LU86652A1 - Verfahren zum auffinden von gewebslaesionen - Google Patents

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Description

I “T BL-3963
_ Q A lf C 0 GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG
Brevet N° Q 0 0 v t
Monsieur le Ministre 4 du 10 novembre 1986 de l’Économie et des Classes Moyennes , =ΣLa| Service de la Propriété Intellectuelle
__Z_ LUXEMBOURG
^
Demande de Brevet d’invention / . ---------------------------------—...................................................................—-------------------------------------------------- (i) I. Requête
La soc,-dite PROGEN. BIOTECHNIK Gmbü, Im Neuenheimer Feld . 519, __________„. ( 2) -U...-......6900.........Heidelberg------------------------------------------------------------------------------------------------------------..._______________ représentée par E.Megers & E. T. Freilinger, Ing.conseils en propreind., ^ ^ 46 rue du Cimetière. Luxembourg,______agissant en qualité de mandataires________ déposent) ce —dix novembxe. mil-Jieuf cent , quatre vingt six___( 4) à 10_______ heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: nVerfahrerL...zum.Auffinden.....von......Gewebsläsionen"__ ( 5) 2. la description en langue______allemande_________________________________de l’invention en trois exemplaires; 3. ............-..............................................planches de dessin, en trois exemplaires; ' 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 10 novembre 1986_______; 5. la délégation de pouvoir, datée de_____Heidelb.org.________________ le 5 novembre . 1986 ____; ! 6. le document d’ayant cause (autorisation); 1 déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont): ( 6) 1 ...2-.....Dr.Garda.....BRUDERt......Bergheimer....S±rasse 11 OA,.....1.....-....6.900.Heidelberg___________________________ ! .,2.,.......Prof........Dr Werner Wilhelm FRANKE,.....Landfriedstrasse 6, D - 6900 Heidelberg revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d'une (des) demande(s) de ( 7) ..................................................................................................................................................... déposée(s) en (8)__________________________________________________________________ le (9).................................................”...................................................................................................------------------------------------------------------------------------------------------------------ sous le N° (10)......................."..................................................................................................................................................................................................................__...........
au nom de (11)__________________________“_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ élitfélisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg________________ 46 rue du.....Cimetière.f...........Luxembourg.____________________________________________________________________________________________ (12) solliciteQnt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à.............................dix-huit _ ..........................................................................mois. (13)
Le d^ô/^iji / mandataire:......Ernest.....Meyers....................-..........................-..............................-...........—..................—............................, (14) Π. Procès-verbal de Dépôt
La susditéaemande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuelle· «iLuxembourg, en date du: 10 novembre 1986
/ ** '·**'\ , I
/ Z 'f. \ Pr. le Ministre de l’Economie et des Classes Moyennes, à.........IQ...................heures f * > \ pjd.
U \ P j Le chef du service de Impropriété intellectuelle, ™-:-y/_ . w / EXPLICATIONS RELATIVES AU FOR Mi XVTJirt /_ / (1) s’il y a lieu "Demande de certificat d’addilion au brevei principal, à la demande de brevet principal No..........:THu\../.......**- (2) inscrire les nom, prénom, profession, adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social Jusque le demandeur est une personne morale - (3) inscrire * *
BL-396 3/BM
PATENTANMELDUNG Verfahren zum Auffinden von Gewebsläsionen PROGEN BIOTECHNIK GmbH Im Neuenheimer Feld 519 D . 6900 Heidelberg 1 A 57 019 5.11.86* » * g
VERFAHREN ZUM AUFFINDEN VON GEUEBSLÄSIONEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Geuebsläsionen, bei dem Körper fl üssigkeit abgezogen und untersucht wird.
Es ist bekannt, Hepatitis durch Nachweis Leber-spezifischer Enzyme im Blutserum aufzufinden. Ebenso lassen sich Myokard-Läsionen durch den Nachueis von Myokard-spezifischen Enzymen u*nd anderen löslichen Proteinen auffinden. Enzyme haben nur eine begrenzte Aktivität und viele Geuebs- beziehungsweise Zel1typ-spezifische Proteine sind nicht in Serum und anderen Körperflüssigkeiten löslich. Dadurch ist die Anwendung dieses Verfahrens begrenzt.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der eingangs genannten Art so auszugestalten, daß es möglichst weitgehend anwendbar ist.
Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß lösliche Fragmente von unlöslichen, Antigen-tragenden, intrazellulären und nicht-sezernierten Strukturen und Proteinen, immunologisch dem lädierten Gewebe zuordbaren Cytoskelettproteinen, immunologisch bestimmt „.und quantifiziert werden.
Eine Weiterbildung der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-tragenden Proteine Intermediärfi1amentpro-teine sind.
Die Erfindung macht sich dabei die folgenden Erkenntnisse aus der Zellbiologie zunutze:
Intermediärfi1ament(IF)-Proteine, die als Bestandteile des Cytoskeletts zu den unlöslichen Zel1bestandtei1 en gehören, jr v 2 A 57 019 30.10.86.
^sind durch hohe Stabilität ausgezeichnete Proteine von großer Zel1typspezifität♦ Die Zuordnung ergibt sich aus der nachfolgenden Tabelle I.
TABELLE 1
Gewebe Intermediärfi1ament- protein
Muskel- Desmin
Neuronal- Neurofi1amentproteine (NF-L, NF-M, NFH)
Mesenchymal- Vimentin
Astrozyten Gliafilament
Epithel- Cytokératine
Nach Zell-Läsion werden nicht lösliche Proteine und Strukturen vielfach proteolytisch abgebaut. Aus IF-Proteinen erhält man beispielsweise nach Abbaureaktionen die relativ stabilen alpha-helikalen Mittelstücke, die nun in Körperflüssigkeiten mit immunologischem Verfahren nachgeuiesen und bestimmt wei— den können.
Das Nachweisverfahren gjeschieht mit Hilfe eines Sandwich-ELISA, der für jeden Filament-Typ aus jeweils zwei spezifischen Antikörpern aufgebaut ist.
Als Körperflüssigkeiten kommen für das Verfahren in Betracht Serum von Blut, Cerebrospinal 1iquor, Urin, Fruchtwasser und Punktat e.
In den Punktaten können Intermediärfilamentproteine in unlöslicher Form untermischt sein. Damit diese auch bei serologischen Untersuchung mit in Betracht gezogen werden, wird -* » 3 A 57 019 30.10.86.
ayf das abgezogene Punktat abbauend eingewirkt, bis aus wenigstens einem großen Teil der eventuell im Punktat vorhandenen Intermediärfilamentproteine jeweils das alpha-hel ikal e Mittelstück abgebaut ist. Dann wird die lösliche Fraktion abgetrennt und dann werden die in der löslichen Fraktion enthaltenen alpha-helikalen Mittel stücke in löslicher Phase immunologisch identifiziert.
Um dabei sicherzustel1 en, daß die alpha-helikalen Mittelstücke beim Abbau nicht so weit mitzerstört werden, daß die Identifikation behindert wird, empfiehlt es sich, daß diese nur so weit abgebaut werden, bis sie zu 60 bis 100 Gewichtsprozent bei einer Temperatur von 0 bis 40°C (Grad Celsius) in physiologischer Kochsalzlösung löslich sind. Das geschieht durch Abstoppen der Aktivität des für den Abbau eingesetzten Enzyms durch geeignete Inhibitoren. Hierbei ist es zweckmäßig, die Intermediärfilamentproteine nur so weit abzubauen, daß bei mindestens 80 Gewichtsprozent das alpha-helikale Mittelstück intakt bleibt.
Es gibt verschiedene Cytokératine (Nr. 1 - 19), deren Expressionsmuster verschiedenen Epithelgeweben zugeordnet sind. Deshalb wird bei Cytokeratinen vorzugsweise auch die Art des jeweils zugeordneten Epithelgewebes bestimmt und quantifiziert. Auch füc. diese Zuordnung liegen hinreichende Charakteristika in den alpha-helikalen Mittelstücken vor.
Die zur Quantifizierung erforderliche Standardisierung erfolgt zweckmäßig anhand eines definierten Standards, wobei der Standard gebildet ist aus gereinigten alpha-hel ikal en Mittelstücken der jeweils zugeordneten Intermediärfilamentproteine .
Die Erfindung gestattet es, die Ergebnisse der Bestimmung und Quantifizierung unverzüglich nach Entnahme des Serums zu 4 a 57 019 30.10.86.
ermitteln. Das ist ein besonderer Vorteil.
4
Die Erfindung gestattet es weiter, den Verlauf pathologischer oder therapeutischer Prozesse - beispielsweise Bestrahlung, Chemotherapie - zu kontrollieren., bei denen Gewebe zerstört wird, indem zur Verlaufskontrolle einer geue-belädierenden Behandlung die Entnahme der Körperf1üssigkeit und die Bestimmung und Quantifizierung mehrfach zeitlich nacheinander während der lädierenden Behandlung und/oder danach erfolgt.
Die Erfindung wird nun anhand der beigefügten Beispiele näher erläutert.
1 ·% 5 A 57 019 30.10.86.
* BEISPIEL 1
Nachweis von Läsionen im Epithelgewebe 2ur Differentialdia-gnost ik
In 1 ml (Milliliter) Serum von Patientenblut werden die vorhandenen Cytokératine immunologisch durch einen Sandwich-ELISA bestimmt. Hierzu dient ein erster monoklonaler Antikörper PAN-CI. der sogenannte Fänger-Antikörper, der gegen ein erstes Epitop, das in allen im Serum vorhandenen Cytoke-ratinfragmentkomplexen vorkommt, gerichtet ist. Es sind weitere monoklonale Antikörper C-401 bis C-419 vorgesehen, sogenannte Detektor-Antikörper, die einzeln gegen zweite Epitope gerichtet sind, die spezifisch den einzelnen bekannten 19 Cytokeratinen zugeordnet sind. Das zweite Epitop ist jeweils vom ersten Epitop unabhängig und verschieden.
Die Detektor-Antikörper sind enzymatisch markiert mit Peroxidase.
Zur Standardisierung wird das gereinigte alpha-helikale Mittelstück der 19 verschiedenen Cytokératine dem gleichen Sandwich-ELISA mit den gleichen Antikörpern unterworfen. Die so erhaltenen 19 verschiedenen Cytokeratinwerte dienen dann als Bezugsgrößen für die quantitative Auswertung der Meßergebnisse. _
Auf diese Ueise ermittelt man den relativen Anteil der einzelnen Cytokératine. Das läßt eine genaue Spezifizierung des lädierten Epithelgewebes zu und Rückschlüsse auf das Ausmaß der Lädierung.
Uenn so nur die Cytokératine 8 und 18 nachgeuiesen werden, läßt das auf eine Läsion von Hepatozyten, Nierenepithel beziehungsweise von Acini, des Pankreas und der von diesen Zelltypen abgeleiteten Tumoren schließen und macht andere ' * 6 A 57 019 30.10.86.
Gewebe als Ort der Läsion unwahrscheinlich.
BEISPIEL 2
Nachweis von Läsionen im inneren Epithelialbereich
Uie Beispiel 1, .jedoch mit der Beschränkung auf den Fänger-Antikörper PAN-CI und diejenigen Detektoi—Antikörper C-408, D-418 und C-419, die den Cytokeratinen Nr. 8. Nr. 18 und Nr. 19 zugeordnet sind. Wenn die Cytokératine Nr. 8, Nr. 18 und Nr. 19 mit hinreichenden Anteilen nachgewiesen werden, läßt das auf eine Läsion im Epithelialbereich des Darmtraktes schließen und läßt anere Organe als Ort der Läsion unwahrscheinlich erscheinen.
BEISPIEL 3
Verlaufskontrolle bei der Chemotherapie eines Leberhepatoms
Die Untersuchung und Bestimmung der Cytokératine 8 und 18 nach Beispiel 1 wird wiederholt an monatlich dem gleichen Patienten entnommenen Blutproben.
BEISPIEL 4
Frühdiagnostik bei Verdacht auf Neuralrohrdefekte während der Schwangerschaft 10 ml Fruchtwasserpunktat wird zentrifugiert. Das Sediment wird im 3fachen Volumen, bezogen auf das Feuchtgeuicht, einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung < 10 rnM (millimolar) Natriumphosphat pH 7,4, 150 mH Natriumchlorid) mit Hilfe eines Messerhomogenisators bis zur breiartigen Konsistenz zerkleinert. Dem Homogenat wird Chymotrypsin im Verhältnis 1 : 1000, berechnet auf das Feuchtgewicht des Gewebes, zugesetzt. Es folgt ein Inkubationsschritt bei 30° C im Uasserbad, der nach 60 Minuten abgestoppt wird. Das Abstoppen der Enzymaktivität geschieht durch Zusatz von 5 mM 2- 7 A 57 019 30.10.86.
Nitro-4-Carboxyphenyl-N-N-Dipheny1carbamat (NCDC). Anschließend wird das Homogenat 30 Minuten bei lö4g (.g = Gravitationskonstante) zentrifugiert.
Unter diesen Bedingungen werden 80 bis 95 Gewichtsprozent der alpha-helikalen Mittelstücke in noch identifizierbarem Zustand aus den IF-Proteinen des Homogenats freigesetzt.
Die beiden gewonnenen, zentrifugierten Überstände werden gesondert, jeder für sich, immunologisch auf ihren Gehalt an Neurofilament und Gliafi1amentprotein mit einem Sandwich-ELISA untersucht. Hierzu dient für die beiden Filamenttypen je ein erster monoklonaler Antikörper NF-8 beziehungsweise GL-8, der sogenannte Fänger-Antikörper, der gegen ein jeweils erstes Epitop des alpha-helikalen Mittel Stückes der Filamentproteine gerichtet ist. Außerdem dient dazu jeweils ein zweiter monoklonaler Antikörper NF-100 beziehungsweise GL-1Û0, der sogenannte Detektor-Antikörper, der gegen ein zweites Epitop des alphahelikalen Mittelstücks des zugeordneten Filaments gerichtet ist. Das zweite Epitop ist von dem ersten Epitop unabhängig und verschieden.
Die Detektor-Antikörper NF-100 beziehungsweise GL-100 sind rnit Peroxidase gekoppelt und werden bei der Bindung an das alpha-helikale Mittel stück über die Enzymaktiviät der Peroxidase nachgewiesen. Die Standardisierung erfolgt entsprechend wie im Beispiel 1 angegeben.
Das Auftreten von Glia- beziehungsweise Neurofi1amentfrag-menten in Fruchtwasserproben weist auf Neuralrohrdefekte hin und liefert so einen wesentlich verläßlicheren und schnelleren pränatal diagnostischen Test als bisher benutzte bekannte Methoden.
k 4 <· » 8 A 57 019 30.10.86.
BEISPIEL 5-7
Uie Beispiel 1-4, wobei jedoch statt den einzelnen Cytoke-ratinen einzeln zugeordnete Fänger-Antikörper solche Fängei— Antikörper eingesetzt werden, die in Kombination die einzelnen Cytokératine erkennen. Zum Beispiel die Kombination C-501 und C-504 erkennt das Cytokeratin Nr. X, die Kombination C-501 und C-503 erkennt das Cytokeratin (X+l).
BEISPIEL 8
Gewinnung der Antikörper
Vimentin wird aus Augenlinsen von Rindern gereinigt, als Filament rekonstituiert, mit Chymotrypsin gespalten und das alpha-helikale Mittel stück chromatographisch abgetrennt und eingesetzt zur Herstellung der monoklonalen Antikörper mit Hilfe der Hybridomtechnik. Die Spezifität der Antikörper wird mit Hilfe der gereinigten al pha-hel ikal.en Fragmente festgestellt und Kreuzreaktionen mit den übrigen IF-Proteinen durch Immunreaktionen in nativem (beziehungsweise renaturiertem) und denaturiertem Zustand dieser Proteine ausgeschlossen.

Claims (12)

1. Verfahren zum Auffinden von Gewebsläsionen, bei dem Körperflüssigkeit abgezogen und untersucht wird, dadurch gekennzeichnet, daß lösliche Fragmente von unlöslichen, Antigen-tragenden, intrazel1 ulären und nicht-sezernierten Strukturen und Proteinen, immunologisch dem lädierten Gewebe zuordbaren Cytoskelettproteinen, immunologisch bestimmt und quantifiziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-tragenden Proteine Intermediärfi1ament-proteine sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommene Körperflüssigkeit Blut ist und die Bestimmung im Blutserum erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommene Körperflüssigkeit Cerebrospinal- 1iquor ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommene Körperf1üssigkeit Urin ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommene Körperf1üssigkeit Fruchtwasser ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommene Körperflüssigkeit durch Punktierung gewonnen wird. 10 a 57 019 5.11.86. , * *· »
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, s daß auf das abgezogene Punktat abbauend eingewirkt uird, bis aus wenigstens einem großen Teil der eventuell im Punktat vorhandenen Strukturproteinen lösliche Fragmente entstanden sind, daß dann die lösliche Fraktion abgetrennt uird und daß dann die in der löslichen Fraktion enthaltenen Fragmente immunologisch identifiziert werden.
9 Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei Cytokeratin in der Körperflüssigkeit die Art des jeweils zugeordneten Epithelgewebes anhand des relativen Anteils der identifizierten Cytokératine Nr. 1 bis 19 bestimmt und guantifiziert wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quant ifikation anhand eines definierten Standards erfolgt, wobei der Standard gebildet ist aus gereinigten biochemisch definierten Fragmenten des Cytoskeletts.
11. Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, __ daß die Quantifikation anhand eines definierten Standards erfolgt, wobei der Standard gebildet wird aus gereinigten alpha-helikalen Nittel stücken der jeweils zugeordneten Intermediärf ilamentproteine. 1i A 57 019 5.11.86. \ *" k
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verlaufskontrolle einer ärztlichen Behandlung die Entnahme der Körperf1üssigkeit und die Bestimmung und Quantifizierung mehrfach zeitlich nacheinander während der Behandlung und/oder danach erfolgt.
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