JP2021012094A - アルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー及び診断用キット、脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法、並びに被験者におけるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の検出を補助するためのインビトロの方法 - Google Patents
アルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー及び診断用キット、脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法、並びに被験者におけるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の検出を補助するためのインビトロの方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1] HSP90からなるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[2] HSP90とHSP90以外のバイオマーカーとを組み合わせてなるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[3] 前記HSP90以外のバイオマーカーがCD63及びフロチリンからなる群から選択される少なくとも1つである、[2]に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[4] 前記HSP90以外のバイオマーカーがCD63である、[2]又は[3]に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[5] 前記HSP90以外のバイオマーカーがフロチリンである、[2]又は[3]に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[6] 前記HSP90以外のバイオマーカーがCD63及びフロチリンである、[2]又は[3]に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[7] 脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量を評価するための、[1]〜[6]のいずれか1つに記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
[8] HSP90に特異的な抗体を含む、アルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
[9] さらに、CD63に特異的な抗体を含む、[8]に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
[10] さらに、フロチリンに特異的な抗体を含む、[8]又は[9]に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
[11] 脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量を評価するための、[8]〜[10]のいずれか1つに記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
[12] 被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定して測定値を得る工程、及び
前記HSP90濃度の測定値を基準値と比較する工程
を含む、脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法。
[13] さらに、
被験者由来の血液検体中のCD63濃度を測定して測定値を得る工程、及び
前記CD63濃度の測定値を基準値と比較する工程
を含む、[12]に記載の脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法。
[14] さらに、
被験者由来の血液検体中のフロチリン濃度を測定して測定値を得る工程、及び
前記フロチリン濃度の測定値を基準値と比較する工程
を含む、[12]又は[13]に記載の脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法。
[15] 被験者におけるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の検出を補助するためのインビトロの方法であって、被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定する工程を含む、方法。
[16] さらに、
被験者由来の血液検体中のCD63濃度を測定する工程
を含む、[15]に記載の方法。
[17] さらに、
被験者由来の血液検体中のフロチリン濃度を測定する工程
を含む、[15]又は[16]に記載の方法。
「発症前アルツハイマー病」は、脳内Aβの蓄積が認められるが、認知障害の症状は無い病態をいう。
血液は、全血、血漿又は血清のいずれでもよいが、血漿又は血清が好ましく、血清がより好ましい。
本発明のアルツハイマー病(AD)又は発症前アルツハイマー病(発症前AD)の診断用マーカー(以下、単に「本発明の診断用マーカー」という。)は、HSP90(ヒートショックプロテイン90)からなる。
また、血液中のHSP90濃度とアミロイドPETイメージングによる脳内Aβ蓄積量とは逆相関することが確認されている。
前記基準値としては、この値以下であるとADであることが疑われる基準値が考えられる。被験者の血液中のHSP90の測定値がこの基準値以下であっても、臨床症状として認知障害が現れていない場合は、発症前ADと診断できる。また、被験者の血液中のHSP90の測定値がこの基準値を超えておりADが否定される場合であっても、臨床症状として認知障害が現れているときは、AD以外の認知障害であると診断できる。
前記HSP90以外のバイオマーカーは、CD63及びフロチリンからなる群から選択される少なくとも1つが好ましく、CD63又はフロチリンがより好ましく、CD63がさらに好ましい。
また、血液中のCD63濃度とアミロイドPETイメージングによる脳内Aβ蓄積量とは逆相関することが確認されている。
(1)血液検体(全血、血漿又は血清)を用いるため、侵襲が少なく、腰椎穿刺により髄液を採取するのに比べて、容易に検体を採取できる。特に、被験者自身が検体を採取することも可能である。
(2)ADの発症前診断、早期診断が可能である。
(3)ADと他の脳内Aβ蓄積の無い認知障害との鑑別が可能である。
(4)アミロイドPETイメージングの代替となり得る。
本発明のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット(以下、単に「本発明の診断用キット」という。)は、HSP90に特異的な抗体及び取扱説明書を含む。
HSP90に特異的な抗体は、HSP90に対する特異的結合性を有する抗HSP90抗体である。抗HSP90抗体は、HSP90に対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。また、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分の他、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗HSP90抗体が、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv抗体等の抗体断片であってもよい。
HSP90に特異的な抗体は、上述したとおりである。
本発明の脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法(以下、単に「本発明の評価方法」という。)は、以下の工程(1)及び工程(2)を含む。
工程(1)は、被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定して測定値を得る工程である。
被験者から採取された血液検体を用意し、血液中のHSP90濃度を測定する。
血液検体の量は、特に限定されないが、0.1mL以上が好ましく、0.5mL以上がより好ましい。
まず、抗HSP90抗体を不溶性支持体に固定化する。具体的には、例えば、マイクロプレートの表面を抗HSP90抗体で感作する(コートする)。このように固相化した抗体に対して、血液検体を接触させる。この操作の結果、固相化した抗HSP90抗体に対する抗原(HSP90)が血液検体中に存在していれば免疫複合体が形成される。洗浄操作によって非特異的結合成分を除去した後、酵素を結合した抗体を添加して免疫複合体を標識し、次いで、酵素の基質を反応させて発色させる。そして、発色量を指標として、免疫複合体を検出する。
指数とする場合は、予め健常者又は非AD患者(non−AD群という)について、血液検体中のHSP90濃度を測定しておき、non−AD群の血液検体中のHSP90濃度の平均値を1.0とする方法が挙げられる。
工程(2)は、工程(1)で得られたHSP90濃度の測定値を基準値と比較する工程である。
工程(1)の測定値を基準値と比較して、脳内へのAβの蓄積量を評価する。
指数で設定する場合は、予めnon−AD群について、血液検体中のHSP90濃度を測定しておき、non−AD群の血液検体中のHSP90濃度の平均値を1.0として、基準値を、例えば、0.8とする方法が挙げられる。基準値は1つに限定されず、例えば、0.8及び0.4とするなど、2つ以上設定してもよい。
具体的には、脳内へのAβの蓄積量が基準値以上であれば、AD又は発症前ADであると診断し、さらに、認知障害の有無と組み合わせて、AD、発症前ADの診断ができる。また、脳内へのAβの蓄積量が基準値未満であれば、AD及び発症前ADが否定され、さらに、認知障害があれば、AD以外の認知障害であると診断でき、認知障害がある被験者のADとAD以外の認知障害の鑑別が可能となる。
工程(3):
工程(3)は、被験者由来の血液検体中のCD63濃度を測定して測定値を得る工程である。工程(3)は、抗HSP90抗体に代えて抗CD63抗体を用い、血液検体中のCD63濃度を測定する点を除いて、工程(1)に準じる。
工程(4):
工程(4)は、工程(3)で得られたCD63濃度の測定値を基準値と比較する工程である。工程(4)は、HSP90濃度に代えてCD63濃度の測定値を用いる点を除いて、工程(2)に準じる。
工程(5):
工程(5)は、被験者由来の血液検体中のフロチリン濃度を測定して測定値を得る工程である。工程(5)は、抗HSP90抗体に代えて抗フロチリン抗体を用い、血液検体中のフロチリン濃度を測定する点を除いて、工程(1)に準じる。
工程(6):
工程(6)は、工程(5)で得られたフロチリン濃度の測定値を基準値と比較する工程である。工程(6)は、HSP90濃度に代えてフロチリン濃度の測定値を用いる点を除いて、工程(2)に準じる。
例えば、健常者由来の血液検体中のHSP90濃度等の測定値の平均を1.0として、被験者由来の血液検体中のHSP90濃度等の測定値を指数化できるようにしておき、指数を掛け合わせる方法等が挙げられる。具体的には、HSP90、CD63、フロチリンのいずれについても、AD患者では健常者よりも低値となることから、被験者由来の血液検体中のHSP90濃度の指数が0.6、CD63濃度の指数が0.5であれば、これらを掛け合わせたHSP90×CD63は、0.3となる。指数が1.0よりも小さいものをかけ合わせれば値はより小さくなるので、健常者とよりよく分離できるようになる。
本発明の被験者におけるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の検出を補助するためのインビトロの方法(以下、単に「本発明のインビトロの方法」という。)は、被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定する工程を含む。
被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定する工程は、上述した脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法における工程(1)と同様である。
さらに、上述した脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法における工程(2)と同様の工程、すなわち、測定して得られたHSP90濃度を基準値と比較する工程を含んでもよい。
本発明のインビトロの方法が、被験者由来の血液検体中のCD63濃度を測定する工程を含む場合において、さらに、上述した脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法における工程(4)と同様の工程、すなわち、測定して得られたCD63濃度を基準値と比較する工程を含んでもよい。
本発明のインビトロの方法が、被験者由来の血液検体中のフロチリン濃度を測定する工程を含む場合において、さらに、上述した脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法における工程(6)と同様の工程、すなわち、測定して得られたフロチリン濃度を基準値と比較する工程を含んでもよい。
解析対象としたのは下記のサンプルである。これらの解析に当たっては、名古屋市立大学、大分大学の倫理審査委員会の承認を受けた。
(i) 臨床診断(アミロイドPET検査でアミロイド沈着陽性)でADと診断された人の血清(−80℃で凍結保存)
(ii)臨床診断(アミロイドPET検査でアミロイド沈着陰性)で非ADと診断された健常診の血清(−80℃で凍結保存)。
血清は、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、Na2HPO4 10mmol/L、KH2PO4 1.76mmol/L、pH7.4)で100倍に希釈した後、等量のサンプリングバッファー(組成は、100mM トリス−塩酸(pH7.4)、10質量% グリセロール、4質量% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、10質量% メルカプトエタノール、0.01質量% ブロモフェノールブルー)に混和させ、90℃で5分間ボイルした。
各サンプルは、10質量%トリス・トリシンSDS−PAGEで電気泳動させた後、PVDF(ポリフッ化ビニリデン)膜(イモビロン膜、ミリポア社製)に転写した。
一次抗体には、抗HSP90抗体(Purified Mouse Anti−Hsp90、BD Biosciences Pharmingen社製)、抗CD63抗体(CD63/MLA1ポリクローナル抗体、Bioss社製)又は抗フロチリン1抗体(抗フロチリン1ウサギ宿主抗体、Sigma−Aldrich社製)を使用した。翌朝、PVDF膜をPBS−T(PBS−ツイーン20)溶液にて洗浄し、非特異的に結合している一次抗体を除去した後、二次抗体(抗HSP90抗体には抗マウスIgG抗体、抗CD63抗体には抗ウサギIgG抗体をそれぞれ5000倍希釈)を溶解した溶液で室温にて1時間インキュベーションした。その後、PBS−Tにて十分に洗浄した後、発色液で反応させイメージアナライザーでHSP90、CD63又はフロチリンのバンドを検出した。イメージアナライザーにインストールされているソフトウエアにてこれらのバンドの強さを定量してグラフを作成するとともに、統計学的解析をした。
血清中のHSP90、CD63又はフロチリンのレベルを解析した結果、血清においてHSP90、CD63又はフロチリンのレベルが、それぞれ、Non−ADに比べてADで有意に低下することが判明した(図1、図2、図3)。
図1(B)、図2(B)、図3(B)に、non−AD群の平均値を1.0としてnon−AD群及びAD群の各測定値を指数化して示す。
non−AD群とAD群とでは、平均値に有意な差があった。
血清中のHSP90、CD63又はフロチリンのレベルが0.4以下であれば、AD又は発症前ADである可能性が高い。重度の認知障害が認められる場合はADである可能性が極めて高く、そうでない場合であっても、発症前ADである可能性が極めて高い。
血清中のHSP90、CD63又はフロチリンのレベルが0.4超0.8以下であれば、AD又は発症前ADである可能性を否定できない。アミロイドPETイメージングその他のより精密な検査を受診すべきである。
血清中のHSP90、CD63又はフロチリンのレベルが0.8超1.2以下であれば、AD又は発症前ADである可能性は低い。認知障害が認められる場合は、ADも疑うべきである。
血清中のHSP90、CD63又はフロチリンのレベルが1.2超であれば、AD又は発症前ADである可能性を否定してよい。認知障害が認められる場合は、AD以外を疑うべきである。
同じ血清サンプルを用いた解析で、HSP90、CD63、フロチリンを解析したデータを、それぞれ、non−AD群の平均値を1.0として指数化し、掛け合わせると、図4(A)〜(D)に示すように、HSP90、CD63、フロチリン単独で見られたデータ間の重複が著しく軽減された。このことから、診断用マーカーの値をそれぞれ掛け合わせることで、特異性が上昇することが分かった。
図5から、血液検体中のHSP90、CD63又はフロチリンの濃度は、アミロイドPETイメージングによる脳内Aβ蓄積量と、負の相関があることがわかる(図5(A)〜(C))。
図5(A)は、PiB SUVR(ピッツバーグコンパウンドBの標準取込値比、Aβの沈着量が多いほど高値)を横軸に、HSP90 levels(血清HSP90濃度をnon−ADの平均値を1として指数化した値、血清HSP90濃度が低いほど低値)を縦軸にとって作成したグラフである。PiB SUVRとHSP90 levelsとは、負の相関を示した。なお、図5(A)〜(B)において、PiB SUVRは、アミロイドPETイメージングによって測定した脳内Aβ沈着レベルに基づく。
図5(B)は、PiB SUVRを横軸に、CD63 levels(血清CD63濃度をnon−ADの平均値を1として指数化した値、血清CD63濃度が低いほど低値)を縦軸にとって作成したグラフである。PiB SUVRとCD63 levelsとは、負の相関を示した。
図5(C)は、PiB SUVRを横軸に、Flotillin×HSP90×CD63 levels(血清HSP90濃度をnon−ADの平均値を1として指数化した値と、血清CD63濃度をnon−ADの平均値を1として指数化した値と、血清フロチリン(Flotillin)濃度をnon−ADの平均値を1として指数化した値とを掛け合わせた値)を縦軸にとって作成したグラフである。PiB SUVRとFlotillin×HSP90×CD63 levelsとは、相関係数が、r=−0.5194、P<0.027(Spearman rho関数)と有意差があり、負の相関を示した。フロチリン、HSP90、CD63の値を掛け合わせた指数は、脳内Aβ沈着レベルと逆相関する。
血液検体中のHSP90、CD63又はフロチリンの濃度とアミロイドPETイメージングによる脳内Aβ蓄積量の検量線を作成して、血液検体中のHSP90、CD63又はフロチリンの濃度を脳内Aβ蓄積量に換算してもよい。
Claims (17)
- HSP90からなるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- HSP90とHSP90以外のバイオマーカーとを組み合わせてなるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- 前記HSP90以外のバイオマーカーがCD63及びフロチリンからなる群から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- 前記HSP90以外のバイオマーカーがCD63である、請求項2又は3に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- 前記HSP90以外のバイオマーカーがフロチリンである、請求項2又は3に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- 前記HSP90以外のバイオマーカーがCD63及びフロチリンである、請求項2又は3に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- 脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量を評価するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー。
- HSP90に特異的な抗体を含む、アルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
- さらに、CD63に特異的な抗体を含む、請求項8に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
- さらに、フロチリンに特異的な抗体を含む、請求項8又は9に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
- 脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量を評価するための、請求項8〜10のいずれか1項に記載のアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用キット。
- 被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定して測定値を得る工程、及び
前記HSP90濃度の測定値を基準値と比較する工程
を含む、脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法。 - さらに、
被験者由来の血液検体中のCD63濃度を測定して測定値を得る工程、及び
前記CD63濃度の測定値を基準値と比較する工程
を含む、請求項12に記載の脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法。 - さらに、
被験者由来の血液検体中のフロチリン濃度を測定して測定値を得る工程、及び
前記フロチリン濃度の測定値を基準値と比較する工程
を含む、請求項12又は13に記載の脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法。 - 被験者におけるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の検出を補助するためのインビトロの方法であって、被験者由来の血液検体中のHSP90濃度を測定する工程を含む、方法。
- さらに、
被験者由来の血液検体中のCD63濃度を測定する工程
を含む、請求項15に記載の方法。 - さらに、
被験者由来の血液検体中のフロチリン濃度を測定する工程
を含む、請求項15又は16に記載の方法。
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