF están compuestos predominantemente de tres proteínas subunidades, es decir NF-L, NF-M, NF-H, con cantidades más pequeñas de dos proteínas más, \alpha-internexina y periferina (Shaw, 1998 Neurofilaments. Nueva York: Springer). Cuando las neuronas se dañan las subunidades de los NF, que normalmente se encuentran en filamentos estables de 10 nm de diámetro, se rompen a componentes solubles bajo la influencia de varias enzimas endógenas, tales como las calpaínas, catepsinas, caspasas y otras. Estas enzimas producen una familia de NFDP solubles. Las NFDP son proteínas solubles y difusibles que derivan de NF ensamblados, y pueden ser proteínas de subunidades de NF completamente intactas o fragmentos proteolíticamente procesados de subunidades de NF.

La subunidad de NF más resistente a proteasas es NF-H y esto, junto a algunas propiedades proteicas químicas e inmunológicas poco comunes de esta molécula sugirió que ésta era la que más probablemente fuera la más fácil de detectar en sangre, LCR y otros fluidos corporales tras la lesión neuronal. Basado en lo anterior se desarrolló un ensayo de captura prototipo de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). La versión actual de este ensayo puede detectar de forma fiable NF-H en volúmenes pequeños de 50 \mul en cantidades tan pequeñas como 50 pg (equivalente a 1 ng/ml ó 1 \mug/L, véase la figura 1). Se usó el ensayo prototipo para examinar la inmunorreactividad de NF-H en sangre de ratas control y en la sangre de ratas que se habían sometido a varias lesiones neuronales experimentales diferentes. No se pudo detectar inmunorreactividad de NF-H en sangre control, pero se detectaron hasta 60 \mug/L de inmunorreactividad de NF-H en la sangre de ratas a las que se les habían producido lesiones experimentales en la médula espinal. Las ratas a las que se les habían producido lesiones cerebrales traumáticas experimentales también mostraron señales reproducibles de NF-H en sangre si bien bastante más bajas. Algunos otros modelos de lesiones neuronales revelaron señales reproducibles de NF-H en sangre. En resumen, una serie completa de experimentos muestran que NF-H se puede detectar mediante un ensayo apropiado basado en un anticuerpo en sangre de animales que han recibido lesiones neuronales experimentales. La señal de NF-H se pudo detectar fácilmente no solo en sangre, sino también en suero tras la coagulación de la sangre y también en plasma, lo que muestra que la señal estaba presente en la fracción soluble de la sangre y no asociada con los glóbulos rojos u otros componentes celulares.

Específicamente, a las ratas se les produjo hemisección de la médula espinal en los niveles torácicos T11 y T12. Este sistema se usa como modelo para heridas por arma blanca y bala en el SNC. Las muestras de sangre recogidas del sitio de la lesión de corte mostraron niveles muy altos de expresión de NF-H (>80 \mug/L), lo que muestra que NF-H se libera en cantidades fácilmente detectables inmediatamente después de este tipo de lesión neuronal. Las muestras de sangre recogidas de la cola a las 2, 8, 16 y 24 horas, revelaron todas señales pequeñas pero reproducibles de NF-H, con las señales más fuertes a tiempos posteriores. Estos descubrimientos establecen el principio de que NF-H se encuentra en la sangre en las horas siguientes a la lesión neuronal en cantidades fácilmente medibles. De forma interesante, los niveles de NF-H en esta serie de experimentos se estabilizan alrededor de 24 horas, y después suben hasta niveles incluso más altos con máximos entre 3 y 5 días después de la lesión, volviendo a niveles control alrededor de 9 días después de la lesión. Se piensa que este segundo pico de inmunorreactividad corresponde a la muerte secundaria de neuronas y este ensayo está pensado para proporcionar un método único de medir este fenómeno. Este experimento se ha realizado en una serie de animales, todos los cuales produjeron evoluciones temporales y grados de señal de NF-H muy similares, lo que sugiere que tanto la respuesta del animal a la lesión como la detección de NF-H son fiables y reproducibles. Otra serie de experimentos muestra que las lesiones experimentales por contusión de la médula espinal en ratas producen una respuesta de NF-H cuantitativa y cualitativamente similar. La contusión se produjo usando un aparato de caída de peso normalizado, y este sistema modelo se usa como modelo de lesiones de comprensión e impacto de la médula espinal en seres humanos. Por último estudios de ratas sometidas a lesiones cerebrales traumáticas, también usando el aparato de caída de peso, muestran una señal de NF-H en sangre medible pero menor comparada con las sometidas a lesión en la médula espinal. En resumen, los niveles de NF-H en sangre son capaces de detectar de forma fiable varios tipos diferentes de lesiones neuronales del sistema nervioso central.

El ensayo ELISA que se describe aquí es rápido, actualmente se realiza en algo más de tres horas, y no agresivo, requiere solo una gota de sangre. El ensayo funciona con sangre reciente, suero obtenido tras la coagulación a temperatura ambiente o plasma obtenido mediante centrifugación. Por uniformidad, el ensayo se normalizó en plasma que se obtuvo a partir de sangre reciente mediante centrifugación a 14.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se usaron rutinariamente muestras de 10 \mul de ratas experimentales aunque sin duda se podría obtener mayor sensibilidad con muestras mayores. La señal de NF-H es bastante estable y se puede detectar sin disminución aparente después de varios ciclos de congelación y descongelación de la sangre, suero o plasma, o después de varias horas a temperatura ambiente. Esto significa que probablemente el ensayo sea consistente en la práctica. El ensayo se puede usar en estudios con animales cuyo fin es cuantificar la lesión neuronal y evaluar la eficacia de fármacos diseñados para combatir la muerte neuronal. Un ensayo consistente y rápido de lesión neuronal también tiene un gran potencial de uso en pacientes humanos con lesiones de médula espinal y cerebro en el servicio de urgencias.

Según esto, la invención presenta un método para detectar una lesión neuronal en un sujeto según la reivindicación 1. También puede implicar realizar un inmunoensayo seleccionado del grupo que consiste en inmunotransferencia, ELISA, radioinmunoensayo, inmunodifusión e inmunoprecipitación.

La invención también presenta el uso de un kit para detectar y cuantificar la lesión neuronal en un sujeto según las reivindicaciones 4 y 5.

Como se usa aquí, "unir", "une" o "interacciona con" significa que una molécula reconoce y se adhiere a una segunda molécula particular en una muestra, pero no reconoce o se adhiere sustancialmente a otras moléculas estructuralmente no relacionadas en la muestra. En general, una primera molécula que "se une específicamente" a una segunda molécula tiene una afinidad de unión mayor de 10^{5} a 10^{6} moles/litro para esa segunda molécula.

El término "sangre", como se usa aquí, significa los derivados de sangre plasma y suero.

Mediante referencia a un "anticuerpo que se une específicamente" a otra molécula se quiere decir un anticuerpo que se une a la otra molécula, y no muestra unión sustancial a otras proteínas naturales diferentes de aquellas que comparten los mismos determinantes antigénicos que la otra molécula. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales así como fragmentos de anticuerpos o partes de moléculas de inmunoglobulina que se pueden unir específicamente al mismo antígeno que la molécula intacta de anticuerpo.

El término "sujeto", como se usa aquí, significa un ser humano o un animal no humano, que incluye pero no está limitado a mamíferos tales como un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, conejo, cobaya, oveja, cabra, primate, rata y ratón. Puesto que las regiones inmunogénicas de NF-H están bien conservadas a través de las especies de vertebrados superiores, se espera que el ensayo de NF-H actual funcione también en sujetos de aves y reptiles. Mediante un razonamiento similar, también es probable que ensayos basados en la detección de otras NFDP funcionen en todas las especies de vertebrados superiores.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos usados aquí tienen el mismo significado que entiende normalmente el experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica o ensayo de la presente invención, los materiales y métodos adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, se aplicará la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, las formas de realización particulares discutidas más adelante son solo ilustrativas y no se pretende que sean limitantes.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados del ELISA con cantidades variables de NF-H pura, ilustrando la sensibilidad del ensayo prototipo. La ordenada representa la serie de diluciones seriadas de una placa de ELISA típica, de modo que el primer pocillo está sin diluir (100%, a la derecha), el segundo está diluido al 50%, el tercero al 25% y así sucesivamente. Una línea recta indica una respuesta lineal y por lo tanto cuantificable. Se pueden detectar fácil y reproduciblemente cantidades tan bajas como 50 pg de NF-H en muestras pequeñas (50 \mul).

La figura 2 es un gráfico que muestra los resultados de los ELISA realizados para determinar la concentración de NF-H en un conjunto de muestras de plasma de 10 \mul recogidas a los tiempos indicados de un único animal que había recibido una hemisección de médula espinal experimental. Nótese el marcado aumento en la NF-H detectable en las primeras horas después de la lesión, y el pico incluso mayor que se ve después de 3-4 días.

La figura 3 es un gráfico que muestra la inmunorreactividad de NF-H en suero de rata después de la lesión experimental de contusión de la médula espinal. Se dejaron coagular muestras de 50 \mul de sangre y se recogió el suero para el ensayo ELISA. Los niveles de NF-H aumentan hasta 3-5 días, después disminuyen hasta niveles basales a los 7 días.

Descripción detallada

La invención se refiere a métodos para detectar NF-H en una muestra de sangre, suero o plasma para evaluar lesión neuronal. Las formas de realización preferidas descritas más adelante ilustran adaptaciones de estos métodos. Sin embargo, a partir de la descripción de estas formas de realización, se pueden hacer y/o practicar otros aspectos de la invención basados en la descripción proporcionada a continuación.

Métodos biológicos

Se describen aquí métodos que implican técnicas biológicas convencionales. Tales técnicas son en general conocidas en la técnica y se describen en detalle en tratados de metodología tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas). Los métodos inmunológicos (por ejemplo, preparación de anticuerpos específicos de antígeno, inmunoprecipitación e inmunotransferencia) se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1991; y Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992.

NFDP

Las NFDP se generan mediante digestión enzimática de NF por proteasas activadas. Los NF son los componentes estructurales principales de las neuronas y pertenecen a la familia de proteínas de filamentos de 10 nm de diámetro o intermedios. Los NF están compuestos de las subunidades principales NF-L, NF-M y NF-H, con ciertos tipos de neuronas que contienen cantidades menores de dos subunidades adicionales, periferina y \alpha-internexina. Los otros miembros de la familia de filamentos de 10 nm de diámetro o intermedios incluyen las queratinas encontradas en células epiteliales, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) característica de células astrocíticas, desmina encontrada en células musculares y endoteliales, vimentina encontrada en muchos tipo celulares y varias proteínas menos conocidas. Esta familia de proteínas tiene varias propiedades interesantes. Primero, se expresan en patrones de expresión bien definidos específicos de subtipos celulares. Esto significa, por ejemplo, que se pueden usar anticuerpos contra NF para identificar de modo inequívoco células que son de origen neuronal, y se usan anticuerpos contra GAFP como el criterio de referencia para identificar astrocitos. Segundo, las diferentes proteínas de filamentos intermedios y sus subunidades son componentes extremadamente abundantes de muchas células, y en muchas neuronas grandes las subunidades de los NF pueden representar un porcentaje significativo de la cantidad total de proteína. Tercero, las subunidades de NF y las subunidades de otros filamentos de 10 nm son componentes de la célula de vida larga y estables que por lo tanto deben ser bastante resistentes a los mecanismos proteolíticos celulares normales. Estas propiedades hacen de las proteínas de los filamentos de 10 nm o intermedios en general y las moléculas de neurofilamentos en particular dianas excelentes para el desarrollo de kits de diagnóstico cuyo fin es analizar daño específico del tipo celular.

Las neuronas grandes del sistema nervioso central son particularmente ricas en NF-L, NF-M y NF-H. Los tres polipéptidos son cada uno complejas proteínas multidominio que en el caso de NF-M y NF-H están inusualmente muy fosforiladas. Cuando se daña el sistema nervioso, las células neuronales mueren de forma apoptótica o necrótica y se espera que liberen su contenido a los tejidos circundantes, la sangre y el líquido cefalorraquídeo. Se espera que este material esté particularmente proteolizado, puesto que tanto la apoptosis como la necrosis producen la activación de una serie de enzimas proteolíticas. Sin embargo, NF-H es tanto muy inmunogénica como resistente a proteasas, de modo que es probable que sean detectables NF-H intacta o fragmentos derivados de NF-H en fluidos corporales después de la liberación de las neuronas dañadas. Como se mostró anteriormente, NF-H se puede detectar en sangre en grandes cantidades en el sitio de una lesión, en sangre tan pronto como dos horas después de esta lesión, y en sangre a lo largo de varios días después de la lesión neuronal.

Debido a que los NF se encuentran solo en células neuronales, este planteamiento tiene una ventaja considerable sobre otros métodos. Trabajadores previos han usado S100-\beta y productos de degradación de espectrina que se pueden detectar en sangre y LCR como marcadores de lesión cerebral. Sin embargo, ambas proteínas se encuentran no solo en neuronas sino también en células de glía, endoteliales y muchos otros tipos y no son específicas de células en el SNC. Por lo tanto, un ensayo basado en la detección de NF proporciona información mucho más refinada y ofrece mayor valor científico y clínico ya que refleja solamente el daño a neuronas. Como se ha advertido anteriormente, la MAP tau y la enolasa específica de neuronas son otros marcadores potenciales de lesión neuronal que también tienen desventajas específicas. También es probable que un sistema de detección de NF proporcione mayor sensibilidad puesto que se piensa que los NF son los componentes específicos más abundantes de las neuronas, y se expresan particularmente mucho en especies grandes tal como notablemente el ser humano.

Detección de lesiones neuronales

La invención proporciona un método para detectar una lesión neuronal en un sujeto según la reivindicación 1.

El paso de proporcionar una muestra biológica derivada de un sujeto se puede realizar mediante técnicas médicas convencionales. Una muestra biológica puede ser de cualquier sitio en el cuerpo del sujeto. Mientras que se espera que NF-H se acumule en el LCR después de la lesión neuronal, y se podría ensayar allí, una gran ventaja del método presente es que se puede detectar una señal adecuada en sangre. La sangre se obtiene mucho más fácilmente que el LCR, y se recoge rutinariamente de animales de experimentación y de pacientes humanos en el servicio de urgencias. Por lo tanto, no se necesitan pasos extra específicos más allá de la disponibilidad de un kit apropiado para detectar NF-H.

Los sujetos adecuados para su uso en la invención pueden ser cualquier especie animal que exprese NF que se pueda detectar con este sistema de ensayo. El sujeto puede ser, por lo tanto, cualquier mamífero tales como un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, conejo, cobaya, oveja, cabra, primate, rata o ratón. Se espera que este ensayo funcione al menos en especies de aves y reptiles, si no también en anfibios y peces. Un sujeto preferido para los métodos de la invención es un ser humano. Particularmente preferidos son sujetos que se sospecha que tienen o están en riesgo de desarrollar lesiones neuronales traumáticas o no traumáticas, tales como víctimas de lesión neuronal producida por agresiones traumáticas (por ejemplo, heridas de bala, accidentes de automóvil, accidentes deportivos), sucesos isquémicos (por ejemplo, ictus, hemorragia cerebral, paro cardiaco) y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedades de Alzheimer y de Parkinson).

El paso de detectar la presencia de NF-H en una muestra se puede realizar de varias formas diferentes. Se conocen numerosas técnicas adecuadas para analizar la presencia de proteínas. Por ejemplo, se pueden detectar proteínas y productos específicos de degradación de las mismas proteínas usando técnicas inmunológicas, por ejemplo, usando anticuerpos que se unen específicamente a la proteína y/o sus productos de degradación (por ejemplo NF, sus subunidades y productos de degradación producidos por proteasas específicas) en inmunoensayos tales como inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia tipo Western), ELISA, radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia o tinción y análisis inmunohistoquímico, y técnicas similares. Se describen métodos adecuados para detectar NF-H más adelante; no obstante, también se podrían emplear otros métodos adecuados.

Cualquier anticuerpo que se una a NF-H es adecuado para su uso en la invención. En una forma de realización preferida, se puede usar un anticuerpo único para detectar al mismo tiempo o de forma independiente una NF-H específica.

Kits

La invención incluye el uso de un kit según las reivindicaciones 4 y 5. La presencia del anticuerpo de detección se visualiza y cuantifica mediante agentes de detección tales como anticuerpos unidos a enzimas que reaccionan con el anticuerpo de detección. La presencia del anticuerpo unido a enzima se detecta usando moléculas de sustratos cromogénicos apropiados para la enzima. La cuantificación de la señal se puede realizar mediante medidas de la densidad óptica a la longitud de onda óptima para el cromógeno particular. Planteamientos más complejos utilizan resonancia de plasmón de superficie, transferencia de energía de resonancia por fluorescencia u otras técnicas que implican el uso de equipo especializado para ensayar la unión pueden tener ventajas en términos de cuantificar la unión y para aplicaciones de alto rendimiento.

Al desarrollar la invención, se hicieron una serie de anticuerpos policlonales contra NF en conejo y pollo y se hicieron ciertos anticuerpos monoclonales en ratón. En el ensayo ELISA prototipo descrito aquí se usó un anticuerpo policlonal de pollo de título muy alto contra NF-H en modo de captura. Este se purificó por afinidad sobre NF-H pura, y se recubrieron placas de ELISA usando métodos estándar. El anticuerpo de detección fue un anticuerpo policlonal de conejo que también se purificó por afinidad de la misma manera. La combinación de dos anticuerpos policlonales producidos en dos especies diferentes da una sensibilidad inusual a este ensayo. Se evaluarán otros anticuerpos que se unen específicamente a NFDP particulares adicionales para su utilidad en el futuro. Tales kits incluirían reactivos para detectar NF-M, NF-L, \alpha-internexina y periferina. Kits más avanzados y automatizados usan micromatrices de proteínas basados en los mismos reactivos anticuerpos. Tales matrices se podrían usar tanto en investigación básica como aplicaciones clínicas (por ejemplo, servicio de urgencias). Además, un ensayo colorimétrico basado en filtro usando anticuerpos específicos inmovilizados está dentro de la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Subunidad de neurofilamento NF-H como un biomarcador consistente de lesión neuronal en suero Materiales y métodos

Desarrollo de anticuerpos específicos de NF-H: Puesto que se pueden obtener tejidos bovinos con relativa facilidad y puesto que la molécula de NF-H bovina es inmunológica y químicamente similar a la de seres humanos y otras especies, se usó NF-H bovina para preparar anticuerpos reactivos con NF-H. Se obtuvo tejido bovino de médula espinal del matadero local, se transportó en hielo, se limpió de meninges y se almacenó a -70ºC. Se prepararon geles ricos en neurofilamentos esencialmente como describen Delacourte et al. (Delacourte et al., Biochem J 191:543-546, 1980). Brevemente, se descongelaron \sim250 g de material de médula espinal bovina y se homogenizaron en un homogenizador de tipo aspas en tampón MES (MES 0,1 M, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, pH=6,5, más PMSF 0,2 mM). El homogenizado se filtró a través de estopilla y se centrifugó a 14.000 rpm/29.000 g durante una hora a 4ºC. El sobrenadante se centrifugó después a 28.000 rpm/78.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Se añadió glicerol para dar una concentración final del 20% y el material se incubó durante 20 minutos a 37ºC. El sobrenadante se centrifugó a 45.000 rpm/235.000 g durante 30 minutos a 20ºC. Típicamente se recogieron alrededor de 3 g de precipitados amarillentos claros por preparación. Estos precipitados típicamente contienen alrededor del 90% de NF-L, NF-M y NF-H, con cantidades menores de GFAP y fodrina/espectrina. Este material se disolvió en urea 6 M en tampón fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol al 0,01%, pH = 7,5, y se aplicó a una columna de DEAE celulosa equilibrada en el mismo tampón. Las proteínas se eluyeron usando un gradiente de NaCl de 0 M a 0,25 M en el mismo tampón. Una banda única limpia de proteína NF-H eluyó a aproximadamente NaCl 0,05 M, y este material se concentró hasta alrededor de 1 mg/ml y se dializó frente a PBS. Se mezclaron 250 \mug de NF-H 1:1 con adyuvante completo de Freund y se inyectó en ratones, conejos y pollos, y 3 semanas después los animales recibieron una dosis de con 200 \mug mezclados 1:1 con adyuvante incompleto de Freund.

Después de dos dosis de recuerdo adicionales, se desangraron dos conejos y se recogió el suero para purificación por afinidad. Para los pollos, se recogieron los huevos y se produjeron preparaciones enriquecidas en IgY mediante deslipidación en solventes orgánicos seguida por precipitación con sulfato de amonio. Los ratones se sacrificaron y sus células de bazo fusionadas con mieloma PAI se procesaron para la producción de hibridomas usando métodos estándar. Se hicieron crecer los hibridomas en placas de 6 por 24 pocillos, y se cribaron mediante ELISA en el inmunógeno. Se seleccionó el hibridoma NP1 para subclonación ya que reaccionó de forma extremadamente fuerte con NF-H en ELISA y también tiñó neuronas en secciones histológicas sin fijar y fijadas con paraformaldehído. La preparación policlonal de IgY de pollo se designa CPCA-NF-H, el suero policlonal de conejo se designa RPCA-NF-H y el monoclonal de ratón se designa MCA-NP1. Los tres se pueden obtener ahora comercialmente de EnCor Biotechnology Inc. (Alachua, FL). Antes de su uso en estos ensayos, tanto el suero de conejo como las preparaciones de IgY se purificaron por afinidad sobre NF-H purificada acoplada a Sepharosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Sigma). El monoclonal de ratón se purificó por afinidad en una columna de proteína G Hi-Trap (Amersham) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos eluidos se dializaron frente a PBS antes de su uso en los ensayos de ELISA.

Ensayo ELISA prototipo: Para realizar los ensayos ELISA, se usaron placas Immulon 4HBX, que son placas ELISA de 96 pocillos de formato estándar recubiertas para mejorar unión de proteínas. Se cuantificó el anticuerpo de pollo purificado por afinidad para NF-H mediante absorbancia UV y se aplicaron cantidades de 100 \mul a 0,7 \mug/ml en tampón bicarbonato de sodio 50 mM a pH = 9,5. Las placas se incubaron a 4ºC durante la noche y después al día siguiente se bloquearon durante al menos 1 hora con 150 \mul de leche desnatada Carnation al 5% en solución salina tamponada con Tris (TBS). Después las placas se lavaron en TBS más Tween 20 al 0,1% (TBS/Tween) usando un lavador de placas de ELISA de Biorad ajustado a un volumen de 300 \mul, 4 segundos de tiempo de mojado por ciclo, 5 ciclos. Las placas se pudieron almacenar entonces en una caja húmeda a 4ºC en 100 \mul/pocillo de TBS/Tween que contenía azida de sodio 1 mM, o se pudieron usar para los ensayos inmediatamente. Para realizar un ensayo se aplicaron 50 \mul de tampón de incubación de ELISA (leche desnatada Carnation al 2% en TBS/Tween) a cada pocillo. Se aplicaron después hasta 50 \mul de sangre u otra muestra de proteína a la fila A de cada placa, y este material se diluyó en serie descendiendo en la placa, permitiendo el análisis de hasta 12 muestras por placa.

Después de 1 hora de incubación con agitación a temperatura ambiente, la placa se lavó varias veces en TBS/Tween usando el lavador de placas de ELISA de Biorad como antes. Se añadió anticuerpo de detección de conejo purificado por afinidad para NF-H a alrededor de 50 \mug/ml de concentración a 10 ml de tampón de incubación de ELISA por placa de ELISA, y se aplicaron 100 \mul de esta solución a cada pocillo. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación, la placa se lavó de nuevo en TBS/Tween en el lavador de ELISA, cada pocillo se incubó con cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina 1:2.000 (Sigma) en tampón de incubación de ELISA. Después de otra hora de incubación a temperatura ambiente con agitación, las placas se lavaron por última vez en el lavador de placas de ELISA como antes y se desarrollaron con 100 \mul/pocillo de glicina 0,1 M, Mg 1 mM, Zn 1 mM a pH = 10,4 que contenía fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) 1 mg/ml. Después de 20 minutos a 1 hora de desarrollo, la reacción se paró con 50 \mul/pocillo de NaOH 2 M, y los resultados se cuantificaron en un lector de placas de ELISA Tecan Spectrafluor Plus usando absorbancia a 405 nm.

Experimentos con animales: Se obtuvieron ratas hembras Long-Evans que pesaban 230-300 gramos de Harlan (Indianápolis, IN). Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles con calor suplementario. Se usó administración intraperitoneal de Nembutal (pentobarbital de sodio) a 50-60 mg/kg para inducir anestesia. Después de la laminectomía parcial de T11, T10 con la duramadre intacta, se produjo la lesión mediante hemisección con bisturí que se realizó al nivel espinal T12, T11. Se recogió una pequeña muestra de sangre de la región cortada. Las incisiones se cerraron en capas y se dejó que los animales se recuperaran en un incubador calentado con comida y agua ad libitum. Se exprimieron las vesículas y se administraron líquidos cuando se requirió. En el caso de animales tratados con la lesión, se recogieron muestras de sangre mediante sangrado de la cola a las 2 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 2 días y cada día siguiente hasta los 11 días. En la figura 2 se muestra un resultado típico. El ELISA muestra consistentemente un pico fuerte de NF-H en suero a los 3-4 días después de la lesión. De forma significativa sin embrago, NF-H se puede detectar consistentemente tan pronto como a las 8 horas después de la lesión, y se vio una señal débil pero reproducible a las 2 horas después de la lesión. Los ensayos ELISA mostraron una expresión consistente y marcada de NF-H en la sangre recogida del sitio de la lesión, realmente mucho más alta que los niveles vistos en suero en puntos más tardíos. Estos experimentos muestran que NF-H se libera inmediatamente en la sangre después de la lesión nerviosa y además se puede detectar de forma consistente y reproducible en las horas y días que siguen a la lesión experimental del sistema nervioso.

Es particularmente significativo que NF-H sea detectable en el sitio de la lesión y a las pocas horas después de la lesión. Esto permite un ensayo basado en estos descubrimientos para detectar lesión neuronal en pacientes humanos en el servicio de urgencias. La detección de lesiones neuronales serias por otros medios, tales como, IRM, rayos X, TAC, etc., es problemática. Un ensayo basado en estos descubrimientos podría detectar rápidamente la lesión neuronal en un paciente inconsciente y el nivel de NF-H detectado muy probablemente tenga un valor de pronóstico.

En otra serie de experimentos se produjo lesión en la médula espinal usando un dispositivo impactador normalizado New York con un peso de 10 g que cae 25 mm. Los animales del grupo de lesión de referencia recibieron laminectomía y se colocaron en el aparato de lesión pero no se lesionaron. Los animales tratados experimentalmente se sacrificaron a las 24 horas, 48 horas, 72 horas, 5 días, 7 días y 6 semanas después de la lesión. Se recogió sangre y se dejó coagular durante 1-2 horas a temperatura ambiente, y después se almacenó congelada. Como se muestra en la figura 3 se obtuvieron señales fuertes de muestras de suero de animales que tenían lesiones de contusión en la espinal dorsal. La cantidad de NF-H detectada fue significativa después de 24 horas y aumentó a lo largo de 48 y 72 horas. A los 5 días el nivel de NF-H era algo menor y a los 7 días había vuelto casi a niveles de fondo. Las señales fueron sorprendentemente fuertes y mediante comparación con los estándares, se calculó que el nivel de NF-H en el suero de los animales de experimentación estaba en el intervalo desde 26 \mug/L en los animales de 24 horas hasta tanto como 66 \mug/L en los animales de 72 horas después de la lesión. Los animales sin tratar fueron aquellos que no tuvieron lesiones mecánicas y típicamente se sacrificaron al final de los experimentos realizados por razones irrelevantes a estos estudios, y revelaron señal de NF-H no detectable. Controles adicionales fueron los animales del grupo quirúrgico de referencia, se anestesiaron y sus médulas espinales se expusieron como en el grupo experimental, pero no se sometieron al sistema de la caída de peso. Ninguno de estos animales mostró ninguna inmunorreactividad significativa de NF-H con el ensayo presente.

Puesto que sería ventajoso conocer exactamente qué forma de NF-H se detecta en este ensayo, se sometió el suero de una rata que recibió lesión en la médula espinal 3 días antes y que había mostrado una señal fuerte en el ensayo ELISA a fraccionamiento preliminar. Se obtuvieron fracciones de proteínas séricas mediante precipitación con sulfato de amonio. Las fracciones se ensayaron usando ELISA, y se obtuvo una señal débil en la primera fracción y una mucho más fuerte en la segunda fracción, mientras que en las fracciones posteriores la señal estaba esencialmente a niveles de fondo. Por lo tanto, se sometió la segunda fracción a filtración en gel en una columna de Superosa (Pharmacia), y las fracciones se cribaron de nuevo usando el ensayo ELISA. La inmunorreactividad de NF-H eluyó muy pronto en el perfil indicativo de un peso molecular en el rango de 0,5 millones de Dalton. Esto indica que la señal de NF-H es al menos multimérica y quizás parte de un complejo de proteínas.

Ejemplo 2 Variaciones del ensayo

Además del ensayo descrito anteriormente, existen muchas variaciones posibles que pueden ser útiles para detectar NFDP en el suero de un animal. Por ejemplo, el uso de métodos basados en conjugados de avidina-biotina puede aumentar mucho la sensibilidad de los ensayos ELISA. Como otro ejemplo, las modificaciones tales como usar concentraciones de anticuerpo más altas e incubaciones a 37ºC más que a temperatura ambiente pueden mejorar el ensayo. También se prevé el desarrollo de ensayos que implican métodos colorimétricos rápidos u otros que permitirían la determinación del nivel de NF-H en suero en minutos. Tal planteamiento podría ser potencialmente útil en el diagnóstico de pacientes humanos. Un kit que detecta NF-H en suero usando, por ejemplo, un procedimiento de difusión simple y captura de anticuerpo corrido en un filtro, como se ha desarrollado para otros tipos de biomarcadores encontrados en suero y otros líquidos, puede ser particularmente útil. Este kit se podría usar para cuantificar el grado de daño neuronal en una variedad de situaciones aparte de los ejemplos ilustrados aquí. Un ensayo que detecta tales marcadores es útil experimentalmente en estudios con animales y se espera que sea diagnósticamente útil en seres humanos. En particular, el grado de lesión neuronal en pacientes con lesión de médula espinal y lesión cerebral traumática es difícil de determinar usando IRM o mediante otros métodos actuales de diagnóstico por imagen. Un ensayo basado en la detección de una proteína neuronal fácilmente detectable tal como este podría evaluar rápidamente el grado de daño neuronal en tales víctimas de accidente. Usando los métodos y composiciones de la invención, se espera que se pueda correlacionar el nivel de expresión de NF-H con un grado específico de lesión neuronal y un pronóstico específico.

Otras formas de realización

Mientras que la especificación anterior contiene muchos aspectos concretos, estos no se deben interpretar como limitaciones en el ámbito de la invención, sino más bien como ejemplos de formas de realización preferidas de la misma. Son posibles otras muchas variaciones. Según esto, el ámbito de la invención se debe determinar no mediante las formas de realización ilustradas, sino mediante las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales.

Claims

1. Un método para detectar una lesión neuronal en un sujeto, comprendiendo el método los pasos de:

(a): poner en contacto una muestra de sangre, suero o plasma obtenida del sujeto con un anticuerpo que se une específicamente a NF-H en la muestra;

(b): detectar la presencia o cantidad de NF-H en la muestra; y

(c): correlacionar la presencia o cantidad de NF-H en la muestra con la lesión neuronal.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el paso (b) de detectar la presencia o cantidad de NF-H comprende realizar un inmunoensayo seleccionado del grupo que consiste en inmunotransferencia, ELISA, radioinmunoensayo, inmunodifusión e inmunoprecipitación.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el paso (b) de detectar la presencia o cantidad de NF-H en la muestra comprende realizar un ELISA.

4. Uso de un kit para detectar una lesión neuronal en un sujeto mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el kit:

(a): un sustrato sólido;

(b): al menos un anticuerpo que se une específicamente a NF-H;

(c): un agente para detectar la unión del al menos un anticuerpo a NF-H; e

(d): instrucciones para usar el kit para detectar lesión neuronal en un sujeto.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde el agente para detectar la unión del al menos un anticuerpo a NF-H comprende una molécula de sustrato cromogénico.