MX2009001591A

MX2009001591A - Metodo para seleccionar compuestos con propiedades antiamiloides.

Info

Publication number: MX2009001591A
Application number: MX2009001591A
Authority: MX
Inventors: Hoau-Yan Wang; Philippe Morain; Caryn Thibierge
Original assignee: Servier Lab
Priority date: 2006-08-18
Filing date: 2007-08-16
Publication date: 2009-02-23
Also published as: US20100197740A1; BRPI0715890A2; WO2008020131A1; JP2010505089A; MA30648B1; AU2007285666A1; NO20090769L; EA200900149A1; CA2661122A1; EP2051994A1; CN101506231A; FR2905009A1; KR20090047532A

Abstract

La invención se relaciona con un método para seleccionar o separar compuestos con propiedades antiamiloides. El método de selección o separación de compuestos que tienen capacidad de disociar o evitar complejos de alta afinidad entre péptidos ß-amiloides y receptores de acetilcolina nicotínicos de tejidos de la corteza humana hace posible identificar rápidamente compuestos para usarse en el tratamiento curativo y/o preventivo de enfermedades neurodegenerativas y en particular de la enfermedad de Alzheimer.

Description

METODO PARA SELECCIONAR COMPUESTOS CON PROPIEDADES ANTIAMILOIDES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con el campo médico y es de interés especialmente para unidades de investigación farmacológica. Esta invención se relaciona en efecto con un método para seleccionar o separar compuestos que tienen propiedades antiamiloides .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Hasta este punto, la invención emplea técnicas bioquímicas para el análisis ex vivo de muestras biológicas que permiten la rápida identificación de compuestos que se pretende sirvan para el tratamiento curativo y/o preventivo de enfermedades neurodegenerativas, especialmente enfermedad de Alzheimer. La invención en consecuencia se relaciona con un método para seleccionar o separar compuestos que son capaces de disociar complejos de alta afinidad entre el péptido ß-amiloide y el receptor de acetilcolina nicotínico de tejidos corticales humanos. La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa progresiva la cual afecta a una gran proporción de la población vieja. En términos clínicos, la enfermedad se caracteriza por una pérdida de la memoria y una declinación de las funciones cognitivas. En términos neuropatólogicos , la enfermedad de Alzheimer se manifiesta en si en la presencia de dos tipos de lesiones cerebrales histopatológicas : placas amiloides y degeneración neurofibrilar (NFD) . Una tercera característica de la enfermedad de Alzheimer es la atrofia cortical que corresponde a pérdida neuronal pronunciada. La acumulación de péptidos ß-amiloides (?ß) en forma de depósitos intraneuronales y de placas amiloides, o placas seniles, alrededor de las neuronas se considera reside en el origen de la etiología de la enfermedad de Alzheimer. En conjunto con las perturbaciones cognitivas asociadas y la degeneración neurofibrilar, la acumulación de depósitos amiloides representa la característica inicial e invariable de todas las formas de la enfermedad de Alzheimer, incluyendo las formas familiares. La degeneración neurofibrilar corresponde a una acumulación intraneuronal de fibrillas formadas de filamentos helicoidales apareados o PHF. Los PHF están compuestos de un montaje de proteínas asociadas con microtúbulos tau. La caracterización bioquímica de esas proteínas revela la presencia de un triplete mayor de proteínas tau fosforiladas y agregadas anormalmente (tau 60, 64, y 69). la proteína tau normal está fosforilada de 2 a 3 veces, en oposición de 5 a 9 veces en la enfermedad de Alzheimer, y juega una parte en la polimerización/ despolimerización de los microtúbulos del citoesqueleto neuronal y también en el transporte axonal. La atrofia cortical se manifiesta en si en pacientes con la enfermedad de Alzheimer en una pérdida del 8 al 10% del peso del cerebro cada 10 años, mientras que en sujetos sanos esa perdida es de solo el 2%. La atrofia cortical es acompañada por dilatación de los ventrículos cerebrales y de los surcos corticales, por una reducción en el volumen del hipocampo y también por pérdida neuronal la cual afecta especialmente al sistema colinérgico. Las placas amiloides resultan de depósitos globulares de sustancia amiloide. La sustancia amiloide está compuesta de filamentos de polipéptidos de 39 a 43 aminoácidos conocido como ?ß (ß-amiloides) . El péptido ß-amiloide tiene una estructura de hoja beta que le da su carácter insoluble y su toxicidad. El péptido ß-amiloide es un producto catabólico normal de una glicoproteína de la membrana de gran tamaño conocido como APP (proteína precursora amiloide) . La placas amiloides están rodeadas por procesos neuríticos y células gliales. Las placas amiloides infiltran el parénquima nervioso y se difunden hacia la materia gris cortical de todas las regiones del cerebro. La corteza occipital parece ser más frecuentemente afectada por esos depósitos amiloides. La neurotoxicidad del péptido ß-amiloide constituye un problema mayor en la enfermedad de Alzheimer. Estudios recientes muestran que las placas amiloides localizadas en el espacio extracelular son el resultado de la lisis celular de neuronas que tienen acumulación muy sustancial de depósitos amiloides en el compartimiento lisosomal. Esta acumulación intraneural produce la degeneración de la célula neuronal y entonces la célula muere y libera aquellos depósitos hacia el espacio extracelular, formando gradualmente las placas amiloides (Nagele et al. 2002). Las placas amiloides están rodeadas por procesos neuríticos y células gliales y contienen fragmentos de núcleos (evidencia de que las placas resultan de neuronas muertas). El receptor nicotínico tipo al juega un papel fundamental en la entrada del péptido ?ß en las neuronas (D'Andrea y Nagele 2006) . Wang et al. han mostrado que el péptido ?ß se une específicamente y con alta afinidad a los receptores de acetilcolina nicotínico al {al nAChR) presentes sobre la superficie extracelular de la neurona (Wang et al. 2000). La interacción del péptido ?ß, especialmente el péptido ?ß42 con el receptor al nAChR parece ser un paso esencial antes de la acumulación intraneuronal de los complejos de ?ß42-a7 nAChR, experimentando los complejos sobre la superficie de las neuronas endocitosis, lo cual da como resultado su acumulación en el compartimiento lisosomal (Nagele et al. 2002) . Además, la acumulación intraneuronal de aquellos compuestos ?ß-a7 produce la fosforilación anormal de tau (Wang et al. 2003) y disfunciones sinápticas incluyendo una falla de la neurotransmisión colinérgica (Roselli et al. 2005; Almeida et al. 2005; Shemer et al. 2006). Estos datos, tomados como un todo, tienden a mostrar que la disrupción crónica de los receptores de a7 nAChR por los péptidos ?ß, especialmente los péptidos ?ß42, en ancianos y aquéllos que padecen de enfermedad de Alzheimer es un mecanismo central por el cual los péptidos ?ß provocan disfunciones neuronales, la formación de placas amiloides y la fosforilación de proteínas tau que subyacen en el origen de la neurodegeneracion fibrilar. Como una consecuencia, los compuestos que son capaces de inhibir la interacción ?ß42-a7 nAChR podrían probar ser agentes especialmente efectivos para reducir la formación de placas amiloides y disfunciones neuronales. En consecuencia parece ser de valor, a la luz de su importancia en las patologías neurodegenerativas y relacionadas con la edad, para identificar compuestos capaces de actuar sobre el complejo ?ß42-a7 nAChR, el cual se encuentra en el origen de la formación de las placas amiloides.

La identificación de esos compuestos puede ser llevada a cabo por varios métodos los cuales, dependiendo de la situación, se encuentra son más o menos adecuados y eficientes. Ellos son algunas veces inadecuados por si mismos y entonces son útiles únicamente cuando se combinan y, en cualquier caso, tienen un cierto número de ventajas y desventajas las cuales se resumen aquí más adelante y que serán discutidas sobre la base de dos criterios de validez en modelos con animales: validez de construcción, la cual se basa en la similitud en las condiciones causales de la patología y los mecanismos neurobiológicos subyacentes; y validez descriptiva, la cual se basa en la similitud en los estados de comportamiento que son causados. Un primer método consiste de una inyección de proteínas ß-amiloides en cerebros de ratones, llevadas a cabo usando una cánula en la posición intracerebroventricular (i.c.v). Este método (Yamada et al. 2005; Mazzola et al. 2003) hace posible obtener ratones que tienen un déficit de memoria después de una introducción exógena de 7 días de péptidos ß-amiloides. Este modelo murino es obtenido rápidamente y puede ser usado para probar nuevas sustancias prospectivas para el tratamiento de patologías neurodegenerativas, especialmente la enfermedad de Alzheimer. Este método se basa en un modelo el cual no representa exactamente la patofisiología de la enfermedad de Alzheimer. En efecto, este método de identificación de compuestos que actúan sobre el complejo ?ß42-a7 nAChR no tiene validez aparente debido a que la patología tau del enve ecimiento cerebral no se desarrolla en este modelo murino. Además, el presente modelo murino no satisface la validez de construcción en vista del hecho de que, por un lado, los péptidos ß-amiloides son de origen exógenos y no son producidos de manera natural por el animal y, por otro lado, el modelo es animal y no humano. Finalmente, la inyección de péptidos ß-amiloides exógenos en el cerebro de ratones hace necesario trabajar in vivo, lo cual incluye que este método sea usado rutinariamente para seleccionar e identificar compuestos antiAlzheimer . Varios otros métodos de identificación de compuestos usan, como modelos de la enfermedad de Alzheimer, ratones transgénicos, los cuales pueden contener mutaciones que estén presentes en las formas familiares de la enfermedad de Alzheimer, en los genes APP y/o PSI (presenilina-1 ) . La validez de construcción de esos modelos es en consecuencia innegable por las formas familiares pero altamente debatible por las formas esporádicas, las cuales representan más del 97% de los casos. Un primer tipo de ratón transgénico tiene solo una mutación en APP (Hsiao et al. 1996) o una doble mutación en APP y PS1 (Holcomb et al. 1998). La validez descriptiva de los modelos transgénicos descritos anteriormente no es completa debido a que no reproduce de manera confiable las características fisiopatológicas asociadas con la enfermedad de Alzheimer, encontrándose, por un lado, una ausencia de degeneración neurofibrilar y, por otro lado, poca o ninguna pérdida neuronal y también la aparición tardía de placas seniles en la corteza de los ratones transgénicos con una sola o doble mutación. Como consecuencia, en vista de las diferencias fisiológicas visa-vis la enfermedad de Alzheimer y el tiempo que toma a las lesiones asociadas con esta patología aparecer, el uso de modelos de ratón transgénico en una sola o doble mutación no es recomendado. El uso de un modelo transgénico de ratones que tienen tres genes mutantes (APP, PS1 y tau) (LaFeria et al. 2003) también tiene desventajas. La validez de construcción de este modelo es debatible debido a que, en comparación con los modelos precedentes, se agregó una mutación adicional, no presente en los humanos que padecen enfermedad de Alzheimer, en el gen tau. Sin embargo, la validez descriptiva de este modelo es buena debido a que imita bien las lesiones fisiológicas de la enfermedad de Alzheimer, las cuales consisten de placas amiloides, degeneración neurofibrilar y pérdida neuronal. Sin embargo, este método requiere un periodo de 6 meses a 12 meses antes de que se obtengan ratones que tengan las lesiones típicas de la enfermedad de Alzheimer. Como consecuencia, este modelo de ratón transgénico puede ser usado de manera válida en un método para confirmar las propiedades antiamiloides de un compuesto probado pero, en vista del tiempo que le toma al modelo y la dificultad de llevar a cabo éste, no puede ser usado de manera razonable para seleccionar compuestos en esta primera instancia. Un tercer método (Wang et al. 2000) consiste de probar la capacidad de compuestos para prevenir la formación de complejos entre péptidos ?ß introducidos de manera exógena y OÍ7 presente en tejidos de rata ( sinaptosomas de hipocampo y corteza de rata) . Este método in vitro es más rápido de efectuar que los métodos descritos anteriormente, pero tiene las desventaja de no ser representativo de los complejos que están presentes en humanos, debido a que son usados extractos de cerebros de rata y los péptidos ?ß son introducidos de manera exógena. Como consecuencia, este modelo no satisface las condiciones de validez de construcción ni aquéllas para la validez descriptiva que se requieren para usar este modelo en un método para seleccionar compuestos capaces de actuar sobre el complejo ?ß42-a7 nAChR, el cual se encuentra en el origen de la formación de las "placas amiloides.

IA INVENCION La presente invención tiene en consecuencia el objetivo de proponer una estrategia alternativa a los métodos de identificación de compuestos capaces de actuar sobre los complejos ß-amiloide-a7 nAChR, con vista a superar, al menos en parte, las desventajas conocidas de los métodos de selección de los compuestos. Para ese efecto, la invención en consecuencia propone un método de selección o separación ex vivo el cual recrea las condiciones fisiológicas presentes en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Esas condiciones óptimas son obtenidas usando cerebros humanos, especialmente cortezas frontales obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Por definición, este modelo satisface los criterios de validez de construcción y validez descriptiva debido a que implica directamente el uso de tejido humano enfermo. Las condiciones ex vivo del método de selección de acuerdo a la invención hacen posible evitar las restricciones asociadas con la implementación y manejo de modelos animales. Además, el uso de material biológico humano hace posible evitar todos los artefactos y errores asociados con las diferencias fisiológicas que existen entre especies animales y humanas. El uso de material biológico humano en el contexto de método de selección de acuerdo a la invención es especialmente importante en vista del hecho de que la enfermedad de Alzheimer y las patologías neurodegenerativas en general no existen de manera natural en otras especies además de los humanos. La invención en consecuencia se relaciona con un método para seleccionar compuestos que son capaces de disociar o prevenir complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotínicos derivados de cerebros humanos. La invención se relaciona preferiblemente con un método para seleccionar o separar compuestos que son capaces de disociar o prevenir complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotínicos a7 derivados de cerebros humanos. El método de selección o separación de acuerdo a la invención hace posible en consecuencia identificar compuestos que tienen propiedades curativas o preventivas, dependiendo de si los compuestos son capaces de disociar o prevenir, respectivamente, los complejos ?ß42- 7 nAChR. Debe comprenderse que la propiedad "antiamiloide" o "antibetaamiloide" es la capacidad de un compuesto para disociar - u oponerse a la formación de - depósitos intracelulares o extracelulares de péptidos ß-amiloides, significa disociar - o significa inhibir la formación de -los complejos que son formados por péptidos ?ß con receptores de acetilcolina nicotinicos. En el contexto de la invención el receptor de acetilcolina nicotinico alfa-7 (a7 nAChR) denota un receptor celular que tiene una superficie pentamérica, la cual es expresada principalmente en la corteza e hipocampo y que tiene un papel importante en el aprendizaje y la memoria . En el contexto de la invención, la expresión "ß-amiloide", "?ß" y "péptido ß-amiloide" se relaciona con la totalidad de los péptidos ß-amiloides incluyendo los péptidos ?ß?-39 o ?ß39, ?ß?-40 o ?ß40, ?ß?_41 o ?ß41/ ?ß?-42 o ?ß42, ?ß?_43 o ?ß43? y fragmentos de los mismos (Glenner et al. 1984). Los fragmentos de péptido ß-amiloide anteriores tienen actividad biológica y pueden ser usados en el método de selección de acuerdo a la presente invención. Los fragmentos son, por ejemplo, los fragmentos ?ß?-28 Y ?ß28-35· Los péptidos ß-amiloides usados en el contexto de la invención son especialmente los péptidos ?ß39, ?ß40, ?ß4?, ?ß42, y/° ? 43· El péptido ?ß42 tiene la mayor afinidad por los receptores de acetilcolina nicotinicos o¡7 y el papel más importante en la etiología de la enfermedad de Alzheimer . El método de selección de la presente se lleva a cabo usando muestras de cerebro humano, preferiblemente corteza e hipocampo humano. Esas muestras son tomadas postmortem de pacientes con enfermedad de Alzheimer. La invención se relaciona preferiblemente con un método de selección caracterizado porque la disociación de complejos de péptidos ß-amiloides y receptores de acetilcolina nicotinicos OÍ7 es demostrada por inmunohistoquimica . En el contexto de la invención, el término "inmunohistoquimica" se relaciona con la totalidad de técnicas reveladoras de antígenos que usan anticuerpos para la detección o aislamiento de moléculas definidas. El método de selección preferiblemente comprende los siguientes pasos de: incubación de complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotinicos en presencia o ausencia de un compuesto bajo prueba y determinación entonces de la cantidad de complejos no disociados en presencia o ausencia de compuesto bajo prueba y evaluación de la diferencia en cantidad de complejos no disociados, que indican diferencia de que el compuesto bajo prueba media la disociación de complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotinicos . El método de selección de acuerdo a la invención preferiblemente también comprende un paso de aislamiento de los complejos no disociados de' los péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotínicos usando anticuerpos antipéptido ß-amiloide. Los anticuerpos antipéptido ß-amiloide usados en el método de selección están dirigidos preferiblemente a los péptidos ß-amiloides ?ß39 ?ß40/ ?ß4?, ?ß42 y/o ?ß 3. Esos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales de ratón o cabra. De manera aún más preferible, el método de selección de la presente se caracteriza por revelar, especialmente por un método Western blot, complejos no disociados usando anticuerpos antirreceptor de acetilcolina nicotínicos especialmente anticuerpos antirreceptor de acetilcolina nicotínico al. De manera ventajosa, el método de selección de acuerdo a la invención ha mostrado que el compuesto S 24795, es decir cloruro o yoduro de 1- (4-bromofenil) -2- (1-metil-2-piridinioil) -1-etanona, es un compuesto capaz, por un lado, de inhibir la formación de complejos ß-amiloide-oc7 nAChR y, por otro lado, de disociar los complejos de ß-amiloide-a7 nAChR que se han acumulado en las placas amiloides alrededor de la neurona y se han depositado dentro de la neurona. El compuesto S 24795 identificado por el método de selección de la presente invención es en consecuencia un compuesto capaz de disociar los complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotinicos presentes en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer y también de inhibir la formación de los complejos. La invención se relaciona con cada compuesto identificado usando el método de selección de acuerdo a la invención . La invención se relaciona también con una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, el compuesto obtenido usando el método de selección de acuerdo a la invención en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Debe comprenderse que el "ingrediente activo" es una sustancia responsable de las propiedades farmacodinámicas o terapéuticas de la composición farmacéutica. En el contexto de la invención, debe comprenderse que los "excipientes" son cualquier sustancia con la cual el ingrediente activo de un medicamento se incorpore para facilitar su preparación y administración y para modificar su consistencia, forma y volumen. Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que pueden ser mencionados, a manera de ejemplo y sin implicar ninguna limitación, están los diluentes, solventes, preservativos, agentes humectantes, emulsificantes, dispersantes, aglutinantes, agentes, laudantes, desintegrantes, retardantes, lubricantes, agentes absorbentes, agentes de suspensión, colorantes y saborizantes . Además, las composiciones farmacéuticas que se pretende sirvan para la prevención y/o tratamiento de patologías neurodegenerativas, especialmente la enfermedad de Alzheimer están en forma adecuada para administración oral, parenteral, nasal, per o transcutánea , rectal, perlingual, ocular o respiratoria, especialmente tabletas o pastillas, tabletas sublinguales, sacos, paquetes, cápsulas, grageas, trociscos, supositorios, cremas, ungüentos, geles dérmicos, y ampolletas inyectables o bebibles . La presente invención se relaciona además con el uso de compuestos identificados usando el método de selección de acuerdo a la invención para obtener composiciones farmacéuticas que se pretende sirvan para la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas . Los compuestos identificados por el método de selección de acuerdo a la invención son usados en el tratamiento de "patologías neurodegenerativas", por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, demencia corporal de Lewy, síndrome Steele-Richardson, síndrome de Down, síndrome de Shy-Drager, esclerosis lateral amiotrófica, ataxia neurodegenerativa, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, afasia progresiva primaria, enfermedad de Machado-Joseph, síndrome de Tourette, disarthria paralítica, enfermedad de Kennedy, parálisis espasmódica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, enfermedad de Kugelberg-Welander, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Wohlfart-Kugelberg-Welander , paraparesis espática, leucoencefalitis multifocal progresiva y enfermedades relacionadas con priones incluyendo enfermedad de Creut zfeldt-Jakob y Gerstmann-Stráussler-Scheinker . El término "preventivo" de acuerdo con la invención corresponde al tratamiento dirigido de manera preventiva que tiene el objetivo de reducir el riesgo de desarrollar enfermedad de Alzheimer inhibiendo la unión de péptidos ß-amiloides a receptores de acetilcolina nicotínicos al . Esta inhibición limita la formación de complejos p-amiloides-a7 nAChR, en los cuales se encuentra el origen de las placas amiloides, las cuales son lesiones presentes en la enfermedad de Alzheimer. Además, el término "preventivo" puede ser comprendido como prevención secundaria, la cual se pretende reduzca la prevalencia por reducción del progreso y duración de la enfermedad. "Tratamiento" debe comprenderse el tratamiento dirigido de manera curativa prescrito para el propósito de tratar pacientes con enfermedad ' de Alzheimer disociando los complejos de p-amiloide-a7 nAChR que están presentes en cerebros humanos y que constituyen placas seniles. El uso de los compuestos resultantes del método de selección de acuerdo a la invención para obtener composiciones farmacéuticas pretende más especialmente la prevención y/o tratamiento de pacientes con enfermedad de Alzheimer . Debe comprenderse que la "enfermedad de Alzheimer" es una enfermedad neurodegenerativa fatal que afecta la memoria y función mental con, en particular, deterioro del lenguaje, perturbación de movimientos complicados y trastornos de orientación en el tiempo y el espacio. Estos trastornos cognitivos están asociados con dos lesiones neuropatológicas características - placas seniles y degeneración neurofibrilar - las cuales permiten su diagnóstico definitivo postmortem.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente invención es ilustrada por las siguientes figuras 1 a 5, sin ser limitada por éstas: Figura 1: Western Blot que ilustra la inhibición, por S 24795, de complejos de ?ß42-a7 nAChR obtenida postmortem de los sinaptosomas de la corteza frontal de pacientes con enfermedad de Alzheimer o sujetos control. Los complejos de ?ß42~a7 nAChR son incubados en el medio (Krebs - Ringer) solos o en presencia de S 24795 (30µ?) durante 10 minutos, seguido por incubación en la presencia de péptido ?ß42 por 30 minutos. - Figura 2: Cuantificación de la inhibición de la formación de complejos de ?ß42-a7 nAChR en sinaptosomas de corteza frontal humana obtenidos postmortem de pacientes con enfermedad de Alzheimer y sujetos control e incubados con S 24795 (30µ?) - o no - y entonces con péptidos ?ß42 (?????). *:p<0.01 para controles y pacientes con enfermedad de Alzheimer, prueba de Newman - Keuls para comparaciones múltiples . Figura 3: Western Blot que ilustra la disociación, causada por S 24795, de complejos de ?ß42-a7 nAChR obtenida postmortem de los sinaptosomas de corteza frontal de pacientes con enfermedad de Alzheimer o sujetos control. Los complejos de ?ß42-a7 nAChR son incubados en el medio (Krebs - Ringer) solos o en presencia de S 24795 (1, 10, 30 o ???µ ) durante 10 minutos y entonces en presencia o ausencia de ?ß42 (???? ) . - Figura 4: Cuantificación de la disociación de la interacción de receptores al nAChR asociados con ?ß42 en sinaptosomas de corteza frontal humana obtenidos postmortem de pacientes con enfermedad de Alzheimer y sujetos control e incubados con S 24795 (de 1 a ???µp?) y entonces en presencia o ausencia de ?ß42 ( ???? ) . * :p<0.01 para controles y pacientes con enfermedad de Alzheimer, prueba de Newman -Keuls para comparaciones múltiples. - Figura 5: Cuantificación de la entrada de 5Ca2+ en sinaptosomas de corteza frontal humana obtenidos postmortem de pacientes con enfermedad de Alzheimer y sujetos control y tratados con S 24795. Las rebanadas de cerebro control son incubadas en presencia de ?ß42 (?µ?) - o no - antes del tratamiento con S 24795 (??µ?) . La entrada de calcio es causada por el agonista de a7 (PNU282987) o por NMDA agregado a glicina.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION 1. Materiales y Métodos 1.1) Pacientes Las cortezas frontales humanas postmortem obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer y sujetos control sanos se obtuvieron de bancos de cerebros (Harvard Brain Tissue Resource Center and Analytical Biological Services) . Los pacientes y controles incluidos en el estudio fueron de entre 50 y 90 años de edad. Los controles fueron personas quienes, durante su vida, no mostraron trastornos cognitivos o signos manifiestos de pérdida de memoria.

Además, los pacientes con enfermedad de Alzheimer fueron divididos en dos subgrupos que tenían, o no tenían, patologías vasculares asociadas. Unicamente los cerebros de los pacientes sin patología asociada fueron usados en el presente estudio. Debe notarse que el diagnóstico de enfermad de Alzheimer fue confirmado por el método inmunohistoquímico del Instituto Nacional sobre la Edad del Grupo de Trabajo del Instituto Reagan sobre Criterios de Diagnóstico para la Evaluación Neurológica de la enfermedad de Alzheimer en pacientes que exhibieron los síntomas clínicos. 1.2) Preparación de las cortezas Para evitar cualesquier artefactos postmortem, las cortezas removidas en el contexto del estudio provinieron de personas cuya muerte ocurrió dentro de 15 horas antes de esa remoción. Las cortezas removidas son almacenadas a -80°C hasta que son usadas en el método de selección de acuerdo a la invención. 1.3) Almacenamiento de las cortezas Después de la remoción, las cortezas son crioprotegidas durante 2 semanas en amortiguador de fosfato de sodio 0.2M (NaH2P04.2H20/NaH2P04.12H20, pH 7.4) con un contenido de 20% (p/v) de sucrosa. Entonces son congeladas durante 1 minuto en isopentano manteniendo una temperatura de -30°C en dióxido de carbono sólido. Finalmente, los cortes de 5um de espesor, producidos en un criostato controlado termostáticamente a -30°C (Super Frost Plus Fisher) , son colocados en amortiguador PBS 0.02M y entonces almacenados a 4°C. 1.4) Preparación de los sinaptosomas 100 mg de corteza frontal postmortem triturada sobre hielo son homogenizados en 10 volúmenes de HEPES lOmM pH 7.4 mantenido sobre hielo y oxigenado en presencia de sucrosa 0.32mM y EDTA 0. lmM y entonces mezclados en un triturador de tejido de Teflón/vidrio a 4°C en una solución de homogenización que contienen HEPES 25mM pH 7.5, EDTA lmM, 50 g/ml de leupeptina, 10µg/ml de aprotinina, 2µg/ml de inhibidor de tripsina de soya, PMSF 0.04mM, una mezcla de proteínas inhibidoras de fosfatasa, y 0.2% de 2-mecaptometanol . El homogeneizado es centrifugado, primero, a lOOOg y 4°C durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido en esa primera centrifugación es centrifugado durante un segundo tiempo a 15000 g durante 30 minutos para obtener un sedimento de sinaptosomas. El sedimento de sinaptosomas es lavado dos veces por suspensión en 10ml de solución de Krebs-Ringer, mantenido sobre hielo, que comprende HEPES 25mM pH 7.4, NaCl 118mM, KC1 .8mM, NaHC03 25mM, CaCl2 1.3mM, MgS04 1.2mM, KH2P04 1.2m , glucosa lOMm, ácido ascórbico ???µ?, 50µg/ml de leupeptina, 10 g/ml de aprotinina, 2µg/ml de inhibidor de tripsina de soya, PMSF 0.04mM y una mezcla de proteínas inhibidoras de fosfatasa, aireados durante 10 minutos usando 95% de 02/5% de C02 y entonces centrifugado nuevamente a 15000 g durante 10 minutos a 4°C. Los sinaptosomas lavados son entonces suspendidos en 1 mi de solución de Krebs-Ringer oxigenada y la concentración de proteína de la suspensión de sinaptosomas es determinada por el método de Bradford. 1.5) Inmunoprecipitación Los sinaptosomas de corteza humana son incubados en una solución de Krebs-Ringer oxigenada en presencia del compuesto S 24795 a 37 °C durante 30 minutos en un volumen total de incubación de 500µ1. El compuesto S 24795 está presente en la mezcla de reacción a una concentración de ?µ?, 10µ?, 30µ? o ???µ?. Dependiendo de los experimentos que se estén llevando a cabo, los sinaptosomas también son incubados en presencia de ?ß42 100nM o en presencia del vehículo. La reacción es detenida diluyendo con 1.5ml de una solución de EDTA lmM mantenida sobre hielo - ión calcio Ca2+ - sin solución de Krebs-Ringer y entonces centrifugada durante 10 minutos a 15000g y 4°C. Después de la remoción del sobrenadante, el sedimento de los sinaptosomas obtenido es retirado en 250µ1 de amortiguador de inmunoprecipitacion (HEPES 25mM pH 7.5, NaCl 200mM, EDTA lmM, 50^g/ml de leupeptina, 10^g/ml de aprotinina, 2µg/ml de inhibidor de tripsina de soya, PMSF 0.04mM y una mezcla de proteínas inhibidoras de fosfatasa) que contiene 0.5% de digitonina, 0.2% de sodio quelado y 0.5% NP-40. Después de diluir los sinaptosomas con 750µ1 de amortiguador de inmunoprecipitacion mantenido sobre hielo y centrifugar a 4°C para remover los residuos insolubles, los complejos de ?ß42-a7 nAChR son aislados por inmunoprecipitacion usando anticuerpos anti-Ap42 incubados en su presencia durante 16 horas a 4°C y concentrados por incubación durante 2 horas en presencia de 25µ1 de perlas de agarosa conjugadas con A/G (Cai et al. 1990, ang et al. 2000, , Jin et al. 2001) . 1.6) Electroforesis y Western Blot Después de tres lavados con 1 mi de solución salina amortiguada con fosfato pH 7.2 seguido por centrifugación, los complejos de ?ß42_??7 nAChR aislados son disueltos en ???µ? de amortiguador de SDS-PAGE (Tris-HCl 62.5mM pH 6.8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 5% de 2-mercapto-étanol, 0.1% de azul de bromofenol) en estado caliente durante 5 minutos. Los complejos son entonces colocados en un gel de electroforesis de poliacrilamida con 8-16% de SDS. Son usados anticuerpos monoclonales anti-a7 nAChR en el análisis Western Blot y entonces revelados por quimioluminiscenecia . La intensidad de las bandas obtenidas es analizada por densimetria para cuantificar los efectos de los compuestos, como función de su dosis, sobre la cantidad de complejos de ? 42-?? nAChR que están presentes . 1.7) Compuesto Antiamiloide . El compuesto S 24795 es usado como agente antiamiloide en el protocolo del método de selección ex vivo de acuerdo a la invención. El compuesto S 24795 es un compuesto de piridina usado como un facilitador mnemocognitivo capaz de mejorar los procesos cognitivos y/o de oponerse a los trastornos cognitivos asociados con el envejecimiento. En contraste con los facilitadores mnemocognitivos que actúan directamente sobre los sistemas colinérgicos centrales, el compuesto S 24795 carece de actividad hipotérmica, actividad la cual puede ser problemática al tratamiento de pacientes que padecen de enfermedades neurodegenerativas. 1.8) Método de recuperación funcional Los experimentos de recuperación funcional se llevaron a cabo usando cerebros de acuerdo a 1.2 obtenidos de pacientes de acuerdo a 1.1. La recuperación funcional causada por los tratamientos con S 24795 (??µ?) se evaluó con referencia al influjo de calcio via receptores de oc7 y NMDA. Esta se probó después de 1 hora de tratamiento con S 24795 sobre cerebros control expuestos a ?ß42 (30 minutos) sobre cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Los tratamientos usando ?ß42 (?µ?) y S 24795 (??µ?) son llevados a cabo sobre rebanadas de corteza obtenidas de aquellos cerebros. Los sinaptosomas son entonces preparados como se describe en 1.4. Para evaluar los influjos de Ca2+ via los receptores de al y NMDA, los sinaptosomas son incubados en presencia de 45Ca2+ (5µ?) durante 5 minutos a 37° C en medio de Krebs-Ringer . Los flujos de Ca2+ son causados por la adición de agonistas del receptor a7nAChR selectivo de al, PNU282987 (0.1, 1 y ??µ?) , y por los receptores de NMDAR por la adición de NMDA (0.1, 1 y 10 µ?) y glicina (?µ?) . La reacción es detenida por la adición de EGTA que contiene Krebs-Ringer (4°C) pero que no contiene calcio. Después de dos lavados, los sinaptosomas son Usados por sonicación en etanol (95%) y la radioactividad es contada por la espectrometría de destellos en estado liquido. La especificidad de los influjos de calcio es verificada por medio de la adición de inhibidores selectivos de receptor de al (oc-bungarotoxina) y del receptor de NMDA (AP-5) .

II. Resultados Los resultados demuestran dos tipos de efectos del compuesto S 24795. Primero, el método de selección hace posible identificar, cuando los péptidos ?ß son agregados a extractos de cerebro, una propiedad preventiva del S 24795 (agregado antes de los péptidos ?ß) con respecto a la formación de complejos de ?ß2-a7 nAChR. En realidad como puede observarse de la Figura 1, la adición de péptidos ?ß a sinaptosomas de corteza humana no enferma causa un incremento marcado en la cantidad de complejos de ?ß42- 7 nAChR. Cuando se agrega S 24795 a los sinaptosomas antes de los péptidos ?ß, la cantidad de complejos de ?ß42-a7 nAChR formados se reduce en un 92%, lo cual muestra que S 24795 (a 30 µ?) evita la formación de esos complejos causados por los péptidos ?ß. En los sinaptosomas obtenidos de las cortezas de pacientes con enfermedad de Alzheimer, la cantidad de complejos presentes es veinte veces mayor que en los controles no enfermos. La adición de péptidos ?ß no causa ningún incremento en la cantidad de complejos presentes en los tejidos enfermos, estando la totalidad de receptores nicotinicos saturada por péptidos ?ß endógenos. En este caso, el método de selección hace posible identificar una propiedad curativa del S 24795 debido a que disocia los complejos que se formaron antes de la muerte del paciente. El S 24795 produce una reducción sustancial en la cantidad de complejos de ?ß42-a7 nAChR presentes en los cerebros enfermos . Los resultados ilustrados en la Figura 3 confirman que la capacidad del método de selección para identificar un compuesto que tiene una propiedad curativa debido a que, sin que sean agregados péptidos ?ß, este compuesto puede provocar una disociación de los complejos ya presentes en los tejidos humanos enfermos. En realidad, en ausencia de péptidos ?ß exógenos el compuesto S 24795 causa, aún a una concentración de 1 µ?, una reducción de aproximadamente 22% en el complejo de ?ß42~?:7 nAChR previamente presente en los extractos de cerebro enfermos. Esta reducción se vuelve sustancial a concentraciones de 10, 30 y 100 µ? de S 24795, con los complejos no disociados siendo reducidos de manera dependiente de la dosis en el orden del 63% a la concentración más alta (p<0.01 con ANOVA factor de' 2 seguido por prueba de Newman-Keuls para comparaciones múltiples) . Este método de selección en consecuencia hace posible seleccionar, de manera especifica, compuestos que por un lado son capaces de evitar la formación de complejos, lo cual es aplicable a las etapas iniciales de la enfermedad, donde la acción de los compuestos es preventiva, y por otro lado son capaces de disociar los complejos ya presentes, lo cual es aplicable a etapas de la enfermedad avanzadas o en realidad severas, donde la acción de los compuestos es curativa. La disociación de los complejos de ?ß42-a7 nAChR evitará la acumulación intraneuronal excesiva de complejos de ?ß42-a7 nAChR y en consecuencia se opondrá a la muerte neuronal debida a aquellos depósitos. Llevar a cabo el método de selección de acuerdo a la invención usando sinaptosomas de cerebro humano evita los artefactos y falsos positivos asociados con las diferencias entre especies animales y humanas. Además, el procedimiento ex vivo de este método de selección hace posible lograr rapidez y repetibilidad en la identificación de compuestos que son capaces de disociar complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotinicos. Finalmente, puesto que este método de selección emplea material biológico que representa una etapa fija, severa de la enfermedad de Alzheimer, en consecuencia hace posible seleccionar e identificar compuestos que actuarán en una etapa final de la enfermedad. El método de selección de acuerdo a la invención hace posible identificar compuestos que puedan ser usados en el tratamiento curativo de enfermedades neurodegenerativas, especialmente la enfermedad de Alzheimer . Además, se condujo un experimento especifico para evaluar la posible recuperación funcional después de la disociación de los complejos de ?ß42-a7 nAChR. Este experimento muestra que la disociación de los complejos de ?ß42-a7 nAChR causada por S 24795 permite la recuperación de ciertas funcionalidades de los receptores a7 nAChR y receptores de glutamato del tipo NMDAR. En comparación con los sinaptosomas de los sujetos control, la entrada de calcio vía a7 nAChR y NMDAR en los sinaptosomas de pacientes con enfermedad de Alzheimer es, en efecto, reducida en gran medida (35% de los valores control) (Figura 5) . Esta reducción a la entrada de calcio se debe claramente a la formación de los complejos de ?ß42-a7 nAChR debido a que la adición de ?ß a rebanadas de cerebro de sujetos control produce una reducción en la entrada de calcio a un nivel comparable al de los pacientes. El tratamiento con S 24795 en oposición a la acción de ?ß en los cerebros control, muestra un reestablecimiento sustancial de esa entrada de Ca2+. De manera más notable, el tratamiento con S 24795 de los complejos ya formados en los pacientes con enfermedad de Alzheimer produce un incremento sustancial de la entrada de Ca2+ del orden del 75% en comparación con los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer no tratados. La Figura 5 muestra que, después del tratamiento, con S 24795, de los cerebros de los pacientes con enfermedad de Alzheimer y de los controles pretratados con ?ß, la entrada de Ca2+ alcanza niveles comparables correspondientes a aproximadamente 65% de los valores control sin ?ß . Se demostró en consecuencia por este experimento que la disociación, causada por S 24795, de complejos de ?ß42-a7 nAChR en tejido enfermo obtenida de pacientes con enfermedad de Alzheimer hace posible la restauración postmortem de ciertas funcionalidades celulares - en este caso particular entrada de calcio. Este experimento en consecuencia subraya el valor terapéutico de este método de selección.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Método para seleccionar compuestos capaces de disociar o prevenir complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotinicos derivados de cerebros humanos.
2. Método de selección según la reivindicación 1, caracterizado porque los compuestos identificados tienen propiedades curativas o preventivas.
3. Método de selección según la reivindicación 1, caracterizado porque los receptores de acetilcolina nicotinicos son del tipo al.
4. Método de selección según la reivindicación 1, caracterizado porque los péptidos ß-amiloides son ?ß39, ?ß40, ?ß4?, ?ß42 y/o ?ß43.
5. Método de selección según la reivindicación 1, caracterizado porque los complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotinicos son derivados de cortezas o hipocampos humanos.
6. Método de selección según la reivindicación 1, caracterizado porque la disociación de complejos de péptidos ß-amiloides y receptores de acetilcolina nicotinicos es demostrada por inmunohistoquimica .
7. Método de selección según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: - incubación de complejos de péptidos ß-amiloides con receptores de acetilcolina nicotínicos en presencia o ausencia de un compuesto bajo prueba; - determinación de la cantidad de complejos no disociados en presencia o ausencia del compuesto bajo prueba y evaluación de la diferencia en la cantidad de complejos no disociados.
8. Método de selección según la reivindicación 7, caracterizado porque los complejos no disociados son aislados usando anticuerpos antipéptido ß-amiloides.
9. Método de selección según la rei indicación 8, caracterizado porque los anticuerpos están dirigidos a los péptidos ß-amiloides ?ß39, ?ß40, ?ß42 y/o ?ß43.
10. Método de selección según la reivindicación 7, caracterizado porque los complejos no disociados son demostrados usando anticuerpos dirigidos a receptores de acetilcolina nicotínicos.
11. Método de selección según la reivindicación 10, caracterizado porque los complejos no disociados son demostrados usando anticuerpos antirreceptor de acetilcolina nicotínico al.
12. Compuesto identificado por el método de selección según la reivindicación 1.
13. Compuesto según la reivindicación 12, caracterizado porque este compuesto ' es 1- (4-bromofenil) -2- ( l-raetil-2-piridinioil ) -1-etanona .
14. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y uno o más compuestos según la reivindicación 12.
15. Uso del compuesto según la reivindicación 12, en la obtención de composiciones farmacéuticas que se pretende sirvan para la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
16. Uso del compuesto según la reivindicación 12, en la obtención de composiciones farmacéuticas que se pretende sirvan para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.