DE1906743A1 - Mittel fuer die Diagnose von Vitamin-B12-Mangel und gegebenenfalls Folsaeuremangel und Verfahren zu dessen Anwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahr en und Mittel sur Differential-Diagnose der eegaloblaetischen Anänie-SyndroBe. Insbesondere besieht sieh die Erfindung auf die positive Eiffcrenti al-Diagnose der auf Oobelaaln-Mangtl (VItSMn-B₁₂-Hangel) und auf folettureungel surücksufUbrendan Krankheitesyndro«e. Beide kennselohnen sioh dadurch» dass sie hlstologleeh und gowöhnlioh auoh klinisoh identische aegaloblastisohe oakrosytlsehe AnJiBiie-Syndroae rerureaohen.

In der U3A-Patentechrift 3 157 575 ist die Darreichung netabolisoher Beladungedosen der Aminosäure Histidin und die Messung der Menge der dadurch verureaohten Pormiminoglutanineäureaussoheidung la Urin beschrieben, um das Vorhandensein und die Schwere des ϊοΐβKureaangei-Syndrome genau cu identifizieren. Da über 98 ^ der aegaloblastlsohen Anämie-Syndrome beim Menschen auf TolsäureMngel, auf Oobalaninnangel oder auf eine Konbination beider Mengelerscheinungen surttokzufUhren sind, erlaubte ~

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diese Methode, indem sie spezifisch den Polsäuremangel identifizierte, eine teilweise diagnostische Unterscheidung zwischen den Syndromeri der megalohlastiechen Anämie. Sie für diese Syndrome charakteristischen Eigenschaften der roten Blutkörperchen und gewisse andere histologische Kennwerte sind unter den Mikroskop Morphologisch identisch.

Nach den in der genannten USA-Patentachrift beschriebenen Verfahren lassen sich positiv nur das Syndrom und die Anämie identifizieren, die durch Polsäurenangel verursacht werden. Zu einer Diagnose des Cobalaminnangels konnte nan nur durch Schlussfolgerung können.

Der Ausdruck "Cobalamin" umfasst hier 4ie ganze Gruppe von organischen Kobaltverbindungen nit Vitamin-B^-Aktivität, wozu die Cyano- und Hydroxycobalamine sowie andere, in der Natur vorkommende, danit verwandte Verbindungen und Komplexverbindungen derselben, gewöhnlich mit Proteinen, gehören.

Der Ausdruck "Polsäur·" bezieht'sich auf die ganze Gruppe von Polsäurederivaten oder Pteroylglutamatverbindungen einschliesslich der Mono-, Di-, Sri-., Heptapolyglutaeate und der sonstigen Polyglutanmte der PteroyIglutaaineäure, der reduzierten formen einer jeder dieser Verbindungen sowie der Derivate, wie der forsri-, Methyl-, Methylen-, Methenyl- und 7ornininod«rivate und der natürlichen Komplexverbindungen'derselben, gewöhnlich nit Proteinen.

Ss ist wichtig, dass eine positive Diagnose eines jeden Mangoltype durchgeführt werden kann, der zu dem Syndrom führt, welches sich in seiner offenen Form durch makrozytische megaloblastisohe Anämie kennzeichnet. Die Therapie für diese beiden Mangtlerecheinungen ist unterschiedlich und muss spezifisch sein. Die Darreichung des nicht mangelnden von den beiden Vitaminen an einen Pa'tienten, der an dem anderen Vitamin Mangel leidet, behebt zwar zeitweilig die Blutanomalie, kann aber andere Symptome des MangelBustandes verdecken und zu ernsten Polgen für den Patienten führen.

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Zum Beispiel wird durch die Darreichung von Folsäure die megaloblastische Anämie der auf Cobalaminmangel (Vitamin-B-jg·"¹*⁸¹¹-gel) zurückzuführenden perniziösen (Addisonschen) Anämie behoben, jedoch werden dadurch die neurologischen Komplikationen nicht beeinflusst oder beseitigt, die auf einem dem Addisonschen Anämie-Syndrom zu Grunde liegenden Vitamin—B^g-Hangel beruhen. Folsäure in ausreichenden Mengen, um bei der Addisonschon perniziösen Anämie die normalen Blutwerta wiederherzustellen, kupiert nicht das Fortschreiten von auf Vitamin-^ ₂~ Mangel zurückzuführenden neurologischen Komplikationen und verhindert nicht die Entwicklung von neurologischen Schädigungen bei Patienten, die bisher nicht daran gelitten haben. Ss ist über Fälle berichtet worden, in denen die Darreichung von Folsäure an Patienten, die mn Oobalaminmangel litten, eine plötzliche, fortschreitende und ernste Fons der neurologischen Schädigungen der Addisonsohen Anämie herbeigeführt hat, während oich aus der Zählung der Blutkörperchen und aus Knochenmarkuntersuohungen das Bild einer hämatopoetischen Besserung ergab. Da die anfänglichen neurologisohen Symptome des CobalaiBinmangels, der zur perniziösen Anämie führt, im allgemeinen diffus und unspesisch sind, kann die Besserung des hämatopoetischen Bildes in beziig auf den wahren Vitaminmangel, der der Krankheit des Patienten su Grunde liegt, irreführend sein» und dadurch kann der Beginn der richtigen spezifischen Therapie so lange \^rerzögert werden, ble der Fortschritt der neurologischen Schädigungen zu nicht mehr rückgängig zu machenden Änderungen führt. Wenn einem Patienten, dor an einer unerkannten perniziösen Anämie leidet, weiterhin Folsäure dargereicht wird, kann dies aussar sur Erscheinung und/oder zum Fortschritt der neurologi-Gchen Krankheit der Bakrosyticohen cegaloblastisohen Anämie auch siur Thrombozytopenie und der eich daraus ergebenden Blutflcckcrlii/anidieit oder Hämorrhaeic ccwio smr Houtropenie und zur Infektion führen.

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Ebenso muss sine poeitive, wahre und eindeutige Diagnose des Folsäuremangel3 durchgeführt werden, da sonst die Darreichung von therapeutischen Dosen dos unnötigen Cobalamins (Vitamins B₁₂) eine zeitweilige Besserung dar Anämie hervorrufen kann,' wenn das Vitamin B₁₂ ⁱⁿ genügend hoher Dosis dargereicht wird und der Foleäuremangel nicht nu stark ist, und der Folsäuremangel dann so woit fortschreiten kann, bis sich schwere Anämie oder sonstige Erscheinungen deo I'olsäurexnangels, wie Thromboaytopania und Blutfleckenkrankheit oder Neutropenie_s entwickeln kunnen, die für den Patienten entsprechend ernste Folgen haben. Wenn ein starker Folsäuremangel vorliegt, kann 98 vorkommen, dass die Vitamin*·^ g-Therapie selbst in hohen Dosen keine Besserung bringt und der Folsäuremangel fortschreitend ismer starker wird und sohliesslich büt Verschlimmerung der Anlaie fuhrt, so dass der Patient der Gefahr einer möglicherweise ernsten und sogar tödlichen Hiuorrhmgie infolge von Xhroaboiytopenie und pietelioher und. unheilbarer Infektion auegeeetBt let, die bus Teil duroh die auf den etarken Poleäureaangel beruhende leutropenie hervorgerufen werden.

Sa ee bisher keine klinieoh einfaoho und bequeme Hethode but yoeitiren Differentiel-Diagnoet de· besonderen MangelBuetandee gab, der das aakrosytleohe aegaloblaetisohe Anäale-8yndroa verursacht, haben einige Xrzte oral darsureichende Hänatinpräparate verordnet, die diese beiden Mittel enthalten. Diese Praxis ist aber nioht nur kostspielig, sondern kann bei Patienten mit einer unerkannten perniziösen Anämie eu den gleichen ernsten folgen führen oder das Vorhandensein einer anderen, den Sympto» nen eu Grunde liegenden Krankheit verdecken.

Infolgedessen hat die Nahrungs- und Araneimittelverwaltung d@s? Vereinigten Staaten von Amerika den Verkauf von rezeptfreien Vitaminpräparaten mit einem Gehalt an Folsäure untereagt und stark beschränkt.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine differentialdiagnostische Methode zur Identifizierung des Vorhandenseins und der Schwere des spezifischen Folsäuremangels und/oder Vitamin B₁«-Mangele zur Verfügung zu steilen_v der den megaloblastischen Anäiaie-Syndromen im anfänglichen oder voll entwickelten Zustand zu Grunde liegt.

Bine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Kombination von Mitteln für diese differenti al-d iagnostisehe Methode zur Verfügung zu stellen, die imstande ist, einfach, schnell und positiv zwischen den Folsäuremangel-Syndromen und den Cobalaminmangel- (Vitamin-B.,g-Hangel") Syndromen der negaloblastischen Anämie beim Menschen zu unterscheiden und einen bestehenden Folsäuremangel, einen bestehenden Vitamin-B-j ₂· Mangel oder beide Mangelersoheinungen zu identifizieren.

Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zu Grunde, eine Methode zur Diagnose von Störungen der Aminosäure- und/oder Fettsäureausnutzung und des Aminosäure- und/oder Fettsäurestoffwechsels zur Verfügung zu stellen, die die richtige Ausnutzung bestimmter spezifischer Aminosäuren und/oder Fettsäuren durch den Körper verhindern und Anomalien in der Ausscheidung besonderer, nur Identifizierung dienender Chemikalien verursachen und ihrerseits durch Folsäuremangel und/oder Oobalaminnangel (Vitarain—B-, ₂-Mangel) verursaoht werden.

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Differntial- Diagnose des Folsäurettangels und des Vitaoin-B^"Mongole bein Menschen, die darin besteht, dass man Beladungedosen an Histidin oder seinen nioht-toziechen Salzen in Kombination mit einem Methylmalonatbildner darreicht. Die Beladungedosen sind diejenigen Mengen eines jeden dies?r Stoffe, die bedeutungsvolle Steigerungen der von dem Gewebe ausgeschiedenen Mengen an Formiminoglutaminsäure und Methyliaalonat zur Folge haben. Venn Beladunfsdos&n von Histidin und dem Methylmalcmatbildner an Patienten verabfolgt werden, die an Foleäuremangel und/oder Vita-

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3₁₂-*Mangel leiden, wird im IPalle von Folsäureraangel 3?orn-^% iminoglut&minsäure in diagnostisch nachweisbaren orhöhten Msngen im Urin ausgeschieden, während im Falle von Vitamin-B^ ₂-Mangel Methylmalonat in diagnostisch nachweisbaren, erhöhten Mengen im Urin ausgeschieden wird» Normale Personen sowie solche, die an anderen Arten von Anämie leiden, scheiden keine erhöhten Mengen an diesen Stoffen aus, wenn ihnen im Sinne der Erfindung Beladungedosen der beiden Substanzen dargereicht werden. Die Bestimmung der ausgeschiedenen Mengen an dieses Substanzen wird vorzugsweise an dem im Verlaufe von 24 Stunden naoh Beginn der Darreichung der Beladungedosen geoaimsalten Urin durchgeführt.

Ss wurde ferner gefunden, dass als Methylraalonatbildner, die bei der Darreichung in Beladungsdosen in Koabination Bit Histidin diagnostisch wirksam sind, 1-Valin, DL-Valin, L-Isoleucin, DL-Isoleuoin, L-Threonin, DL-Threoniii, Shymin, £, -Homoserin, ÜL·-Homoserin sowie die nicht-toxischen Komplexverbindungen und Salee derselben verwendet werden können. Von diesen ▼erbindungen Bind dl· Darreiohungefonaen als Threonin, Xhyaln und Homoserin neu, da bisher nooh nicht bekannt war, dass sie für sich allein odor la Kombination als Kethylealcnatbildner für die Diagnose des TItSJdJL-B₁₂-MoAeOlS bei* Manschen geeignet sind.

ferner wurde überraschenderweise gefunden, dass man dl· besten AuBicheidungsausbeuten bedeutungsvoller Mengen an f oraimisoflutanineäure und Methylealonat erhält, wenn dl« Beladungedosen auf «Inen BeladungsBeitraum von etwa 12 Stunden verteilt werden. Vorzugsweise sollen die Beladungsdosen in drei Portionen in ZeItabstfinden von 4· Stunden dargereicht werden.

für Srwaehstne aoll a.B. die Geaaatdosis an UHiatidin-HCl*B_o0 je nach der Grosse und des Gewicht des Patienten etwa 5 bis 20 g botragen. Die Boladungadoals an DL-Valin soll z.B. etwa 15 bis 60 g betragen. Ua die stärkste Aueschtidung von formlminoglu-

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taminsäurei und Methylmalonat bei einer bestimmten Beladungsdosie zu erreichen, sollen diese kombinierten Gesamtmengen vorzugsweise in drei Portionen geteilt und allo vier Stunden verabfolgt werden. Die einzelnen Portionen liegon bei dieser Art der Darreichung im Bereich von 1,7 bis 6,6 g L-Histidin-HCl°H₂0 und von 5 bis 20 g t>L~Valin.

Ausser dieser neuen Methode, die die gemeinsame, aber nicht gleichseitige Darreichung dee Histidine und des Methylmalonatbildners vorsieht, umfasst die Erfindung auch Mittel zur gleichseitigen Darreichung dieser Stoffe in bestimmten Dosen und Mengenverhältnissen.

Was die Zusammensetaung der Mittel betrifft, wurde gefunden, das« die L-Iora der Methjlmalonatbildner aktiv, die L-Fora dagegen nicht aktiv ist. Wenn aber die Racexate der Aminosäuren dargereicht werden, so hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass die Ausscheidung an Methylmalonat um 30 bis 80 £ höher ist als oe nach dem Gehalt der dargereichten Beladungsdosis an der L-Porm sm erwarten gewesen wäre ο

wurde ferner gefunden, dass die Menge der meisten Methylmalonatbildner, wenn sie mit Histidin dargereicht werden, aus noch unbekannter Ursache verschieden von der Menge ist, die erforderlich ist, um die Methylmolonataussoheldung zu erhöhen, wenn der Methylmalonatbildner für eich allein dargereicht wird. Daher wurde die Menge des Methylealonatbildnere in der erfindungsgemäeeen Kombination über diejenige Menge hinaus erhöht, die man auf Grund der Methylmalonatausscheidung bei Yerabfolgung nur eines Mittels für eine ausreichende Beladung wählen würde, um eine positive Diagnose zu gewährleisten.

Die Beladungsdosis besteht in Sinne der Erfindung aus den Gesamtmengen an Histidin und Methylmalonatbildnern, die nicht gleichzeitig oder gleichzeitig dargereicht werden, m bei Patienten, die an Poleäuremangel oder Vltaain-^ g-Häagel leiden,

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die charakteristische Erhöhung der Ausscheidung von Formiminoglutaiainsäure oder Methylmalonat au bewirken. Die Gesamtbeladungedosis an Histidin in dem erfindungsgemäasen Mittel beträgt fttr Erwachsene etwa 5 bis 20 g, diejenige an Methylmalonatbildner etwa 10 bis iOO g. Der Bereich der Gesamtdosismongen für besonder® Kethylraalonatbildnor in dem erfindungsge-DJässen Mittel bei Darreichung an Erwachsene ergibt sich aus der nachfolgenden Zusammenstellung:

Bereich der ßesamtbeladungsdoais an Methylmalonatbildnero, die gusaaaen mit Histidin Erwachsenen dargereicht werden

Me thylmalonatbildner Gramm DL-Valin 15 bis 60 DT-Threonin 30 bis 80

L-Yalin 10 bis 40

!-Threonin 20 biß 60

DL-Isolouein 15 bis 60 L-Isoleucin 10 bis 30

ThyBin 10 bis 50

ÜL-Homoeerin 40 bis

Alle oben angegebenen Dosisbereiche verursachen diagnostisch bedeutungsvolle Anstiege der Methylmalonatauseoheidung im Urin bei an Yitaain-^ g-Mangel leidenden Patienten, dagegen nicht bei normalen Kontrollporeonen, bei an ?olsäuremangel leidenden Patienten oder bei sonstigen Patienten mit verschiedenen Arten von Anämie, die an Kangelerechelnungen, aber nicht an VitAain-B₁₂-Mangel, leiden.

/on grosser Bedeutung in bezug auf den intermediären Stoffweoheel, der beim Menschen but Bildung von Methylmalonat führt, ist die durch Threonin, Thymin und Hpmoserin verursachte Erhöhung in der Ausscheidung. Die die Methylmalonatausscheidung im Urin erhöhende Virkung der lotistgenannten Verbindungen bei an Vitamin B₁₂-Mangel leidenden Personen war lieber noch aicht bekannt. Auf Äquimolekularer Bau ie verureseht thyrnte »twa di·

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Hälfte, !-Threonin etwa 1/4 bis 2/5 und Bl-Honoserin etwa 1/6 bie 1/8 der Zunahme der ftethylnalonatausscheidung is Urin, die von L-Valin hervorgerufen wird!

Versuche, den die Me thy lmalonat aus scheidung in Urin bei Vi taming ₂-Mangel erhöhenden Effekt von Propionat und Bomocyetein, die als aktive Kethylnalonatbildner bekannt sind, bein Nensohen su untersuchen» sind bisher immer durch das Auftreten von Brechreiz, häufig α it nachfolgenden Erbrechen, gescheitert, obwohl diese Substanzen in verschiedenen Lösungsmitteln, naoh verschiedenen Dosierungsplänen und bei verschiedenen pH-Werten dargereicht wurden. .

Zufolge weiteren Versuchen erzeugen äquimolekulare Genisohe aus !-Valin und !.-Isoleucin, aus !«-Valin und !-Threonin sowie aus L-Valin, DL-Isoleuoin und D!.~Threonin keinen bedeutungsvollen Unterschied in der Hethylnalonatausschaidung in Urin in Vergleich eu den Werten, die nan nit äquinolekularen Mengen der einzelnen Aminosäuren erhält.

Die relative Reihenfolge der Aktivität der verschiedenen Verbindungen fur dl· Ausscheidung von Metbylaalonat ±m Urin von Patienten, die an Vitanin-ä₁₂-Kang·! leiden, aber nicht von Personen, dit an folsäuresangel leiden, oder von Kontrollptr- sontn, ist für dl· L-Fon der Verbindungen auf äquinoltkularer BmIs folgende ι (V) I-Valin, (2) l-Iaoleuoin, (3) OL-Valin, (4) OL-Isoltucin, (5) fhyadn, (6) V-fhreonin, (7) DH-Threonin, (8) I-Ionoserin und (9) DU-Honoserin. Kein· nennenswerte Aus- soheidUÄf von Metnylnalonat ie Urin von an VItSaJLn-B₁₂~Mangel leidenden Patienten erfolgt nach Darreichung von D-Talin, I-Methionin, Dl·-Serin, L-Asparagin, !.-Asparaginsäure, β-Alanin oder l-Iistidin, wean dl··· etwa in den gleichen »olaren Mengen verabfolgt werden wie dl· oben genannten Verbindungen.

»si Darreiohunf in äguinolekularen Mengen bewirken L-Valin und XmUolMUoiA ·ϋι·& Anstieg der Methylaalonataussoheidunf la Urin *fft «to» A^ fleiohsa erOssmordmmfi allerdlag· fibt I-Valln

gewöhnlich etwas höhere Werto ο Die racemische Form dieser Aminosäuren bewirkt, wenn sie in der gleichen molaren Menge dargereicht wird wie die L-Form der betreffenden Aminosäure, eine He thylraalonataus scheidung im Urin in der Grüssenordnung von etwa 30 bis 80 j£ derjenigen, die durch die I-Form erzielt wird.

Ss wurde ferner gefunden, dass» wenn bei dem hler beschriebenen Verfahren und bei der hier beschriebenen Beladungsdoei@ die Konzentration der Formiminoglutaminsäure, die in dem ia» nerhalb 24 Stunden nach der Darreichung eines Formimisoglutaminsäurebildnere gesammelten Urin ausgeschieden wird, mehr als 30 bis 35 pg/l boträgt und die Säure innerhalb dieser 24 Stunden seit Beginn der Darreichung in Mengen Von mehr als etwa 35 mg ausgeschieden wird, diese Werte eine diagnostische Bedeutung für das Vorhandensein eines Folsäureraangela haben. Venn die Werte niedriger liegen als die oben angegebenen Mengen, zeigen sie an, dass kein Poloäuresangel besteht. Im allgemeinen geht der Grad der erhöhten Ausscheidung mit dem Grad des Folsäuremangels Hand in Hand.

Wenn der innerhalb 24 Stunden nach Beginn der Beladungedarreichung gesammelte Urin zeigt, dass Methylmalonat in Kengen von mehr als etwa 30 mg/24 Std. ausgeschieden wird, so bedeutet dies einen Vitamin-B^-Mangel. Ein· Aueeoheidung la Urin von weniger al· 30 ag innerhalb 24 Stunden naob Beginn der Darreiohung der B«ladungedoaie bedeutet, dass dar Patient nicht an VItEBIn-B₁₂-MaOgOl leidet. Im allgemeinen geht der Grad der Erhöhung der Hethylmalonatausscheidung Hand in Hand mit dem Grad de· VItRnIn-B₁₂-Mangels.

Die für die Darreichung nach dem erfindungsgemfissen Verfahren erforderlichen Verbindungen sind in den Formen, in denen sie üblicherweise erhältlich sind, im allgemeinen nicht besonders schmackhaft. Einige von ihnen, wie Histidin, das manchen Personen sauer und manchen Personen salzig zu schneoken sobeint, Valin, das nicht besonder· löelioh let und einen etwas "fetti-

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gen" Geschmack hat, und Isoleucin, das ein klumpiges Gefühl im Magen erzeugt, lassen sich nicht in Su3ponsion oder in Lösung in Wasser darreichen, ohne dass die Patienten sich beschweren. Man hat bereits viele Träger für die Darreichung dieser Verbindungen in Beladungsdosen ausprobiert. Ss wurde nun ein preiswerter Träger, nämlich Apfelsaft', gefunden, der Histidin und die meisten Methylmalonatbildner am besten in Lösung bringt und die Schwierigkeiten hinsichtlich des Geschmacks und der Verabfolgung von Forndminoglutainineäure und Methylmalonatbildnern in überraschender Weise beseitigt.

In geteilten Fortionen lassen sich die Beladungedosen leioht in Lösung oder Suspension in 60 bis 225 cm⁵ Apfelsaft darreichen. Die Gesamtbeladungsdosis gemäss. der Erfindung kann in Mischung mit Mengen bis zu 1 1 dieses Trägers dargereicht werden. Die Sohmackhaftigkeit des Apfelsafte gestattet die Darreichung von Beladungsdosen sogar an Kinder.

In bezug auf die Beladungsdosen für Kinder, bei denen in Anbetracht der geringen ensymatisohen Seeerven eine schnelle Diagnose erforderlich ist, wurde gefunden, dasa die Beladungedoaen etwas höher sind als für. Erwachsene, wenn eie auf Basis des Körpergewichte, berechnet werden. Die Beladungadoeis für Kinder betragt insgesamt etwa 0,185 bis 0,32 g an Histidin oder din davit verwandten Pörttininoglutaminsäurebildnern je kg KSrpergewioht und etwa 0,165 bie 3,2 g an Methylmalonatbildnera je kg Körpergewicht. Die jeweilige besondere Dosis der letzteren Verbindung richtet sich nach der relatives Aktivität des Materials, wie eich aus dem nachstehenden Beiepiel 2 ergibt.

Von den Histidlarerbindungen wird im Rahmen der Erfindung L-HiBtiöin-HCl.HgO bevorzugt. Diese Verbindung ist in Apfelsaft sehr echaackhmft, und die Beladungeäosen lösen «ich leicht in den oben angegebenen Mengen Apfelsaft. Di« freie Bae· des Histidine* ist oehr schwer löslich.

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Zu den bei den erfindungsgemässen Verfahren verwendbaren Methylnalonatbildnern gehören (in der Reihenfolge der Bevorzugung) DL-Valin, Κ,-Valin, QIl-Threonin, Ihymin und DI.-Isoleucin. In bessug auf Kosten und Aktivität wird Dl.-Valin bevorzugt. In bezug auf die Aktivität allein ist v.-Valin der Vorteil zuzusprechen« DX,-Threonin iot trotz seiner niedrigeren Aktivität eine bevorzugte Verbindung, v/eil es sahr löslich und vorhältnismässig geschmacklos ist und nur einen ochv/ach süssen Efachgeschmaok hat. Ihymin ist verhältnismässig preiswert und kann unter Umständen Vorteile bieten, weil ea keine Aminosäure ist= Dk-Isoleucin gehört trotz seiner geringeren Verträglichkeit für Patienten zu den verwendbaren Verbindungen, da es eine hohe Aktivität aufweist. Da die racemischen Aminosäuren unerklärlicher- und unerwarteterweiße auf äquimolekularer Basis als Hethylnalonatbildner eine höhere Aktivität aufweisen als die L-Form, und da die Racemate bedeutend preiswerter sind ale die JU-Form, die die einzige bisher bekannte aktive Form dieser Malonatbildner war, eignen sich die Racemate sehr gut für die diagnostische Verwendung in der allgemeinen klinisohen Praxis.

In dem nachstehenden Verfahrensabsciraitt und den Beispielen wird die Erfindung in ihren Einzelheiten erläutert. Die darin beschriebenen Verfahren sind wertvoll, und ee eind auch Einzelheiten für neue Abänderungen bei der Bestimmung von Me thy 1-nalonat angegeben. Die Bestimnmngsmethode für foroiminoglutami&säure ist nicht im einzelnen beschrieben, weil sie aus den angegebenen literaturstellen entnöamen werden kann. Auch die Verwendung der Methylmalonatbildner allein in Beladun£edosen, die beschriebene Art der Darreichung, die Samralung des Urine im Verlaufe von 24 Stunden nach Beginn dee Beladungeverfahrens und die nachfolgende Analyse einer Urinprobe auf ihren Methylmalonatßehalt stellen einen spezifischen Test mir Jdentifisi©- rung und Beetiicmung der Schwere des Yitaming., g-Mangele i@sää®e den hier beschriebenen und in den nachstehenden Beispielen er-läuterten Kriterien dar„

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Die Beispiele erläutern Fälle, in denen an megaloblastischer Anämie leidende Personen, nachdem sie ihr Einverständnis gegeben haben, mit Beladungsdosen der Bestandteile und der Koabination gemäss der Erfindung behandelt werden, um den Parameter und die Gefahrlosigkeit dee Verfahrens zu untersuchen. Einzelheiten der laboratoriumsbefundo, die die Grundlage für die Diagnose und für die Empfehlung bestimmter Zusammensetzungen und Mengenverhältnisse bilden, sind aus den angegebenen Ergebnissen ersichtlich. Ferner hat die Erfahrung mit Versuchspersonen aus einem allgemeinen Krankenhaus und mit ambulanten Patienten, die unter dem Verdacht standen, an diesen Stoffwechsel-Hangelerscheinungen zu leiden, die allgemeine Zuverlässigkeit und die spezifische Anwendbarkeit des orflndungsgemässen Verfahrene bewiesen.

Sie Erfahrung mit der erfindungegemässen Kombination, die in vielen Hunderten von Seladungsdosistesten dargereicht und durch Analysen kontrolliert worden ist, beweist die Gültigkeit dieses differentiellen Siagnoseverfahrens und den Wert der für die BeladungsdosiB zu verwendenden Mittel. In keinen Falle wurden nach Verabfolgung der empfohlenen Beladungsdoeen der verschiedenen, als wirksam beschriebenen Kombinationen "falsche positive¹¹ oder "falsche negative" Resultate erhalten.

Obwohl alle Analysen naoh dem bevorzugten Verfahren durchgeführt wurden, ist die Erfindung nicht auf diese Verfahren beschränkt, da jede hinreichend genaue Methode sua Analysieren von ForxDiminoglutamineäure und Methylaalonat su vergleichbaren diagnoetleohen Ergebnissen.führen sollte.

Sa sämtliche Verbindungen normale lahrungemittslbestandteile sind, können sie ohne Gefahr oral dargereicht werden. Si« Erfahrung ait den Verbindungen für eich allein und ait Kombinationen derselben hat keinen Fall ergeben, in dea von der Verabfolgung abgeraten werden attest·. Diene Erfahrung wurde an Kindern, eohwangeren Frauen und sonstigen Personen mit Folsäure-.

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und Vitamin-JB- «-Mangel in verschiedenen Stadien gesammelt.

Probenahme

Urin von Testpersonen wird in reinen Behältern gesammelt, zu denen so viel Säure (gewöhnlich Salzsäure} zugesetzt wird, dass der pH-Wert des endgültigen Volumens unter 2,0 liegt. Unter diesen Umständen sind Methylmalonat und Pormiminoglutamineäure im Urin mehrere Wochen bei Raumtemperatur haltbar. Unmittelbar vor der Analyse wird eine Urinprobe filtriert oder zentrifugiert, um den Bodensatz zu entfernen, und der pH-Wert für die Formiminoglutaminsäure- oder Kethylroalonatanalyse eingestellt. Das Volumen des gesammelten Urins wird bestimmt und verzeichnet. Konservierungsmittel können zugesetzt werden, wenn sie die jeweils anzuwendenden Analysenmethodon nicht stören.

Analyatnaathoden

Obwohl die gegenwärtig bevorzugten Bestimmungen der ?onniainoglutamineäur* und des Msthylaalonats an Urinproben durchgeführt werden, lassen sich diese Bsstimaungen bei entsprechender Abändtrung dtr nachstehend beschriebenen Methoden auoh an Blutplasa* odsr anderen Körperflüssigkeit en durchführen, in denen dies·, die Mangtlerscheinung anssigsndsn Substanzen nach Verabfolgung dsr Beladungsdossn der oben beschriebenen Vorlauf ervtrbindungtn in höheren als normalen Konzentrationen erscheinen.

Ss sind verschiedene Nethoden zu» nachweis und zur Bestimmung dsr Konzentration dsr formiainoglutaminsäurs entwickelt worden. Diese Methoden fallen in die folgenden Kategorien ι

1. Bnzyaatische Analysen,

2. mikrobiologische Analysen, 3· ohroeatographiacbt Analysen, 4· ohsaisohs Analysen.

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4S

Diese Analysenmethcden sind in der folgenden literaturstelle beschrieben: Luhby und Cooperman, "Advances in Metabolie Disorders", Band 1, Seite 263-334 (Verlag Academic Press, New York, 1964)ο

Mit geeigneten Abänderungen kann jede dieser Methoden zum Nachweis und zur Bestimmung der Konzentration von Formiminoglutaminsäure im Urin und anderen Körperflttssigkeiten engewandt werdenο

Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden enzymatischen Methoden werden für die Bestimmung der Pormiminoglutaminsäure im Urin bevorzugt. Eine solche Methode ist die Schweineleber-Ponn- { im J.noglutaminsäure-Transf eraee-Cyclodeaminase-Eneyn- (T-O) -methode, die in der USA-Patentschrift 3 157 575 und bei Luhby und Cooperman, "Advances in Metabolie Disorders", Band 1, Seite 263-334 (Verlag Academic Press, Hew York, 1964) beschrieben ist. Die oben genannten Literaturstellen enthalten die Einzelheiten über die Herstellung der Reagenaien, die Behandlung der unbekannten Probe und die Methoden für die Durchführung der Analyse und die Berechnung der Ergebnisse. Dieses ist die bevorzugte Methode, veil sie unter den but Verfügung stehenden Analyaenmethoden die höchste Empfindlichkeit aufweist und lan stände ist, Formiminoglutaminsäure nit einer Sicherheit von nur 1 bis 3 ng je al Urin nachzuweisen. Ferner ist diese Metho- i de die spezifischste Methode für Formirainoglutaudneäure, und sie wird durch andere, in Urin, besonders ia Urin der hier in Betracht kommenden Patienten, vorkommende Verbindungen nicht beeinflusst. Diese Analysenmethode bietet den weiteren Vorteil der Einfachheit der Durchfuhrung, der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, und sie eignet sieh zur Bestimmung von Foraiminoglutaaineäure in vielen Proben in dem durchschnittlichen klinischen Laboratorium.

Von den beiden anderen Enzyramatho&en iat di© om® von Silverman und Kitarbeitern ("J₀ National Cancer Inste, Band 20, 1958,

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Seite 71), wonach eine mikrobiologisch© Malyeamsethode ms? Bestimmung άββ Endpunktee angewandt wisd, und ©in® Ä"bäad@rumg derselben von Qhanarin-Bennet ("Brit, Med. J.ⁿ _T Band 1₅ 1962_S Seite 27 und 985) beschrieben WOrASn₁, wonach das Bndprodiikt in eine spektrophotometriscli bestimmbar© Smbstsns umgewandelt wird.

Alle drei Analysenmethoden sind so empfindlich, dasn sie Nachweis der diagnostisch wesentliches Bereich© dar Έο-miminoglutaminsäurekonzentrationen lsi urin verwendet werden können. Bio T-C-lnzyffl-Analysenmethode wird jedoch bevorzugt« Biese Enzymmethode, die im einzelnen in der genannten Patentschrift beschrieben ist, wurde in den nachgehenden kliniechen Baispielen sur Bestimmung der Fonsiiuinoglmtaminsäure angewandt»

Die mikrobiologischen Analysenmethoden» bei denen Lactobacillus arablnosus als 'Uestorganisiaue verwendet wird, haben eine gute SpezifiEität, sind aber iia allge&ainen su umst&idlioh für die Routineanalyse im klinischen Laboratorium.

Se haben sich auch Terschiedene chroaRtographisch© eingebürgert, die aloh leicht mit der in eines Surcheohnittlichen klinieohen Laboratoriua war Verfügung stehenden Au&rfletung durchführen laeeen Dies« Methoden sind aber nur qualitativ und eignen sich nicht ohne weiteres sum lachweie τοη JormiBinoglutaBinsäurekonzentrationen uat®r 100 bis 150 μβ/ηΐ Frin. AusserdeB können die Ergebnisse durch störende Stoffe beeinträchtigt werden.

Ee .gibt auch chemische Analysennethoden für Ionaiainoglutaisin» säure. Zwei solche Methoden sind ±n der oben angegebenen S±t®~ ratur beschrieben* Diese Analysensethoden lassen eieh einfaoh durohfüTaren, sind aber nicht spezifisch wx& lieh genug für die Bestimmung der yorasifflinoglutaaimsaur Urin der Patienten, auf die sieb die Erfindung besieht.

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Analvsenverfahren für Methylmalonat

Die Konzentration an Methylmalonsäure (Methylmalonat) lässt eich nach verschiedenen Methoden bestimmen, die in drei Gruppen eingeteilt werden, näinlicn die Dampfphasenohroraatographie, die Dünnschichtchromatografie und die FlüssigkeitBcolorimetrie.

Die Daapfphasenchromatographiemethoden sind die empfindlichsten. Bei den hier in Betracht kommenden Methoden wird das Methylmalonat aus dem Urin mit einem Lösungsmittel extrahiert und unmittelbar nach dem Verfahren von Hoffman und Barboriak ("Anal. Biochem.", Band 18, i967, Seite 10) oder durch Bestimmung an flüchtigen Derivaten des Ms thy Im al ona to (nach Coz und White, "lancet", Band 2, 1962, Seite 853-856) bestimmt. Die Erfahrung mit diesen Verfahren ergibt, dass es zweckmäseig ist, vor der Dampf phasenchromatographie flüchtige Derivate des Methylmalonats herzustellen, da die Ausgangssäure sich bei dem Verfahren in und an der Säule zersetzt. Die auf lösungsmittelextraktion des Methylmalonats aus dem Urin und Konzentrationebestimmung durch Dampfphaoenchromatographie beruhenden Analysenmethoden sind zwar die empfindlichsten und spezifischsten Analysenaethoden, die gegenwärtig sur Verfügung stehen; sie sind aber umständlich und langwierig und erfordern eine Spezialapparatur und besonders ausgebildetes Personal zur Bedienung der Apparatur und zur Auswertung der Ergebnisse.

Eine Methode, die die Lösungsmittelextraktion des Methylmalonats aus den Urin mit der Ditanschichtohromatographie des Rückstandes kombiniert, iet von Hinterberger, Bashir und Jones in "Proco Australian Aesoc. of Clin. Biochem.", Band 1, 1965, Seite H3, beschrieben. Dieses Verfahren ist im Gründe qualitativ, und zufriedenstellend© Abänderungen für die im Rahmen der Erfindung erforderliche quantitative Bestimmung sind bisher nooh nicht entwickelt worden. Andere Methoden, die zur Zeit erforscht werden» machen von Molekularsieben, chemischen Ladungen, Enssym-

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und mikrobiologischen Umwandlungen, Elektroneneinfangmethoden und Chromatographie in flussigsr Phase Gebrauch.

Die andere Hauptgruppe von Analyoenmothaden, die für dae durchschnittliche klinische Laboratorium geeigneter ist, "basiert auf der coloriiaetri3clioB Analyse. Ein© ausgeseichnete Methode zur Bestimmung von Hethylsnalonat im Urin ist von Giorgio und Plaut ("J, Lab. & Olin. Medc", Band 66, 1965, Seite 667-676) vorgeschlagen worden. Nach dieser Methode wird dae Methylmalonat an einem schwach basischen Anionenaustauschharz konzentriert, dann aus dem Harz eluiert und mit diazotierten p-Nitroanilin gekuppelt. Bei hohem pH-Wert entwickelt eich eine smaragdgrüne farbe mit einem iaolaren· Absorptionsmaximum von etwa 10 000 bei einer Wellenlänge von 620 πψ.* Sie Erfahrung hat gezeigt, dass diese Absorption über einen Konzentrationsbereich von 0,6 bis 12 μβ/πΐ linear ist, was unter den von den Verfassern angegebenen Bedingungen einen Bestiiamungebereich für Methylmalonatkonzentrationen von 12 bis 240 mg/1 Urin liefert.

Obwohl das oben beschriebene, schwach basische Anionenaue» taueohharz dae Methylaalonat aus dem Urin adsorbiert, entfernt •8 gleichzeitig aenrere andere, ait Diazoverbindungen reaktionsfähige Stoffe, die dann bei der Bestimmung bei der für Methylmalonat kritischen Wellenlänge in Konzentrationen von ' 25 bis 70 mg/1 erscheinen. Diese Verbindungen machen die Bestimmung des Methylmalonatβ im Urin nach dieser Method® ungenauer, besondere wenn das Methylmalonat in niedrigeren Konsentrationen vorliegt.

Um dieser Schwierigkeit zu begegnen, bedient man eich vorzugsweise einer Abänderung des Verfahrens von Giorgio und Plaut, wobei Bau ein zweites Ionenaustauschharz, und zwar ein stark saures Kationenauetausehharζ in der Waeserstoffionenform. ver-

Λ ^W

wendet, um das aus dem eohwach basischen Anioneztaustauachhars gewonnene Eluat su behandeln. D>.esea stark saure Katloneziäue-

- 18 -009820/1753

tauschharz entfernt die meisten störenden Stoffe und lässt dabei das Methylraalonat hindurchtreten, so dass man zu einer genaueren und sichereren Bestimmung des Methylraalonats im Urin Ms hinab zu 20 rag/l Urin kommt.

Nachstehend wird eine genaue Beschreibung dee bevorzugten klinischen Analyseverfahrens für KethylEalonat gegeben.

Stoffe und Reagenzient

1) Harzsäule:

Harz χ»- ^EiÄ schwach basisches Anionenaustauschharz, wie "Dowex AG 3 χ 4", bei des funktioneile Polyalkylamingruppen an ein StjTol-(4 ^-Mvinjlbensol-MischpolymerisatgerUat gebunden sind, wird in einer Teilchengrösse von 37 bis 74 μ in der Chloridforza verwendet. Das Hars wird iait IO Raumteilen dreifach destillierten Wasaers gewaschon und bis zum Gebrauch in 1 bis 2 Raumteilen destillierten Wassers suspendiert., Bs kann in einer dunklen Glasflasche bei 4° C mehrere Monate aufbewahrt werden.

Harz II: Bin stark saures Kationenaustauschharz, wie "Dowex 50 W χ 8", daa aus kernständigsa, an ein Styrol-(8 5^)-Divinylbenzol-Misehpolya3erisatg@rüst gebundenen SuI-fonsäuregruppen besteht, wird in Teilchengrössen von 37 bis 74 μ in der Wasserstoff!onenform verwendet. Das Harz wird, v/ie oben beschrieben, gewaschen und aufbewahrt.

P-Hitroanilins Sine 0,0?5prozentige Ib'eung wird herge-StOlIt₅ indem man 375 mg urakristallisiertas p-lJitroanilin (vom Rcagensgütagrad) in 500 ml 0,2n Salssäure löst« Die Lösuig kann in dunklen Flaschen a^ifbewahrt werden und hält sich bei Raumtemperatur viele Monate.

Zur Bestimminß niedriger Methylmalonatkonzentrationen (1 bis 100 mg/1) kann man O,O25~ bis O,065prozentige p-STitroanilinliJaungen veirnronden. Pur Konzentrationen zwi-

.-. 19 > 009820/17H3

zu

sehen 500 und 3000 rag Methylisalonat eignet sich eine O.OIprosentige Lösung.

3) Acetatpuffer vom pH 4·«3x 3Jer Puffer wird hergestellt, indem man 8,3 g wasserfreies Natriumacetat in destilliertem Wasser löst und mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllt. Dar pH-Wert wird nit Essigsäure auf 4»3 eingestellt

4) 0 * 5pro gentige Hatriuiani tr i tlö suiffi t Für niedrigere Konzentrationen des p-Nitroanilin-Reagens kann der Zusatz tos 0,20« bis 0,45prozentiger NaHO₂-IiOsung sweekssässig sein»

5) 0.2-BOlaro gatriumacetatlcSsung.

6) 3n Natronlauge.

7) 8n Natronlauge.

8) 0,1,n Salzsäure: Im Bedarfsfalle auf einen pH-Wert von 1,1 einzustellen.

9) Herstellung des. Piazo-Rsagenz; 4>0 al dar 0,i5pros@ntig@ii NaNOg-Iiösung werden zu 15 ial der O,075prosentig©n p-Hitroanilinlosung bei Baumtemparatur zugesetzt. Das G-eiaisch wird im Eisbad auf 4° G gekühlt und mit 4₉0 ml kalter,

rer Natriumacetatlöeung versetzt. Das so erhaltene Beagenz hält sich bei 4° C 24 Stunden.

10) Methylmalonaäure-Biohproben: Bs werden swei Hethylaialonsäure-Eichproben hergestellt, die ein© Oj,005-iBolar und die andere 0,01-molar.

Einzelheiten das AnalyB9¥@rfahrea.8

Herstellung der Hargsäule und Bshandluny_[ der Proiba,» Bia© Sm®- penaion de3 Harzes I wird in eine 1 cm weite und 20 on lang© Glas säule mit einem gesinterten ölasstopfen eingebracht vmß. unter gelindem Luftdruck bis au einer Tiefe von 1 χ 2,5 om leicht zusammengedrückt. Vorzugsweise beträgt die Füllhöhe dee Harass

-■20 009820/1753

in der Säule nicht mehr als 2,7 cm

Eine TTrinprobe der Testperson wird filtriert oder zentrifugiert, um den Bodensatz daraus au entfernen» und mit massig starkem Alkali auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.

5,0 ml werden unter der Wirkung dor Schworkraft durch die Säule strömen gelassen. Dann wird das Harz zweimal mit je 50 ml destilliertem Wasser ausgewaschen. Hierauf wird die Methylraalonsäure aus dem Harz unter der Wirkung der Schwerkraft alt 20,0 ml 0,1n Salzsäure eluiert.

Jäine Suspension des Harzes II wird in eine andere, 1 cm weite und 20 cm lange Glaasäule eingegeben und bis zu einer liefe von 4 cm leicht durch gelinden Luftdruck hineingestopft. 10 al des obigen Eluates aus dem Harz I werden mit 1,0 ml konzentrierter Salzsäure versetzt, und die Lösimg wird durch die mit dem Harz II beschickte Säule gegossen. Per Ablauf wird mit 8n Natronlauge auf einen pH-Wort von 1,1 eingestellt.

farbentwicklung: In 13 mm weiten und 75 mm langen Reagenzgläsern wird 1,0 ml des angesäuerten Ablaufs aus der Harzsäule II zu 1,5 al 1,0-aolarea Acetatpuffer (pH 4,3) zugesetzt, lach Zusatz tob 1,5 al kaltea Diftso-Beagens wird der Inhalt vermischt und da« Geaieoh 3 Minuten im Wasserbad auf 90 Me 94° erhitzt. Dann wird dft· Gemisch mit 1,0 al 3»On Natronlauge versetzt. Sie Reagenzgläser werden alt Stopfen versehen, der Inhalt wird durchmischt, und die Gläser werden aus dem Wasserbad herausgenommen und 10 Hinuton bei Raumtemperatur.erkalten gelassen.

Wenn Konzentrationen dos mit dem Urin ausgeschiedenen Hethylaalonato von mehr als 240 mg/1 erwartet warden, verwendet aan eine entsprechend kleinere Kongo des angesäuerten Ablaufe als t,0 ml, wobei die Volumendifferenz mit 0,1η Salzsäure aufgefüllt wird.

-. 21 - BAD

009820/ 1763

Dann wird die entwickelte Farbe in Spektrophotometer bei 620 αμ unter Terwendung geeigneter Leerproben und einer Methylmalonsäure-Eichprobe abgelesen.

Mit jeder Gruppe von Bestimmungen werden Bestimmungen an einer Reagenz· Leerprobe aus 1,0 ml 0,1n Salzsäure, 1,5 ml Diazo-Reagenz und 1,5 ml Acetatpuffer sowie zwei Methylmalonaaure-Eichproben durchgeführt. Die erste Methylmalonsäure-Eichprobe enthält 0,05 ml 0,005-molare Methylmalonsäurelösung, die zweite Eichprobe enthält 0,05 ml 0,01-molare Methylmalonsäurelösung mit einem Zusatz von je 0,95 ml 0,1n Salzsäure, die in gesonderten Reagenzgläsern mit 1,5 ml Diazo-Reagenz und 1,5 ml Acetatpuffer versetzt werden. Diese Proben werden dann ebenso behandelt wie die oben beschriebene Testprobe.

Die optische Dichte (O.D.) der Eichprobe, der Reagenz-leerprobe und der unbekannten Testproben wird in Küvetten mit einem Lichtvreg von 1 cm länge in einem Spektrophotometer bei 620 χημ bestimmt.

Unter Normalbedingungea. der Analyse wird die Konzentration von Methylmaloneäure je 14.%·* Urin nach der folgenden öleiohung berechnet»

'Pf der Probe - O.B» der . der Bichprobe - O.D.

o.D. der Bichprobe - O.D. der Reagenl-Lterprobe

» , 1000 _ ToltUBen dea Ablaufe χ itri&Tolumen * Yoluaen der Ablauf probe

wobei sich die Elchprobe auf die Menge der Methylmalonaäiire je Reagenzglas besieht.

Unter den Bedingungen dieser Analyse kann man die folgende Berechnung anwenden:

" ²² "" . SAD

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«τ /-. tr * o.B.'dar Probe (korrigiert) χ 283»2 mg MKa/1 Urin * o.S, aer Sichrobe!"'(korrigierTTg^

* O.Do der Eichprobe (korrigiert) *

O₀D. dar 0,005-HioXaren Eichprobe (korrigiert) χ 2 + P.P. der 0,01~3iolaren Eiohproibe (korrigiert)

Die Methylmalonsäurekonaentration je Liter Urin bei normalen Kontrollpersonen beträgt nach dieser Methode weniger als etwa 30 bis 40 ag.

Beispiel 1

Die folgenden Versuche erläutern die Wirkung von Methylmalonatbildnern und Histidin, vronn sie allein und in verschiedenen Kombinationen dargereicht werden, auf dia Ausscheidung von Methylaalonat und Porairoinoglutaiainsäure in dem Urin von an Vitamin-B^2""^Mailß^e^ leidenden Patienten, an SOlsäuroinangel leidenden Patienten und normalen Personen»

YarBuohgperson A: Weiblich, Alter 51 Jahre« Körpergewicht

61,7 kg.

Diagnose t Perniziöse Anämie im Btickfall.

Klinische Patens Schwäche, Blässe, Kribbeln in den Fingern. Häeoglobin 9_f0 &-$, rote Blutkörperchen 2,2 Millionen/ran', mittleres Volumen der roten Blutkörperchen 110 μ' (normal: 72 bis 87 μ )» Blut- und Knochenisarkcytologie megaloblaetiech 4 φ, köia gastrischer Intrineic-Faktor, Vitamin— B₁₂-Aktivität Im Sarue 70 μμβ/rnl (normals 150 bia 900 μμβ/al), folßäureaktivität im Seruia (1. caeei) 10,2 (normal 4 bis 20 wpg/ml).

Die Beladungsdosen werden oral dargereicht, und der Urin wird in der beschriebenen Weis· gesammelt.

²⁵ ~ BAD ORIGINAL

009820/1753

Vi

" Σ -Histidin" bedeutet L-Hietidin~HCl< >H₂0$ Δ bedeutet Zunahme über den Grundspießcl hinsuaf g = Gramm | q. « alle ι h « Stunden.

- 24 009820/1753

Vereuehe-

tag

Bargereichte Terminating

Schwerer Vitamin-B,g-Mangel

Gesant-

beladungs- Darreiehungsdosis, g weise

Ausscheidung im Urin, mj^/Iaff

MMa** FIGIU***

Gesamt- Gesamtmenge 2\ menge

V. V

<n 1

Verauoh A 1. 2.

3. 4.

5. 6.

Versuch B 1. 2.

3.

4.

5. · 6.

keine DL-Valin

keine L-Hietidin

keine

L-Histiöin

+ DL-Valin

keine DL-Threonin

kein« L-Hietidin

keine

DL-Threonin

t-Histidin

20 15

15 20

6,67 g x 3

α 4 h

5 g x 3

«1 4 h

I^s

j.

6,7 g

x 3

200
816

210
205

215
MS

180

20 15 20

6,67 g x 3 4 4h

5 g χ 3 q. 4 h

6,67 g

JL

5g

185

200

195 280

616

225

174

£2.

2,5 3,0

2,0 16,0

3,2 16,9

2,0 2,2

3_f2 17,0

4,5 16,5

Versuchs-

Versuch C 1. 2.

3. 4.

5·. 6.

7. 8.

Dargereiohtβ Verbindung

keine

W-Threonin

keine

DL-Threonin

L-Hittidin

keine

!-Histidin

DI-Isoleucin keine

L-Histidin *

Thymin

Gβ »auntbelAdungedoeia» g

50

50

15

15 20

15

10

	χ 3	-	AusBoheidune im	•	Δ	Urin. mft/Pae
	ah		MMa**			FIGIäJ***
	W 1 3,3 5 ς	Gesamt		440	Gesamt
Darreiohungs-	L 4 h	menge		menge
weise	190		3,4
	630	120	4,6
10 g χ 3
q 4 h	200		2,0
-	120	200	20,0
Sg I***	200		4,6
-	400	170	18,7
5g j
6,7 g j	T80	4,3
350	16,1

Jede Vorlauferyerbindung, die gemeinsam mit einer anderen dargereioht wird, wird nicht gleichzeitig mit der letzteren, sondern 1/2 Std. später dargereicht.

** MMa *** PIGIU

Methylnalonat. Formiminoglutaieinsäure.

Dieser Patient zeigte anschliesaend eine klassische häraatologische Reaktion auf die täglich für einen Zeitraum von 3 Tagen vorgenommene intramuskuläre Injektion von 3 μg Vitamin B₁₂, wodurch das Vorhandensein von Vitamin-^ ₂-Mangel Tasstätigt wurde (vgl. Liihby und Cooperman, ^MAdv. in Hetab. Dis.¹¹, Band 1, 1964, Seite 263-334, Verlag Academic Press, Nevr York).

Aus den o"bigen, erfindungsgemäss durchgeführten Versuchen ist ersichtlich, dass "bei Patienten, die an Vitamin-^₂-Mangel leiden, die alleinige Darreichung von dl-Valin eine auffallende Zunahme der Ausscheidung von Methylmalonat in Urin innerhalb 24 Stunden seit Beginn der Verabreichung der Beladungsdosis verursacht. In dem gleichen Zeitraum bleibt die Ausscheidung von Pormiminoglutaminsäure im Urin unverändert. Anschliessend beeinflusst die Darreichung von Histidin allein die 24-stÜndige Ausscheidung von Methylmalonat im Urin nicht wesentlich, und obwohl der innerhalb 24 Stunden nach Beginn der Histidinbehandlung gesammelte Urin einen mässigon Anstieg der Ausscheidung von Formiminoglutaminsäure im Urin zeigt, liegt dieser Wert unter demjenigen, der erfindungsgemäss als charakteristisch für lolsäuremangel festgestellt wurde.

Bei der ansohliesaenden Verabfolgung einer Kombination aus Histidin und DI-Valin liegt die Gesamtaus3cheidung von Methylmalonat im Urin in einem Zeitraum von 24 Stunden in der Grössenordnung von 1/3 derjenigen, die nach der Darreichung der gleichen Dosis an ΰϊ,-Valin allein beobachtet wird. Trotzdem ist der Anstieg der Ausscheidung an Methylmalonat auffallend, obwohl bei diesem Patienten der hohe 24-etündige Grundepiegel der Methylmalonatauescheidung ira Urin (etwa 200 mg) ein Anzeiohen für Vitamin—B^g-Mangel ist, zeigt der Test des sechsten Versuchstages, wie die Erfindung als spezifische differentielle Diagnosemethode anwendbar ist, um darüber hinaus den spezifischen Vitamin-3-j g""^^⁶¹ *>ei einem Patienten zu bestimmen, bei den die töegaloblcotieche Anämie nicht auf Polsäuremangel, sondern nur auf 7itamin-B₁₂-Mange3. zurückzuführen ist, wobei die

~ 27 009820/1753

Beladungsdosen gleichseitig dargereicht werden und die Bestimmung von Msthylsialonat und SOrmiiainogXutaminsäure im Urin an einer einzigen gesammelten Urinprobe durchgeführt wird. Bei der nachstehenden Versuchsperson B wird der Wert der spezifischen differentiellen Diagnosemethode gemäss der Erfindung an einem Fall erläutert, in dem der endogen© fcrundspiegel der Mettiylmalonatausscheidung im Urin innerhalb 24 Stunden nicht charakteristisch für Vitamin-B^g-Hangel ist«

Die Werte des Versuchs B se igen die erhöhende Wirkung von DI-Threonin auf die Methylmalonatausscheidung im Urin innerhalb 24 Stunden, wenn diese Verbindung einerseits allein, andererseits in Kombination mit Histidin dargereicht vjird. Der Test des sechsten Versuchstages des Versuchs B zeigt die verminderte, aber noch beträchtliche Aktivität von Dl-ihreonin» wenn es zusammen mit Histidin dargereicht wird. Der Tost des vierten Versuchstages des Versuchs O zeigt, wie die verminderte Wirkung der Darreichung einer als Methylmalonatbildner wirkenden Aminosäure gleichzeitig mit Histidin ausgeglichen werden kann, und gibt ein Beispiel der Wertebasis für die verschiedenen und erhöhten Mengenverhältnisse in den Beladungsdosen, die für die erfindungsgesässe Kombination mit einem Pormiminoglutamlnsäurebildner {im Unterschied su der alleinigen Verwendung eines Hethylmalonatbildners) empfohlen werden» Die Werte des sechsten und des achten Versuchstages des Versuchs O aeigen den differentieilen Diagnosewert von Kombinationen aus DL-Isoleucin und Histidin sowie aus Thymin und Histidin, die jeweils einen auffallenden Anstieg der in 24 Stunden mit dem Urin ausgeschiedenen Methylmalonatmeng©, aber keinen bedeutungsvollen diagnostischen Anstieg der in 24 Stunden mit dem Urin ausgeschiedenen SOrmiminoglutaminsäuremenge hervorrufen, wodurch in jedem Falle nachgewiesen wird, dass ein Vitamin-B-j₂-Mangel, aber kein Polafiuremangel, vorliegt„

- 28 -

009820/ 1 753

1908743

Versuchsperson B: Weiblich, Alter 36 Jahre, Körpergewicht

63,5 kg.

Diagnose: Perniziöse Anämie, behandelt (früher

Rückfall).

Klinische Paten: Keine Beschwerden, Hämoglobin 13,2 g-£, rote Blutkörperchen 3,68 Millionen/mm , mittleres Volumen der roten Blutkörperchen 98, kein gastrischer Intrinsic-Faktor, Vitarain~B.<₂-Ak'fciviüätsspiegel des Serums 205 μμg/ml, Eolsäure-Aktlvitätsspiegel des Serums

(L. easel) 8,1 n^g/ml, Khochenmarkeytologie zweideutig

megaloblastiach»

Es weröen Beladungsdosen oral dargereicht, und der Urin wird in der beschriebenen Weise gesammelt. Die Symbole sind die gleichen, wie oben angegeben»

- 2S 009820/1753

	? I	Vereuche- tag	Dargereichte Verbindung	Milder Yj	■	30	Darreichunge weise	Aueeoheidune im	Δ	«	CO O	O
		1.	keine				MMa** Gesamt menge		Urin. o«/Ta«
		2.	DL~Valin	Geeaat- beladunge- doeie, g		6,6 g χ 3 <l 4 h	20	60	FIGLU*** Gesamt menge
		3.	keine			-"	85		.1,8
		4c	I-Histidin	20	5,0 g χ 3 q. 4 h	27	—	2,1
		5o	keine	-	-	22		2,3
		6o	OL-Talin	15	6,6 g ) χ 3	18		10,3
O «0		7.	L-Hietidin keine	-	5g N**	28		3,6
•ο		8o	ö£~Yalin	20	1? g U 3	16	46	10,2
O >*.		L-Hietidin	15	5rg i^4h	68		3,1
1763	9.	keine	30	-			11,9
	10.	DL »Threonin	15	30 g χ 1	17	*
	11.	keine	-	-	28		4,2
	12.	•01-Threonin	30	10 g χ 3 α 4 h	14	28	2,2
			42	1,3
			2,1

13.

keine

1,1

Yereuohe- Dargereiohte tag Terfrintamg

DL-Threonin

+ L-Hietidin

Iceine

:43t«fhreonin

+ L-Histidin

keine

BiL »Isoleucin

+ I-Hietidin

keine

DL-Ieoleucin

+ L-Hietidin

W.

15. 16.

17.

19. 20.

21. 22.

23. 24.

25. 26.

L-Histidin

Tixyiiin

+ L~Hiitidin

OeeaatbeledungedoeiB, g

30

+ 15

66

+ 15

20

+ 15

35

+ 15

15

15

+ 15

24

AuBBoheidung im urin« aag/Tag MMa** PIGLU***

Dexreichungsveiae

10 g , _χ 3 5⁺g <**^h

20 g ) _x 3 5⁺g l·*

6,7 g ) _x 3 5⁺g N^4h

11,7 g ) _χ 3 5⁺g I * * ^h

5 g x 3 4 4 η

aenge 27

12 60

20 30

18 75

20

45

17 29

20 52

48

53

25

menge

10,1

32

1*2	•	^-
9,8		CO O Oi — ■
1,8
8,2
1,2
12,3
2,4
1,9
1,1
11,4
2,1
12,3

q 4 h

Anmerkungen zur,tabelle :

* Unbedeutender Anstieg, ** MMa * Methyliaalonat,

Versuchsperson Os Weiblich, Al tor 57 Jahre, Körpergewicht

52,2 kg.
Diagnose: Auf Sprue beruhende mangelhafte Absorp-

tionesyajptome.

Klinisch© Daten: Schwäche, Blässe, Durchfall. Hämoglobin 7,2 g-#, rote Blutkörperchen 2,2 ^

der roten Blutkörperchen 102 μ , normaler gastri,-ocher Intrinsic-Falctor, bedeutend verminderte Xyloseabsorptions TitaiDin—B^₂-Aktivitätsapieg@l des Serusas 110 i^g/sil, Folsäure-Aktivitätsspiegel (L₀ casei) äes Se-2_?8 mpg/ml, Enochenisarkcytologia megaloblastisch 3 +

- 32 009820/ 1 753

Kombinierter Vitaain-B^ ₂~ und Polsäuremangel ι Massiger Polsäuromangel, milder Vitamin-B^g-Mangel

	O	ί	Yerauoha- tag	Dargereichte Verbindung	Geeaat- beiadunge- dosis, g	Dasreiohunge- weise	AuBseheidunÄ ira	■A.	TJrin. Eg/Slag
	«ο	i	1.	keine	-		MMa** Gesaat menge		JfJ-U1JjU*** Gesamt menge
	820/		2.	L-Hietidin*	t5	5 g x 3 q 4 Ii	20		5,2
			3.	keine	-	-	22	-	15,7
-	cn <*>		4.	Bt-Valin	20	6,67 g χ 3 4 4 h .	20	77	6,2
		5.	keine		-	97	«»,	5,9
		6.	X-Valin L-Hiatidin	20 15	6,67 g ) x 3	25	32	4,1
	7.	keine	-	-	57	«=.	140
	8.	DI.-Yalin	45	15 g ) χ *	22	63	6,1
		L-Histidin	15	5 g ) « 4 h	85		126
	9.	keine	-	MfI		-
	10.	!,-Histidin	60 15		20	55	4,7
				75

* In allen Fällen L-Hirfeidin-HCl'HgO,

** HHa s Methylmalonat. ♦·♦ FIGIjU « Ϊ ornininoglutastinetture ·

Die Beladungedosen werden oral verabfolgt, und dar Urin wird in der oben beschriebenen Weise gesammelt. Pie Symbole sind die gleichen wie oben.

Versuchsperson D: Männlich, Alter 47 Jahre, Körpergewicht

65,8 kg.

Diagnose: Megaloblastische Ernährungsanämie» Klinische Daten; Schwäche und Blässe, Hämoglobin 6,3 g-#₅ rote Blutkörperchen 1,9 Millionen/mm , mittleres Volumen der roten Blutkörperchen 106 \xr\ normaler gastrischer Intrinsic-Faktor, normale Magen- und Dannabsorption von Xylose, Vitamin-B₁₂--AktivitätBspiegel des Serums 360 μμ&/πΙ, Folsäure-Aktivität des Serums (L. casei) 3fO mμg/ml, Knochenmarkcytologie megaloblas ti sch 4 +<>

Wie beschrieben, werden die Beladungedosen oral dargereicht, und der Urin wird gesammelt. Die Symbole sind die gleichen wie oben.

- 34 -009820/1753

Käsai|g sahvfQrer

im Urin. rag/Sag

GO K> O

tag

c

4c 5.

=

8.

9-

10.

11. 12.

keine

L-Histidin*

keine

DL-Valin

keine

&-Histidin

keine

Dt-Ieoieuoin

!-Histidin keine

Dl-Tnreonin

+ I.-Histidin

keine Thymin

I-Hietidin

Gesamt-.

belädungo-

dosis, g

15 20

20

13

20 15

20

15

10

15

Darreichungsv/eis©

5 g χ 3 q. 4 h

6,67 g x 3 q. 4 h

6,67 g ) _ ,

JL 1 "*

5 g J ■ « * ^h

6,67 g

+ 5 g

6,67 β

5 g

5g {■*♦*

MMa**

Gooamtmcnge 18 21 20 24

25 20

18

22 26

• 20 23

FIGLU***

230 8,0 6,0

5,2 ' 220

f>,6 234

4,1 242

8,7 229

uO

* In allen Fällen L-Hietidin-HCl-HgO. ♦* MMa = Methyloalonat. *** PIGIÄJ = FormiBinoglutamineäure.

Versuchsperson E; Männlich, Alter 27 Jahre, Körpergewicht

72,5 kgo

Diagnose t Makrocytische Ernährungsanämie.

Klinische Daten: Schwäche und Blässe. Hämoglobin 8,8 g-#, rote Blutkörperchen 2,4 Millionsn/mm , mittleres Volumen df,r roten Blutkörperchen 100 μ , normaler gastrischer Intrinoic-Faktor, Vitamin--B₁ g-Aktivitäteepiegel des Serums 480 YYg/ral, Polsäure-Aktivität des Serums (L. casei) 5,2 n^g/ml, Knochenmarkcytologie megaloblastisch 2 +.

Die.Beladungsdoeen werden oral verabfolgt, und der Urin wird gesammelt, wie oben beschrieben. Die Symbole sind die gleichen, wie oben angegeben.

- 36 009820/1753

Versuche- Dargereichte

1. 2. 3. 4.

5."

V. 8.

9.

10. ■11. . 12.

keine L-Hietidin*

L-Valin

L-Hietidin keine

t-Isoleuoin L-Hieticl±n

keine

L-Threonin

+ . L-Hietidin

Milder PolsäuremanKel Gesejrt*

e" Sarreichungedo«i*_f g weise

15

10

T5

10

10 15

15

15 15

5 g x 3

3,3 g ) x 3 5⁺g i*^5h

3,3 g ac 3 q 3

5⁺g l**^h

5 g x 3 q. 4 h 5⁺g ) * * *

AusseheidunK	im Urin, m«/Ta«
MMa** Gesamt menge ^j	/^ PIGLU***
17	2,1
21	109
15	3,5
28	98
20	4,3
25	3,8
18	·*·' 3,6
26	95
20	2^2
2?	2,4
16	1,8
23	90

* In allen fällen L-Hietidin«^[01.H₂0. ♦· IQ!a - Methyl»alonat.

TLQW m iormieinoglutaminaäure ο Yerauchgperson >g Weiblich, Alter 28 Jahre» Körpergewicht

54»5 kg, la siebenten Monat schwanger.

Diagnoseι Hakrocytiache Schwangerechaftsanämie.

ELinieche Baton: Blässe. Hämoglobin 8,2 g-£, rote Blutkörperchen 2,1 Millionen/mm⁵, Khochensarkcytologie mega~ loblastisch 4 +.

- 3S -009820/1753

Masai« schwerer golaäurenangel

CD 00 IO O

2 * cn I

	Oft.rgere±chte Verbindung	fceladunge- dosis, g	Barreiohunge- weie·	Ausscheidung im	Δ	Urin, Bg/Iag
Vexeuehs- tag	keine			MMa** Öeeant- nenge
1.	ÖL-Valin	20	6,7 g x 3 q. 4 h	12	—	5,6
2.	kein«		-	18	-	4,2
3.	L-Hietidin	15	5 β x 3 . q 4 h	17	-	5,7
4.	keine	mm	-	20		128
5.	ttL-T«lin	20		13		6,7
6.	. L-Hietidin	15	Jl I * ♦ h	20		118

to

♦♦ MMa ♦♦♦ TtIQW

MethyliÄlonat

t1 Tn

CO O

HO ¹⁹⁰⁶⁷*³

Versuchsperson G: Männlich, Alter 15 Monate, Körpergewicht

. 9 kg.

Diagnose t Zöliakie«,

Klinische Patent Blässe. Hämoglobin 7,0 g-#, rote Blutkörperchen 2,1 Millionen/isnr, Knochenmarkcytologie megazweideutig.

- 40 -

Milder yplsäuremangel

	•	ι	Dargereiohte	Geeamt-	Sarreiohuoge-	Ausscheidung	im Urin, ©g/Tag
	Tereuchs-		Verbindung	beladungs-	weise	MHa** '
	tag		keine	. doale, g		Gesamt
	1ο	OL-Valin	mm	1,0 g χ 3	menge ι	^ PIGLU***
	2.		3,0	q 4 η	5	8,0
					15	. 6,0
	3.	L-Hieiidin	-	0,8 g χ 3
	4ο		2,4	q 4 h	12	5,1
O O	5.	ÖL-Valln		1;° g ) χ 3	14	100
«0	6.	!-Histidin	3,0	0,8 g j 4 a
•ο ca		2,4	15	90

♦♦ MHa

MethylimloBftt

Γ"

σι

-■*>• .,· w j

Terbindung

L-Talin Ci-Talin I-taiin I-Talin

Hl

B e i s ρ i e 1

Ausscheidung im urin, /

Gesamtbeladungsdosis, g

5 10 10 15

Darreichungsweise

χ 1

χ 1

x 3 H 3 h

χ 1

KHa**, Zunahme über den Grundspiegalwert von 180-250 hinaus

100 448 811 560

FIGIiU***

2,1 3,2 3,1 1,8

t-T«lin C-Talin

10 10

χ 1

χ 1

2,3 3,1

DL-Talin DL-Talin W.-Talin BL-talin

10 20 20 30

χ 1 χ 1 x 3 x 3

4 h 4 h

185 300 660 706

4,6 3,8 4,1 2,0

L-Ieoleuoin

10

χ 1

395

2,8

Ct-Iaoleucin (50 5 d-Allo i»oleucin)

• B

10 20

χ 1

x 3 * 4 a

275 536

3,2

5,1

I-Ihrtonin τ.-Threonin	10 10	X X	1 3	q. 4 h	150 220	2,7 3,6
DL-Threonin	ο ο CM CM	X X	1 3	q 3 h	90 . 192	3,0 1,3
DL-Threonin	30	X	1		306	2,7
Thymln	10	X	Jui j	q 2 h	256	1*9

009820/1753

Beispiel 2 (gortSetzung)

Verbindung

Gesamt»

beladungs- Darreichungsdosis, g weise

Ausscheidung in Urin, mg/Tag

MMa**, Zunahme über den Grund-

spiegel-

wert von 180-250

hinaus P2&1U***

D&.-Hoinoserin	20	X	3	α. 4 h	115	2,8
!,.-Methionin ϊ-Methionin	10 10	X 3C	3 3	α. 4 h α. 4 h	15 5	2,0 3,8
X>tt -Serin	20	X	1		8	2,7
'y-Asparagin	10	X	1		12	1,8
.i» -Asparagin säure	10	X	1		6	2,3

r-Hietidin-	15	S3	q 4	h	5	13,4
!.-Histidin- HCl-H2O	15	Σ 3	q 4	h	0	16,2
l-Histidin- HOl.H2O	15	x 3	CL 4	h	4	14,7

** MMa =s Mothylioalonai;. ♦** PI&LU a Pormininoglutaminsäure.

Die Bsladungsdosen werden oral dargor eicht, und der Urin wird gesammelt, wie oben beschrieben. Pie Symbole eind die gleichen wie vorher«

009820/ 1753

BAD

B e i β ρ i β 1

Werte für normale Personen: Der Bereich der Ausscheidung von Hethylmalonat ia Urin im Verlaufe von 24 Stunden beträgt bei normalen Erwachsenen (20 Fälle), bei schwangeren Frauen (18 Fälle) und bei Kindern (12 Fälle) ohne Beladung 0 biß 27 ng. flach Beladung mit jedem der in den obigen Beispielen angegebenen Methylmalonatbildner für 3ich allein und in verschiedenen Dosen und Kombinationen mit Histidin einschliesslich der Dosen an Methyliaalonatbildnern, die in der vorherigen Tabelle aufgeführt sind, steigt die Ausscheidung von Methylaalonat in Urin bei 320 Beladungsversuchen niemals über 30 mg/Tag.

Der Bereich der Ausscheidung von Fonaiminoglutaminsäure im Urin innerhalb 24 Stunden bei normalen Erwachsenen (1510 Fälle), schwangeren Frauen (680 Fälle) und Kindern (420 1&17.&) ohne Beladung beträgt 0 bis 6 zag pro Tag. Nach Beladung Bit jedem der in den obigen Beispielen angegebenen MethyXiaalonatbildnern allein oder in verschiedenen Kombinationen miteinander vrird die Ausscheidung von Formiialnoglutamxnsäure im Urin innerhalb 24 Stunden in 264 Versuchen nicht höher als 6 mg. Wenn die verschiedenen Methylmalonatbildner in verschiedenen Doeiekombinationen mit Histidin dargereicht werden, erzeugen sie innerhalb 24 Stunden bei 362 Versuchen keine höhere FormizQinoglutamineäureausscheidung im Urin als 28 mg/Tag.

Die Verabfolgung von Histidin als der bevorzugten Verbindung in den oben beschriebenen Beladunsedosen und Darreichungeweisen führte bei Patienten mit Vitemin-B₁₂-Mangel innerhalb 24 Stunden nicht zu höheren Formiminoglutaminsäureauescheidungen im Urin als 35 ng/Tag, nachdem 300 solche Personen mit reinen Vitamin-B^-Mangel untersucht worden waren. Die Beladung mit den verschiedenen Methylmalonatbildnern führte bei übor 35 Patienten mit reinem Polsaurenangel in 116 Versuchen niemals su einem Anstieg der Methylmalonetabscheidung im Urin innerhalb 24 Stunden von mehr aiii 30 ng,

... 44 D0 9P20/1753

Claims (1)

1. Heue Patentansprüche

   1. Verfahren zur Diagnose von Vi. tamin-B₁₂-Mangel und gegebenenfalls von Folsäuremangel, dadurch gekennzeichnet, dass man der su untersuchenden Person Beladungsdosen an

   (a) mindestens einem Kethylmalonatblldner und gegebenenfalls

   (b) Histidin oder nicht-toxischen Hlstidlnsalzen darreicht, worauf man den Urin der su untersuchenden Person für einen Seitraum von etwa 24 Stunden nach Beginn der Beladungsperiode sammelt und die Xonsentration und Gesamtmenge an Methylmalonat und gegebenenfalls an Pormiminoglutamlnsäure im Urin bestimmt·

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennseiohnet, dass man der su untersuchenden Person während der Beladungsperiode Insgesamt etwa 10 bis 100 g Methylmalonatbildner und gegebenenfalls Insgesamt etwa 5 bis 20 g Histidin oder Histidinsals gibt.

   3* Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Methylmalonatblldner L-Valln, DL-VaIin, L-Iso-Xeucin, DL-Xsoleuoln, L-Threonin, DL-Threonin, Thymln, L-Homoserln, DL-Homoserln und/oder nicht-toxische.Kooplexverblndungen und/oder Salse dieser Verbindungen darreicht.

   H. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» daduroh gekennzeichnet, dass man die Beladungsdosen innerhalb von 12 Stunden In mindestens drei Portionen darreicht.

   009820/1753

   /ι

   A333-OQ3

   5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch dass man als Nethylmalonatblldner DL-Valin und als toxisches Histldinsalz darreicht·

   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass DL-Yalin in drei Binseldosen von je 5. bis 20 g und din-hydroehlorid-monohydrat in drei Einzeldo«®n von 1,7 bis 6,6 g darreicht.

   Mittel rar die Durchführung des Diagnoseverfahrens Vitamin-B₁₂-Mangel uiad gegebenenfalls Folsäniremangel Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet durch einen Gehalt sm wenigstens einem Methylmalonatbildner und gegebenen?alls Histidin oder einem nicht-toxischen

   8. Mittel nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet, dass ©@ fffis» die Darreichung an Erwachsene den Methylmalonatblldn®^ ±n Beladungsdosen von etwa 10 bis 100 g nand gegebenenfalls Histidin oder Hlstldinsalse in Beladungsdosen von etw& 5 bis 20 g enthalt.

   9· Mittel nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als Methylmalonatbildner L-Valin, DL-VaIIn₉ L-Isoleucin« DL-Isoleuoin, L-Threonin, DL-Threonin, Thymin, L-Homoterin, DL-Homoserin und/oder nicht-toxische Komplexverbindungen und/oder Salze dieser Verbindungen enthält.

   10. Mittel nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verbindungen in einem trinkbaren f lassigen Trflger enthält.

   009820/1753

   A333-OO3

   11. Mittel nach Anspruch 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es L-Histidin~hydrochloridHnonohydrat in Mengen von etwa 1,7 bis 6,6 g je Einseldosis und DL-Valin in Mengen von etwa 5 bis 20 g je Eiiuseldosls enthalt.

   12. Mittel nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass es für die Darreichung an Kinder den Methylntalonatblldner in Beladungsdosen τοη etwa 0,185 bis 3*2 g je kg Kurperge« wicht und gegebenenfalls Histidin oder Ristidinsalse in Beladungsdesen von etwa C I85 bis 0,32 g Je kg Körpergewicht enthält.

   009820/ 1753