DE69632734T2 - QUANTIFIZIERUNG VON p97 ZUR DIAGNOSE UND ÜBERWACHUNG DER ALZHEIMHER-KRANKHEIT - Google Patents

QUANTIFIZIERUNG VON p97 ZUR DIAGNOSE UND ÜBERWACHUNG DER ALZHEIMHER-KRANKHEIT Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren zur Quantifizierung von p97, die zur Diagnose und Überwachung der Alzheimerkrankheit verwendet werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Krankheit, die die Wahrnehmung, das Verhalten und die Funktion beeinträchtigt. In einer neueren Untersuchung wurde gezeigt, dass fast 7% der Individuen im Alter von 75 Jahren von AD betroffen sind, was bis zum Alter von 85 Jahren auf mehr als ¼ steigt [Canadian Study of Health and Aging Working Group, J. Can. Med. Assoc. 150, 899–913 (1994)]. Andere Untersuchungen behaupten sogar, dass AD bei Älteren noch häufiger vorkommt [Evans, D. A. J. Am. Med. Assoc. 262, 2551–2559 (1989)]. Zur Zeit gibt es nur sehr eingeschränkte Therapiemöglichkeiten für AD, und das einzige definitive Verfahren zur Diagnose ist eine Gehirnautopsie.
  • AD ist durch verschiedene pathologische Marker im Gehirn gekennzeichnet, wie u. a. Alters-Plaques, die vorwiegend aus β-Amyloid-Protein (Aβ) bestehen, neurofibrilläre Knäuel mit hyperphosphoryliertem mikrotubulin-assoziiertem Protein Tau [Goedert, M., Spillantini et al., Neuron 8, 156–160 (1992) und Selkoe, D. J. Neuron 6, 487–498 (191)], neuronaler Zelltod und Verlust der synaptischen Verbindungen [Terry, R. D. et al., Ann. Neurology 30, 572–580 (1991)]. Es wurde vorgeschlagen, dass eine anormale Ablagerung von Protein Aβ zum neuronalen Zelltod in Bereichen des Gehirns führt, die an Wahrnehmung und Gedächtnis beteiligt sind [Blass, J. P. Neurology 43, 525–38 (1993); und Price, D. L. Ann. Rev. Neurosci. 9, 489–512 (1986)].
  • Klinisch erfolgt die Diagnose von AD durch neurologische und neuropathologische Bestimmungen, die die Erkrankung in ihrem frühen Zustand leider nicht erfassen können. Die Anwendung einheitlicher klinischer Diagnose-Kriterien, wie NINCDS-ADRDA hat die Genauigkeit einer klinischen pa thologischen Diagnose auf mehr als 80% verbessert [McKhann, G. et al., Neurology 34, 939–944 (1984)].
  • Versuche, die Mengen an Proteinen der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) mit AD zu korrelieren, hatten nur beschränkten Erfolg. Ein Test, der bspw. zur Erfassung von Aβ in der CSF entwickelt wurde, zeigte, dass sich die Gesamt-Aβ-Mengen in AD-Patienten nicht signifikant von den Kontrollen unterschieden [Shoji, M. et al., Science 258, 126–129 (1992)], obgleich Patienten mit einem frühen Beginn der AD leicht höhere Aβ-Mengen als ältere Kontrolle hatten [Nakamura, T., et al., Ann. Neurol. 36, 903–911 (1994)]. Es wurde jedoch vermerkt, dass Aβ, das auf Position 42 verlängert ist, d. h. Aβ1-42, sowohl in diffusen als auch in Altersamyloid-Plaques vorherrscht [Roher, A., et al., J. Biol. Chem. 268, 3072–3083 (1993)] und dass Aβ1-42 sowohl in der CSF von AD-Patienten gegenüber Kontrollen signifikant niedriger war [Motter, R. et al., Ann. Neurol. 38, 643–648 (1995)]. In Untersuchungen der sezernierten Form des Amyloid-Vorstufenproteins (APP), aus dem Aβ hergeleitet ist, wurde entdeckt, dass lösliches APP in der CSF von AD-Patienten gegenüber Kontrollen erheblich vermindert war [Van Nostrand, W. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2551–2555 (1992)]. Andere Untersuchungen haben jedoch nur leichte Anstiege vermerkt [Palmert, M. R. et al., Neurol. 40, 1028–1034 (1990)] oder sogar Anstiege von APP [Kitaguchi, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 166, 1453–1459 (1990)]. Untersuchungen, die zur Überwachung von Protein Tau in der CSF entwickelt wurden, ergaben, dass zwar die durchschnittlichen Tau-Spiegel in AD-Patienten gegenüber den Kontrollen erhöht waren, es aber doch eine beträchtliche Überschneidung mit normalen Kontrollen [Motter, R. et al., Ann. Neurol. 38, 643–648 (1995), Vigo-Pelfrey, C. et al., Neurology 45, 788–793 (1995)], und mit Kontrollen gab, die an anderen neurologischen Erkrankungen litten [Vandermeeren, M., et al. J. Neurochem. 61, 1828–1834 (1993)].
  • Andere CSF-Diagnose-Marker wurden in Betracht gezogen, aber für ungeeignet befunden, wie alphal-Antichymotrypsin, das mit Alters-Plaques einhergeht [Abraham, C. R. Selkoe, D. J. & Potter, H. Cell. 52, 487–501 (1988) und Ubiquitin [Wang, G. P. et al., Acta Neuropathol. (Berl.) 82, 6–12 (1991)], und zwar aufgrund von widersprüchlichen Ergebnissen und Überschneidungen zwischen AD und Kontrollen. Nicht nur diese Ergebnisse sind enttäuschend, sondern eine Routine-Probennahme für die Patienten-Diagnose wird wahrscheinlich auch nicht gut aufgenommen. Eine im Handel erhältliche Diagnoseuntersuchung wurde jedoch von Athena Neuroscience Inc. entwickelt, welcher die Messung der CSF-Tau- und Aβ1-42-Spiegeln mit der Häufigkeit des Apolipoprotein E (ApoE)-E4-Allels auf Chromosom 19 beim Mensch kombiniert. Es wurde festgestellt, dass ApoE mit Alters-Plaques einhergeht, und dass Personen, die für ApoE E4 homozygot sind, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung von AD aufweisen [Sanders, A. M. et al., Neurol. 43, 1467–1472 (1993)]. Es wird behauptet, dass diese kombinierte Analyse dem Arzt helfen kann, die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, ob ein Patienten AD hat [Motter, R. et al., Ann. Neurol. 38, 643–648 (1995)]. Der Test ist jedoch zeitaufwändig und bietet nur eine wahrscheinliche Antwort.
  • Ein jüngerer Bericht über die Untersuchung der Pupillenreaktion schlägt vor, dass AD-Patienten eine Überempfindlichkeit gegen eine verdünnte Lösung des Acetylcholin-Blockierungs-Medikamentes Tropicamid aufweisen [Scinto, L. F. et al., Science 266, 1051–1054 (1994)]. Diese Überempfindlichkeit wurde zuerst bei Patienten mit Down-Syndrom beobachtet, die ausnahmslos eine Neuropathologie entwickeln, die der AD im mittleren Alter stark ähnelt [Olson, M. I. & Shaw, C. M. Brain 92, 147–156 (1969)]. Diese Untersuchung schien zwar vielversprechend zu sein, jedoch ließen sich die Ergebnisse nicht leicht reproduzieren. Sie litten an Überschneidung und Schwierigkeiten bei der Interpretation, wie die Wirkung, die Augenstörungen oder -farbe auf die Untersuchung haben kann (Loupe, D. N. et al., Ophthalmology 103, 495–503 (1996)]. Vor kurzem wurde eine Strategie beschrieben [Parshad, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5246–5150 (1996)], wobei AD-Zellen durch Erfassung von Defekten hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Reparatur von DNA-Schaden identifiziert wurden. Es wurde geschlossen, dass sich die Untersuchung dazu eignen könnte, die Diagnose von AD zu festigen oder sie als unwahrscheinlich zu interpretieren. Der Test ist jedoch noch weit von der klinischen Praxis entfernt, da er arbeitsaufwändig ist und viele Schritte mit gezüchteten Zellen erfordert. Schließlich wurde vermerkt, dass man Abweichungen des Glucose-Metabolismus in den Gehirnen von AD-Patienten mittels Positronen-Emissions-Tomographie erfassen kann [Reiman, E. M., N. Engl. J. Med. 334, 752–758 (1996). Der Test ist zur Verwendung auf Routinebasis nicht geeignet.
  • Erhebliches Interesse erhielten die genetischen Ursachen von AD, und es wurde gezeigt, dass Mutationen in mehreren Genen eine Empfindlichkeit gegenüber einer kleinen Anzahl von familiären AD-Fällen verliehen. Mutationen im APP-Gen [Murrell, J. et al., Science 254 97–99 (1991) und Karlinsky, H. Neurology 42, 1445–1449 (1992)] auf Chromosom 21 wurden mit autosomal dominanter früh beginnender AD (< 65 Jahre) in Verbindung gebracht, und an Chromosom 14 gekoppelte Mutationen in den Präsenilinen, S182, [Schellenberg, G. D. et al., Science 258, 668–671 (1992); Van Broeckhoven, C. et al., Nature Genet 2 335–339 (1992) und Sherrington, R. et al., Nature 375, 754–760 (1995)] und an Chromosom 1 gekoppeltes STM2, [Levy-Lahad, E., et al., Science 269, 973–975 (1995) und Rogaev, E. I., et al., Nature 376, 775–778 (1995)] werden einer kleinen Anzahl von Fällen familiärer AD zugeordnet. Zudem verändert das E4-Allel des ApoE-Gens auf Chromosom 19 die Gefahr der Entwicklung der spät einsetzenden Form von AD [Sanders, A. M., et al., Neurol. 43, 1467–1472 (1993); und Rogaev, E. I. et al., Nature 376, 775–778 (1995)]. Die Entdeckung dieser Gene hat zwar einen erheblichen Wert bei der Bestimmung der Anfälligkeit einer kleinen Anzahl von Individuen zur Entwicklung von AD, jedoch ist die genetische Bestimmung bei der Erfassung oder Überwachung von AD nicht geeignet.
  • Das p97-Antigen, ebenfalls bekannt als Melanotransferrin, ist mit AD assoziiert (PCT/CA93/00272, veröffentlicht als WO94/01463 am 20. Januar 1994). p97 gehört zu der wichtigen Gruppe der Eisenbindungsproteine, die Serumtransferrin (Tf), Lactoferrin und Ovotransferrin aus Vogel-Eiweiß umfassen [Baker, E. N., Rumball et al., Trends Biochem. Sci. 12, 350–353 (1987)]. p97 kann Eisen binden und ist an der zellulären Eisenaufnahme beteiligt [Kennard, M. L. et al., Embo J. 14, 4178–4186 (1995)]. Es gibt 2 Formen von p97; eine ist über einen Glycosylphosphatidylinositol-Anker an die Zelloberfläche gebunden, und eine wird aktiv sezerniert [Food, M. R. et al., J. Biol. Chem. 269, 3034–3040 (1994)]. In einer neueren Untersuchung wurde gefunden, dass p97 und der Transferrinrezeptor (TR) übermäßig im Kapillarendothel von menschlichem Gehirn lokalisiert sind. Es wurde zwar gefunden, dass Transferrin (Tf) selbst hauptsächlich in Gliazellen lokalisiert ist [Rothenberger, S. et al., Brain Res. 712, 117–121 (1996)]. Es wurde jedoch ebenfalls gezeigt, dass im Gehirngewebe von AD-Patienten bei der Obduktion p97 spezifisch auf reaktiven Mikrogliazellen exprimiert ist, welche mit Amyloid-Plaques einhergehen [Jefferies, W. A. et al., Brain Res. 712, 122–126 (1996)]. Sämtliche anderen Mikroglia, die nicht mit Alters-AD-Plaques assoziiert sind, und solche, die sich in Gehirngewebe von anderen Neuropathologien befinden (Parkinson-Krankheit, progressive subpranukleäre Lähmung, Huntington-Erkrankung und amyotrophe Lateralsklerose) exprimierten keine nachweisbaren Mengen von p97.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder haben insbesondere gezeigt, dass die lösliche Form des Eisenbindungsproteins, p97, im Serum und in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) von Alzheimer-Patienten verglichen mit gesunden Individuen signifikant erhöht ist. Es wurde übereinstimmend bestimmt, dass die p97-Menge in Proben von Alzheimer-Patienten höher als die p97-Menge in Proben von gesunden Individuen ist. Die Erfinder haben ebenfalls deutlich gezeigt, dass die p97-Mengen in Serum mit steigender Dauer der Krankheit ansteigen. Zudem scheinen die p97-Spiegel etwa 2 Jahren vor den beobachteten AD-Symptomen anzusteigen. Die spezifische Quantifizierung von p97 kann Individuen identifizieren, die von der Erkrankung betroffen sind, und kann zur Überwachung des Beginns und des längsgerichteten Verlaufs verwendet werden.
  • Als Ergebnis dieser Befunde haben die Erfinder einen einfachen und verlässlichen Test zur Ermittlung von AD in Körperflüssigkeiten entwickelt, der ein wertvolles Werkzeug bei der Beurteilung und der Behandlung der Erkrankung ist. Die frühe Diagnose von AD mit Hilfe der Erfindung verschafft Familien mehr Zeit, für Alzheimer-Patienten die zutreffende Pflege zu planen und eliminiert die Möglichkeit von Bedingungen, welche Alzheimer-Symptome vortäuschen, wie Depression oder Schlaganfall. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls zur Überwachung der Effektivität neuer Behandlungsstrategien für AD verwendet werden. Es wurden zwar viele Medikamente zur Behandlung von AD entwickelt, es gibt jedoch kein billiges und schnelles Verfahren zur Untersuchung der Wirksamkeit dieser Medikamente. Derzeitige klinische Untersuchungen versuchen, die Effizienz mit komplexer und arbeitsintensiver Neuroverhaltens-Bestimmung zu messen.
  • Allgemein ausgedrückt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit. durch Quantifizieren von p97 in einer Körperflüssigkeitsprobe aus einem Patienten, umfassend die Schritte:
    • a) Gewinnen einer Serumprobe von einem Patienten, bei dem ein Verdacht auf eine Alzheimer-Erkrankung besteht, so dass man eine Untersuchungsprobe erhält;
    • b) Bestimmen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe; und
    • c) Vergleichen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe mit der Menge an p97 in Kontrollproben,
    wobei die Anwesenheit einer Menge an p97 in der Untersuchungsprobe, die gegenüber der Menge an p97 in den Kontrollproben erhöht ist, ein Anzeichen für das Potential der Alzheimer-Erkrankung ist.
  • Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs der Alzheimer-Erkrankung durch Quantifizieren von p97 in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit, umfassend die Schritte:
    • a) Gewinnen einer Körperflüssigkeitsprobe aus einem Patienten mit Alzheimer-Krankheit, so dass man eine Untersuchungsprobe erhält;
    • b) Bestimmen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe; und
    • c) Vergleichen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe mit einer Menge an p97 in einer ersten Untersuchungsprobe, die vorher aus dem Patienten erhalten wurde,
    wobei die Anwesenheit einer Menge an p97 in der Untersuchungsprobe, die gegenüber der Menge an p97 in der Kontrollprobe erhöht ist, ein Anzeichen für den Verlauf der Alzheimer-Erkrankung in dem Patient ist.
  • Die Beschreibung beschreibt darüber hinaus ein Verfahren zum Überwachen einer Behandlung der Alzheimer-Erkrankung durch Quantifizierung von p97 in einer Körperflüssigkeitsprobe aus einem Patienten mit Alzheimer-Erkrankung, umfassend die Schritte:
    • a) Gewinnen einer Körperflüssigkeitsprobe aus einem Patient, der wegen einer Alzheimer-Erkrankung behandelt wird, so dass eine Untersuchungsprobe erhalten wird;
    • b) Bestimmen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe; und
    • c) Vergleichen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe mit einer Menge an p97 in einer Vorbehandlungsprobe, die aus dem Patient vor der Behandlung erhalten wurde,
    wobei die Unterschiede der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe gegenüber der Menge an p97 in der Vorbehandlungsprobe die Effizienz der Behandlung anzeigt.
  • Die Erfindung schlägt weiterhin Kits vor, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Sie umfassen ein Mittel, das das Vorhandensein von p97 in einer Serumprobe erfasst, und sämtliche Reagenzien, die zur Erfassung des Vorhandenseins von p97 erforderlich sind, sowie geeignete Hilfsmittel, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden anhand der folgenden eingehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Zudem wird auf verschiedene Patent-Dokumente und Veröffentlichungen verwiesen, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Es zeigt:
  • 1 eine Kalibrierungskurve für p97-Standards;
  • 2, ein Schaubild, einen Vergleich zwischen den altersbezogenen p97-Serumspiegeln für Patienten mit Alzheimer-Krankheit und Kontroll-Individuen;
  • 3, ein Schaubild, einen Vergleich zwischen den auf die Dauer der Erkrankung bezogenen p97-Serumspiegeln für Patienten mit Alzheimer-Krankheit und Kontroll-Individuen;
  • 4, ein Schaubild, einen Vergleich zwischen den altersbezogenen Transferrin-Serumspiegeln für Patienten mit Alzheimer-Erkrankung und Kontroll-Individuen;
  • 5, ein Schaubild, einen Vergleich von Serum p97-Konzentrationen von AD-Individuen und Kontrollen mit dem Alter der Individuen;
  • 6, ein Schaubild, einen Vergleich von p97-Serumkonzentrationen von AD-Patienten mit der Zeit, da der Patient zuerst mit Symptomen von AD beobachtet wurde;
  • 7, ein Schaubild, einen Vergleich der Transferrin-Serumkonzentrationen von AD-Individuen und Kontrollen mit dem Alter der Individuen; und
  • 8, ein Säulendiagramm, das Verhältnis von p97-Serumkonzentrationen aus AD- und Ehepartner-Kontrollpaaren.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Überwachung und Diagnose der Alzheimer-Erkrankung in einem Patienten durch Quantifizieren von p97 in einer Körperflüssigkeitsprobe aus einem Patienten bereit. Das Verfahren beinhaltet die Gewinnung einer Untersuchungsprobe einer Körperflüssigkeit aus einem Patienten. Der Begriff "Patient" betrifft ein warmblütiges Tier, wie ein Säugetier, vorzugsweise ein menschliches Individuum, das von Alzheimer-Erkrankung betroffen ist, oder das unter dem Verdacht steht, dass es Alzheimer-Erkrankung hat. Der Patient kann eine Wahrnehmungsstörung aufweisen oder nicht, und der Patient kann eine Behandlung für AD erhalten. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens wird bestimmt, ob ein Individuum, das keine AD-Symptome aufweist, eine Prädisposition oder ein Potential zur Entwicklung von AD aufweist.
  • Die erfindungsgemäße Untersuchungsprobe ist Serum, wohingegen es aus einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten erhalten werden kann, einschließlich bspw. Lymphe, Galle, Speichel oder Cerebrospinalflüssigkeit. Zellproben können ebenfalls als Testprobe verwendet werden, wie Blutzellen, vorzugsweise Monocyten. Insbesondere aktivierte Makrophagen, die p97 exprimieren, können untersucht werden. Die Untersuchungsprobe wird vorzugsweise aus Serum oder CSF, am stärksten bevorzugt Serum, erhalten. Die Testproben werden mittels bekannter Techniken erhalten.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Blutserumproben aus einem Patienten erhalten. Die Proben können vor dem Gebrauch aufbewahrt und eingefroren werden (bspw. bei –80°C), und sie können unverdünnt und/oder verdünnt verwendet werden, bspw. in 50% Vol./Vol. fötalem Kälberserum (FCA) in Pandex-Puffer (DNEM mit 0,1% NaH3 und 1,0% Gew./Vol BSA).
  • p97 wird in einer Untersuchungsprobe mit einem Mittel quantifiziert, mit dem man p97 in der Untersuchungsprobe quantifizieren kann. Das Mittel erkennt und bindet p97 vorzugsweise in einer Testprobe. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper.
  • Der hier verwendete Begriff "Antikörper" umfasst polyklonale und monoklonale Antikörper; Gemische von mehr als einem Antikörper, der mit p97 reagiert (bspw. ein Cocktail von verschiedenen Antikörpertypen, die mit p97 reagieren); Vollantikörper; biologisch funktionelle Fragmente davon, die sich zum Binden des Antikörperfragmentes an p97 eignen; und chimäre Antikörper, die Anteile von mehr als einer Sorte umfassen; bifunktionelle Antikörper und tetramere Antikörper.
  • Herkömmliche Verfahren können zur Herstellung der Antikörper verwendet werden. Durch Verwendung eines p97-Peptids können bspw. polyklonale Antiseren oder monoklonale Antikörper mittels Standardverfahren hergestellt werden. Ein Säuger (bspw. Maus, Hamster, Kaninchen) kann mit einer immunogenen Form des Peptids immunisiert werden, die eine Antikörperreaktion in dem Säugetier hervorruft. Techniken zur Verleihung von Immunogenität an einem Peptid beinhalten die Konjugation an Träger oder andere Techniken des Standes der Technik. Das Peptid kann bspw. in Gegenwart eines Hilfsstoffs verabreicht werden. Der Verlauf der Immunisierung kann durch Erfassung der Antikörpertiter in Plasma oder Serum überwacht werden. Standard-ELISA- oder andere Immuntest-Verfahren können mit dem Immunogen als Antigen zur Bestimmung der Antikörperspiegel verwendet werden. Nach der Immunisierung lassen sich Antiseren erhalten und bei Bedarf polyklonale Antikörper aus den Seren isolieren.
  • Zur Herstellung monoklonaler Antikörper können antikörperproduzierende Zellen (Lymphozyten) aus einem immunisierten Tier geerntet werden und durch somatische Zellfusions-Standardverfahren mit Myelomzellen fusioniert werden, so dass diese Zellen immortalisiert werden und Hybridomzellen erhalten werden. Es gibt solche Techniken im Stand der Technik (bspw, die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Köhler und Milstein (Nature 256, 495–497 (1975) entwickelt wurde) sowie andere Techniken, wie die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)), die EBV-Hybridom-Technik zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985), Allen R. Bliss, Inc. S. 77 bis 96), und das Durchmustern kombinatorischer Antikörperbanken (Huse et al., Science 246, 1275 (1989)). Hybridomzellen lassen sich immunochemisch auf die Produktion von Antikörpern durchmustern, die spezifisch mit dem p97 reagieren, und die monoklonalen Antikörper lassen sich isolieren.
  • Alternativ kann eine SCID-hu-Maus, bspw. das Modell, das für Genpharm entwickelt wurde, zur Produktion von Antikörpern oder deren Fragmenten, die mit p97 reagieren, verwendet werden.
  • Die Antikörper können ebenfalls aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich bspw. Laboratorien oder Hinterlegungsstellen, wie der American Type Culture Collection. Der monoklonale anti-p97-Maus-Antikörper, HybC (33B6E4), kann von Dr. Shuen-Kuei Liao, McMaster Universität, Hamilton, ON, erhalten werden, der monoklonale anti-p97-Antikörper 9B6 kann von Biotechnology Laboratory, UBC, BC, Canada erhalten werden, oder der monoklonale anti-p97-Maus-Antikörper L235 kann von der American Type Culture Collection (ATCC-HB 8446 L235 (H-19)) erhalten werden.
  • Verschiedene andere Mittel, die p97 in einer Untersuchungsprobe erkennen und binden und es ermöglichen, dass es in der Probe quantifiziert werden kann, können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Der Transferrin-Rezeptor bindet bspw. an p97 und kann zur Quantifizierung von p97 in einer Untersuchungsprobe verwendet werden. Zudem bindet p97 an Eisen und an andere Metalle, die zur Quantifizierung von p97 in einer Untersuchungsprobe verwendet werden können, wobei Standardverfahren verwendet werden (siehe PCT/CA93/00272, das als WO94/01463 am 20. Januar 1994 veröffentlicht wurde und Eisenbindungstests beschreibt).
  • Mittel, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können nachweislich mit einer nachweisbaren Substanz markiert werden, oder sie können anschließend nachweisbar markiert werden. Beispiele für nachweisbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerettich-Peroxidase, Biotin, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material beinhaltet Luminol; und Beispiele für ein geeignetes Radioaktivmaterial beinhaltet radioaktives Iod I125, I131 oder Tritium.
  • Mittel, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können anschließend nachweisbar markiert werden, bspw. mit einer Substanz, die das Mittel erkennt und daran bindet. Ist das Mittel bspw. ein Antikörper (bspw. Maus-IgG-Antikörper) kann ein zweiter Antikörper, der mit dem Mittel reagiert (bspw. ein Kaninchen-anti-Maus-gamma-Globulin) und mit einer nachweisbaren Substanz wie hier beschrieben markiert ist, verwendet werden, damit das Mittel erfasst wird und die Quantifizierung dadurch ermöglicht wird.
  • Ein Mittel, das ein Antikörper ist, kann zur Erfassung und Quantifizierung von p97 in bekannten Immuntests verwendet werden, die auf der Bindungswechselwirkung zwischen einer Antigendeterminante von p97 und dem Antikörper beruhen. Beispiele für solche Tests sind Radioimmuntests, Enzymimmuntests (bspw. ELISA), Immunfluoreszenz, Immunfällung, Latex-Agglutinierung, Hämagglutinierung, Gegenstromimmunelektrophorese (CIEP), Radioimmunfällungen, Dot-Blot-Tests, Hemmungs- oder Kompetitionsassays und Sandwich-Assays.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Test verwendet, der auf einer schnellen Immunfluoreszenztechnik beruht [bspw. "Particle concentration fluorescence immunoassay" (PCFIA), beschrieben in Jolley et al., 1984, J. Im munol. Meth. 67, 21–35], damit man die p97-Spiegel in einer Probe quantifiziert oder bestimmt. Dieses Verfahren setzt Abfangantikörper (Ab) ein, die an Submikron-Polystyrol-Perlen gebunden sind. Die "aktivierte" feste Phase wirkt als ein spezifisches Absorptionsmittel für das interessierende Protein. Ein fluoreszenzmarkierter Zweit-Ab, der ebenfalls für das Protein spezifisch ist, wird dann mit der festen Abfangphase inkubiert, so dass ein Komplex gebildet wird, dessen Fluoreszenzsignal proportional zur ursprünglichen Proteinkonzentration ist. Die Reaktionen können in speziell angefertigten Platten mit 96 Vertiefungen (Katalog 22-400-1; Idexx Laboratories Inc., Wesbrook, ME) durchgeführt werden. Jede Vertiefung enthält eine 0,22 μm Celluloseacetatmembran, die es ermöglicht, dass die Vertiefungen unter Vakuum entwässert werden können, so dass der fluoreszierende Komplex am Boden jeder Vertiefung angereichert werden kann. Die Platten können dann gewaschen werden und jede Vertiefung bei verschiedenen Wellenlängen mit einem Pandex Fluoreszenz-Konzentrations-Analysegerät (FCA; Idexx) auf Fluoreszenz gemessen werden.
  • Aktivierte Perlen zur Verwendung in dem Test können mit anti-p97-Antikörpern hergestellt werden, so dass Carboxypolystyrol-Teilchen (0,77 μm, 0,25% Vol./Vol.; Idexx) beschichtet werden. Geeignete anti-p97-Antikörper umfassen den monoklonalen anti-p97-Maus-Ab, Hyb C (33B6E4; Dr. Shuen-Kuei Liao, McMaster Universität, Hamilton, ON), 9B6 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC) oder anti-p97-Kaninchen-Antiseren (Dr. Wilf Jefferies Biotechnology Laboratory, UBC, BC).
  • Der fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper kann hergestellt werden, indem der monoklonale anti-p97-Maus-Antikörper, L235 (ATCC-HB8446 L235 (H-19) oder anti-p97-Kaninchen-Antiseren (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC), verwendet werden, die mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) fluoreszenzmarkiert sind.
  • Ein p97-Standard kann aus p97, bspw. p97, das aus dem Überstand von mit Phosphatidylinositolphospholipase C (PI- PLC) behandelten Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) gereinigt wurden, die mit menschlichem p97 transfiziert waren, durch Immunaffinitäts-Chromatographie hergestellt werden.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann ein Blutserum-p97-Test in speziellen Platten mit 96 Vertiefungen (22-401-1; Idexx) durchgeführt werden, und die Fluoreszenz in FCA (Idexx) abgelesen werden. 60 μl der Blutserumprobe in der geeigneten Verdünnung in der 50% FCA-Lösung können zu einer Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen gegeben werden. p97-Standards können zur Herstellung einer Kalibrierungskurve verwendet werden. Die Herstellung einer Probenkalibrierungskurve ist in der Tabelle 1 gezeigt, und die Kalibrierungskurve ist in der Figur 1 gezeigt.
  • Die Erfinder haben entdeckt, dass die p97-Spiegel etwa 2 Jahre vor den beobachteten Symptomen der Alzheimer-Krankheit zu steigen beginnen. Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnostizierung der Alzheimer-Erkrankung oder des Potentials zur Entwicklung der Alzheimer-Erkrankung in einem Patient herangezogen werden, der keine klinisch offensichtlichen Symptome der Alzheimer-Krankheit aufweist, wodurch eine frühe Prognose für die Krankheit gegeben wird. Zur Diagnostizierung der Alzheimer-Erkrankung kann die Konzentration von p97 in der Patientenprobe mit einem Bereich von Konzentrationen von p97 in den Kontrollproben von gesunden Individuen verglichen werden, die durch zukünftige und oder rückblickende statistische Untersuchungen festgesetzt werden können. Gesunde Individuen können auf der Grundlage der NINCDS-ADRDA-Kriterien und/oder den Ergebnissen der MMS-Untersuchungen ausgewählt werden. Die gesunden Individuen haben vorzugsweise keine klinisch offensichtliche Wahrnehmungsstörung oder anderen klinischen oder pathologischen Probleme. Die Diagnose kann ebenfalls durch das Auffinden gestiegener Spiegel an p97 verglichen mit vorherigen Spiegeln, die für den gleichen Patienten quantifiziert wurden, erfolgen.
  • Erhöhte Mengen p97 in einer Untersuchungsprobe verglichen mit Kontrollen zeigen, dass der Patient Alzheimer-Krankheit oder das Potential zur Entwicklung der Alzheimer-Krankheit hat. Es werden bspw. die Mengen an p97 im Serum einer repräsentativen Anzahl von Kontroll-Individuen bestimmt, wobei die durchschnittlichen p97-Mengen bestimmt werden, oder die p97-Mengen werden gegen das Alter der Individuen, wie in 5 gezeigt, aufgetragen, und es wird eine Regressionslinie oder Grundlinie (--- in 5) für die Kontroll-Individuen festgesetzt. Die Untersuchungsprobe, die p97-Spiegel oberhalb des Durchschnitts oder der Grundlinie enthält, ist ein Anzeichen für Alzheimer-Krankheit oder das Potential für eine Alzheimer-Krankheit. Die p97-Spiegel in einer Probe von einem Patient mit Alzheimer-Krankheit, die gegenüber den Spiegeln im Serum von Kontroll-Individuen um das Eineinhalbfache oder mehr erhöht ist, insbesondere um das Doppelte oder mehr, vorzugsweise das doppelte bis das Neunfache, sind ein Anzeichen für das Potential der Alzheimer-Krankeit.
  • p97-Mengen im Serum steigen mit fortschreitender Krankheit (siehe 3 und 6). Daher kann zur Überwachung des Verlaufs der Alzheimer-Krankheit in einem Patienten die Konzentration von p97 in einer Probe aus dem Patienten mit p97-Spiegeln von vorherigen Proben aus dem gleichen Patient wie hier beschrieben verglichen werden. Der Verlauf und die Beurteilung der Erkrankung kann ebenfalls bestimmt werden, indem die Spiegel in einer Untersuchungsprobe mit den Spiegeln verglichen werden, die wie hier beschrieben von Kontroll-Individuen erhalten werden, oder Spiegeln, die von anderen Patienten mit Alzheimer-Krankheit erhalten werden. Dieser letztere Vergleich beruht auf der linearen Beziehung zwischen den p97-Spiegeln in den Proben von Körperflüssigkeiten und dem Verlauf der Erkrankung. Das Stadium der Erkrankung in einem Patienten kann bspw. durch Quantifizieren der p97-Spiegel in einer Probe aus dem Patienten und Extrapolieren von einer Standard-Kurve bestimmt werden (siehe bspw. das in 6 gezeigte Schaubild).
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können ebenfalls in einem Patienten zur Überwachung oder Beurteilung der Effizienz einer therapeutischen Behandlung für die Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Die Proben können vor, während und/oder nach der Behandlung genommen werden, und die Effizienz der Behandlung kann durch den Einfluss der Behandlung auf die p97-Konzentration in den Proben bestimmt werden. Eine wirksame Behandlung ist erwartungsgemäß eine Behandlung, die zu niedrigeren Mengen p97 in den Proben im Vergleich mit einer Kontrolle führt.
  • Es wird angenommen, dass sich das Verfahren zur Überwachung der Effizienz eines beliebigen Behandlungstyps der Alzheimer-Krankheit, insbesondere die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen, verwenden lässt, von denen man annimmt, dass sie bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit wirken. Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine gewisse Effizienz bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit haben können, umfassen Substanzen, die die cholinerge Funktion wiederherstellen oder ersetzen, wie Tacrin, Cholin, Lecithin, Huperzin A und B, Galanthamin, Methansulfonylfluorid, Physostigmin und Deprenyl.
  • Die Reagenzien, die sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Quantifizierung von p97 verwenden lassen, können in geeignete Kits verpackt werden, die die nötigen Materialien in geeignete Behälter verpackt bereitstellen. Diese Kits können Antikörper, die mit p97 reagieren, und die nötigen Reagenzien zur Quantifizierung der in einer Probe vorhandenen, an p97 gebundenen Antikörper mit den hier beschriebenen Verfahren, umfassen. Die Kits können ebenfalls geeignete Träger beinhalten, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben die erfindungsgemäße Quantifizierung von p97 in Proben von Patienten mit Alzheimer-Krankheit und Kontrollen, und die Durchführungen dieser Quantifizierung. Die Beispiele werden zur Veranschaulichung gegeben, und sollen keinesfalls einschränken.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Untersuchung der RE-p97-Spiegel im Serum von Alzheimer-Patienten
  • Ein Test zur Messung der p97-Spiegel im menschlichen Blutserum wurde entwickelt auf der Basis einer schnellen Immunfluoreszenz-Technik, "Particle Concentration fluorescence immunoassay" (PCFIA), die 1984 eingeführt wurde (Jolley et al., 1984, J. Immunol. Meth. 67, 21–35). Dieses Verfahren setzt Abfangantikörper (Ab) ein, die an Sub-Mikron-Polystyrol-Perlen gebunden sind. Diese "aktivierte" Festphase wirkt als spezifisches Absorptionsmittel für das interessierende Protein. Ein fluoreszenzmarkierter Zweit-Ab, der ebenfalls für das Protein spezifisch ist, wurde dann mit der festen Abfangphase inkubiert, wobei ein Komplex erhalten wurde, dessen Fluoreszenzsignal proportional zur ursprünglichen Proteinkonzentration war. Die Reaktionen erfolgten in speziell angefertigten Platten mit 96 Vertiefungen (Katalog 22-400-1; Idexx Laboratories, Wesbrook, ME). Jede Vertiefung erhielt eine 0,22 μm Celluloseacetat-Membran, die es ermöglichte, dass die Vertiefungen unter Vakuum entwässert werden konnten und der fluoreszierende Komplex am Boden jeder Vertiefung konzentriert wurde. Diese Platten wurden dann gewaschen und jede Vertiefung bei verschiedenen Wellenlängen mit einem Pandex Fluoreszenz-Konzentrations-Analysegerät (FCA; Idexx) auf Fluoreszenz gemessen.
  • Aktivierte Perlen zur Verwendung in dem Test wurden mit den folgenden Antikörpern zur Beschichtung von Carboxypolystyrol-Teilchen (0,77 μm, 0,25% Vol./Vol.; Idexx) hergestellt; monoklonalem anti-p97-Maus-Ab, Hyb C (33B6E4; Dr. Shuen-Kuei Liao, McMaster Universität, Hamilton, ON) oder 9B6 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC), oder anti-p97-Kaninchen-Antiseren (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC). 1 ml der Teilchen (mit dem Vortex-Gerät aufgewirbelt und 1 min mit Ult raschall behandelt) wurden zentrifugiert und in 8 ml 0,1 M MES [2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure]-Puffer, pH-Wert 4,5, resuspendiert. Dazu wurden 5,0 mg EDC [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimd], und anschließend 1 ml Antikörper (1 mg/ml) gegeben. Das Gemisch wurde regelmäßig mit dem Vortex-Gerät aufgewirbelt, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und 10 min bei 6000 U/min (Sorval HB4) inkubiert. Die Perlen wurden in 20 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,2% Natriumazid (NaN3) und 2% Gew./Vol. Rinderserumalbumin (BSA) resuspendiert. Die Perlen wurden dann 10 min bei 6000 U/min zentrifugiert, und die beschichteten Perlen wurden in 32 ml PBS mit 0,2% NaN3 und 2% BSA bei 4°C (Antikörper-Konzentration 25 μg/ml) aufbewahrt.
  • Der fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper wurde mit dem monoklonalen anti-p97-Maus-Antikörper, L235 (ATCC-HB8446 L235 (H-19)) oder anti-p97-Kaninchen-Antiseren (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC) hergestellt, die folgendermaßen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluoreszenzmarkiert wurden. 1 mg/ml FITC wurde zu Phosphatpuffer, pH-Wert 9,5 (0,15 M Na2HPO4) gegeben. Bei Fehlen von Azid wurde 0,5 ml Antikörper mit 4 mg/ml zur FITC-Lösung (0,15 ml FITC-Lösung mit 1 mg/ml) dazugegeben, und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Der fluoresenzmarkierte Antikörper war gebrauchsfertig und wurde bei 4°C aufbewahrt.
  • Ein p97-Standard wurde aus p97 hergestellt, welcher durch Immunaffinitätschromatographie aus dem Überstand von mit Phosphatidylinositolphospholipase C (PI-PLC) behandelten Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) gereinigt wurde, die mit menschlichem p97 transfiziert waren. Etwa 109 transfizierte CHO-Zellen wurden mit 1 ml PI-PLC (300 mU/ml) in PBS für 1 Std. bei 37°C behandelt. Der Überstand wurde durch Zentrifugation aus den Zellen gewonnen und durch eine 0,2 μm Membran filtriert. Der Überstand wurde dann auf eine Säule (1 × 10) mit Antikörper (HybC), der auf Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Mississauga, ONT) immobilisiert war, aufgetragen. Die Säule wurde vorher gewaschen und in PBS bei pH-Wert 7,2 regeneriert. Gebundenes p97 wurde mit 0,1 M Zitronensäure, pH-Wert 3,0 eluiert, gefolgt von Neutralisation mit 1 M Tris-HCl, pH-Wert 9,0. Das gereinigte p97 wurde mit einer 30000 MW Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Es erfolgte Dialyse gegen PBS und Sterilfiltration. Die Konzentration des Standard-p97 wurde mit dem p97-Extinktionskoeffizient bei 280 nm 1% = 12,0 cm–1 (Baker et al., 1992) bestimmt.
  • Blutserumproben wurden folgendermaßen hergestellt. Für jeden Patient wurden die folgenden Proben genommen: (a) Serumprobe, die bei –20°C aufbewahrt wurde, und (b) frisches Blut, das bei 4°C aufbewahrt wurde. Vor dem Untersuchen der Probe wurde das frische Blut zentrifugiert und das Serum gewonnen. Beide Probentypen wurden unverdünnt und/oder verdünnt in 50% Vol./Vol. fötalem Kälberserum (FCA) in Pandex-Puffer (DNEM mit 0,1% NaH3 und 1,0% Gew./Vol. BSA) untersucht.
  • Der Blutserum-p97-Test erfolgte in den speziellen Platten mit 96 Vertiefungen (22-401-1; Idexx), und die Fluoreszenz wurde wie folgt in dem FCA (Idexx) gemessen. 60 μl der Blutserumprobe in der geeigneten Verdünnung in der 50% FCA-Lösung wurde in eine Vertiefung auf der Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Jede Probe wurde doppelt oder dreifach untersucht. Zu jeder Platte wurden p97-Standards ebenfalls im Doppelansatz gegeben (300, 150, 120, 90, 60, 30, 15, 9, 6 ng/ml). Diese Standards wurden in der 50% FCA-Lösung verdünnt und zur Herstellung einer Kalibrierungskurve verwendet. Die Herstellung einer Probenkalibrierungskurve ist in Tabelle 1 gezeigt, und eine Kalibrierungskurve ist in 1 gezeigt. 20 μl der anti-p97-beschichteten Perlen (~25 μg Ab/ml) wurde zu jeder Probe gegeben und 40 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Inhalt der Vertiefungen wurden vorsichtig gemischt, indem auf die Seiten der Platte mit 96 Vertiefungen geklopft wurde. Nach der Inkubation wurden 20 μl des fluoreszenzmarkierten Zweit-anti-p97-Ab (1/75 in Pandexpuffer verdünnt (~25–40 μg/ml)) zu der Probe dazugegeben, und die Perlen wurden 5 bis 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann in dem FCA untergebracht, entwässert und 3 bis 5 Mal in PBS mit 0,1% NaH3 und 1% Gew./Vol. BSA gewaschen. Die entwässerten Platten wurden dann mit dem 485/535 nm Filterpaar bei 25× Verstärkung gelesen.
  • Die Blutserumproben wurden aus Alzheimer-(AD)-Patienten, von Ehegatten-Kontrollen und unverwandten Kontrollen erhalten. Die Tabelle 2 zeigt Probenergebnisse von p97-Blutserumkonzentrationen von p97 in AD-Patienten. Die Dauer der Erkrankung zeigt die Anzahl der vergangenen Jahre seit der Diagnosestellung des Leidens. Es ist jedoch ziemlich wahrscheinlich, dass ein einzelner Patient an dieser Krankheit schon einige Zeit vor der Diagnosestellung gelitten hat. Die Tabelle 3 zeigt die p97-Blutserumkonzentrationen in AD-Patienten- und Kontrollproben. p97-Spiegel im Serum von unverwandten Kontrollen reichten von 2,4 bis 12 ng/ml, und es wurde entdeckt, dass die Spiegel nicht mit dem Alter des Individuums anstiegen (2). Der 2 zufolge waren die p97-Spiegel im Serum von AD-Patienten verglichen mit den Kontrollen signifikant erhöht, und die Spiegel schienen mit dem Alter des Patienten anzusteigen. Die AD-Patienten hatten p97-Spiegel im Serum von mindestens 20 ng/ml. Der höchste gefundene Spiegel war 300 ng/ml. Es ist wichtig, dass die Serum-p97-Spiegel mit der Dauer der Erkrankung in AD-Patienten, wie es in 3 gezeigt ist, korreliert waren. Mit steigender Erkrankungsdauer wurden immer höhere p97-Spiegel im Serum von Patienten gefunden.
  • Die Transferrin-Serumspiegel wurden ebenfalls in Proben von AD-Patienten und Kontrollen gemessen. Es wurde kein offensichtlicher Unterschied in Transferrin-Serumspiegeln zwischen AD-Patienten und Kontrollen gefunden, und es wurde keine Korrelation zwischen dem Alter des Individuums und den Transferrin-Serumspiegeln gemessen (4).
  • Transferrin- und p97-Spiegel wurden ebenfalls in CSF- und Serum-Proben gemessen, die vorher aus einer Gruppe japanischer AD-Patienten und Kontroll-Individuen erhalten wurden. Diese Proben waren 2 Jahre eingefroren, aufgetaut und wiedereingefroren, so dass die tatsächlichen Proteinspiegel nicht die absoluten Spiegel widergeben, die ursprünglich in den Proben vorherrschten. Die in der Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse bestätigen jedoch die vorstehenden Befunde, dass die p97-Spiegel im Serum von AD-Patienten verglichen mit den Spiegeln in den Kontroll-Individuen erhöht waren. Die Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass die p97-Spiegel in der CSF in AD-Patienten verglichen mit den Kontrollen erhöht waren. Die Transferrin-Spiegel im Serum und in der CSF der AD-Patienten waren gegenüber den Kontrollspiegeln nicht erhöht.
  • BEISPIEL 2
  • Eine vollständigere Beschreibung und Diskussion der in Beispiel 1 veranschaulichten Untersuchungen sind in diesem Beispiel 2 gegeben. Die folgenden Materialien und Verfahren wurden in den in Beispiel 2 beschriebenen Untersuchungen verwendet.
  • Kanadische Individuen: Die AD-Individuen (N = 27) wurden unter denjenigen ausgewählt, die am Clinical Trials Programme der UBC-Klinik für Alzheimer-Krankheit und verwandte Störungen, Vancouver Hospital, teilnahmen. Sämtliche AD-Individuen wurden gemäß den NINCDS-ADRDA-Kriterien als "klinisch wahrscheinlich" diagnostiziert. Die geschätzte Dauer der Wahrnehmungs-Symptomatologie wurde für sämtliche AD-Individuen bestimmt. Die Individuen standen zum Zeitpunkt dieser Untersuchung nicht unter einer experimentellen Medikation. Die Kontrollen, die entweder zufallsgemäß aus gesunden Freiwilligen (N = 15) oder fürsorgenden Ehegatten (N = 10) ausgewählt waren, zeigten keine klinisch offensichtliche signifikante Wahrnehmungsstörung.
  • Es wurden zwei Untersuchungen durchgeführt: a) Serumproben wurden unmittelbar nach der Venenpunktur bei 4°C aufbewahrt und innerhalb von 24 Std. auf p97 und Tf untersucht. 17 AD-Individuen (10 Frauen, 7 Männer) im Alter von 51 bis 82, 5 Jahren, (66, 4 ± 17, 52 Jr.) wurden mit 15 Kon trollindividuen (6 Frauen, 9 Männer) im Alter von 28 bis 76 Jahren (52,33 ± 16,5 Jr.) verglichen. b) Serumproben von Ehepaaren (N = 10 Paare) wurden sofort nach der Venenpunktur bei –20°C eingefroren aufbewahrt. Die Proben wurden von den Ehepaaren zeitgleich entnommen, eingefroren und dann gleichzeitig analysiert. Die AD-Patienten (7 Frauen, 3 Männer) im Alter von 54 bis 86 Jahren (70,6 ± 10,47 Jr.) wurden mit ihren Nicht-AD-Ehepartnern (3 Frauen, 7 Männer) im Alter von 53 bis 84 Jahren (69,9 ± 10,21 Jr.) verglichen.
  • Japanische Individuen. 8 AD-Individuen (6 Frauen, 2 Männer) im Alter von 61 bis 80 Jahren (71,5 ± 6,52 Jr.) wurden untersucht und mit 7 Kontrollindividuen (4 Frauen, 3 Männer) im Alter von 57 bis 72 Jahren (66,57 ± 6,4 Jr.) verglichen. Die Serum- und CSF-Proben von den AD-Individuen und Kontrollen wurden von der Neurologie-Abteilung der School of Medicine, Chiba Universität, erhalten. Sämtliche AD-Individuen wurden nach den NINCDS-ADRDA-Kriterien als "klinisch wahrscheinlich" diagnostiziert. Die Kontrollen stammten von älteren Individuen, die an den folgenden Neuropathologien litten: 1 an Parkinson-Erkrankung, 2 an spinocerebellarer Degeneration, 1 an amyothropher Lateralsklerose, 2 an Cervixspondylose und 1 an peripherer Neuropathie. Die Serum- und CSF-Proben wurden sofort nach der Entnahme bei –20°C eingefroren und gemeinsam und identisch vor der Analyse aufgetaut.
  • p97-Test. Die Proben wurden unverdünnt und verdünnt in 50% Vol./Vol. fötalem Kälberserum in DMEM-Puffer mit 0,1% Natriumazid und 1,0% Gew./Vol. Rinderserumalbumin untersucht. Der anti-p97-Maus-Antikörper, HybC, wurde zur Beschichtung der Carboxypolystyrol-(0,77 μm)-Abfangteilchen verwendet, und der monoklonale anti-p97-Maus-Antikörper, L235 (ATCC-HB 8446 L235 (H-19)) wurde fluoreszenzmarkiert (Kennard, M. L., EMBO J. 14, 4178–4186 (1995). Standards von p97 wurden frisch in DMEM-Puffer mit fötalem Kälberserum im Bereich von 300 bis 1 ng/ml hergestellt. Der Test bestand aus dem Mischen von 60 μl Proben und Standards mit 20 μl Abfangteilchen (~25 μg Antikörper/ml) in den speziellen Platten mit 96 Vertiefungen und Inkubieren für 40 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurden 20 μl des fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpers (~25 bis 40 μg/ml) dazu gegeben und das Gemisch weitere 5 bis 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann in einem "Pandex Fluoreszenz-Konzentrations-Analysegerät" (Jolley, M. J. Immunol. Methods 67, 21–35 (1984)), entwässert und bis zu 4 Mal mit PBS mit 0,1% Natriumazid und 1,0% Rinderserumalbumin gewaschen. Die entwässerten Platten wurden dann mit dem 485/535 Filterpaar bei 25× Verstärkung gelesen. Die p97-Konzentrationen wurden aus einer Kalibrierungskurve bestimmt, die aus den p97-Standards hergestellt wurde, welche die Fluoreszenz mit der p97-Konzentration korrelierte. Sämtliche Proben wurden bei verschiedenen Verdünnungen dreifach untersucht, und die Konzentration über alle Ergebnisse gemittelt.
  • Transferrin-Test. Dieser Test beruht auf dem vorher beschriebenen "Particle Concentration Fluorescence Immunoassay ". Die Anti-Mensch-Transferrin-Ziege-Antiseren wurden auf die Abfangteilchen aufgebracht, und Anti-Mensch-Transferrin-Schaf-Antiseren wurden fluoreszenzmarkiert. Die Transferrin-Standards wurden im Bereich von 3 bis 0,5 μg/ml frisch hergestellt. Sämtliche Proben wurden bei verschiedenen Verdünnungen untersucht, und die Konzentration aus sämtlichen Ergebnissen gemittelt.
  • Ein quantitativer Test wurde entwickelt, der die Konzentration von p97 in menschlichen Körperflüssigkeiten überwachen kann. Der Test beruhte auf einer schnellen Immunfluoreszenz-Technik, "Particle Concentration Fluorescence Immunoassay", welcher Abfangantikörper, die an Submikron-Polystyrolperlen gebunden sind, und fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper einsetzt, (Kennard, M. L. et al., Biotech. Bioeng. 42, 480–486, 1993). Der modifizierte Sandwich-Assay wurde in speziell entworfenen Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, die 0,22 μm Celluloseacetat-Membranen enthielten. Die Vertiefungen können unter Vakuum entwässert werden, so dass der fluoreszierende Komplex am Boden jeder Vertiefung konzentriert werden kann. Die Platten können gewaschen werden und jede Vertiefung auf Fluoreszenz gelesen werden, wobei die Fluoreszenz proportional zur p97-Konzentration ist. p97 erwies sich in menschlichem Serum als partiell instabil und verlor beim Aufbewahren Antigenität. Die Tabelle 5 zeigt die Wirkung der Aufbewahrungstemperatur und -dauer auf die nachweisbare Konzentration von p97, das dem Serum zu Beginn in einer Konzentration von 100 ng/ml zugesetzt war. p97 blieb in Proben, die 30 min bei 60°C einem Wärmeschock ausgesetzt waren, nicht erfassbar (überraschenderweise schien Tf durch diese Behandlung unbeeinträchtigt zu sein) und Proben, die bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden, verloren bis zu 20% Antigenität über 48 Std. Die Proben waren jedoch über einen Zeitraum von 48 Std. relativ stabil, wenn sie bei 4°C und –20°C aufbewahrt wurden, obwohl das Einfrieren und Auftauen die Erfassung von p97 weiter reduzierte. Aus diesem Grunde wurden die Serumproben in einer Untersuchung, wobei die Serum-p97-Konzentration aus AS-Patienten mit kognitiv normalen Kontrollen verglichen wurde, sofort nach der Entnahme bei 4°C aufbewahrt und innerhalb von 24 Std. untersucht. Die 5 zeigt, dass sämtliche AD-Patienten erhöhte p97-Spiegel in ihrem Serum verglichen mit den Kontrollen hatten und es keine Überschneidung gab. Die mittlere p97-Konzentration der AD-Gruppe (N = 17, 43,8 ± 11,6 ng/ml) unterschied sich signifikant von dem Mittel der Kontrollgruppe (N = 15, 7,04 ± 3,28 ng/ml) auf der Basis des gepaarten t-Test (t0,05 = 12,96, p = 6,6 × 10–10). Bisher gab es nur eine weitere Untersuchung von p97 in menschlichem Blut (Brown, J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539–543, 1981), als p97 im Bereich von 1,3 bis 2,7 ng/ml erfasst wurde. Das mittlere Alter der Kontrollgruppe (52,3 ± 16,5 Jr.) war zwar niedriger als das mittlere Alter der AD-Gruppe (66,4 ± 17,52 Jr.), jedoch zeigte die lineare Regression, dass es keine signifikante Korrelation zwischen der p97-Serum-Konzentration und dem Alter des Individuums gab (AD-Patienten: N = 17, Steigung der Regressionslinie = 0,359, R = 0,30, p = 0,249; Kontrollen: N = 15, Steigung der Regressionslinie = 0,07, R = –0,35, p = 0,197). Wurden die Daten für die AD-Patienten darüber hinaus gegen die Zeit aufgetragen, da der Patient zuerst mit AD-Symptomen beobachtet wurde (6), zeigte die lineare Regression, dass es eine signifikante Korrelation zwischen der gesteigerten p97-Serum-Konzentration und dem Verlauf der Erkrankung gab (N = 17, Steigung der Regressionslinie = 3,3, R = 0,82, p = 0,0003). Schließlich legte die Extrapolation der linearen Regression zur maximalen p97-Konzentration der Kontrollen nahe, dass die p97-Konzentration ungefähr 2 Jahre vor den beobachteten AD-Symptomen zu steigen beginnt.
  • Zur Eliminierung der Möglichkeit, dass p97 nichtspezifisch in AD ansteigt, wurde ein weiteres eisenbindendes Protein aus dem Blut, Transferrin (Tf) im Serum von AD-Patienten und Kontrollen analysiert. Die 7 zeigt, dass es nur einen kleinen Unterschied zwischen den Tf-Konzentrationen beider Populationen gab. Die mittlere Tf-Konzentration der AD-Gruppe (N = 17, 1,81 ± 0,71 mg/ml) unterschied sich nicht signifikant vom Mittel der Kontrollgruppe (N = 15, 1,93 ± 0,78 mg/ml), auf der Basis des gepaarten t-Tests (t0,05 = 0,41, p = 0,69).
  • Bei einer weiteren Untersuchung wurden die Serumspiegel von p97 aus AD-Patienten mit ihren kognitiv normalen Ehepartnern verglichen, und es wurde bestimmt, ob sich die Ernährung, der Lebensstil oder ein anderer gemeinsamer Faktors auf die p97-Konzentration im Serum auswirkt. In diesem Fall wurden die Serum-Proben unmittelbar nach der Entnahme bei –20°C eingefroren. Die 8 vergleicht die Verhältnisse von Serum-p97-Spiegeln von 10 AD-Patienten-Paaren (70,6 ± 10,47 Jr.) und als Kontrolle ihre Ehepartner (69,9 ± 10,21 Jr.). In sämtlichen Fällen waren die p97-Serumspiegel gegenüber den Ehepartnerkontrollen erhöht, wobei die Verhältnisse von 1,6 bis 32,5 (Mittel 10,17 ± 9,08) reichten. Diese Befunde beweisen, dass Um weltfaktoren wahrscheinlich nicht die Ursache für erhöhte p97-Serumspiegel bei AD-Patienten sind.
  • p97- und Transferrin-Spiegel im Serum und CSF
  • In einer dritten Untersuchung wurden gefrorene Proben von Serum und CSF aus AD-Patienten und Kontrollen japanischen Ursprungs auf Tf und p97 untersucht. Die in dieser Untersuchung verwendeten Kontrollen waren Individuen, die an verschiedenen anderen Neuropathologien litten. Sie wurden untersucht, um zu bestimmen, ob p97-Serumspiegel bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen erhöht waren. Diese Serumproben waren jedoch eingefroren und wurden gemeinsam und auf identische Weise vor der Analyse aufgetaut, was die p97-Erfassung unglücklicherweise senkte. Der Tabelle 6 zufolge waren jedoch trotzdem einige Beobachtungen erwähnenswert. Die mittlere Konzentration von p97 war in der CSF von AD-Patienten (N = 5, 22,4 ± 9,21 ng/ml; mittleres Alter 72,4 ± 5,99 Jr.) im Vergleich zu Kontrollen (N = 5, 8,48 ± 4,02 ng/ml; mittleres Alter 67,2 ± 6,82 Jr.) erhöht. Diese Konzentrationen unterschieden sich signifikant auf der Basis des gepaarten t-Tests (t0,05 = 2,90, P = 0,044). Dies galt ebenfalls für p97 im Serum, wo sich die mittlere p97-Konzentration der AD-Gruppe (N = 4, 11,3 ± 2,76 ng/ml; mittleres Alter 74,3 ± 5,63 Jr.) signifikant vom Mittel der Kontrollgruppe (N = 6, 2,01 ± 1,75 ng/ml; mittleres Alter 65,6 ± 6,52 Jr.) auf der Basis des gepaarten t-Tests (t0,05 = 4,52, p = 0,02) unterschied. Dies stimmte mit den Daten in der 5 überein, obgleich die Gesamt-Konzentrationen erheblich reduziert waren. Die anderen Beobachtungen wurden dadurch gestärkt, dass die p97-Konzentrationen nicht mit dem Alter oder dem Geschlecht des Individuums korreliert zu sein schienen. Diese Daten legen ebenfalls nahe, dass die Überwachung der CSF, die 2- bis 4-fach höhere Spiegel als die Spiegel von Serum-p97 hatte, eine wertvolle Information in Bezug auf den Beginn und den Verlauf von AD lieferte. Die mittlere Konzentration von Tf, das im Serum viel stabiler als p97 war, war für AD- und Kontroll-Individuen in der CSF und im Serum fast gleich. Für die CSF unterschied sich die mittlere Tf-Konzentration der AD-Gruppe (N = 8, 20,35 ± 4,78 μg/ml; mittleres Alter 71,5 ± 6,52 Jr.) nicht signifikant vom Mittel der Kontrollgruppe (N = 7,16, 0 ± 4,5 μg/ml; mittleres Alter 67,7 ± 6,32 Jr.) auf der Basis des gepaarten t-Tests (t0,05 = 2,05, p = 0,18). Für Serum unterschied sich die mittlere Tf-Konzentration der AD-Gruppe (N = 4, 2,24 ± 3,6 mg/ml, mittleres Alter 74,3 ± 5,63 Jr.) ebenfalls nicht signifikant vom Mittel der Kontrollgruppe (N 5, 2,26 ± 7,0 mg/ml; mittleres Alter 63,4 ± 4,5 Jr.) auf der Basis des gepaarten t-Tests (t0,05 = 0,38, p = 0,72). Es ist ebenfalls interessant zu vermerken, dass die Serum-Tf-Spiegel erheblich höher als in der CSF waren (~100fach), was im Gegensatz zu p97 steht, dessen Spiegel im Serum niedriger waren als in der CSF. Diese Daten implizieren, dass p97 eine einzigartige Funktion im Gehirn hat, da es scheint, dass Tf aktiv aus dem Gehirn ausgeschlossen wird, Tf aber nicht.
  • In dieser Untersuchung wurde ein biochemisches Markermolekül identifiziert, das im Serum von AD-Patienten gegenüber verwandten und nicht-verwandten Kontrollen übereinstimmend erhöht ist. Die Erfinder haben keine Überschneidung zwischen AD-Patienten und Kontrollen gefunden.
  • Aus dem Vorhergehenden geht hervor, dass zwar spezifische Ausführungsformen der Erfindung für Veranschaulichungszwecke beschrieben wurden, jedoch verschiedene Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne dass vom Geist und Rahmen der Erfindung abgewichen wird. Die Erfindung ist daher nicht eingeschränkt, ausgenommen durch die beigefügten Ansprüche.
  • TABELLE 1
    Figure 00280001
  • Tabelle 2 Blutserumtests für die p97-Konzentration von AD-Patienten und normalen Kontrollen
    Figure 00290001
  • Tabelle 3 Proben getestet am 21. und 24.7.95 – Patienten und Ehepartnerkontrollen
    Figure 00300001
  • Tabelle 4 Proben von Cerebrospinalflüssigkeit und Blutserum von japanischen Individuen im Test auf Transferrin (Tf) und p97
    Figure 00310001
  • Tabelle 5
    Figure 00320001
  • Tabelle 6
    Figure 00330001

Claims (5)

  1. Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit, indem in einer Untersuchungsprobe mit Serum von einem Patienten, bei dem ein Verdacht auf einer Alzheimer Erkrankung besteht, die Menge an p97 bestimmt wird, umfassend die Schritte: a) Bestimmen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe; und b) Vergleichen der Menge an p97 in der Untersuchungsprobe mit der Menge an p97 in Kontrollproben; wobei die Anwesenheit einer Menge an p97 in der Untersuchungsprobe, die um das Eineinhalbfache oder mehr zur Menge an p97 in den Kontrollproben erhöht ist, ein Anzeichen für das Potential einer Alzheimer-Erkrankung ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine zur Menge an p97 in den Kontrollproben um das zwei- bis neunfache erhöhte Menge an p97 in der Untersuchungsprobe ein Anzeichen für das Potential einer Alzheimer-Erkrankung ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt b) die Menge an p97 in der Untersuchungsprobe mit einer Durchschnitts- bzw. einer Hintergrundmenge an p97, die für die Kontrollproben bestimmt wurde, verglichen wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kontrollprobe in b) eine normale Probe vom gleichen Patienten oder eine normale Probe von einer anderen Person ist.
  5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Menge an p97 in Schritt a) mit Hilfe von Antikörpern gegen p97 bestimmt wird.
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