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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von
Alzheimer-Krankheit bei einem Menschen durch Regulieren der Wechselwirkung
eines zweiwertigen Kations mit APP sowie ein Verfahren zum Testen
neurologischer Funktionen unter Verwendung einer Zinkzubereitung.
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Alzheimer-Krankheit
ist eine progressive Demenz, die durch Amyloidablagerung in den
intrazellulären und
extrazellulären
Räumen
der Großhirnrinde
gekennzeichnet ist (Davies et al., 1988). Die extrazellulären Ablagerungen
bestehen aus einem Protein einer relativen Molekülmasse von 4000 (Mr =
4K), das als βA4
bezeichnet wird (Kang et al., 1987). Molekülklonierungs- und Proteinsequenzierungsstudien
haben gezeigt, daß βA4 einen
Teil der membranumfassenden und extrazelluläre Domänen des Amyloidvorläuferproteins
(APP), welches Merkmale eines integralen Transmembranzellenoberflächenrezeptors
aufweist (King et al., 1987; Goldgaber et al., 1987), umfaßt.
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βA4 scheint
das Ergebnis einer anomalen APP-Spaltung zu sein. Eine normale Spaltung
erfolgt an oder nahe einem Lysinrest innerhalb der βA4-Sequenz
(Esch et al., 1990; Sisodia et al., 1990; Palmert et al., 1989).
Eine Spaltung an dieser Stelle dürfte
die Bildung des amyloidogenen βA4-Fragments verhindern.
Das normalerweise APP von der Membranoberfläche abspaltende Enzym wird
als "APP-Sekretase" bezeichnet, obwohl
es bislang noch nicht identifiziert ist.
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Es
hat sich gezeigt, daß mindestens
eine APP-Form neurotrophe Aktivität, d.h. die Fähigkeit
zur Förderung
des Überlebens
oder desn Auswuchses von Nervenfortsätzen besitzt. Eine Störung bei
der APP-Verarbeitung kann für
einen bei Alzheimer-Krankheit feststellbaren Verlust bestimmter
Neuronenpopulationen verantwortlich sein.
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Es
gibt nun zunehmend Belege dafür,
daß APP
aus Membranen als Teil seiner normalen neurotrophen Funktion durch
Spaltung an einer Stelle innerhalb der βA4-Sequenz (Lysin 16) durch
APP-Sekretase freigesetzt wird. Da βA4 bei Alzheimer-Krankheit entsteht,
deutet dies darauf hin, daß ein
Ausfalls der Spaltung an dieser Stelle die Ursache für Alzheimer-Krankheit sein oder
zumindest zum Fortschreiten der Krankheit beitragen könnte.
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Es
besteht ein Bedarf nach einem Test, der einen Voraussage- und Diagnosewert
bei der Überwachung
von Alzheimer-Krankheit und für
irgendwelche einschlägige
therapeutische Interventionen besitzt. Voruntersuchungen haben nahegelegt,
daß die
Werte von zirkulierendem APP bei Alzheimer-Patienten im Vergleich
zu Normalen unterschiedlich sein können (Bush et al., 1991, WO-A-9116628)
und daß solche Änderungen
das Ergebnis einer geänderten
APP-Verarbeitung sein können.
Erfindungsgemäß hat es
sich nun gezeigt, daß die
Verarbeitung von zirkulierendem APP bei Alzheimer-Krankheit geändert ist
und somit die Basis für
einen Test auf diese Krankheit liefert. Weiterhin hat sich aus den
Arbeiten, die zum erfindungsgemäßen Test führten, eine
verbesserte Möglichkeit
zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit durch Regulieren der Wechselwirkung
zwischen zweiwertigen Kationen und APP ergeben.
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Die
vorliegende Erfindung ist mit der Bereitstellung eines Verfahrens
zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bei einem einer solchen Behandlung
bedürfenden
Patienten durch Einwir kenlassen von Mitteln zur Regulierung der
Zinkwechselwirkung mit APP auf den Patienten befaßt. Dieser
Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert teilweise auf der Erkenntnis,
daß durch
Regulieren der Wechselwirkung zwischen Zink und APP eine proteasevermittelte
Verdauung von APP (d.h. APPase-Aktivität) geändert wird.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung eines Zinkbindemittels
oder eines Mittels mit der Fähigkeit
zur Blockade einer oder mehrerer Komponente(n) eines Zinktransportsystems
zur Verminderung der Zinkaufnahme oder eines die biologische Verfügbarkeit
von Zink vermindernden Mittels oder eines Mittels mit der Fähigkeit
zur Unterdrückung
einer Zinkabsorption, zur Förderung
einer Zinkeliminierung oder zur Blockade der Kationenbindungsstelle
auf APP oder auf dem für
Kationen empfänglichen
Promotorbereich des APP-Gens bei der Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit, wobei das Medikament so
formuliert ist, daß es
zur oralen Verabreichung geeignet ist.
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Bei
Alzheimer-Krankheit erfolgt eine Erhöhung der APP-Spiegel. Erhöhungen von
APP-mRNA treten bekanntlich im Gehirn sporadischer Alzheimer-Krankheitsfälle auf
und sind höchstwahrscheinlich
das pathogenetische Ereignis bei der Amyloidgenese, die in gleicher
Weise das Down-Syndrom begleitet. Eine Erhöhung der APP-Spiegel kann bei
normalen und Alzheimer-Krankheit-Freiwilligen,
bei Ratten und bei PC12-Kulturzellen durch extrazelluläre Zinkbelastung
induziert werden. Hierin wird gezeigt, daß extrazelluläres Zink
die APP-Expression reguliert. Dies liefert eine Grundlage für eine therapeutische
Intervention auf der Basis einer Regulierung der Wechselwirkung
zweiwertiger Kationen mit APP.
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Durch
Regulieren der Gehalte an zweiwertigen Kationen oder Heparin oder
irgendeiner sonstigen Einheit, die eine Bindung mit den Heparinbindungsstellen
auf APP (Reste 318-331 und rund um die Reste 98-105) oder irgendeiner
sonstigen Bindungsstelle auf APP mit der Fähigkeit zur Bindung dieser
Einheiten (z.B. weitere Zink- oder Heparinbindungsstellen auf APP)
eingehen können,
lassen sich der Bereich, die Art und/oder das Ausmaß der APP-Spaltung
derart ändern,
daß eine
unrichtige Protease-vermittelte Verarbeitung von APP vermindert
oder gehemmt werden kann. Unter "Regulieren" ist die Änderung
der Verfügbarkeit
zweiwertiger Kationen und dreiwertiger Kationen oder von Heparin
oder irgendeiner sonstigen Einheit, die eine Bindung mit den Heparinbindungsstellen
auf APP (Reste 318-331 oder rund um die Reste 98-105) oder irgendeiner
sonstigen Bindungsstelle auf APP mit der Fähigkeit zur Bindung dieser
Einheiten (z.B. weitere Zink- oder Heparinbindungsstellen auf APP)
eingehen kann, zur Bindung an APP vor oder gleichzeitig mit einer
APPase-vermittelten Spaltung zu verstehen. Es hat sich gezeigt,
daß Zink
(Zn2+) an einer spezifischen und sättigungsfähigen Bindungsstelle
an APP gebunden wird. Die Zinkbindungsstelle auf APP wurde durch
enzymatische Verdauung von an Zn2+-chelatisierende
Sepharose gekuppeltem, gereinigtem APP695-Fusionsprotein identifiziert.
Das synthetische Peptid repräsentiert
etwa die Reste 181-200 von APP, liegt zwischen den cysteinreichen
und negativ geladenen Domänen
des Proteins und hat sich als spezifisch und sättigungsfähig zinkbindend erwiesen. Die
enge Verwicklung zwischen APP und Zink ist ein starkes Indiz für eine Beteiligung
von Zink an der APP-Verarbeitung. APP bindet Heparin (in einer zu
FGF analogen Weise). Es hat sich gezeigt, daß Heparin APP gegen eine proteolytische
Verdauung schützt.
Dies ergab sich beispielsweise bei Verwendung des proteolytischen
Enzyms Trypsin. Eine Heparinkonzentration von nur 100 nM führt zu einer
deutlichen Verminderung der Geschwindigkeit und des Ausmaßes eines
Gehirn-APP-Abbaus durch Trypsin. Das Gehirn enthält eine Reihe von heparin- oder heparinsulfathaltigen
Proteinen und somit kann die Wechselwirkung von Heparin mit APP
APP gegen einen proteoly tischen Abbau in vivo stabilisieren. Es
hat sich ferner gezeigt, daß Zink
die Kinetik einer Heparinbindung an APP beeinflußt und die APP-Affinität gegenüber Heparin
um das 5- bis 10-fache
steigern kann. Überraschenderweise
gehen bei niedrigen Zinkkonzentrationen (über etwa 1 μm) die Schutzwirkungen von Heparin
verloren. Diese Erkenntnis deutet darauf hin, daß von der Norm abweichende Zinkgehalte
in vivo, im intrazellulären
und/oder extrazellulären
Gehirnmilieu, eine von der Norm abweichende APP-Proteolyseverarbeitung
fördern
können
und somit der Anlaß für das Amyloidprotein
und somit eine folgende Alzheimer-Krankheit oder sonstige mit einer
Amyloidablagerung im Gehirn vergesellschaftete Störungen sind.
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Die
die Schutzwirkungen von Heparin beseitigenden Mechanismen hinter
Zink sind unbekannt.
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Bei
Alzheimer-Patienten durchgeführte
Untersuchungen belegen, daß eine
Verabreichung von Zink (z.B. von elementarem Zink in Form von Sulfat)
bei einer mäßigen oralen
Dosierung von 50–100
mg von Gramm pro Tag über
einige Tage hinweg (unter Verwendung üblicher aus Apotheken erhältlicher
Zinkergänzungsmittel)
zu einer raschen Beeinträchtigung
neuronaler Funktionen führt.
Dies ergibt sich aus einem drastischen Verlust der Erkenntnisfunktionen
bei Minimentalstatusprüfung
(Folstein et al., 1975). Die Bewertung verschlechtert sich von schwacher
Demenz bis zu einer nicht feststellbaren Funktion. Über den
Zeitraum der Ergänzung
verschlechterten sich auch Augenbewegungsanomalitäten und
die allgemeinen Fähigkeiten,
sich um sich selbst zu kümmern.
Im Gegensatz dazu zeigten gesunde Freiwillige keine Krankheitswirkungen
aufgrund einer Zinkergänzung.
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Die
mit Alzheimer-Patienten erzielten Ergebnisse stimmen mit einer neurotoxischen
Reaktion auf einen Zinkstoffwechsel im Gehirn bei Alzheimer-Krankheit überein.
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Gemäß einer
Aspekt dieser Erfindung werden Alzheimer-Krankheit und sonstige
neurologische Störungen
durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Zinkbindemittels
mit der Fähigkeit
zur Bindung eines zwei- oder dreiwertigen Kations und (dadurch bedingte)
Regulierung seiner Wechselwirkung mit APP an einen einer solchen
Behandlung bedürfenden
Patienten behandelt, gelindert und/oder verhindert. Genauer gesagt,
handelt es sich bei dem Kation um ein zweiwertiges Kation, insbesondere
Zink, wobei es sich dann bei dem Bindemittel um ein Zinkbindemittel
handelt. Diese Regulierung kann eine Verminderung der biologischen
Verfügbarkeit
von Zink infolge Komplexbildung mit Zink unter Verminderung der
Menge an freiem Zink umfassen. Die Zinkbindung kann beispielsweise
im Gastrointestinaltrakt, im Blutstrom und/oder im Gehirn, z.B.
auf extrazellulärer
und/oder intrazellulärer
Ebene, erfolgen.
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Erfindungsgemäß kann jedes
pharmazeutisch akzeptable Zinkbindemittel verwendet werden. Besonders
bevorzugt sind Bindemittel mit der Fähigkeit zum Durchdringen der
Blut/Hirn-Schranke
und somit zur Regulierung der Konzentrationen von freiem Zink im
Gehirn auf extrazellulärer
und/oder intrazellulärer
Ebene, um von der Norm abweichende Zinkspiegel im Gehirn wieder
herzustellen und somit einen Schutz gegen eine anomale APP-Verarbeitung,
die für
das Amyloidprotein verantwortlich sein kann, zu bieten. Beispiele
für Zinkbindemittel
(z.B. chemische Chelatbildner) sind Phytinsäure und deren Derivate, z.B.
Phytat, Natriumcitrat und zinkspezifische Chelatbildner auf der
Basis heterocyclischer Pyridone, wie 1,2-Diethyl-3-hydroxypyridin-4-on (CP94)
und 1-Hydroxyethyl-3- hydroxy-2-methylpyridin-4-on
(CP40) (Hilder et al., 1990). Diese Mittel können Zellmembranen durchdringen
(CP94) oder zum Eindringen in die Zellen unfähig sein (CP40).
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Eine
Zinkwechselwirkung mit APP kann durch die Nahrung, durch Verabreichen
einer Diät
mit niedrigem Zinkanteil an Patienten oder durch Entfernen von Zinknahrungsquellen
reguliert werden. Zink ist ist zahlreichen Nahrungsmitteln angereichert.
Besonders stark ist dies bei Austern, Krabben, Rindfleisch, Leber
und sonstigen Meerestier- und tierischen Produkten (Stanton, 1992).
Die biologische Verfügbarkeit
von Zink wird durch unbehandelte Weizenkleie, hohen Alkoholgenuß und verschiedene
Proteine gehemmt. Die Vermeidung tierischer Produkte in Kombination
mit einer unbehandelte Fasern, z.B. Weizenkleie, enthaltenden Diät kann die
biologische Verfügbarkeit
von Zink verringern und folglich den Beitrag von Zink zu einer Neurotoxizität reduzieren.
Entsprechend diesem Aspekt wird somit ein Verfahren zum Behandeln/Lindern
oder Verhindern von Alzheimer-Krankheit durch Verabreichung einer
Diät niedrigen
Gehalts an freiem Zink an ein einer solchen Behandlung bedürfendes
Individuum geschaffen.
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Der
Ausdruck "Regulieren" erstreckt sich auch
auf den Einsatz von Arzneimitteln, die Zinktransportmechanismen
durch die Zellmembranen unterbrechen. Wie andere Metallionen, z.B.
Eisen und Calcium, wird (auch) Zink über ein Zinktransportsystem
(derzeit schlecht charakterisiert) in Zellen transportiert. An diesem System
ist (sind) ein oder mehrere Protein(e) und/oder Lipid(e) und/oder
Kohlenhydrat(e), das (die) den Zinkstrom durch die Membranen steuert
(steuern), beteiligt. Arzneimittel, die eine oder mehrere Komponente(n) des
Zinktransportsystems herausbrechen, können zur Blockade der Zinkaufnahme
aus dem Darm sowie des Zinktransports in die und aus den Zellen
im Gehirn verwendet werden. Gemäß diesem
Aspekt wird folglich ein Verfahren zur Regulierung der Zinkwechselwirkung
mit APP durch Verabreichung eines Arzneimittels mit der Fähigkeit
zur Blockade einer oder mehrerer Komponente(n) des Zinktransportsystems
mit dem Ziel einer Reduzierung der Zinkaufnahme an ein Individuum
geschaffen. Unter Verwendung solcher Mittel läßt sich möglicherweise die Fehlverteilung
von Zink in extrazellulären
und intrazellulären
Kammern bei Alzheimer-Krankheit korrigieren. Der Ausdruck "Regulieren" erstreckt sich ferner
auf Maßnahmen
zur Beeinflussung der Einwirkung der Kationen auf APP. Solche Maßnahmen
umfassen beispielsweise Änderungen
im pH-Wert. "Regulieren" bedeutet auch eine Änderung
des Zinkstoffwechsels mit Mitteln, z.B. einer Eisenergänzung, die
beispielsweise eine Zinkabsorption aus dem Darm unterdrücken und
eine Zinkeliminierung fördern,
oder durch Blockade der Kationenbindungsstelle auf APP oder auf
dem auf Kationen ansprechenden Promotorbereich des APP-Gens beispielsweise
mit Kupfer(II)ionen.
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Eine
Verabreichung von Zinkbindungsverbindungen und pharmakologischen
Mitteln mit der F„higkeit zum
Unterbrechen des Zinktransportsystems erfolgt oral.
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Hohe
Dauerkonzentrationen an extrazellulärem Zink (über 200 μM) sind bekanntlich neurotoxisch.
Die Zinkkonzentrationen in den Hippocampus-Synapsen erreichen während der
synaptischen Transmission kurzzeitig 300 μM. Die Unterbrechung des extrazellulären Zinkstoffwechsels
kann eine wichtige Stufe im neurotoxischen Mechanismus, der eine
Amyloidablagerung bei Alzheimer-Krankheit begleitet, sein. Die hierin
beschriebenen Erkenntnisse stützen
die Ansicht, daß APP
eine wichtige Rolle bei der Regulierung bei der neuronalen Zinkkompartimentaufteilung
spielt. Eine Anomalität
des APP-Stoffwechsels kann folglich die Ursache für einen
anomalen Zinkstoffwechsel sein. Eine Strategie zur Heilung dieser
Anomalität
bei Alzheimer-Krankheit dürfte
die Wiederherstellung des normalen APP-Stoffwechsels beispielsweise
durch Umkehrung der bei Alzheimer-Krankheit auftretenden anomalen
APP-Proteaseresistenz oder durch Behandeln des Alzheimer-Patienten
mit normalem APP-Ergänzungsmitteln
umfassen.
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Selbstverständlich sind
die auf eine Regulierung der Zinkspiegel abzielenden Aspekte dieser
Erfindung zu den bislang vorgeschlagenen Therapien, die vermuteten,
daß Alzheimer-Krankheit mit einem
Zinkmangel einhergeht, und folglich eine Zinkverabreichung an Alzheimer-Patienten
vorgeschlagen haben, gegenläufig.
Wie hierin beschrieben, hat es sich gezeigt, daß eine Verabreichung von Zink
an Alzheimer-Patienten die Krankheit verschlechtert. Dies wurde
aufgrund von neurologischen Standardtests ermittelt.
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Es
hat sich überraschenderweise
gezeigt, daß Alzheimer-Krankheit durch Verabreichen
einer Zinkprovokation an ein Individuum und anschließendes Testen
der neurologischen Funktionen nach einem oder mehreren der bekannten
Standardtests nachgewiesen werden kann. Im Vergleich zu normalen,
Nicht-Alzheimer-Kontrollpersonen zeigt (hierbei) eine an Alzheimer-Krankheit
leidende Person einen Abfall an Erkenntnisfähigkeit sowie auch eine Verschlechterung
bei anderen neurologischen Standardfunktionstests. Ein üblicher Test
ist das Testen der Augenbewegung auf visuelle Reize, die bei Alzheimer-Patienten
im Vergleich zu normalen Kontrollpersonen bei Zinkprovokation deutlich
vermindert ist. Die Menge an bei einem Provokationstest an ein Individuum
verabreichtem Zink beträgt
im allgemeinen 50–500
mg oder mehr. Die genaue, bei einem Test verabreichte Zinkmenge
ist nicht entscheidend, sie basiert im allgemeinen (lediglich) darauf,
daß die
Nebenwirkungen auf eine Zinkverabreichung bei Alzheimer-Patienten
auf ein Mindestmaß gesenkt
werden.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt die
Verwendung von Zink in der Formulierung eines Diagnostikums zur
Gewinnung von Information betreffend die neurologische Funktion
und folglich zur Bestimmung des Vorliegens oder Nichtvorliegens
von Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten.
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Ein
Verfahren zum Nachweis von Alzheimer-Krankheit gemäß diesem
Aspekt kann in der Verabreichung einer Zinkprovokation an ein Individuum
und anschließendem
Testen der neurologischen Funktion bestehen. Hierbei ist eine Verschlechterung
bzw. ein Abfall in der neurologischen Funktion im Vergleich zu normalen
Kontrollpersonen ein Anzeichen für
Alzheimer-Krankheit.
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Die
Zinkprovokation kann an einen Patienten auf verschiedene Art und
Weise, z.B. oral, intravenös, intramuskulär, transdermal,
rektal, intranasal u.dgl., verabreicht werden. Die orale Verabreichung
wird bevorzugt. Wie bereits erwähnt,
ist die bei einem Provokationstest an einen Patienten verabreichte
Zinkmenge nicht kritisch, solange die verabreichte Menge zur Hervorrufung
einer Antwort bei Alzheimer-Patienten ohne begleitende schwere Krankheitssymptome
fähig ist.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht beschränkenden
Figuren und Beispiele näher
erläutert.
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In
den Figuren sind:
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1 eine photographische Darstellung von
Immunoblots zum Vergleich von Alzheimer-Krankheit- und altersangepaßtem Kontrollplasma-APP.
Plasma-Heparin-Sepharose-Eluate (65 μg) wurden durch 8,5% (g/v) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
analysiert und mit MAb 22C11, der ein aminoterminales Epitop erkennt,
einem Imunoblotting unterworfen (vgl. Beispiel 1). Die relative
Molekülmasse
von Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) ist
auf der linken Seite dargestellt. APP-immunoreaktive Banden mit
130, 110 (ein Dublett), 65 und 42 kDa sind durch Pfeile auf der
rechten Seite angegeben. Lediglich die relativen Häufigkeiten
der 130- und 42-kDa-APP-Formen (wie in der veranschaulichten Probe)
vermögen
sichtbar zwischen Alzheimer-Krankheit im Vergleich mit (1A)
nicht-dementen älteren
Kontrollpersonen und (1B) normalen jungen Kontrollpopulationen
zu unterscheiden.
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2 eine
photographische Darstellung eines Vergleichs der APP-proteolytischen
Aktivität
von Alzheimer-Krankheit-(B)
und Kontroll-Plasma (A). Heparin-Sepharose-gereinigtes APP aus dem
Plasma von Alzheimer-Patienten und Kontrollfällen wurde in Gegenwart bzw.
Abwesenheit von 20 μM
Zn2+ 2 h bei 37°C in Kochsalzpuffer inkubiert.
Proben (65 μg
Protein) einer jeden Inkubation wurden durch Elektrophorese auf
8,5% (g/v) Polyacrylamidgelen analysiert und mit 22C11 immunoblottiert.
Die relative Molekülmasse
von Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) ist
auf der linken Seite angegeben. Immunreaktive APP-Banden mit 130,
110, 65 und 42 kDa sind auf der rechten Seite durch Pfeile bezeichnet.
Die Figur zeigt Proben von sechs Alzheimer-Krankheitsfällen und
sechs normalen jungen erwachsenen Kontrollpersonen.
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3 eine
photographische Darstellung eines Western-Blots von Plättchen und
Plasma bei Grauplättchensyndrom
im Vergleich zu einer Kontrolle. Ein aliquoter Teil von 65 μg von durch
Heparin-Sepharosechromatographie gereinigtem Plasma und 50 μg gewaschene
Vollplättchen
von einem Patienten mit Grauplättchensyndromen
(GPS) wurden mit ähnlichen
von einer jungen erwachsenen Kontrollperson erhaltenen Präparaten
ver glichen. Die Proben wurden durch 10% (g/v) Polyacrylamidminigelelektrophorese
analysiert und mit 22C11 immunoblottiert. Die relative Molekülmasse von
Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) ist auf
der linken Seite angegeben. Die Lagen der immunreaktiven Hauptbanden
bei normalen Plättchen
(130 und 110 kDa) und eine kleinere Bande (65 kDa) sind auf der
rechten Seite durch Pfeile gekennzeichnet.
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4 eine
graphische Darstellung einer zeitlichen Verlaufsanalyse einer 65Zn-Bindung an Humangehirn-130/110-kDa-APP. Der Amyloidproteinvorläufer (APP)
wurde nach der Methode gemäß Moir et
al. (1992) gereinigt. Das Präparat
von gereinigter 130- und 110-kDa-APP stammte aus Humangehirnmembranextrakten und
enthielt den vollständige
Länge aufweisenden
Vorläufer
mit intaktem Carboxylterminus jedoch ohne das 17-Rest-Signalpeptid.
Die 130- und 110-kDa-Proteine erschienen bei der Silberfärbung nach
einer Polyacrylamidgelelektrophorese in gleichen Verhältnissen
und waren die einzig sichtbaren Banden. Die Identität dieser beiden
Proteine wurde durch Westernblots mit monoklonalem Antikörper 22C11
(der ein aminoterminales Epitop auf APP erkennt) und durch Aminoterminussequenzierung
bestätigt.
Die Proteinkonzentration des APP-Präparats wurde durch Aminosäureanalyse
bestimmt. Aliquote Teile von APP (90 ng, ≈1,1 pmol, unter der Annahme,
daß das
durchschnittliche Aminosäureformelgewicht
von APP ≈80
kDa ist) wurden während
der angegebenen Zeiträume
bei 20°C
inkubiert. Die Inkubationen (50 μl)
erfolgten in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von
7,4 und in Anwesenheit von 106 cpm 65Zn (175 nM). Danach wurde die Inkubationslösung auf
eine ein Bettvolumen von 1,1 ml aufweisende Sephadex-G25 (Pharmacia,
Uppsala, Schweden)-Säule,
die vorher mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, ins Gleichgewicht
gesetzt worden war, aufgegeben, absetzen gelassen und anschließend mit
645 μl des
Gleichgewichtspuf fers ausgesalzt. Eine vorhergehende Analyse der
Aussalzungseigenschaften der Säule
mit Mischungen aus Dextranblau und Kaliumdichromatlösung zeigte,
daß mehr
als 95% des Proteins im Inkubationsgemisch in diesem Volumen ohne nachweisbares
vorhandenes freies Salz ausgesalzt wurden. Das ausgesalzte Protein
wurde direkt in Zählröhrchen mit
10 ml einer wäßrigen Zählszintillationsmittellösung gesammelt.
Zum vollständigen
Aussalzen waren weniger als 2 min erforderlich. Die Menge des an
das ausgesalzte APP gebundenen 65Zn wurde
durch Zählen der
gesammelten Probe in einem auf den breitesten Kanal eingestellten
Beta-Zähler
bestimmt. Es wurde eine 51%ige Zählwirksamkeit
ermittelt. Die angegebenen Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung
von n ≥ 3
Ablesungen dar. Diese Daten belegen, daß eine rasche Bindung von Zn
an APP erfolgt (ungefähr
30% von Bmax nach 5 min) und nach 30 min ein Maximum erreicht.
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5 eine
graphische Darstellung einer Konkurrenzanalyse einer 65Zn-Bindung
an Humangehirn-130/110 kDa-APP. Aliquote Teile APP wurden – wie in 4 – 30 min
mit 65Zn inkubiert. Die Bindung des markierten
Zn2+ an APP wurde in Konkurrenz mit unmarkiertem
Zn2+ in Form des Chloridsalzes durchgeführt. Die
angegebenen Daten zeigen die bei pH-Werten von 6,4 bzw. 7,4 gewonnenen
Konkurrenzkurven. Die Bindung von Zn2+ an
APP verschlechterte sich bei dem niedrigeren pH-Wert (ungefähr 45% von Bmax, pH-Wert: 7,4).
Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM
von n ≥ 3
Ablesungen dar. Die dargestellten Kurven sind typisch für drei Experimente.
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6 eine
graphische Darstellung einer Scatchard-Analyse einer 65Zn-Bindung
an Humangehirn-130/110 kDA-APP. Aus den Ergebnispunkten in 5 ergibt
die Scatchard-Analyse, daß die
Dissoziationskonstante (KD) für die Zn2+-Bindungsstelle auf APP bei einem pH-Wert
von 7,4 764 nM und bei einem pH- Wert
von 6,4 2,08 μM
beträgt.
Ein APP-Molekül
bindet ein Zinkion.
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7 eine graphische Analyse zur Veranschaulichung
einer Spezifitätsuntersuchung
der Zn2+-Bindungsstelle auf APP.
- (a) Die APP-Inkubation mit 65Zn
und konkurrierendem nicht-markierten
Zn2+ wurden unter den im Zusammenhang mit 5 detailliert
beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ist die Konkurrenzwirkung
durch Ca2+ und Mg2+ bezüglich einer
Zn2+-Bindung dargestellt. Die Werte stellen
Mittelwerte ± SEM
von n ≥ 3
Ablesungen dar. Die Konkurrenzkurven für Ca2+ und
Mg2+ sind mehr als zwei log-Einheiten nach
rechts gegenüber
der Zn2+-Konkurrenzkurve verschoben. Dies
zeigt, daß die
Bindungsstelle für
Zn2+ bei physiologischen Konzentrationen
spezifischer ist.
- (b) Es wurde ein Vergleich bezüglich der Fähigkeit anderer Metallionen,
mit 65Zn um eine Bindung an APP zu konkurrieren,
durchgeführt.
Die APP-Inkubationen mit 65Zn und konkurrierendem
nicht-markierten Metallionen (mit 20 μM) wurden unter den im Zusammenhang
mit 5 detailliert beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die
Werte stellen Mittelwerte ± SEM
von n ≥ 3
Ablesungen dar. Zn2+ konnte bei 20 μM im Rahmen
des Konkurrenzversuchs mehr als 97% der Markierung von APP verdrängen. Co2+ war bei der Konkurrenzbindung die nächstkommende
Konkurrenz, es erreichte bei derselben Konzentration eine Verdrängung von
ungefahr 70% der Markierung vom APP.
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8 eine
photographische Darstellung einer Analyse von immunreaktivem APP
in Plasma durch Westernblot. Immunreaktive APP-Proteine in Heparin-Sepharoseeluaten
aus Plasma wurden, durch 8,5%-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
und Western-Blotting mit mAb 22C11 analysiert. Bahn 1: Heparin- Sepharoseeluat von
Plasma (65 μg
Protein); Bahn 2: durch Antiserum 90/3 (gegen Humangehirn-APP voller
Länge entwickelt)
immungefälltes
Heparin-Sepharoseeluat; Bahn 3: Durch die Vorblutprobe von Antiserum 90/3
immungefälltes
Heparin-Sepharoseeluat. Bahn 4: Durch Anti-Fd-APP (gegen APP-Fusionsprotein
entwickelt) immungefälttes
Heparin-Sepharoseeluat. Die relativen Molekülmassen von Standardproteinmarkern (Rainbow
Standards, Amersham, UK) sind auf der linken Seite angegeben. Zuvor
veröffentlichte15 immunreaktive Banden von APP mit 130,
110 (ein Dublett), 65 und 42 kDa sind durch Pfeile auf der rechten
Seite gekennzeichnet.
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9 eine graphische Darstellung von Streudiagrammen
der Remissionsanalyse von Immunoblots zum Vergleich von AD mit Kontroll-Plasma-APP.
Die Verteilung der Plasma-APP-Immunreaktivität wurde entsprechend den Einzelheiten
in Tabelle 1 durch Remission analysiert. Die durchgezogenen Linien
zeigen die Mittelwerte für
jede Untergruppe. Zwischen AD und gepoolten Kontrollgruppen läßt sich
ein signifikanter Unterschied in den Anteilen der 130- und 42-kDa-Arten
von APP feststellen, Folglich wurde eine weitere Analyse bezüglich der
Unterschiede in den Konzentrationen dieser Arten zwischen diesen
Gruppen durchgeführt.
- (a) Anteile von 130-kDa-APP in der AD-Gruppe
und bei den einzelnen Kontrollgruppen. Der mittlere Anteil der 130-kDa-APP-Art reichte von
etwa 50–80%
(p ≤ 0,05;
Scheffé,
1959), die er in der AD-Gruppe im Vergleich zu jeder Kontrollgruppe
höher liegt.
Die punktierte Linie deutet einen vermutlichen Schwellenwert für eine biochemische
Charakterisierung von AD an, der eine Spezifität von 91% und eine Empfindlichkeit
von 75% ergibt.
- (b) Anteile der 42-kDa-APP-Konzentrationen in der AD-Gruppe
im Vergleich zu den einzelnen Kontrollgruppen. Der mittlere Anteil
der 42-kDa-APP-Art reichte etwa von 30–40% (p ≤ 0,05; Scheffé, 1959), die er in der AD-Gruppe
im Vergleich zu den junge-Erwachsene- und den altermäßig entsprechenden
Kontrollgruppen niedriger liegt. Die punktierte Linie deutet einen
Schwellenwert für
eine biochemische Charakterisierung von AD an, der eine Spezifität von 85%
und eine Empfindlichkeit von 50% liefert.
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Beispiel 1
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Materialien und Methoden
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Materialien:
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Sämtliche
Reagenzien mit Ausnahme des Tris-HCl waren analysenrein. Letzteres
besaß Elektrophoresereinheit
(BioRad) zur Vermeidung einer Verunreinigung mit Zinkspuren. 65Zn wurde von Amersham (U.K.) erworben.
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Fallauswahl:
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Alzheimer-Krankheitsfälle erfüllten die
NINCDS/Alzheimer-Krankheit-RDA-klinischen
Kriterien (McKann et al., 1984) und wiesen eine Minimentalstatus
(Folstein et al., 1975)-Bewertung von weniger als 17 auf. Jede altersmäßg entsprechende
Kontrollperson unterzog sich einer Minimentalstatusprüfung und
wurde ausgeschlossen, wenn die Bewertung unter 28 lag. Die unterschiedlichen
neurologischen Diagnosen, die für die
als nicht-dementen, mit neurologischen Krankheiten behafteten Kontrollpersonen
dienten (n = 6), waren Epilepsie, Entmyelinisierung, Wasserkopf
und drei Fälle
von Gehirngefäßerkrankungen.
Sämtliche
Freiwilligen waren zum Zeitpunkt der Studien bei stabiler Gesundheit
und litten an keiner akuten Krankheit.
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Teilweise Reinigung von
APP aus Plasma:
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Hungernden
Individuen wurde mit einer 21iger Nadel in heparinisierte Sammelröhrchen Blut
(20–40 ml)
entnommen. Das Blut wurde 15 min lang bei 2500 g zentrifugiert.
Die überstehende
Plasmafraktion wurde von dem Blutkörperchenpellet getrennt und
25 min bei 4°C
und 19 000 g zentrifugiert (J2-21-Zentrifuge,
Beckman, USA), um irgendwelche Bruchstücke zu entfernen.
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Zum
Nachweis von APP doch Western-Blotting wurde APP durch Heparin-Sepharosechromatographie
teilweise von Plasma gereinigt. Plasma (2,5 ml) wurde auf eine zuvor
bei 4°C
mit Puffer 1 (175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4) ins Gleichgewicht
gesetzten Heparin-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule (8 mm × 5 mm)
mit 0,25 ml Bettvolumen aufgegeben. Danach wurde die Säule mit
3,25 ml Puffer 1 gewaschen. Das APP wurde mit 750 μl Eluierpuffer
(550 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4) eluiert. Die Proteinkonzentration
wurde nach der Methode von Smith et al. (1985) mit BCA unter Verwendung
von Rinderserumalbuminstandards (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt.
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Gewaschene
Plättchen
wurden nach der Methode von Bush et al. (1990) hergestellt. Die
Plättchen (1,2 × 107) wurden in 30 μl Probenpuffer (100 mM Tris-HCl,
2% (g/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,01% (g/v) Bromphenolblau,
5% (v/v) β-Mercaptoethanol
(pH-Wert: 6,8) solubilisiert und vor dem Western-Blotting von Polyacrylamidgelen 10 min
lang gekocht.
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Plasmazinktest:
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Nach
der Methode von Davies et l1. (1968) wurden Zn2+-Tests
mittels Atomabsorptionsspektrometrie durchgeführt.
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Western-Blotting:
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Western-Blottingmaßnahmen
wurden entsprechend den Angaben von Bush et al. (1990) durchgeführt. Die
Blots wurden mit einem monoklonalen Mausantikörper (mAb) 22C11 (Boehringer
Mannheim, München,
Deutschland), der ein Epitop auf dem Aminoterminus von APP (15)
erkennt, bei einer Verdünnung
von 1:60 000 in einem Blockierungspuffer sondiert bzw. unter sucht.
Die Plasmaproben bei dieser Untersuchungsreihe wurden – sofern
nicht anders angegeben – auf
8,5% (g/v) Polyacrylamidgelen getrennt. Unter diesen Bedingungen
trennte sich die immunreaktive 110-kDa-APP-Bande in ein Dublett
auf. Zum Zwecke der vorliegenden Analyse wurde jedoch die Summe
der durch das Dublett erzeugten Signale als zu dem einen 110-kDa-Bereich gehörend angesehen.
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Remissionsanalyse der
Blots:
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Eine
Remissionsanalyse von Blots wurde durch Videoaufnahme mit einer
Videk-Megaplus-Kamera (Kodak, Canandaigua, NY, USA), die mit Pixel
Tools v1.1 (Perceptics, 1990) arbeitete, durchgeführt. Die
Quantifizierung erfolgte anschließend mit der Software Image-v1.29-(W.
Rasband, National Institutes of Health Research Services Branch,
NIMH), welche genaue Ausrichtungen der einzelnen Blotbahnen mit
dem Remissionsprofil und die Festlegung von Ausschlußgrenzen
einzelner Peaks in den vier interessierenden Bereichen bei 130,
110, 65 und 42 kDa erleichterte. Die integrierte Remission (Fläche unter
der Kurve) wurde auf diese Weise für jeden der vier Peaks bei
jeder Probe berechnet. Die erhaltenen Werte waren für den jeweiligen
Bereich über
einen Bereich von Plasma-Heparin-Sepharose-Eluatdosen
(20–90 μg Protein)
linear zur Konzentration.
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Zum
Vergleich der relativen Mengen der vier APP-Derivate wurde in jeder
Plasmaprobe der relativ Prozentanteil des Bandensignals am Gesamtbahnsignal
ermittelt und danach der Durchschnittswert gebildet, wobei die in
Tabelle 1 aufgeführten
Werte erhalten wurden. Für
die vier immunreaktiven Banden wurden mit einer Signifikanzzahl
von p = 0,0125 (0,05 dividiert durch die Anzahl der Vergleichsproben)
unabhängige
Proben-Student-t-Tests zwischen gepoolten Kontrollgruppen und Alzheimer-Gruppen
durchgeführt.
Wenn sich diese Vergleiche signifikant unterschieden, wurden der
Test einfacher Effekte (Weidemann et al., 1989) und anschließend post-hoc-Vergleiche nach Scheffé (1959)
zwischen sämtlichen
Paaren diagnostischer Gruppen (Alzheimer-Krankheit, Kontrollgruppe
mit sonstigen neurologischen Krankheiten, normale junge erwachsene Kontrollpersonen
und nicht-demente altersmäßig entsprechende
Kontrollgruppe) durchgeführt.
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Test auf APP-abbauende
Protease:
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Aliquote
Teile (500 μl)
von Eluaten aus jeder Heparin-Sepharose-Säule wurden unter Verwendung
einer 1,7-ml-Sephadex-G25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule (8 mm × 34 mm),
die mit 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2,
1 mM MgCl2, pH-Wert: 7,4, in Gegenwart oder Abwesenheit
von 20 μM
ZnCl2 bei 4°C ins Gleichgewicht gesetzt
worden war, ausgesalzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem gleichen
Puffer auf 0,80 mg/ml eingestellt. Die Proben wurden danach 2 h
bei 37°C
inkubiert. Nach Entfernung aliquoter Teile (81,3 μl) wurde
das Protein in jedem aliquoten Teil mit Choroform/Methanol (Wessel
und Flugge, 1984) gefällt,
in SDS-Probenpuffer gekocht und durch Western-Blotting unter Verwendung
von MAb 22C11 analysiert.
-
Die
Wirkungen von Inhibitoren verschiedener Proteaseklassen wurden durch
Zusatz derselben zu diesen Inkubationsgemischen und Beobachten ihres
Einflusses auf den Abbau von 130-kDa-APP getestet. Eine Probe (500 μl) eines
Heparin-Sepharoseeluats aus dem Plasma einer normalen jungen erwachsenen
Kontrollperson wurde in Zn2+-Puffer (175
mM NaCl, 50 mM Tris-HCl,
1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2,
20 μm ZnCl2, pH-Wert: 7,4) ausgesalzt. Aliquote Teile
(mit 65 μg
Protein) wurden mit demselben Puffer mit einem Proteaseinhibitor auf
0,80 mg/ml verdünnt
und dann 2 h lang bei 37°C
inkubiert. Das Protein wurde in jeder Probe durch Zusatz von Chloroform/Methanol
(wie oben) gefällt
und dann immunoblottiert. Die Endkonzentrationen an Inhibitoren in
den Inkubationsgemischen waren EDTA (1 mM), Diisopropylfluorphosphat
(DFP) (1 mM), Aprotinin (10 μg/ml),
N-Ethylmaleimid (NEM) (1 mM), Pepstatin A (10 μg/ml), α1-Antichymotrypsin (0,4 mg/ml)
und Sojabohnentrypsininhibitor (SBTI) (1 mg/ml). In diesem System
wurden auch die Wirkungen von Al3Cl (20 μM) und Heparin
(20 U/ml) gemessen.
-
Gehirn-APP-Präparat:
-
Amyloidproteinvorläufer (APP)
wurde nach der Methode gemäß Moir et
al. (1992) gereinigt. Die Präparate
von gereinigtem 130- und 110-kDa-APP stammten aus Humangehirnmembranextrakten
und enthielten das APP vollständiger
Länge mit
intaktem Carboxylende, jedoch ohne das 17-Rest-Signalpeptid. Die
130- und 110-kDa-Proteine
lagen bei der Silberfärbung
im Anschluß an
eine Polyacrylamidgelelektrophorese offensichtlich in gleichem Verhältnis vor
und waren die einzigen sichtbaren Banden. Die Identität dieser
beiden Proteine wurde durch Western-Blots mit monoklonalem Antikörper (mAb)
22C11 (der ein aminoterminales Epitop auf APP erkennt [Weidemann
et al., 1989]) und Aminoterminussequenzierung bestätigt. Die
Proteinkonzentration der APP-Präparate
wurde durch Aminosäureanalyse
bestimmt.
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Humanserumpräparat:
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40–60 ml Vollblut
wurden in blanken Röhrchen
bei 20°C
3 h lang gerinnen gelassen. Das geronnene Blut wurde dann 16 h lang
bei 4°C
inkubiert und anschließend
15 min bei 1500 g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands
wurde das Serum weitere 15 min bei 1500 g zentrifugiert. Der zellfreie Überstand
wurde entfernt.
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65Zn2+-Bindung an APP:
-
Die
Bindungsanalyse wurde wie folgt durchgeführt: Aliquote Teile von APP
(90 ng, ≈1,1
pmol, unter der Annahme, daß die
durchschnittliche Aminosäureformelmasse
von APP ≈80
kDa be trägt)
wurden bei 20°C inkubiert.
Die Inkubationen (50 μl)
erfolgten in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 in Gegenwart
von 106 cpm 65Zn (175 nM). Dann wurde die
Inkubationslösung
auf eine 1,1-ml-Bettvolumen-Sephadex G25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule, die
zuvor mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, ins Gleichgewicht
gesetzt worden war, appliziert, absetzen gelassen und dann mit 645 μl Gleichgewichtspuffer
ausgesalzt. Eine Voranalyse der Aussalzeigenschaften der Säule mit
Mischungen aus Rinderserumalbumin und Kaliumdichromatlösung zeigte,
daß mehr
als 95% des Proteins in dem Inkubationsgemisch in dieses Volumen
ohne nachweisbares vorhandenes freies Salz ausgesalzt werden konnten.
Das ausgesalzte Protein wurde direkt in Zählröhrchen mit 10 ml einer wäßrigen Zählszintillationsmittellösung (ACSII,
Amersham) gesammelt. Zum vollständigen
Aussalzen waren weniger als 2 min erforderlich. Die Menge von an
das ausgesalzte APP gebundenem 65Zn wurde
durch Auszählen
der gesammelten Probe in einem auf den breitesten Kanal eingestellten
Beta-Zähler
bestimmt. Die Zählung
hat sich als 51% wirksam erwiesen. Die Bindung des markierten Zn2+ an APP wurde einer Konkurrenz(bindung)
mit nichtmarkiertem Zn2+ und sonstigen Metallchloridsalzen
unterworfen.
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Charakterisierung
der mutmaßlichen
Zink-bindenden Domäne
von APP:
16 μg
des synthetisierten Peptids
GVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGAD,
das den Resten 181-214 von APP695 (oder
den Resten 181-200) entspricht, oder 16 μg Kontrollpeptid wurden in 200 μl Blockadepuffer
(50 mM Tris-HCl,
1 mM MnCl2, 10 mM β-Mercaptoethanol, 20% Methanol,
pH-Wert: 7,4) gelöst und punktförmig auf
zuvor mit Methanol angefeuchtetes PVDF (Immobilon-P, Millipore,
Befored, MA) aufgetragen. Der Fleck wurde dann 30 min lang bei 20°C mit 100
000 cpm 65Zn2+ in
Blockadepuffer in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen
von konkurrierendem nichtmarkiertem Zn2+ oder
sonstigen zweiwertigen Kationen inkubiert. Nach der Inkubation wurde
der punktförmig
aufgetragene Fleck dreimal mit 200 μl Blockadepuffer ohne MnCl2 gewaschen. Dann wurde der punktförmige Fleck
ausgeschnitten, in 10 ml Szintillationsmittel gelegt und durch β-Zählung getestet.
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Iodierung von APP:
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100
kDa-Humangehirn-APP voller Länge
wurden nach der Chloramin-T-Methode iodiert. Das iodierte APP (125I-APP) wurde dann von den Markierungsreagenzien
durch Sephacryl-G25-Chromatographie
abgetrennt.
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APP-Bindung an Heparin-Sepharose:
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125I-APP (0,37 pmol, 40 000 cpm) wurde in
250 μl Puffer
1 (50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM
EDTA oder 25–150 μM ZnCl2) auf eine Heparin-Sepharose-Säule (8 mm × 5 mm) mit 0,25 ml Bettvolumen,
die zuvor bei 20°C
mit Puffer 1 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben. Die
Säule wurde
dann mit 6 ml Puffer 1 gewaschen und das APP mit aliquoten Teilen
von Puffern hohen NaCl-Gehalts eluiert. Gradienteneluierungen erfolgten
durch Eluieren in 50 mM-Inkrementen (700 μl) der NaCl-Konzentration von
0–1200
mM, gefolgt von einem Impuls von 2000 mM NaCl (in 50 mM Tris-HCl,
0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM EDTA oder 50 μM ZnCl2). Die Impulseluierung von an Heparin-Sepharose gebundenem
APP benutzte 700 μl
Puffer 2 (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert:
7,4 ± 1
mM EDTA oder 25–150 μM ZnCl2) und anschließend 700 μl Puffer 3 (100 mM CaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin,
pH-Wert: 7,4 ± 1
mM EDTA oder 25–150 μM ZnCl2) und danach 700 μl Puffer 4 (500 mM NaCl, 50
mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM
EDTA oder 50–150 μM ZnCl2) und schließlich 2,5 ml Regenerierpuffer
(2000 mM NaCl).
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Eine
APP-Bindung an Heparin-Sepharose wurde auch unter Verwendung von
teilweise gereinigten APP-Präparaten
aus Humangehirnmembranen (gemäß der Methode
von Moir et al., 1992) oder Humanserum untersucht. Gewaschener Gehirnmembranextrakt
oder Humanserum wurde auf eine MaCl-Konzentration von 350 mM eingestellt
und auf eine Q-Sepharosesäule
(5 cm × 5
cm) aufgegeben, mit 350 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 (250
ml [× 2
für den
Gehirnmembranextrakt]) gewaschen und mit 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl,
pH-Wert: 7,4 (200 ml mit 5 ml/min) eluiert. Diese Maßnahme führt zu einer
80fachen Anreicherung von APP in den Peakproteinfraktionen. Diese
wurden dann gepoolt (Moir et al., 1992). Das Eluat (20 ml) wurde in
25 mM Tris, pH-Wert: 7,4 (30 ml) mittels einer G26-Sephadex-Säule (2,6
cm × 40
cm) ausgesalzt. 15 ml des Produkts wurden mit 2 mM ZnCl2,
50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 auf 50 μM Zn2+ eingestellt.
Die anderen 15 ml wurden mit 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 auf dasselbe Volumen eingestellt.
10 ml des ausgesalzten Q-Sepharose-Eluats mit 6,7 mg Protein wurden
mit einer Geschwindigkeit von 0,35 ml/min auf Heparin-Sepharose
(1,6 cm × 5
cm) appliziert, mit 100 ml Beladungspuffer gewaschen und mit einer
Fließgeschwindigkeit
von 0,35 ml/min mit einem 0–1500
mM NaCl-Gradienten (±50 μM Zn2+) in 52,5 ml eluiert. Fraktionen (1 ml)
entsprechend 20-mM-NaCl-Inkrementen wurden gesammelt. 30-μl-Proben
einer jeden Fraktion wurden durch Western-Blotting mit mAb-22C11
nach der Methode gemäß Bush et
al. (1990), die durch Verwendung von PVDF-Membranen und Verkürzen der
Blockadedauer auf 1 h modifiziert worden war, auf APP getestet.
Die auf den Blots festgestellte Immunreaktionsfärbung der 130-kDa-APP-Spezies
wurde durch computerunterstützte
Bilderfassungsreflexionsdensitometrie (Busch et al., 1992) quantifiziert.
Die 130-kDa-Reflexionssignale auf den Blots wurden als Verhältnis des
in einer Probenbahn entstandenen Signals zur 130-kDa-APP-Reflexions ablesung einer
auf jedem einzelnen Filter als interner Standard vorhandenen Probe
des Ausgangsmaterials ausgedrückt.
-
Beispiel 2
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Anomales Profil von Plasma-APP
bei Alzheimer-Krankheit:
-
Ein
monoklonaler Antikörper
(22C11), der den Aminoterminus von APP erkennt (Weidemann et al., 1989)
identifizierte bei Western-Blots von Humanplasma (Bush et al., 1990;
Buch et al., 1991) vier immunreaktive Hauptbanden von APP (130,
110, 65 und 42 kDa). Die relative Häufigkeit dieser Banden wurde
bei Alzheimer-Patienten und Kontrollpersonen überwacht. Bei Alzheimer-Krankheitsfällen kam
es im Vergleich zu Kontrollpersonen zu einem Anstieg der 130-kDa-Plasma-APP-Bande
und einer Verminderung der 42-kDa-Plasma-APP-Bande. Die Kontrollpersonen
bestanden aus Gruppen nicht-dementer, altersmäßig entsprechender Personen
(1A), normaler junger Erwachsener (1B)
und mit sonstigen neurologischen Krankheiten behafteter Patienten.
Es gab keinen zusammenhängenden
Unterschied in den Intensitäten
der 110- und 65-kDa-Banden
zwischen Alzheimer-Patienten und Kontrollpersonen. Die Gesamtmenge
an APP-Immunreaktivität
unterschied nicht zwischen Alzheimer-Patienten und Kontrollpersonen,
da das Verhältnis
Gesamtimmunreaktivität
von Alzheimer-Patienten/Kontrollpersonen 1,02 ± 0,22 (Mittelwert ± Standardabweichung)
betrug.
-
Eine
Quantifizierung dieser Erkenntnisse durch Bilderfassungsanalyse
(Tabelle 1) zeigte, daß die 130-kDa-
und 42-kDa-Banden
bei AD im Vergleich zu gepoolten Kontrollen (Durchschnittsdaten
von mit anderen neurologischen Krankheiten behafteten Kontrollpersonen,
normalen jungen erwachsenen Kontrollpersonen und nicht-dementen,
altermäßig entsprechenden
Kontrollpersonen) (zweiendig, p < 0,001)
gestiegen bzw. gesunken waren. Bei Alzheimer-Krankheit war eine
60%ige Er höhung
im Anteil der 130-kDa-Form und eine gleichzeitige 35%ige Senkung
in der 42-kDa-Form feststellbar. Das Immunreaktivitätsmuster
war bei der gepoolten Kontrollgruppe gleichmäßiger verteilt, wobei die am
stärksten
konzentrierte APP-Immunreaktivität
im 42-kDa-Bereich lag. Dieser Trend blieb beim Vergleich von Alzheimer-Krankheitsfällen mit
den drei Kontrolluntergruppen durchgängig erhalten. Hierbei bestätigt eine
post hoc-Analyse die Signifikanz des Unterschieds zwischen der Alzheimer-Krankheit
und jeder Kontrollgruppe im 130-kDa-Bereich und zwischen den Alzheimer-Patienten
und jungen Erwachsenen und älteren
Kontrollgruppen im 42-kDa-Bereich. Es gab keine signifikanten Unterschiede
zwischen den mittleren Remissionsproportionen der drei Kontrollgruppen
in sowohl den 130- als auch 42-kDa-Bereichen. Bei der altersmäßig emtsprechenden
Kontrollgruppe waren im Vergleich zu der jungen erwachsenen Kontrollgruppe
der 110-kDa-Bereich
wesentlich höher
und der 65-kDa-Bereich wesentlich geringer.
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Identifizierung der 110-,
65- und 42-kDa-Plasma-APP-Banden als mögliche Spaltungsprodukte der 130-kDa-APP-Spezies:
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Wurde
Plasma-APP aus Heparin-Sepharoseeluaten 18 h bei 37°C inkubiert,
wurde das APP langsam unter Verlust der 130-kDa-Bande und Betonung der drei geringeren
Banden (110 kDa, 65 kDa und 42 kDa) langsam proteolytisch abgebaut.
Die Proteolyse wurde durch die Anwesenheit von Zn2+ beschleunigt.
Die zur Stimulierung der Proteolyse erforderliche Zinkkonzentration
betrug 20 μm.
Dieser Wert liegt innerhalb des Bereichs der normalen Humanplasmakonzentration
(Davies et al., 1968). Die Geschwindigkeit der Zn2+-verstärkten Proteolyse
war im Vergleich zu Kontrollproben von jungen Erwachsenen bei Alzheimer-Krankheit ähnlich. Bei
beiden Gruppen fanden sich identische Abbauprodukte. Dies deutet
darauf hin, daß die
ein geringeres Molekulargewicht aufweisenden APP-Formen in Plasma
Abbauprodukte der 130-kDa-Form sein könnten und daß eine Proteolyse
der 130-kDa-Form in einem Alzheimer-Krankheitspräparat das Plasma-APP-Profil
in Richtung desjenigen von Kontrollpersonen ändert.
-
Eine
Zn2+-verstärkte APP-Proteolyse eines Kontrollpräparats eines
jungen Erwachsenen über
2 h wurde sowohl durch EDTA, Heparin als auch die Serin-Proteaseinhibitoren
Aprotinin, Diisopropylfluorphosphat und SBTI vollständig und
durch α1-ACT unvollständig gehemmt. Weder Al3Cl, der Cystein-Proteaseinhibitor N-Ethylmaleimid noch
der Säure-Proteaseinhibitor
Pepstatin A beeinflußten
die Reaktion.
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Untersuchungen bezüglich der
Herkunft von Plasma-APP-Formen:
-
Das
durch Western-Blotting nachgewiesene APP-Signal wurde durch Ultrazentrifugieren
von Plasma (100 000 g × 15
min) nicht beeinträchtigt.
Durch MAb 22C11 auf Western-Blots von Heparin-Sepharose-Eluaten
nachgewiesenes Plasma-APP konnte durch ein gegen das vollständige Länge aufweisende,
native, von Gehirnmembran herrührende
APP (90/3) gezüchtetes
Kaninchenantiserum und auch durch ein gegen das Fusionsprotein APP695 (Anti-Fd-APP) gezüchtetes Kaninchenantiserum
immungefällt
werden. Eine Immunofällung
war jedoch mit dem Präimmunserum
von 90/3 oder mit gegen synthetische Peptide entsprechend den carboxylterminalen
40 (anti-CT) oder 100 (Anti-A4CT) Resten von APP gezüchteten
Kaninchenantiseren nicht möglich.
Diese Ergebnisse belegen, daß die
in Plasma beobachteten APP-Formen löslich sind und daß ihnen das
Carboxylende fehlt.
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Zur
Bestimmung, ob APP in Vollplasma verarbeitet werden kann, wurde
frisches Plasma einer jungen erwachsenen Kontrollperson über 8 Tage
hinweg bei 37°C
inkubiert. Das Plasma-APP wurde durch Heparin-Sepharosechromatographie
getestet. Über
diesen Zeitraum hinweg war kein signifikanter Abbau der 130-kDa-APP-Form
feststellbar. Dies deutet darauf hin, daß im Plasma keine grundlegende
Verarbeitung von APP erfolgt.
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Es
wurde bereits berichtet, daß es
zwischen dem Gehalt an APP in Vollplättchen oder dem Elektrophoresemuster
von Plättchen-APP
auf Western-Blots bei Alzheimer-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen
keinen Unterschied gibt (Bush et al., 1990). Da bei Alzheimer-Krankheit
andere Plättchen-abnormalitäten beschrieben
wurden (Zubenko et al., 1987) und da ferner APP in dem Plättchen-α-Korn hoch
angereichert ist (Bush et al., 1990; Bush et al., 1991, und Cole
et al., 1990), wurde die Möglichkeit,
daß eine
Plättchen-APP-Freisetzung
zum Plasma-APP-Spiegel einen Beitrag leistet, untersucht. Plättchen und
Plasma eines Individiums mit Grauplättchensyndrom (GPS), einer
angeborenen Anomalität,
bei der die Gehalte im Plättchen-α-Korn stark
vermindert sind, wurden untersucht. Die GPS-Plättchen enthielten weniger als
1% des bei normalen Plättchen
vorkommenden APP (3). Im Gegensatz dazu war das
durche Heparin-Sepharosechromatographie gereinigte 130-kDa-Plasma-APP
bei GPS im Vergleich zur Kontrolle etwa 50% reduziert (3).
Diese Daten belegen, daß es
unwahrscheinlich ist, daß die
in Plasma gefundenen APP-Arten ein durch eine Plättchenfreisetzung von APP während der
Plasmaherstellung entstandenes Kunstprodukt sind, daß jedoch
eine Plättchenzerstörung möglicherweise
in der Milz einen Beitrag zur Plasma-APP leistet.
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Beispiel 3
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Studien der APP-Physiologie-Zinkmodulierung.
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I) Einfluß einer
Zinkbelastung auf Humanplasma-APP.
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100
mg elementares Zink (als Sulfat, in Kapseln) wurden oral an zwei
Individuen mit Alzheimer-Krankheit (NINCDS/ADRDC-Kriterien mit abnormalen Plasma-APP-Profilen)
und zwei altersmäßig entsprechende Kontrollpersonen
(mit normalen Plasma-APP-Profilen) verabreicht. Die Zugabe wurde
7 Tage lang fortgesetzt. Vor Beginn der Zinkergänzung und 3 Wochen nach dem
Aufhören
der Zinkergänzung
wurde Morgenblut im nüchteren
Zustand abgenommen. Western-Blots mit monoklonalem Antikörper 22C11
wurden in der zuvor geschilderten Weise mit 65 μg aus den Proben gereinigtem
Plasma-Heparin-Sepharoseeluat durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten
eine Erhöhung
der 130-kDa-Spezies-Plasma-APP relativ zu den sonstigen vorhandene Spezies,
mit anderen Worten gesagt, eine Verschiebung in Richtung des Profils
der APP-Spezies, die für
Alzheimer-Krankheit
typisch ist. Die beiden Kontrollplasma-APP-Profile näherten sich
Alzheimer-Krankheitsprofilen, die beiden Alzheimer-Profile verschlechterten
sich. Die proportionale Zunahme der 130-kDa-Spezies betrug etwa
20% pro Tag Zinkergänzung.
Ein älterer
Kontrollfreiwilliger, der über
3 Tage hinweg eine viermal stärkere
Dosis erhalten hatte, zeigte dieselben Änderungen in seinem Plasma-APP-Profil.
Diese hielten noch 3 Tage nach Absetzen der Ergänzung an.
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II) Einfluß einer
Senkung der Plasmazinkkonzentrationen auf APP-Spiegel.
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In
der Stunde nach der Mahlzeit fallen bekanntlich die postprandialen
Plasmazinkspiegel (um) etwa 10%. Sieben Alzheimer-Freiwillige und
sechs altermäßig entsprechende
Kontrollpersonen wurden sowohl in nüchterem Zustand als auch 1
h nach einem standardisierten Frühstück auf ihr
Plasma-APP-Profil
und ihre Zinkspiegel hin getestet. Sowohl die Spiegel von Plasmazink
als auch von 130-kDa-APP sanken (um) etwa 10%. Es herrschte eine
lineare Beziehung zwischen der Änderung
im APP-Spiegel und der Änderung
in der Zinkkonzentration.
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Ein
junger erwachsener Freiwilliger erhielt während einer Hungerphase eine
orale Dosis von 50 g Glucose. Innerhalb der ersten halben Stunde
nach der Glucosedosis fielen sowohl die Plasmazink- als auch die 130-,
110- und 65-kDa-APP-Spiegel (um) etwa 10%. Über eine Dauer von 4 h mit
anfänglichem
Abfall und anschließender
Rückprallerhöhung der
Plasmazinkkonzentration war eine enge Parallele bei der Plasma-APP-Konzentration
feststellbar. Die Bestimmung erfolgte mittels eines APP-Radioimmuntests
unter Verwendung eines gegen natives Gehirn-APP (90/3) gezüchteten
Antikörpers.
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III) Bestimmung der Plasmazinkkonzentrationen
bei Alzheimer-Krankheit:
-
Im
Vergleich zu altersmäßig entsprechenden
Kontrollpersonen waren im Plasma von fastendem Alzheimer-Patienten
die Plasmazinkspiegel nicht signifikant erhöht.
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IV) Einfluß einer
Zinkbelastung auf Rattenhirn-APP.
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16
Wochen alte Sprauge-Dawley-Rattenböcke erhielten 4 Tage lang eine
tägliche
Injektion mit 120 mg/kg ZnCl2-Lösung. Die
Versuchstiere wurden anschließend
betäubt
und durch Herzinnenpunktion ausgeblutet. Nach Entfernen ihrer Gehirne
wurden diese homogenisiert und nach dem Ultrazentrifugieren in Membran- und
lösliche
Fraktionen getrennt. Western-Blots von Heparin-Sepharoseeluaten
von Plasma, Membranextrakten und löslichen Fraktionen zeigten
die Entwicklung einer neuen 80-kDa-Bande
im Plasma und eine ungefähr 80%ige
Steigerung in den Mengen sämtlicher
APP-Formen bei den Ratten, die eine Zinkergänzung erhalten hatten, im Vergleich
zu Kontrollplasma und Gehirnpräparaten
(aus Tieren des Wurfs, die kein Zink erhalten hatten).
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V) Einfluß von extrazellulärem Zink
auf gezüchtete
PC12-Zellen.
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24
h lang wurden in Anwesenheit von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM,
N2), das mit 8% fötalem
Kalbserum (FCS) ergänzt
war, Plattenkulturen von 106 PC12-Zellen
angelegt. Danach wurde das Medium entfernt und durch DMEM ± 2 bis
50 μM ZnCl2 oder ein anderes Salz, jedoch ohne FCS,
ersetzt.
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Zellen
und Medien wurden 48 h später
geerntet. Aliquote Teile Medien, Zellcytosol und Membran (nach einer
Lyse und Ultrazentrifugieren) wurden mit mAb 22C11 durch Western-Blotting auf APP
getestet. Die Ergebnisse von vier Versuchen mit Kontrollproben zeigten,
daß das
Zink eine merkliche Zunahme an in die Medien freigesetztem APP induzierte,
und zwar ungefähr
50% bei 2 μM
mit einem Anstieg auf einen Spitzenwert von ungefähr 200%
bei 50 μM.
FeCl2 besaß eine ähnliche Wirkung, Kupfer(I)-
und Aluminiumchlorid besaßen weit
geringere stimulierende Wirkungen. Diese Änderungen waren von geringeren
Steigerungen an Cytosol-APP begleitet. In den Membran-assoziierten
APP-Spiegeln war keine Änderung
feststellbar.
-
VI) Einfluß von extrazellulärem APP
auf die Zinkaufnahme durch PC12-Zellen.
-
24
h lang wurden in Anwesenheit von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM,
N2), das mit 8% fötalem
Kalbserum (FCS) ergänzt
war, Plattenkultuen von 106 PC12-Zellen
angelegt. Das Medium wurde danach entfernt, durch DMEM ohne FCS
ersetzt und weitere 24 h lang inkubiert. Dann wurden die Zellen
gewaschen (× 2
mit DMEM) und mit DMEM, das mit 10 nM gereinigtem, Gehirnmembran-assoziiertem
APP mit 130/110 kDa mit 20 000 cpm 65Zn
(hergestellt wie im Zusammenhang mit 1 beschrieben)
ergänzt
war, inkubiert. Nach wechselnder Inkubationsdauer wurden die Zellen
geerntet, gewaschen, einer Pronaseverdauung unterworfen, um Oberflächenproteine
zu entfernen, danach in einem Szintillationsmittel lysiert und in
einem Beta-Zähler
getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß in Gegenwart von APP innerhalb
1 h ungefähr
10% der Zählimpulse
im Vergleich zu ungefähr
4% bei Abwesenheit von APP internalisiert wurden (zwei Versuche mit
im Doppel durchgeführten
Inkubationen). Diese Daten belegen, daß APP bei der zellulären Aufnahme
von externem Zn2+ eine Rolle spielen könnte.
-
Beispiel 4
-
Bindung von
Zink an APP
-
Zur
Bestimmung, ob APP Zink bindet, wurden Inkubationen von Humangehirn-APP
voller Länge
mit 65Zn2+ und konkurrierenden
Konzentrationen von nichtmarkiertem Zn2+ durehgeführt. Eine
maximale Bindung wurde nach 15 min beobachtet (30% Bmax nach
1 min). Diese war mit einer Dissoziationskonstante (KD)
von 764 nM bei einem pH-Wert von 7,4 und von 2,08 μM bei einem
pH-Wert von 6,4 sättigbar.
Die Bindung von 65Zn2+ an
APP war für
sämtliche
konkurrierenden Metallionen einschließlich Ca2+ und
Mg2+ spezifisch. Co2+ war das
am stärksten
konkurrierende Kation. Es besaß die
Fähigkeit
zu einer 70%igen Bmax-Konkurrenz bei 20 μM. Schwermetalle,
Cu2+ und Al3+ konkurrierten
bei 20 μM
um etwa 60% Bmax. Die Stöchiometrie der Zn2+-Bindung bei
APP betrug 1:1.
-
Eine
mutmaßliche
Zn2+-Bindungsstelle wurde durch Trypsinverdauung
von APP und anschließende Aminoterminussequenzierung
eines 6-kDa-Verdauungsfragments, das an mit Zn2+-beladene,
chelatbildende Sepharose gebunden war, identifiziert. Die Fragmentsequenz
war FRGVEFVXXPLA. Zur weiteren Charakterisierung und Bestätigung der
Zn2+-Bindungseigenschaften dieses APP-Bereichs
wurden synthetische Peptidkandidaten mittels der dot-blot-Methode
untersucht. Ein synthetisches Peptid entsprechend den Resten 181-214
von APP besaß Fähigkeit,
Zn2+ in sättigungsfähiger und spezifischer Weise
zu binden. Die Rolle der Cysteinreste bezüglich eines Beitrags zur Fähigkeit
dieses Peptids zur Bindung von 65Zn2+ wurde durch Untersuchen der Fähigkeit
desselben Peptids zur Bindung von 65Zn2+ nach Modifizierung der Cysteine in dem
Peptid durch Carboxyamidomethylierung und durch Untersuchen der 65Zn2+-Bindung an ein anderes
synthetisches Peptid entsprechend den Resten 189-220 von APP695 ohne die Cysteinreste in den Stel lungen
186/187 bestimmt. Beide Peptide vermochten 65Zn2+ signifikant über dem Rauschen, jedoch bis
zu lediglich etwa 15% der 65Zn2+-Bindungsmenge,
die bei Verwendung derselben Menge des 181-214-Peptids (oder 181
bis 200) auftrat, zu binden. Dies deutet darauf hin, daß die Cysteinreste
für die
Zinkbindungseigenschaften dieses Peptids obligatorisch sind. Ähnliche
Mengen an anderen Peptiden entsprechend anderen Bereichen des APP-Moleküls (Reste
422-433, 581-601, 645-655) und andere Kontrollpeptide (Renin und
Insulin A-Kette) vermochten Zn2+ nicht zu
binden. Die positive Kontrolle (Insulin B-Kette) band 65Zn2+.
-
Zur
Erforschung der funktionellen Signifikanz einer Zn2+-Bindung an APP wurde
der Einfluß von
Zn2+ auf eine Heparinbindung an APP aus
drei Quellen, iodiertes gereinigtes Gehirn-APP, teilweise gereinigtes,
unmarkiertes Humangehirn-APP
und teilweise gereinigtes, unmarkiertes Humanserum-APP, untersucht.
Die Menge des an Heparin bindenden Gehirn-APP wurde spezifisch durch
die Anwesenheit von 50 μM
Zn2+ (um) etwa 50% erhöht. Die Steigerung der 125I-APP-Bindung an Heparin erreichte ein
Plateau bei 75 μM
Zn2+. Zn2+ erhöhte den
Anteil der Bindung von APP an Heparin mit höherer Affinität und steigerte
die Menge an 125I-APP, die aus der 50–2000 mM-NaCl-Eluierfraktion
gewonnen wurde, in Anwesenheit von 50 μM Zn2+ um
das etwa 3fache und in Anwesenheit von 100 μM Zn2+ um
das 4,5fache. Ca2+ und Mg2+ änderten
das Profil der 125I-APP-Eluierung nicht.
Co2+ erhöhte
bei 75 μM
die Rückgewinnung
des 125I-APP in den 100-500- und 500-2000-mM-NaCl-Fraktionen. Al3+ senkte die Rückgewinnung von 125I-APP
ausgenommen in der 500-2000-mM-NaCl-Fraktion, in der die Rückgewinnung
auf etwa das 4,5fache stieg. Zn2+ besaß bei 50 μM eine ähnliche
Wirkung auf das NaCl-Gradienteneluierprofil von an Heparin-Sepharose
gebundenem, teilweise gereinigtem Gehirn-APP. Das Vorhandensein
von Zn2+ führte zu einer Zunahme der rückgewonnenen APP-Menge
in sämtlichen
Fraktionen von 1110 auf 1644 Remissionseinheiten, einer Zunahme
von 48%, und ferner zu einer Erhöhung
der APP-Rückgewinnung
in durch NaCl-Konzentrationen von über 520 mM eluierten Fraktionen.
Trotz der erhöhten
APP-Rückgewinnung
in den eluierten Fraktionen zeigte ein Proteintest eine 13%ige Verminderung
der Menge an eluierten Protein. Dies deutet darauf hin, daß das Vorhandensein
von Zn2– die
Spezifität
der APP-Bindung an Heparin steigerte. Eine 125I-APP-Rückgewinnung
erfolgte über
einen Bereich von NaCl-Konzentrationen, die 200–300 mM niedriger waren als
bei der Eluierung von teilweise gereinigtem Gehirn-APP. Dies kann
das Ergebnis einer radiolytischen oder oxidativen Schädigung des
APP-Moleküls
während
der Iodierung sein. Die Möglichkeit,
daß die
Eluierung von teilweise gereinigtem APP durch mitgereinigtes Material
beeinflußt
wird, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.
-
Das
Vorhandensein von 50 μM
Zn2+ förderte
eine geringere Steigerung der Bindung von teilweise gereinigtem
Serum-APP an Heparin-Sepharose. In den Serumproben betrug die Zunahme
an bei der NaCl-Eluierung rückgewonnenem
APP etwa 10%. Ein Proteintest aus rückgewonnenen Fraktionen zeigte
jedoch, daß anders
als beim Einfluß von
Zn2+ auf die Heparin-Sepharosechromatographie
von teilweise gereinigten Gehirnproteinen der Einfluß von Zn2+ auf die Heparin-Sepharosechromatographie
von teilweise gereinigtem Serum darin bestand, die rückgewonnene
Proteinmenge um 12% zu erhöhen.
Anders als sein Einfluß auf
das Salzeluierprofil von aus dem Gehirn stammendem APP führte das
Vorhandensein von Zn2+ bei der Heparin-Sepharosechromatographie
von aus Serum stammendem APP nicht zu einer Steigerung des Anteils
an Bindung mit höherer
Affinität.
-
Die
Wirkung von Zn2+ bei der Modulierung einer
Heparinbindung an APP wurde auch im Rahmen eines Biosensorsystems
untersucht. Bei 100 μM
hat es sich gezeigt, daß Zn2+ in star kem Maße eine Heparinbindung an aus
dem Rattengehirn gereinigtem APP fördert. Diese Wirkung war im
Vergleich zum Fehlen zweiwertiger Kationen oder zur Anwesenheit
von Ca2+, Mg2+ oder
Co2+ am ausgeprägtesten und spezifischsten
bei Zn2+. Am deutlichsten war sie bei niedrigem
Verhältnis
Heparin/AP. Konzentrationen von Zn2+ von
nur 50 nM besaßen einen
deutlichen Einfluß auf
eine Steigerung der Heparinbindung an Rattengehirn-APP. Zn2+ förderte
bei 50 mM eine etwa 170%ige Zunahme der Heparinbindung. Die Wirkung
war bei 70 μM
gesättigt.
-
Beispiel 5
-
Heparin schützt APP
gegen eine proteolytische Spaltung Zink beseitigt die Schutzwirkung
von Heparin
-
Die
proteolytische Aktivität
von Trypsin (Boehringer, Mannheim) wurde untersucht, um zu bestimmen, ob
sie durch wechselnde Dosen von Heparin (Sigma) und ZnCl2 verändert wird.
Sowohl Heparin als auch ZnCl2 veränderten
die Trypsinaktivität
nicht. Dies ergab sich aus einer Bestimmung der Fähigkeit
zur Spaltung einer fluorogenen synthetischen Substanz Z-F-R-AMC.
Dies belegt, daß Trypsin
eine geeignete Serinprotease zur Verwendung im Rahmen von Untersuchungen
hinsichtlich einer Änderung
oder Modulierung der proteolytischen Widerstandsfähigkeit
von APP durch Heparin und Zink ist. Mit Trypsin wurde in einem Mengenverhältnis von
1/64 (Enzym/Substrat) 1 h lang bei 37°C von Humangehirnmembran herrührendes
APP (das den intakten Carboxylterminus enthält) verdaut. Western-Blots
für APP
unter Verwendung des APP-bindenden monoklonalen Antikörpers 22C11
dienten zur Überwachung
des Fortschreitens der proteolytischen Reaktion und zum Nachweis
von Abbauprodukten. Es hat sich gezeigt, daß die Anwesenheit von Heparin
in Konzentrationen von nur 100 nM eine deutliche Verminderung in
der Geschwindigkeit des Gehirn-APP-Abbaugrades durch Trypsin verursachte.
Diese Schutzwirkung war bei 10 μM
gesättigt.
-
Die
Anwesenheit von Zn2+ (bis zu 100 μM) oder EDTA
(1 mM) besaß bei
dieser Reaktion keinen Einfluß auf
die Geschwindigkeit der APP-Proteolyse durch Trypsin. Die Anwesenheit
von Zn2+ (über 1 μM) zusammen mit Heparin (1 μM) bei der
proteolytischen Reaktion beseitigte jedoch vollständig diese
Schutzwirkung von Heparin. Dies war eine unerwartete Antwort, da
vorherige Ergebnisse zeigten, daß die Anwesenheit von Zn2+ die Heparinbindung an APP fördert.
-
Eine
mögliche
Erklärung
für diese
Erkenntnis ist, daß die
Zinkbindung an APP die Heparinbindung an einer anderen Stelle des
Proteins, von der bekannt ist, daß sie in Richtung auf das Zentrum
von APP liegt, durch Verstärken
der Proteinkonformationsstabilität
begünstigt.
Die durch Zink verursachte Konformationsstabilisierung kann das
Offenbleiben des Zentralbereichs von APP für ein Haftenbleiben von Heparin
an den Resten 98 bis 105 von APP695 (CKRGRKQCKTH)
oder den Resten 318 bis 331 von APP695 (KAKERLEAKHRER) – vielleicht
aufgrund eines Ladungseffekts – begünstigen.
Wenn eine Heparinbindung in Abwesenheit von Zink erfolgt, kann das
Protein dazu gebracht werden, eine stärker kugelige und proteaseresistente
Konformation anzunehmen. Diese Zinkbindung an APP könnte das
APP so weit stabilisieren, daß eine
Heparinbindung daran gehindert wird, eine den Proteasewiderstand
steigernde APP-Konformationsänderung
einzuleiten.
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Beispiel 6
-
Verabreichung von Zink
bei Alzheimer-Krankheit (AD)
-
Die
Patienten aus Beispiel 3 wurden untersucht.
-
Die
gesunden Freiwilligen litten an keinen Krankheitseffekten aufgrund
der Zinkergänzung.
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Die
beiden Alzheimer-Freiwilligen fühlten
sich unter Zinkergänzung
akut unwohl. Beide litten an einem schweren Verlust an Erkenntnisfunktion
bei der Minimentalstatusprüfung
(Folstein et al., 1975). Die Bewertungen verschlechterten sich von
mäßigen Demenzgradeb
bis nicht feststellbarer Funktion. Die Augenbewegungsanomalitäten und
die allgemeinen Fähigkeiten,
für sich
selbst sorgen zu können,
verschlechterten sich über
die Ergänzungsperiode.
Diese Antwort stimmte mit einer neurotoxischen Reaktion auf die
Zinkergänzung überein.
Wurde die Zinkergänzung
abgesetzt, kehrte die Erkenntnisfunktion innerhalb von 2 Wochen
wieder auf das vorherige Niveau zurück.
-
Folglich
kann ein Diagnosetest eine orale Zinkprovokation umfassen. Ein klinisch
gemessene neurotoxische Reaktion wäre mit der Diagnose AD verträglich.
-
Die
Wechselwirkung zwischen APP, Zink und Heparin ist derzeit noch nicht
geklärt.
Aus dieser Beschreibung geht jedoch hervor, daß sowohl Zink als auch Heparin über spezielle
Bindungsstellen mit APP eine Wechselwirkung eingehen und dabei seine
Proteolysestabilität ändern. Die
Erfinder haben eine Zinkbindungsstelle und eine Heparinbindungsstelle
auf APP identifiziert. Auf dem APP-Molekül können auch noch weitere dessen
Stabilität ändernde
Zink- und Heparinbindungsstellen vorhanden sein. Diese Erfindung
erstreckt sich auf die Änderung
bzw. Modulierung der Wechselwirkung von Zink und/oder Heparin und/oder
sonstiger Mittel mit APP zur Behandlung, Linderung oder Verhinderung
von Alzheimer-Krankheit und sonstigen neurologischen Störungen,
die mit einer irrtümlichen
APP-Verarbeitung einhergehen.
-
Für den Fachmann
dürfte
es selbstverständlich
sein, daß die
hierin beschriebene Erfindung über
die spezielle Beschreibung hinaus verschiedenen Änderungen und Modifikationen
zugänglich
ist. Selbstverständlich
fallen unter die Erfindung sämtliche
derartigen Änderungen
und Modifikationen. Die Er findung umfaßt ferner sämtliche Stufen, Merkmale, Zusammensetzungen
und Verbindungen, auf die in dieser Beschreibung alleine oder kollektiv
hingewiesen oder eingegangen wurde, sowie jegliche und sämtliche
Kombinationen irgendwelcher zwei oder mehrerer dieser Stufen oder
Merkmale.
-
TABELLE 1 Anteile der
Plasma-APP-Formen, analysiert durch Bilderfassung bei Alzheimer-Krankheit
und Kontrollpersonen.
-
Heparin-Sepharoseeluate
von Alzheimer-Krankheit- und Kontrollplasmaproben wurden mit MAb 22C11
immunoblottiert. Die Remissionen der Banden bei 130, 110, 65 und
42 kDa wurden durch computergestützte
Bilderfassungsanalyse (vgl. Beispiel 1) gemessen. Die relativen
Mengen der vier APP-Derivate – Prozentanteile
am Gesamtbahnnsignal – wurden
in jeder Plasmaprobe bestimmt und auf die hierin präsentierten Werte
gemittelt. Unabhängige
Proben-t-Tests zwischen gepoolten Kontrollen und Alzheimer-Krankheitsgruppen
wurden in den vier Bereichen mit einer Signifikanzzahl von 0,0125
durchgeführt.
Die Vergleiche waren für lediglich
zwei Bereiche, 130 und 42 kDa signifikant (zweiendig, p < 0,001). Vergleiche
zwischen sämtlichen Paaren
der Diagnosegruppen (Alzheimer-Krankheit, Kontrollpersonen mit sonstigen
neurologischen Krankheiten, normale junge erwachsene Kontrollpersonen
und nicht-demente altersmäßig entsprechende
Kontrollpersonen) wurden anschließend für die 130- und 42-kDa-Banden
(vgl. Beispiel 1) durchgeführt.
-
-
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