JP4557971B2 - 血液試料からの神経損傷の評価 - Google Patents
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Description
本願は、2003年3月31日に提出した、米国仮特許出願通し番号第60/459,286号に優先権を主張する。
本発明は、米国陸軍による付与番号DAMD17−01−1−0765、および国立衛生研究所(NIH)による付与番号AA012151−02によって、米国政府から援助を受けて行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
近年、種々の損傷や疾病状態を迅速に診断するために、血液中の特異的マーカータンパク質の検出に大きな関心が寄せられるようになっている。このようないわゆるバイオマーカーを詳細に研究することで、種々の損傷や疾病状態の迅速かつ簡単な診断を行えるようになる可能性がある。たとえば、ヒト血清中の組織ポリペプチド抗原(TPA)の存在は、いくつかの種類のがんに対する有用なバイオマーカーであり、TPA発現のレベルががんの予後と負の相関性をもつことが長年来知られている。TPAは当初は、ヒト腫瘍抽出物の不溶性残渣に対して抗血清を作製することによって同定され、初期の研究による仮説では、TPAの成分が腫瘍特異的タンパク質であると考えられていた(非特許文献1)。しかしながら、後の研究から、TPAは実際には、部分的に分解されたケラチン8,18および19の複合体であることが示された。これらのケラチンは、がん細胞だけでなく正常な分化上皮細胞の細胞骨格に豊富に存在する成分である(非特許文献2)。急速に分裂するがん細胞は、それらの細胞質成分のいくつかを血清中に放出するが、該細胞質成分は血清プロテアーゼにある程度の耐性を持つことから、適当な免疫学的試験によって検出することができるようである。したがって、適当な型のがん腫を有する個体は、正常な個体に比べて、これらの循環タンパク質の断片をはるかに多く有することになる。血清中のTPA発現のレベルは、がん細胞負荷を正確に反映するものであるから、TPAの判定は診断と予後の両方に対して有用である。この種の手法の他の例としては、心臓クレアチンキナーゼと心臓トロポニンIのレベルを測定する心筋梗塞のモニタリングがあげられる。損傷を受けた心臓細胞から放出されたこれらのタンパク質の血清中含量は、梗塞の大きさに関する医学的に有用な情報を提供し、予後診断に価値を示す。この種の発見および多くの他のことから、細胞の正常なタンパク質は、ある種の特別な損傷および疾病状態において非常に高いレベルで発現される可能性があり、該タンパク質の免疫学的検出を診断および予後診断に使用しうるという原理が成立する。
定するのに有用であるとの提案がなされている。しかしながら、S100−βとSBPのいずれも、神経細胞または神経系の損傷に特異的でない。神経細胞特異的エノラーゼは、神経細胞においてのみ大量に発現されることからより前途有望なように見えるが、まだ広くは用いられていない。これはおそらく、NSEが比較的不安定なタンパク質であるためであろう。微小管関連タンパク質(MAP)tauもまた、神経損傷のバイオマーカーとして提案されている(非特許文献6)。しかしながら、これは特に豊富なタンパク質ではなく、非神経細胞(たとえば、反応性の星状グリア細胞)においても発現される(非特許文献7)。したがって、神経損傷を適宜評価するために使用できる迅速かつ信頼性の高い診断アッセイが必要とされている。そのようなアッセイは、実験動物における神経損傷を評価するために、また当該動物において神経防護作用のある薬物の効果をモニターするために有用であろう。このようなアッセイは、関連する分子が脳脊髄液(CSF)ではなく血液中で検出可能な場合に特に有用である。というのも、血液の採取は研究および医学の状況において常套的なものであるばかりでなく、CSFの採取よりも侵襲性や潜在的危険性が低く、簡単であるためである。潜在的バイオマーカーは、外傷後数時間以内の血液中で検出することができれば有用であろう。というのも、脊髄または脳内に神経損傷を負った可能性のある事故の犠牲者を、緊急治療室内でモニターするのに使用できるかもしれないからである。現行のX 線、CATスキャンおよびMRI技術を用いて事故犠牲者にどの程度の神経損傷が生じているかを判定することは難しい。したがって、神経損傷のバイオマーカーの検出および定量は、ヒトにおいて大きな診断的、予後診断的価値を有するであろう。
ビョークルンド、ビー(Bjorklund,B)、Antibiot.Chemother.、1978年、第22巻、p.16−31 ウェバー(Weber)ら、Embo.J.1984年、第3巻、p.2707−2714 インゲブリグツセンおよびロムナー(Ingebrigtsen and Romner)、J.Trauma、2002年、第52巻、p.798−808 パーソン(Persson)ら、Stroke、1987年、第18巻、p.911−918 パイク(Pike)ら、J Cereb Blood Flow Metab、2004年、第24巻、p.98−106 ゼムラン(Zemlan)ら、J Neurochem、1999年、第72巻、p.741−750 トウゴウおよびディクソン(Togo and Dickson)、Acta Neuropathol.、2002年、第104巻、p.398−402
−Hと、より少量の2つのタンパク質であるインターネキシンおよびペリフェリンとによって構成されている(シャウ(Shaw)、1998年、「Neurofilaments.」、米国ニューヨーク所在のスプリンガー(Springer))。神経細胞が損傷を受けると、安定な10nm径フィラメントにおいて通常見られるNFサブユニットは、カルパイン、カテプシン、カスパーゼなどの様々な内在酵素の影響によって、可溶性の成分に分解される。これらの酵素は、可溶性NFDPのファミリーを産生する。NFDPは、集合体化したNFに由来する可溶性かつ拡散性のタンパク質であり、完全に無傷なNFサブユニットタンパク質またはタンパク分解作用を受けたNFサブユニット断片のいずれかである。
別の分子に「特異的に結合する抗体」という場合、該別の分子には結合するが、該別の分子と同一の抗原決定基を共用するもの以外の天然に存在するタンパク質に実質的な結合性を示さない抗体を意味する。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体、ならびに完全な抗体分子と同じ抗原に特異的に結合できる抗体断片またはイムノグロブリン分子の一部も含まれる。
従来の生物学的技術を含む方法について説明する。そのような技術は当該技術分野において周知であり、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第3版、第1〜3巻、サムブルック(Sambrook)ら編、米国ニューヨークコールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press )、2001年;および「Current Protocols in Molecular Biology」、オースベル(Ausubel)ら編、米国ニューヨーク所在のグリーネパブリッシングアンドワイリーインターサイエンス(Greene Publishing & Wiley-Interscience)、1992年(定期的に改訂)などの方法論書に詳細に記載されている。免疫学的方法(たとえば、抗体特異的抗原の調製、免疫沈降、イムノブロッティング)は、例えば、「Current Protocols in Immunology」、コリガン(Coligan)ら編、米国ニューヨーク所在のジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley & Sons )、1991年;および「Methods of Immunological Analysis」、マッセイエフ(Masseyeff)ら編、米国ニューヨーク所在のジョンワイリーアンドサンズ、1992年に記載されている。
NFDPは、活性化されたプロテアーゼによるNFの酵素的分解によって生産される。NFは、神経細胞の主要な構造成分であり、10nmフィラメントまたは中間フィラメントのタンパク質ファミリーに属する。NFは、主要なサブユニットNF−L、NF−MおよびNF−Hで構成され、特定の神経細胞種はより少量のさらに2つのサブユニット、ペリフェリンおよびインターネキシンも含んでいる。10nmフィラメントまたは中間フィラメントタンパク質ファミリーの他のメンバーとしては、上皮細胞中に見られるケラチン、星状細胞に特徴的なグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)、筋肉および内皮細
胞中に見られるデスミン、多くの細胞種において見られるビメンチン、ならびにいくつかの認知度の低いタンパク質があげられる。このタンパク質ファミリーは、いくつかの興味深い特性を有している。第一に、明確で特異的な細胞サブタイプ発現パターンで発現される。このことは、例えば、細胞が神経を起源とすることを明白に同定するためにNFに対する抗体を用いることができること、ならびにGFAP抗体が星状細胞の同定に対する判断基準として使用されることを意味する。第二に、種々の中間フィラメントタンパク質およびそれらのサブユニットは多くの細胞における非常に豊富な成分であり、多くの大きな神経細胞においてNFサブユニットはタンパク質全量の数パーセントを占める場合もある。第三に、NFサブユニットおよび他の10nmフィラメントのサブユニットは長寿命で安定な細胞成分であるので、正常な細胞内タンパク質分解機構に対する耐性がかなり高いはずである。これらの特性により、一般的には10nmまたは中間フィラメントのタンパク質、とりわけ神経フィラメント分子は、細胞種特異的損傷の分析を目的とした診断キットの開発に関する優れた標的となる。
本発明は対象における神経損傷の検出方法を提供する。本方法は、(a)対象に由来する生物試料、例えば血液またはCSFを提供する工程と、(b)該試料中の、無傷のNFから発生したNFDPの存在を検出する工程と、(c)試料中のNFDPの量を、正常な(すなわち損傷を受けていない)対照対象からの試料中のNFDPの量と比較する工程と、(d)工程(a)の試料中のNFDPの量を、損傷の重症度と相関づける工程とを含む。
得ることができ、実験動物や緊急治療室内のヒト患者から常套的に採取することができる。したがって、NF−Hを検出するための適当なキットを入手する以外に、他に特別な工程を必要としない。
本発明は、血液やCSFなどの生物試料中のNFDPのレベルを評価する(たとえば、対象中の神経損傷を検出する)ためのキットを含む。該キットは、固体基体と、所定のNFDPに特異的に結合する少なくとも1つの捕捉抗体と、捕捉抗体に結合したNFDPを検出するために用いる当該NFDPに特異的な別の抗体と、該キットを用いて対象中の神経損傷を検出するための説明書とを含む。キットは典型的には、ELISAプレート、スライドグラス、または他の適当な基体に固定化されたNFDP特異的ポリクローナル、モノクローナル、または組換え抗体を含んでいる。固定化された抗体を、生物試料とともにインキュベートして、試料中に含まれる可能性のある特異的NFDP(例えばNF−H)を結合させる。特定の生成物の結合は、個々のNFDPに特異的な検出抗体によって判定する。検出抗体の存在は、検出抗体と反応する酵素標識抗体などの検出薬によって可視化および定量する。酵素標識抗体の存在は、該酵素に適当した発色性基質を用いて検出する。シグナルの定量化は、個々の発色物に対して最適な波長における光学密度測定によって実施することができる。より複雑な手法では、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動または結合の評価に特化された装置の使用を含む他の技術が、結合の定量という点で、かつハイスループットの用途に対して有益であるかもしれない。
のNF−Hに対するニワトリポリクローナル抗体を捕捉用として用いた。これを純粋なNF−H上にてアフィニティ精製し、標準的な方法を用いてELISAプレート上にコーティングした。検出抗体は、同様にしてアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗体とした。2つの異なる生物種において作製した2つのポリクローナル抗体の組み合わせにより、このアッセイは異例の感度を得た。さらに別の個々のNFDPに特異的に結合する他の抗体については、将来、利用性についての評価がなされるであろう。このようなキットは、NF−M,NF−L,α−インターネキシンおよびペリフェリンを検出するための試薬を含むことになろう。本発明の範囲内のキットは、グリアの損傷も評価できるようにするために、グリア繊維性酸性タンパク質(GFAP)に対する抗体プローブを含んでいてもよい。さらに進化した自動化キットは、同一の抗体試薬に基づくタンパク質マイクロアレイを用いる。このようなアレイは、基礎研究および臨床(例えば緊急治療室の)用途のいずれでも用いることができる。さらに、特定の固定化された抗体を用いた比色フィルタによるアッセイも本発明の範囲内にある。
[材料と方法]
NF−H特異的抗体の開発:ウシ組織は比較的に容易に入手可能で、ウシNF−H分子がヒトおよび他の生物種のNF−H分子と免疫学的およびタンパク質化学的に類似していることから、ウシNF−Hを用いてNF−Hと反応する抗体を調製した。ウシ脊髄組織は、地方の食肉処理場から入手し、氷上で輸送し、髄膜を剥いで、−70℃で保存した。神経フィラメントを豊富に含むゲルを本質的にデラコルテらの報告(Delacourteら,Biochem J、1980年、第191巻、p.543−546)に従って調製した。簡単に説明すると、およそ250gのウシ脊髄材料を解凍し、羽根形式のホモジナイザーで、MESバッファ(0.1M MES,1mM EGTA,0.5mM MgCl2、pH=6.5,+0.2mM PMSF)中でホモジナイズした。ホモジネートをチーズ布でろ過し、14,000rpm/29,000g、4℃で1時間遠心分離した。次いで、上清を28,000rpm/78,000g、4℃で30分間遠心分離した。グリセロールを加えて終濃度20%とし、該材料を37℃で20分間インキュベートした。上清を45,000rpm/235,000g、20℃で30分間遠心分離した。各調製あたり、典型的には、約3gの透明の黄色がかったペレットが回収された。これらのペレットは典型的には、約90%のNF−L、NF−MおよびNF−Hと、より少量のGFAPおよびフォドリン/スペクトリンとを含んでいる。この材料を10mMリン酸バッファ、1mMEDTA、0.1%β−メルカプトエタノール、pH=7.5中の6M尿素に溶解し、同バッファで平衡化しておいたDEAEセルロースカラムにアプライした。タンパク質を、同バッファ中0M〜0.25MのNaCl勾配を用いて溶出した。単一のきれいなNF−Hタンパク質のバンドが、約0.05MのNaClにおいて溶出されたので、この材料を約lmg/mlに濃縮し、PBSに対して透析した。250μgの精製NF−Hを、1:1の比でフロイント完全アジュバントと混合してマウス、ウサギ、およびニワトリに注射し、3週間後には200μgをフロイント不完全アジュバントと1:1の比で混合して、動物に追加投与した。
調製物をCPCA−NF−Hと名付け、ウサギポリクローナル血清をRPCA−NF−Hと名付け、マウスモノクローナル抗体をMCA−NP1と名付ける。これら全ては現在ではEnCor Biotechnology Inc.(米国フロリダ州アラチュア所在)より市販されている。アッセイにおいて使用する前に、ウサギ血清およびIgY調製物のいずれも、臭化シアン活性化セファロース(商標)4B(シグマ(Sigma)社)に結合させた精製NF−Hでアフィニティ精製した。マウスモノクローナル抗体は、Hi−Trap(商標)プロテインGカラム(アマシャム(Amersham)社)で、製造業者の説明書に従ってアフィニティ精製した。溶出した抗体をPBSに対して透析してからELISAアッセイにおいて使用した。
水を自由摂取として回復させた。必要に応じて膀胱から尿を絞り出し、水分を与えた。損傷を与えた動物の場合、血液試料は、2時間、8時間、16時間、24時間、2日、およびその後11日目までの毎日、尾部からの採血により採取した。典型的な結果を図2に示す。ELISAでは、損傷から3〜4日目の血清中NF−Hの強いピークが一貫して示されている。しかしながら、NF−Hは、早ければ損傷から8時間後で確実に検出され、損傷から2時間後に弱いが再現性のあるシグナルが見られることは特筆すべきである。ELISAアッセイから、損傷部位から採取した血液中の、NF−Hの一貫した著しい発現が示され、実際には、それ以降の時点における血清中に見られるよりもはるかに高いレベルであった。これらの実験は、NF−Hが、神経損傷後、迅速に血中に放出され、実験的神経系損傷後の数時間および数日にわたって、一貫して再現性よく検出されることを実証するものである。
上述のアッセイに加えて、動物血清中のNFDPを検出するのに有用な多くの変法が可
能である。たとえば、アビジン−ビオチン共役物に基づく方法を使用することにより、ELISAアッセイの感度を大幅に向上させることができるかもしれない。他の例としては、抗体濃度を高めることや室温ではなく37℃でのインキュベーションを用いるなどの変更によって、アッセイが向上するかもしれない。NF−H血清レベルを数分で判定できる迅速な比色法または他の方法を含むアッセイの開発も想像できる。このような手法は、ヒト患者の診断において潜在的に有用である。例えば、血清および他の流体中に見られる他の種類のバイオマーカーに対して開発されてきたような、フィルタ内で行う単純な拡散および抗体捕捉手順を用いた、血清中のNF−Hを検出するキットが特に有用であるかもしれない。このキットは、本明細書中に説明した例だけでなく様々な状況において神経損傷の程度を定量するために用いることができよう。このようなマーカーを検出するアッセイは、動物研究において実験的に有用であり、ヒトにおいては診断的に有用であると予測できる。特に、脊髄損傷および外傷性脳損傷患者における神経損傷の程度をMRIまたは他の現行の画像化方法によって判定することは難しい。本発明のように容易に検出できる神経タンパク質の検出に基づいたアッセイであれば、そのような事故の犠牲者における神経損傷の程度を迅速に評価することができるであろう。本発明の方法および組成物を用いて、NF−H発現のレベルを、特定の神経損傷の程度および特定の予後と相関づけることができると予想される。
上記の明細書は多くの細目を含んでいるが、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、その好ましい実施形態の例として記載したものである。多くの他の変形が可能である。したがって、本発明の範囲は、例示した実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲とそれらの法的均等物によって決定されるべきである。
Claims (5)
- 対象における神経損傷の検出方法であって、
(a)対象に由来する血液、血清、または血漿試料を、NF−Hと特異的に結合する抗体と接触させる工程と、
(b)前記試料中のNF−Hの存在または量を検出する工程と、
(c)試料中のNF−Hの存在または量を神経損傷と相関づける工程と
を備える方法。 - 試料中のNF−Hの存在または量を検出する工程(b)は、イムノブロッティング、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫拡散法または免疫沈降からなる群より選択される免疫学的検定を実施することを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 試料中のNF−Hの存在または量を検出する工程(b)は、ELISAを実施することを含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記請求項1〜3のいずれかに記載の方法により対象における神経損傷を検出するためのキットの使用方法であって、
(a)固体基体と、
(b)NF−Hに特異的に結合する少なくとも1つの抗体と、
(c)少なくとも1つの抗体とNF−Hとの結合を検出するための試薬と、
(d)対象における神経損傷を検出するためのキットの使用説明書とを含むキットの使用方法。 - NF−Hに対する少なくとも1つの抗体の結合を検出する試薬が、発色性基質分子を含むことを特徴とする請求項4に記載の使用方法。
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