DE2648458C2 - Verfahren zum Nachweis eines im Serum von Krebspatienten vorkommenden, spezifischen Proteins und Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines im Serum von Krebspatienten vorkommenden, spezifischen Proteins gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.

Es ist bekannt, daß für eine wirksame Bekämpfung von Krebs eine möglichst frühzeitige Diagnostizierung dieser Krankheit erforderlich ist. Es sind zahlreiche physikalische und chemische Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs bekannt. Die meisten der physikalischen Verfahren zur Diagnostizierung wie die Mammographie und die Röntgenbestrahlung waren relativ erfolgreich, es ist jedoch möglich, daß die mit der Bestrahlung verbundenen Gefahren größer sind als allgemein angenommen wird, wodurch der Wert dieser Verfahren weitgehend beeinträchtigt wird.

Von den chemischen Untersuchungsverfahren, die beispielsweise aus den US-PS 36 73 410, 36 97 638 und 36 63 684 bekannt sind, sind Untersuchungen bezüglich eines carcinoembryonalen Antigens (CEA) [Gold und Freedman, ]. Exp. Med., 121,439 bis 462 (1965); Gold und Freedman, ]. Exp. Med., 122, 467 bis 481 (1965), und Thomson u.a., Proc. Nat. Acad. Sei., 64, 161 bis 167 (1969)] in weitem Umfang veröffentlicht worden. Aus der DE-OS 20 29 499 ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von CEA im Blut von Krebspatienten bekannt. CEA kommt bei bestimmten Krebsarten im Blut von Krebspatienten vor. CEA wird dadurch nachgewiesen, daß Anti-CEA-Antiserum zu einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum hinzugesetzt wird, daß das erhaltene Gemisch inkubiert und zu dem inkubierten Gemisch radioaktiv markiertes CF.A hinzugegeben wird und daß nach einer weiteren Inkubation die gebildeten CEA-Anti-CEA-Komplexe

mittels eines Protein-Fällungsmittels ausgefällt werden. Das aus der DE-OS 20 29 499 bekannte Verfahren hat den Nachteil, daß es nur bei bestimmten Krebsarten mit Erfolg anwendbar ist Außerdem ist das bekannte CEA nicht spezifisch für Krebs, da es auch in bestimmten normalen Geweben gefunden wird und andererseits nicht bei allen Krebsarten beobachtet wurde. Die CEA-Untersuchung scheint ihren hauptsächlichen Wert auf dem Gebiet der Krebsbehandlung, jedoch nicht auf dem Gebiet der Diagnostizierung von Krebs zu haben. Die Meldungen über den Nutzen der CEA-Untersuchung für die routinemäßige Diagnostizierung von Krebs bei klinischen und Reihenuntersuchungen ist geteilt [Stevens u. a. Br. J. Cancer, 32,147 bis 151 (1975)].

Die Früherkennung von Krebs beruht im allgemeinen auf dem frühen Auftreten von leicht feststellbaren Symptomen wie Hautveränderungen oder Knoten. Auch die Feststellung dieser Symptome ist nachteiligerweise oft zufällig, soweit sie von dem Patienten selbst gemacht wird.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein zuverlässiges, von schädlichen Nebenwirkungen freies, bei allen Krebsarten anwendbares Verfahren zum Nachweis eines im Serum von Krebspatienten vorkommenden, spezifischen Proteins durch Zugabe eines bindefähigen Proteins zu einer Serumprobe zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst.

Überraschenderweise wurde beobachtet, daß ein spezifisches Protein, das normalerweise im menschlichen Serum vorhanden ist, mit einem niedermolekularen, bindefähigen Protein, das durch Einwirkung einer aus Bäckerhefe extrahierten, CoA-SPC enthaltenden Proteinfraktion auf die drei Substrate ATP oder dessen Salz, D-Pantothensäure oder deren Salz und L-Cystein oder dessen Salz gewonnen wird, reagiert. Bei Krebspatienten ist das spezifische Protein des Serums modifiziert, oder es wird ein spezifisches Protein mit ähnlichen Eigenschaften wie das normalerweise vorkommende, spezifische Protein produziert und in das Blut freigesetzt, wobei dieses im Serum von Krebspatienten vorkommende, spezifische Protein ebenfalls mit dem erwähnten niedermolekularen, bindefähigen, unter Einsatz der aus Bäckerhefe extrahierten Proteinfraktion erhaltenen Protein reagiert oder darauf einwirkt. Dieses im Serum von Krebspatienten vorkommende, spezifische Protein wird nachstehend als B-Pro*ein (Bucovaz-Protein) bezeichnet. Die Quelle des B-Proteins ist nicht bekannt. Es kann durch Krebszellen produziert werden, oder die Anwesenheit von Krebszellen löst möglicherweise ein besonderes Immunsystem oder ein anderes System im Körper aus, das zur Produktion dieses im Serum von Krebspatienten vorkommende, spezifischen Proteins führt.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte, bindefähige Protein ist an sich bekannt [Morrison, J. C, Morrison, W. C, Whybrew, W. D., Wiser, W. L. und Bucovaz, E. T., »Alteration of Coenzyme A-Synthesizing Protein Complex Activity Related to Cyclic Hydrocarbon Conjugation«, IRCS, Med. Sei., 3, 23 (1975)]. In dieser und in anderen Literaturstellen:

Bucovaz, E. T., Sobhy, C. M., Morrison, W. C, Whybrew, W. D., Morrison, J. C, Wiser, W. L, Fish, S. A. und Fryer, J. E., »Conjugation of Cyclic Hydrocarbons with the Coenzyme A-Synthesizing Protein Complex of Bakers' Yeast«, Proc. Am. Assoc. Cancer Research, 16 (1975) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe),
Sobhy, C. M, Whybrew, W. D, Morrison, J. C, Morrison, W. C, Wiser, W. L, Fish, S. A. Fryer, J. E. und Bucovaz, E. T., »Coenzyme Α-Synthesis by a Protein Complex of Bakers' Yeast«, Federation Proa, 34, 599 (1975) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe),

Morrison, J. C, Morrison, W. C, Whybrew, W. D, Wiser, W. L und Bucovaz, E. T, »Alterations in Coenzyme Α-Synthesizing Protein Complex Activity Related to Cyclic Hudrocarbon Conjugation«, Southeastern Cancer Res. Assoc. (1975) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe),
Morrison, W. C, Whybrew, W. D, Morrison, J. C, Fryer, J. E, Sobhy, C. M. und Bucovaz, E. T, »Alternant Functions of the Coenzyme Α-Synthesizing Protein Complex of Bakers' Yeast«, American Chemical Society (1975) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe),

Rhoades, J. L, Morrison, W. C. Whybrew, W. D, Morrison, J. C Fryer, J. E. und Bucovaz, E. T, »Modified Preparation of the Coenzyme A-Synthesizing Protein Complex of Bakers' Yeast«, Southeast-Southwest Meeting, American Chemical Society (1975) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe),

findet sich jedoch nicht der geringste Hinweis darauf, daß dieses Protein als bindefähiges Protein zum Nachweis eines im Serum von Krebspatienten vorkommenden, speziellen Proteins geeignet sein könnte.

Das spezifische Protein von Normalserum und das B-Protein haben ähnliche Eigenschaften. Beide reagieren mit dem im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, bindefähigen Protein. Darüber hinaus wandern das B-Protein von Krebspatienten und das spezifische Protein des Normalserums, das bei allen Menschen vorhanden ist, in einem elektrischen Feld in dem gleichen allgemeinen Bereich wie die «-Globulinfraktion von menschlichem Serum. Beide Proteine haben ein Molekulargewicht von etwa 140 000 bis 160 000 und zeigen das gleiche Trennungsmuster in einem kontinuierlichen Sucrosegradienten von 3 bis 10%. Außerdem werden beide Proteine durch 5O°/oige Sättigung des Serums mit (NHi^SO₄ ausgefällt. Da der Titer von B-Protein im Serum von Krebspatienten ansteigt, scheint die Menge des im Normalserum vorkommenden, spezifischen Proteins proportional abzunehmen. Es wird angenommen, daß das B-Protein eine Modifikation des noch nicht identifizierten, spezifischen Proteins von Normalserum darstellt, die mit dem im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, bindefähigen Protein reagiert. Das im Serum von Krebspatienten vorkommende B-Protein ähnelt zwar dem spezifischen Protein, das im Serum von Menschen vorhanden ist, die keinen Krebs haben, jedoch reichen die Unterschiede in den Eigenschaften zwischen diesen beiden spezifischen Proteinen für eine Trennung und Identifizierung des B-Proteins aus.

Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung besteht in dem in Anspruch 2 gekennzeichneten Reagenz zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Eine zum Nachweis von B-Protein und zur Unterscheidung gegenüber dem spezifischen Protein von i^ormalserum bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagenz ist dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Substrate radioaktiv markiert ist, wodurch ein radioaktiv markiertes, bindefähiges Protein erzeugt wird.

Bei der Zugabe des Reagenz zu der Serumprobe eines Patienten verbindet sich das aus dem Reagenz freigesetzte, bindefähige Protein sowohl mit ggf. vorhandenem B-Protein als auch mit dem spezifischen Protein, das sowohl im Serum von Krebspatienten als auch im Normalserum vorkommt. Eine anschließende, partielle Denaturierung des aus dem bindefähigen Protein gebildeten Proteinkomplexes dient zur Unterscheidung zwischen den beiden Arten von spezifischen Proteinen des Serums, da hierdurch Löslichkeitsunterschiede hervorgerufen werden.

Der Komplex aus B-Protein und radioaktiv markiertem, bindefähigem Protein kann durch Radioaktivitäts-Auszählverfahren nachgewiesen werden. Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert.

F i g. 1 zeigt den Zeitverlauf der an CoA-SPC gebundenen Radioaktivität für zwei CoA-SPC-Präparate;

F i g. 2 zeigt ein Muster für die Gelfiltration von CoA-SPC (-. —) mit Freisetzungsaktivität, von Protein ( ) und von gebundener Radioaktivität (—).

Substrate für den Coenzym A synthetisierenden Proteinkomplex sind L-Cystein, D-Pantothensäure und ATP oder deren Salze. Prinzipiell führt die nachstehende Reaktionsfolge zur Freisetzung des bindefähigen Proteins. Zu Beginn findet eine durch CoA-SPC katalysierte Reaktion zwischen der /?-Phosphorgruppe von ATP und der ^-Hydroxylgruppe von Pantothensäure statt, die zur Bildung von an CoA-SPC gebundener ADP-4-Pantothensäure führt. Die a-Aminogruppe von Cystein reagiert dann mit der Carboxylgruppe des Pantothensäure-Molekülteils. Während der Reaktion wird Cystein unter Bildung von an CoA-SPC gebundenem Dephospho-CoA decarboxyliert. Dephospho-CoA wird entweder phosphoryliert und als CoA freigesetzt oder hydrolysiert, wobei sich eine Verbindung bildet, von der angenommen wird, daß es sich um 4'-Phosphopantethein handelt, das an eine niedrigmolekulare Proteinkomponente des CoA-SPC gebunden ist, die sich dann unter Bildung des bindefähigen Proteins von dem Komplex abtrennt. Das Molekulargewicht des bindefähigen Proteins liegt im Bereich von 8000 bis 18 000 und am wahrscheinlichsten im Bereich von 10 000 bis 15 000 [Durchschnittsmolekulargewicht (Gewichtsmittel)].

Eine Funktion des CoA-SPC ist offensichtlich die Synthese von CoA, während eine andere Funktion mit der Synthese von Acyl-Trägerprotein im Zusammenhang steht. Es wird angenommen, daß das niedrigmolekulare Protein mit der an zweiter Stelle genannten Funktion des CoA-SPC in Beziehung steht. Bezüglich der B-Protein-Untersuchung stellt das niedrigmolekulare Protein das als bindefähiges Protein bezeichnete Produkt dar.

Die zwei nachstehend erläuterten Arbeitsweisen können angewendet werden, um das CoA-SPC für das erfindungsgemäße Verfahren herzustellen. Diese Verfahren beinhalten zunächst das Gefrieren und das anschließende Auftauen von Bäckerhefe. Die aufgetaute Hefe wird dann einer Bearbeitung (Bewegen oder Rühren) unterzogen, wodurch CoA-SPC fortschreitend aus seinen Zellstrukturbindungen freigesetzt wird. Das Rühren bzw. Bewegen kann durch übliche Verfahren wie mechanisches Rühren oder Hindurchblasen eines Inertgases wie Luft. COj oder N2 durch die aufgetaute Hefe vorgenommen werden. Es sind viele Variationen dieser grundlegenden Verfahrensweise möglich. Andere Verfahren zum Aufbrechen der Hefezellen, wie Mahlen.

Schallbehandlung oder Anwendung von Druck haben sich als erfolglos erwiesen.

Die nachstehend erläuterte Arbeitsweise wird von Bucovaz, E. T., Morrison, J. C, Morrison, W. C. und Whybrew, W. D. in »Assay for the Detection of a Protein Component in the Serum of Individuals with Cancer«, J.Tenn. Acad. of Sei. (1976) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe), beschrieben: Bäckerhefe wird zu feinen Teilchen zerkrümelt und gefroren. Das ίο Gefrieren kann beispielsweise 1 bis 6 Stunden lang und vorzugsweise 4 bis 6 Stunden lang in einem Kältegemisch aus 1,5 bis 2,51 Äther und 2,27 bis 3,18 kg CO₂ (Trockeneis) durchgeführt werden. Die Dauer und die Temperatur der Gefrierstufe sind nicht entscheidend. Im Handel erhältliche Bäckerhefe (Federal Brand und Fleischmann) wurden mit Erfolg angewendet. Die gefrorene Hefe wird unter Urngebungsbcdingungen auf Raumtemperatur auftauen gelassen. Wenn ein Gefriermedium wie das vorstehend genannte C02/Äther-Gemisch angewendet wird, sollten restlicher Äther und restliches CO2 entfernt werden, z. B. durch Vakuumbehandlung, um eine Denaturierung des Proteins zu vermieden. Die aufgetaute Hefe wird dann bewegt, z. B. durch Rühren, um CoA-SPC freizusetzen. Erwünschtenfalls kann ein Stabilisierungsmittel wie KCI oder ein ähnlich wirksames Salz zugegeben werden. Typischerweise werden bis zu 15 g KCl und vorzugsweise werden 1 bis 10 g KCl je 0,45 kg Bäckerhefe zu dem aufgetauten Bäckerhefe-Homogenat zugegeben. Typische Bäckerhefeproben haben ein Gewicht im Bereich von 0,45 bis 1,8 kg, vorzugsweise von 0,9 bis 1,36 kg, jedoch ist die Probenmenge nicht entscheidend. Die während der Bewegungsstufe angewendeten Bedingungen hängen von der Rührgeschwindigkeit ab und werden so ausgewählt, daß das CoA-SPC ohne begleitende Denaturierung des Enzyms und anderer Proteine in dem Bäckerhefe-Homogenat in wirksamer Weise freigesetzt wird. Typische Bedingungen bestehen darin, daß man 6 bis 25 S'unden, vorzugsweise 15 bis 20 Stunden, bei einer Temperatur von 0 bis 12°C, vorzugsweise von 0 bis 3°C, rührt. Nach dem Rühren wird die CoA-SPC enthaltende Flüssigkeit von den festen Bestandteilen in üblicher Weise abgetrennt, z. B. durch 10- bis 30minüliges Zentrifugieren mit 6000 bis 8000 xg. Anschließend kann die überstehende Flüssigkeit in üblicher Weise gereinigt werden. Beispielsweise kann die CoA-SPC enthaltende Flüssigkeit durch mehrere (z. B. 3 bis 6) Lagen von Seihtüchern hindurch dekantiert werden. Bei Anwendung dieser Arbeitsweise wurden aus einer Probe von Bäckerhefe (1.36 kg) im allgemeinen etwa 350 bis 375 ml einer rohen, CoA-SPC enthaltenden Proteinfraktion (CoA-SPC-Extrakt) erhalten. Der rohe Extraki wurde ein Jahr lang bei tiefen Temperaturen (etwa —90 bis -10O⁰C) gelagert, ohne daß er die Fähigkeit zur Synthese von CoA und zur Freisetzung des bindefähigen Proteins verlor.

Eine Modifikation der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise, die von Bucovaz, E. T., Morrison, J. C Morrison, W. C. und Whybrew, W. D. in »Protein-Protein Interaction Used as Assay for Detection of Abnormal Serum Protein of Patients with Cancer«, Third Internatiol Symposium on Detection and Prevention of Cancer, Proceedings (1976) (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe), beschrieben wird, wird bevorzugt. Sie ähnelt der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise, jedoch ist zusätzlich eine weitere Reinigung von CoA-SPC vorgesehen. Dieses modifizierte Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt:

Bäckerhefe wird wie vorstehend beschrieben zermahlen, gefroren und aufgetaut, jedoch wird vor der vorstehend beschriebenen Bewegungsstufe die aufgetaute Hefe einer Vorrührstufe unterzogen, bei der die vorstehend genannten Stabilisatoren ebenfalls eingemischt werden können. Diese Vorrührstufe ist vorgesehen, um endogene Substrate aus der Hefe zu entfernen und in die flüssige Phase zu überführen und nicht, um die Freisetzung von CoA-SPC in wesentlichen Mengen zu bewirken. Die Vorrührstufe hat deshalb eine wesentlich kürzere Dauer. Beispielsweise kann 1 bis 4 Stunden bei Temperaturen von etwa O bis 12°C gerührt werden. Die flüssige Phase wird dann entfernt, beispielsweise durch einen oder mehrere Zentrifugiervorgänge. Die feste Phase wird dann wieder in der wäßrigen Lösung suspendiert. Dabei kann beispielsweise ein Puffer A, der nachstehend definiert wird, eingesetzt werden.

Das erhaltene Gemisch wird dann gerührt, um das CoA-SPC freizusetzen, und anschließend wie bei der ersten Arbeitsweise behandelt. Diese zweite Rührstufe kann eine geringere Dauer haben als das einmalige Rühren der ersten Arbeitsweise, so kann beispielsweise 11 bis 13 Stunden lang gerührt werden. Es wurde festgestellt, daß der gereinigte Extrakt einer 97,3fachen Reinigung des CoA-SPC entspricht.

Die in dem erfindungsgemäßen Reagenz enthaltenen Substrate reagieren mit der aus Bäckerhefe extrahierten, CoA-SPC enthaltenden Proteinfraktion unter Erzeugung des bindefähigen Proteins. Die Substrate bestehen aus ATP oder einem Salz davon wie dem Dinatriumsalz, D-Pantothensäure oder einem Salz davon wie dem Halbcalciumsalz und L-Cystein oder einem Salz davon. Zur Beschleunigung der Reaktion kann das Gemisch aus dem Extrakt und den Substraten inkubiert werden. Das Verhältnis der Mengen der Bestandteile zueinander und der pH des Reagenz sind nicht entscheidend, sofern bindefähiges Protein erzeugt wird. Ein geeigneter pH-Bereich ist 6,2 bis 7,6. vorzugsweise 6,5 bis 7,2. Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagenz, von der festgestellt wurde, daß sie bei ihrer Anwendung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu befriedigenden Ergebnissen führt, enthält die folgenden Bestandteile:

0,01 bis 0,1 ml, vorzugsweise 0,04 bis 0,06 ml, CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt, 0,01 bis lOmMol, vorzugsweise 1,5 bis 5 mMol, ATP oder deren Salz, 0,01 bis 1,0 mMol, vorzugsweise 0,5 bis 0,6 mMol, D-Pantothensäure oder deren Salz und 0,01 bis 0,6 mMol, vorzugsweise 0,05 bis 0,15 mMol, L-Cystein oder deren Salz je 1 ml Reagenz, wobei der Rest Wasser ist.

Die Einstellung des pH-Wertes kann, soweit crforder lieh, durch Zugabe eines üblichen Puffers durchgeführt werden. Die Art des Puffers ist ebenfalls nicht entscheidend, solange die Erzeugung des bindefähigen Proteins nicht verhindert wird und der geeignete pH-Bereich eingehalten wird.

Zu geeigneten bekannten Puffern gehört eine Lösung von 0,01 bis 250 mMol Trisacetat, 0,01 bis 50 mMol Magnesiumacetat und 0,001 bis 125 mMol KCl (Puffer A) oder eine Lösung von 0,001 bis 250 mMol KH₂PO₄ und 0,01 bis 50 mMol Magnesiumacetat. Für den speziellen Ansatz des vorstehend genannten Reagenz können bis zu 0,8 ml, vorzugsweise 0,3 bis 0,5 ml, dieser Puffer je 1 ml Reagenz zugegeben werden.

Es wird ebenfalls bevorzugt daß alle Lösungen unter Verwendung von destilliertem oder entionisiertem Wasser hergestellt werden. Darüber hinaus kann ATP, da es sauer reagiert, dem Reagenz aus einer Vorratslösung des ATP oder ATP-Salzes zugeführt werden, die einen pH hat, der niedriger ist als der für das fertige Reagenz erforderliche pH und 7,1 bis 7,3, beispielsweise etwa 7,2, beträgt. Die Einstellung des pH kann durch Zugabe einer verträglichen Base wie KOH oder NaOH vorgenommen werden.

Mindestens eines der drei Substrate ist geeigneterweise markiert, damit das bindefähige Protein in der Reaktion leicht feststellbar ist. Typischerweise wird eine radioaktive Markierung angewendet. Eine geeignete Markierung kann z. B. durch Einmischen von [³⁵S]- oder [¹⁴C-U]-L-Cystein oder [¹⁴C]-D-Pantothensäure in das Reagenz erzielt werden. ATP kann ebenfalls, und zwar an seiner ]3-Phosphorgruppe, markiert werden.

Für die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden eine Serumprobe und das Reagenz zunächst miteinander vermischt, wobei die Reihenfolge der Vermischung nicht entscheidend ist. Die relativen Mengen von Reagenz und Serum zueinander sind nicht entscheidend, sollten jedoch so ausgewählt werden, daß der Komplex aus Serum-Protein und bindefähigem Protein erzeugt wird. Beispielsweise sind für den spezifischen, vorstehend beschriebenen Ansatz 0,1 bis 5,0 ml, vorzugsweise 0,5 bis 2,0 ml, Reagenz je 0,01 bis 0,30, vorzugsweise 0,04 bis 0,06 ml, der Serumprobe geeignet, wobei jedoch auch andere Mengenverhältnisse geeignet sind. Natürlich variiert das geeignete Verhältnis der Reagenzmenge zur Menge der Serumprobe in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit der Radioaktivitätsmessung, von der Art der Durchführung des Nachweises als solchem, z. B. davon, ob dieser automatisiert oder per Hand durchgeführt wird, von der spezifischen Zusammensetzung des Reagenz und von der spezifischen bei dem Nachweis selbst angewendeten Verfahrensweise, z. B. den speziell angewendeten Filtrationsverfahren.

Nach dem Vermischen des Reagenz und der Serumprobe wird das Gemisch reagieren gelassen, damit eine für die anschließende Messung ausreichende Menge des Komplexes aus Serum-Protein und B-Protein erzeugt wird. Die Reaktion kann in üblicher Weise unterstützt werden, beispielsweise durch Erhitzen (Inkubation). Die Inkubationsbedingungen werden so ausgewählt, daß eine geeignete Reaktion zur Bildung des Komplexes ohne Denaturierung der aktiven Bestandteile gefördert wird. Dabei ist natürlich eine unbegrenzte Veränderung der Kombination von Zeit und Temperatur möglich. Je niedriger die Temperatur^ ist, desto länger muß die Inkubationszeit sein, um diejenigen Mengen an bindefähigem Protein zu bilden, die äquivalent sind zu derjenigen Menge, die bei höheren Temperaturen gebildet wird und umgekehrt. Die Auswahl der Inkubationsbedingungen ist nicht entscheidend und wird unter Berücksichtigung von Faktoren wie der Zweckmäßigkeit, der Kosten, der Effizienz der Zeit und der Messungsempfindlichkeit usw. bestimmt. So können relativ niedrige Temperaturen angewendet werden, wenn entsprechend lange Inkubationszeiten zulässig sind. Typische Inkubationsbedingungen sind beispielsweise die Anwendung von Temperaturen von 0 bis 40⁰C, vorzugsweise 30 bis 37°C, während 1,5 bis 3,5 Stunden.

Sobald der Komplex aus Serum-Protein und bindefähigem Protein gebildet worden ist, wird eine partielle Denaturierung des Komplexes durchgeführt, damit der Komplex aus normalem Serum-Protein und bindefähigem Protein von dem Komplex aus B-Protein und

bindefähigem Protein unterschieden werden kann. Diese Denaturierung verändert diese beiden Komplexe in unterschiedlicher Weise, so daß der Komplex aus bindefähigem Protein und B-Protein beträchtlich mehr oder weniger, im allgemeinen mehr, denaturiert wird, als der Komplex aus bindefähigem Protein und Normalserum-Protein. Welcher Komplex stärker denaturiert wird, hängt in einem gewissen Ausmaß von dem angewendeten Denaturierungsverfahren ab. Im allgemeinen ist jedes bekannte Denaturierungsverfahren anwendbar. Beispielsweise kann eine Erhitzungsbehandlung angewendet werden und/oder es können ein chemisches Denaturierungsmittel wie Trichloressigsäure (TCA) und andere ähnliche bekannte Mittel zu der den Komplex aus bindefähigem Protein und Serum-Protein enthaltenden Lösung zugegeben werden. Natürlich sollten die Komplexe nur teilweise denaturiert werden, damit ein beträchtlicher Unterschied in den Mengen von denaturierten Komplexen (B-Protein/bindefähiges Protein gegenüber Normalprotein/bindefähigem Protein) existiert, der die Feststellung der Anwesenheit des B-Proteins ermöglicht. Dieser Unterschied in der Löslichkeit, d. h. den Denaturierungseigenschaften, kann auf feinen Unterschieden in der Konfiguration und der Ladung des B-Proteins beruhen, die durch Ort, Art und Ausmaß der Krankheitserscheinung beeinflußt sein können. Es scheint jedoch, daß dieser Einfluß relativ gering ist, wenn der Fortschritt der Erkrankung in direkter Beziehung zur Änderung der Ladung und der Konfiguration in diesem Protein steht, da bei einem sehr großen Anteil der untersuchten Krebspatienten 89 bis 87%, wie in den Beispielen gezeigt wird) ein feststellbarer Gehalt an Serum-B-Protein bei etwa den gleichen Löslichkeitseigenschaften feststellbar war, und zwar unabhängig vom Ausmaß, Typ oder Ort der Erkrankung.

Ein Typisches Denaturierungsverfahren entsprechend den vorstehend erläuterten Erfordernissen besteht darin, daß das inkubierte Gemisch aus Reagenz und Serumprobe auf eine Temperatur von etwa 65 bis 100°C, vorzugsweise 68 bis 70⁰C, 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 3 bis 6 Minuten lang, erhitzt wird. Die Anwendung derartig hoher Temperaturen dient auch zur Beendigung der Inkubationsreaktion. Nach dem Abkühlen des Gemisches, z. B. auf unter 3O⁰C, kann die Messung der Menge des denaturierten Proteins in diesem Zeitpunkt durchgeführt werden, wobei es jedoch wegen der großen Menge an endogenem Protein und anderem nicht als Proteinkomplex vorliegendem Protein, die zu Beginn denaturiert wurden, bevorzugt wird, in diesem Zeitpunkt zunächst das denaturierte Protein zu entfernen, z. B. durch Filtration oder Zeriiriiugieiin (z. B. 4 bis 6 Minuten mit 2000 bis 2300 Umdrehungen je Minute). Hierdurch wird der größte Teil des Hefeproteins als Niederschlag entfernt. Die überstehende Flüssigkeit oder das Filtrat enthält den radioaktiv markierten Komplex aus bindefähigem Protein und Normalprotein und den markierten Komplex aus bindefähigem Protein und B-Protein, wenn das Serum von einem Krebspatienten stammt, oder lediglich den markierten Komplex aus bindefähigem Protein und Normalprotein, wenn das Serum von einem nicht an Krebs erkrankten Patienten stammt.

Anschließend kann eine effektive Unterscheidung zwischen den beiden Komplexen durch zusätzliche partielle Denaturierung vorgenommen werden, z. B. durch Zugabe eines bekannten Denaturierungsmittels wie TCA oder Alkoholen. Beispielsweise können für den speziellen, vorstehend beschriebenen Ansatz 0,1 bis 5 ml, vorzugsweise 1 bis 2 ml, einer 1- bis 50%igen Lösung eines Denaturierungsmittels (z. B. TCA) je ml der überstehenden Flüssigkeit oder des Filtrates, vorzugsweise unter Rühren, hinzugegeben werden.

In dieser Stufe werden die beiden Komplexe in verschiedenem Ausmaß denaturiert. Die Endstufe der Untersuchung besteht in der Messung der Gesamtmenge des Komplexes, der denaturiert wurde. Ein Vergleich mit den Ergebnissen ähnlicher Untersuchungen mit Normal- und Krebs-Vergleichsserumproben, wie nachstehend beschrieben, ermöglicht die Bestimmung der Anwesenheit von Krebs. Zunächst wird der erhaltene Proteinniederschlag (denaturierte Proteinkomplexe) in üblicher Weise von dem noch in Lösung befindlichen, nicht denaturierten Anteil, beispielsweise durch Zentrifugieren oder vorzugsweise durch Filtration, abgetrennt. Zu geeigneten bekannten Filtern gehören Whatman-3 MM-Filterpapierscheiben und Millipore-Filter. Der Messung des denaturierten Proteins sollte eine übliche Waschung (z. B. 3 bis 5 Waschungen unter Verwendung von 2 bis 3 ml Wasser) und Trocknung (z. B. bei 80 bis 90⁰C während 10 bis 20 Minuten) des Niederschlages vorausgehen, wobei ein Überhitzen vermieden werden muß Die getrockneten Filterpapierscheiben werden dann zur Prüfung des Vorhandenseins von denaturiertem Komplex aus bindefähigem Protein und Serum-Protein in üblicher Weise analysiert.

Wenn beispielsweise das bindefähige Protein radioaktiv markiert ist, können die getrockneten Filter in Szintillationsflüssigkeitsampullen hineingebracht werden, und das Ausmaß der Radioaktivität kann durch Szintillationszählung gemessen werden. Ein Vergleich mit Kontrollwerten der Radioaktivität erlaubt die Bestimmung der Anwesenheit von B-Protein und von Krebs bei Patienten in folgender Weise.

Für jede Reihe zu testender, unbekannter Serumsproben werden zur Kontrolle vorbestimmte äquivalente Normalserum- und Krebsserum-Proben unter identischen Bedingungen untersucht. Typischerweise zeigt für den speziellen Ansatz und das vorstehend beschriebene Denaturierungsverfahren das Normalserum beispielsweise 200 bis 500 Zählungen/min. Das Krebsserum zeigt typischerweise beispielsweise 900 bis 1500 Zählungen/ min. Seren, bei denen die Zählungen innerhalb des niedrigeren Bereiches liegen, werden als normal betrachtet. Die Seren, bei denen die Zählungen in dem höheren Bereich liegen, werden als Krebsseren betrachtet. Wenn Zählungen in der Nähe der Grenzen der vorstehend erwähnten Bereiche liegen, sollten die betreffenden Untersuchungen wiederholt werden. Wenn keine exakte Bestimmung gemacht werden kann, ist das Serum als »nicht zuzuordnen« zu betrachten. Im allgemeinen liegen jedoch die Zählungen immer offensichtlich in dem hohen oder dem niedrigen Bereich, und es treten kaum Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von Normalserum- und Krebsserum-Proben auf. Variationen in der Radioaktivität des markierten Substrats beeinträchtigen die Untersuchungsgenauigkeit nicht, da sich jede Veränderung des Ausmaßes der Radioaktivität sowohl auf die Normalserum- als auch auf die Krebsserum-Kontrollproben auswirkt.

Unter Anwendung dieser Arbeitsweise sammelt sich beträchtlich weniger Radioaktivität und Protein auf den Filtern an, wenn kein B-Protein vorhanden ist, als wenn B-Protein vorliegt, was auf unterschiedlichen Wirkungen der spezifischen Denaturierungsbehandlungen auf Normal- und B-Protein beruht. Diese Wirkungen

verändern die Proteine in verschiedener Weise, so daß der Komplex aus bindefähigem Protein und B-Protein auf dem Filter in einem größeren Ausmaß vorliegt als der Komplex aus bindefähigem Protein und Normalprotein. Wie angenommen wird, beruht dies darauf, daß Normalprotein gegenüber dieser Denaturierung durch Erhitzung/TCA-Behandlung resistenter ist als B-Protein. Infolgedessen ist das B-Protein nach der Behandlung das weniger lösliche Protein, so daß eine größere Menge des Normalproteins durch das Filter hindurchgeht, während sich mehr B-Protien auf dem Filter ansammelt. Da etwa die gleiche Menge von radioaktiv markiertem, bindefähigem Protein mit dem Serum-Protein von Menschen reagiert, unabhängig davon, ob diese Krebs haben oder nicht, ist ein höheres Maß an Radioaktivität und Protein auf dem Filter feststellbar, wenn B-Protein in dem Serum vorhanden ist.

Die Serumproben werden aus dem Blut, das koagulieren gelassen wurde, abgetrennt und zentrifugiert, um zusammengeballte Zellen aus dem Serum abzutrennen. Eine typische Arbeitsweise wird in Beispiel 1 beschrieben. Das Serum sollte nicht intensiv hämolysiert werden, was durch eine dunkelrote Farbe angezeigt wird, weil die vorhandenen rotgefärbten Species durch Auslöschung der Radioaktivität stören. Lipämisches Serum stört jedoch nicht.

Wie vorstehend gezeigt wurde, können viele Modifikationen der erläuterten Untersuchungsverfahren angewendet werden. Beispielsweise werden nach der Inkubation des wie vorstehend beschrieben speziell angesetzten Reaktionsgemisches aus Reagenz und Serumprobe die vorstehend genannten geeigneten Mengen an Denaturierungsmitiel zur Durchführung einer ersten Denaturierungsbehandlung, die auch dazu dient, die Reaktion zu beenden, hinzugegeben. Das Gemisch wird anschließend einer Denaturierung durch Erhitzen, wie vorstehend beschrieben, unterzogen und anschließend gekühlt. Die Wasch- und Filtrationsvorgänge werden anschließend durchgeführt. Als Ergebnis dieser Umkehrung der Reihenfolge der Denaturierungsbehandlungen werden die feststellbaren Radioaktivitätswerte umgekehrt. Bei Serum von Krebspatienten wird ein niedrigerer Gehalt an Radioaktivität auf dem Filter festgestellt als bei Patienten ohne Krebs. Vergleiche mit Kontrollwerten, analog zu den vorstehend erwähnten, werden zur Durchführung der Untersuchung vorgenommen.

Bei einem weiteren, besonders bevorzugten, modifizierten Verfahren wird das Reagenz wie vorstehend beschrieben, jedoch ohne Zugabe der Serumprobe, inkubiert. Diese Arbeitsweise ermöglicht die Reaktion des CoA-SPC unter Bildung von CoA und des niedrigmolekularen Proteins. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird dann durch ein Filter oder eine Säule, die Moleküle im üblichen Molekulargewichtsbereich herausfiltern, hindurchlaufen gelassen. Der Bereich des Durchschnittsmolekulargewichts der herausgefilterten Moleküle sollte bei 20 000 bis 100 000, vorzugsweise 30 000 bis 50 000 liegen, damit das niedrigmolekulare, bindefähige Protein hindurchgeht. Das erhaltene Filtrat wird dann als Reagenz für die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in genau der gleichen Weise wie das vorstehend beschriebene Reagenz angewendet, jedoch mit dem Unterschied, daß bei den gleichen Temperaturen kürzere Reaktions-lnkubationszeiten angewendet werden.

Es ist auch möglich, dieses Fütrat aufeinanderfolgend fraktioniert lü filtrieren, um die geeignete Fraktion des bindefähigen Proteins, deren Molekulargewichtsbereich 8000 bis 18 000, vorzugsweise 10 000 bis 15 000, beträgt, zu isolieren. Dies kann beispielsweise in der Weise geschehen, daß man dieses Filtrat durch ein Filter gibt, das nur Substanzen mit Molekulargewichten unter 50 000 durchläßt. Das erhaltene Filtrat kann dann durch ein Filter gegeben werden, das nur Substanzen mit Molekulargewichten unter 1000 durchläßt. Das erhaltene, auf dem Filter gesammelte Material wird zur Reinigung des angestrebten bindefähigen Proteins gewaschen.

Die Eigenschaften des niedrigmolekularen, bindefähigen Proteins können wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Das bindefähige Protein reagiert mit B-Protein, das im Serum von Krebspatienten vorkommt, und mit Protein, das als Gegenstück des B-Proteins anzusehen ist und in Normalserum vorkommt.

2. Das bindefähige Protein wird im Verlaufe der Reaktion aus CoA-SPC freigesetzt.

3. Das bindefähige Protein hat ein Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 15 000.

4. Das bindefähige Protein ist, wie gezeigt wurde, eine Komponente von Bäckerhefe.

5. Das bindefähige Protein ist relativ wärmestabil bis zu Temperaturen von 70° C.

6. Es zeigte sich, daß das bindefähige Protein unter den Bedingungen der Untersuchung keine Bindung mit anderen Proteinen, sondern nur mit B-Protein einging. Die folgenden Proteine wurden bei der Untersuchung dieser Eigenschaft angewendet:

Albumin, Steapsin, Fruchtwasserproteine, Rückenmarkflüssigkeitsproteine, Muttermilch, Kuhmilch, α-Globulin (vom Menschen), Fibrin, Pepton, Histone, (HA, III, IV) Hämoglobin, RN-ase, Pyruvat, Kinase, Pepsin, Casein, Mehl aus den Samen von Canavaliaensiforrnis.Proteinhydrolysat (handelsüblich). Urease, Gramicidin, Ribosomalprotein und Fibrinogen.

7. Das bindefähige Protein weist 4'-Phosphopantheihein auf, das an seine Struktur gebunden ist.

Durch die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Überprüfungstest zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Krebs bei Patienten zur Verfügung gestellt, der eine Zuverlässigkeit von etwa 88% hat, wie aus den Angaben in den nachstehenden Beispielen hervorgeht.

Diese Beispiele zeigen auch, daß das Vorhandensein von anderen Erkrankungen und körperlichen Problemen keinen wesentlichen Einfluß auf die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens hat, denn es wurde im Fall von positiven Befunden bezüglich des Vorhandenseins von B-Protein keine höhere prozentuale Fehlerquote verzeichnet, wenn die Untersuchung an älteren Patienten mit mehr als einem körperlichen Problem oder mehr als einer Erkrankung durchgeführt wurde, woraus auch hervorgeht, daß das erfindungsgemäße Verfahren unabhängig vom Alter der Patienten wirksam ist.

Es ist gegenwärtig nicht bekannt in welcher Stufe des Krebswachstums B-Protein erstmalig im Serum von Krebspatienten nachgewiesen wird. Wie aus den Beispielen hervorgeht, scheint die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßer. Verfahren eine frühere Erkennung des Vorhandenseins von Krebs zu ermöglichen ate gegenwärtig möglich ist, wodurch die Chance zur

Heilung von Krebspatienten erheblich gesteigert wird.

Die Ergebnisse der Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren stehen, wie in den Tabellen 1 und 3 der Beispiele gezeigt wird, in Beziehung zu dem spezifischen Typ der Histologie jeder malignen Erscheinungsform. Diese Krebsarten wurden durch verechiedene Stufen (0 bis IV) der Krankheit und viele verschiedene Stellen des Auftretens charakterisiert Darüber hinaus traten sie bei Patienten mit und ohne Behandlung oder Metastasen auf. Die Ergebnisse zeigen in 87 bis 88% der Fälle eine positive Korrelation zwischen dem Nachweis von B-Protein und der klinischen Diagnose von maligner Erscheinungsform. In etwa 12% dieser untersuchten Fälle war der Befund bezüglich des Vorhandenseins von B-Protein fälschlicherweise negativ. Wie erwähnt, ist der Grund für den falschen negativen Befund nicht bekannt

Da in den Beispielen statistisch gesammelte Proben verwendet wurden, standen viele der in Frage kommenden Patienten für Nachuntersuchungen nicht zur Verfügung.

Es scheint daß der Nachweis von B-Protein sehr gut mit der medizinischen Diagnose von maligner Erscheinungsform bei folgenden getesteten Tumortypen übereinstimmt: Adenokarzinom, Schuppenzellen-Karzinom, Gliatumor, Lymphknotentumor, Leukämie, Tumor der endokrinen Drüsen und andere unbekannte Arten. Es gibt keine spezifischen Arten der getesteten Tumoren, die histologisch oder funktionell erkannt wurden und durch den Nachweis von B-Protein nicht diagnostiziert werden konnten.

Die Daten zeigen jedoch eine bessere Korrelation zwischen dem Nachweis von B-Protein und der Diagnose von Tumoren bei Tumoren mit innerem Ursprung wie Adenokarzinom, Gliatumor, malignen Erscheinungen bei endokrinen Drüsen, Lymphknotentumor und bei verborgenem Situs eines Primärtumors. Bei solchen Tumoren inneren Ursprunges sollte die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine zunehmend wichtige Rolle bei der Früherkennung von Krebs spielen. Außerdem sollte sich diese Untersuchung bei der routinemäßigen Anwendung körperlicher Untersuchungen, wenn keine symptomatische Indikation von Krebs vorliegt, sogar als wirksamer für die Früherkennung von Krebs erweisen, bevor übliche klinische Diagnoseverfahren aufgrund von Beschwerden oder einer Indikation von Seiten des Patienten, der unter Krankheitsverdacht steht, durchgeführt werden.

Die positiven Korrelationen nehmen bei Tumoren wie dem Schuppenzellenkarzinom des Gebärmutterhalses, Hauttumoren oder Leukämie ab. Glücklicherweise können diese drei malignen Erkrankungen klinisch in frühen Stufen durch Abstrich des Gebärmutterhalses, körperliche Untersuchung bei Hautkrebs bzw. Bluttest sowie Symptomatologie bei Leukämie diagnostiziert werden. In jeden Fall ist der Nachweis von B-Protein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auf alle getesteten Krebsarten anwendbar.

Ferner wurde jede getestete Tumorart in den Beispielen durch das gesamte Spektrum der Entwicklungsstufen der malignen Erscheinung repräsentiert. Es scheint keine Korrelation zwischen falschen negativen Befunden und verschiedenen Entwicklungsstufen des Krebses zu bestehen. Beispielsweise waren einige der Gebärmutterhals-Karzinome mit Stufe 0 positiv, und einige Patienten mit Stufe IV erbrachten negative B-Protein-Befunde. Die negativen Ergebnisse können davon abhängen, wie früh im Verlaufe der Erkrankung das B-Protein erscheint, oder das B-Protein kann möglicherweise im Verlauf der Bearbeitung einiger der Proben wieder zerstört worden sein.
5

Beispiel 1

Bevölkerungsgruppe der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren im nachstehenden Beispiel untersuchten

Patienten

1000 Patienten, männlich und weiblich, aus allen

sozialen Schichten wurden gemäß Beispiel 1 untersucht.

Die meisten der Patienten waren in der Altersgruppe zwischen 30 und 70. Einige Patienten waren jedoch erst 13 und andere 92 ] ahre alt.

Serum für die Untersuchung

Von jedem Patienten wurde Blut in Vakuumröhrchen entnommen, die mit einem roten Stöpsel verschlossen und siliconbeschichtet waren. Es wurde kein Antikoagulans hinzugegeben. Sich bildende Gerinnsel oder Klumpen wurden entfernt, und das Blut wurde zentrifugiert Nach dem Zentrifugieren wurde ein »Seraclear«-Stö,sel (Technicon) eingesetzt, um die zusammengeballten Zellen von dem Serum zu trennen. Serum, das intensiv hämolysiert war, wurde verworfen, und in diesem Fall wurde eine neue Probe entnommen. (Die durch Hämolyse bewirkte rote Farbe störte die Untersuchung durch Eliminieiung der Radioaktivitätsmessung.) Lipämisches Serum schien jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Ergebnisse der Untersuchung zu haben. Das Serum konnte bei — 20° C mehrere Wochen lang und bei tiefen Temperaturen (—100°C) noch länger gelagert werden. Normalserum- und Krebsserum-Kontroilproben wurden aus dem Serum einer Anzahl von Personen mit und ohne Krebs ausgewählt und angewendet, um den Bereich der Zählungen/min für sowohl Normalserum- als auch Krebssemm-Proben festzulegen.

Extraktion des Coenzym A synthetisierenden
Proteinkomplexes (CoA-SPC) aus Bäckerhefe

CoA-SPC wurde wie von Bucovaz u. a. beschrieben nach den vorstehend erläuterten Arbeitsweisen hergestellt 1,36 kg Bäckerhefe wurden zermahlen und dann 4 bis 6 Stunden lang in einem Äther/COj-Gemisch gefroren. Die gefrorene Hefe wurde auftauen gelassen, und restlicher Äther bzw. restliches CO2 wurden durch Vakuum entfernt. 15 g KCl wurden zu dem Homogenat zugegeben, und das Gemisch wurde bei 0 bis 4° C 17 Stunden lang gerührt. Nach dem Rühren wurde das Homogenat 20 Minuten mit 7700 xg zentrifugiert, und die überstehende Lösung wurde durch ein mehrfach gefaltetes Seihtuch dekantiert. Das Volumen des rohen Extraktes variierte je nach dem Wassergehalt der Hefe zwischen 350 und 375 ml. Der rohe Extrakt wurde bei tiefer Temperatur (-100⁰C) gelagert. Das in der beschriebenen Weise hergestellte CoA-SPC behielt die Fähigkeit zur Synthese von CoA und zur Freisetzung des bindefähigen Proteins mehrere Monate lang.

Arbeitsweise zum Nachweis von B-Protein

Das beschriebene Reagenz enthielt radioaktiv markiertes [³⁵S]-L-Cystein als Substrat. Auch [¹⁴C-U]-L Cystein oder [^l4C]-D-Pantothensäure wurde anstelle von [³⁵5]-L-Cystein als radioaktiv markiertes Substra eingesetzt.

Es wurde ein Reagenz mit folgenden Bestandteilet

verwendet: 2 mMol Dinatrium-ATP, pH 7,2; 0,5 ml Puffer A, pH 7,2 (enthaltend 0,05 Mol Trisacetat, pH 7,2; 0,01 Mol Magnesiumacetat; 0,02 Mol KCl); 0,5 mMol Halbcalciumsalz der D-Pantothensäure; 0,02 mMol [³⁵S]-L-Cystein (60 000 Zählungen/min); 0,05 ml des CoA-SPC enthaltenden Extraktes aus Bäckerhefe; Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml. Zu diesem Reagenz wurden 0,05 ml des zu testenden Serums hinzugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 36° C 2 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch 5minütiges Erhitzen der Röhrchen in einem Wasserbad auf 68 bis 70⁰C beendet. Die Röhrchen wurden dann auf Raumtemperatur gekühlt, worauf mit etwa 2200 Umdrehungen je Minute 5 Minuten lang in einer klinischen Zentrifuge (Modell CL International) zentrifugiert wurde. Durch diese Arbeitsweise wurde der größte Teil des Hefeproteins als Niederschlag entfernt. Die verbleibende überstehende Flüssigkeit enthielt im Fall der Reaktionsgemische, in die Normalserum gegeben worden war, den Komplex aus bindefähigem [³⁵S]-Protein und Normalprotein. Demgegenüber enthielt die überstehende Flüssigkeit im Fall der Reaktionsgemische, in die Serum von Krebspatienten gegeben worden war, sowohl den Komplex aus bindefähigem [³⁵S]-Protein und Normalprotein als auch den Komplex aus bindefähigem [³⁵S]-Protein und B-Protein. 2 ml 10%iges TCA wurden in jedes Röhrchen, das die überstehende Flüssigkeit enthielt, gegeben, und die Röhrchen wurden geschüttelt, um eine geeignete Vermischung des TCA sicherzustellen. Die erhaltenen Proteinniederschläge, die primär Serumprotein waren, wurden durch Filtration unter Verwendung einer Millipore-Filtervorrichtung und von Whatman Nr. 3 MM-Papierscheiben entfernt. Die auf den Papierscheiben gesammelten Niederschläge wurden viermal mit jeweils etwa 2 ml Wasser gewaschen. Die die Serumprotein-Niederschläge enthaltenden Papierscheiben wurden in einem Ofen unterhalb von 100⁰C getrocknet. Es wurden Vorsichtsmaßnahmen ergriffe«, um eine Verbrennung der Papierscheiben zu verhindern. Die getrockneten Papierscheiben wurden dann in Scintillationsampullen. die die von Hoskinson und Khorana (1965) beschriebene Scintillationsflüssigkci enthielten, hineingebracht, und die Radioaktivitätswerte wurden in einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Nuclear Chicago) gemessen.

Zusammen mit jeder Reihe getesteter, unbekannter Serumproben wurde zur Kontrolle eine Reihe vorbestimmter Normalserum- und Krebsserum-Proben untersucht. Das Normalserum zeigte beispielsweise 200 bis 500 Zählungen/min. Das Krebsserum zeigte beispielsweise 900 bis 1500 Zählungen/min. Die Seren, bei denen die Zählungen innerhalb des niedrigen Bereiches lagen, wurden als normal betrachtet. Die Seren, bei denen die Zählungen in dem höheren Bereich lagen, wurden als Krebsseren betrachtet Wenn Zählungen in der Nähe der Grenzen der vorstehend erwähnten Bereiche lagen, wurde der Versuch wiederholt Wenn keine exakte

ϊ Bestimmung gemacht werden konnte, wurde das Serum als »nicht zuzuordnen« bezeichnet Im allgemeiner; lagen jedoch die Zählungen offensichtlich in dem hohen oder in dem niedrigen Bereich, und es bestanden kaum Schwierigkeiten bei der Identifizierung von Normalserum-Proben einerseits und von Krebsserum-Proben andererseits.

Untersuchungsergebnisse

Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, wurde bei 322 der

■ ■> untersuchten Patienten klinisch Krebs festgestellt. Die in Tabelle 2 aufgeführten Patienten befanden sich dagegen aus verschiedenen anderen Gründen im Krankenhaus. Bei den untersuchten 322 Krebspatienten ergab die Prüfung auf B-Protein in 287 Fällen eine

-ii positive Reaktion, d. h. eine Obereinstimmung mit der klinischen Diagnose in 89% der Fälle. Etwa 11% der Patienten, bei denen klinisch Krebs festgestellt wurde, zeigten keinen feststellbaren Gehalt an B-Protein in ihrem Serum. Ein Anteil dieser 11% könnte auf einer

r> unrichtigen klinischen Diagnose beruhen. Die Diskrepanz, die ebenfalls bei dem nachstehenden Beispiel 2 vorliegt, kann durch vorläufige Versuchsergebnisse erklärt werden, die zeigen, daß in einigen Fällen das B-Protein während der Entnahme oder Lagerung der

in Serumprobe zerstört wurde.

Die Angaben von Tabelle 2 zeigen, daß 597 der 678 Patienten der Kontrollgruppe einen negativen B-Protein-Befund hatten, während 81 Patienten dieser Gruppe einen positiven B-Protein-Befund hauen. Somit

i'i ergab das e-findungsgemäße Verfahren bei 88% der Patienten dieser Testgruppe Befunde, die das Nichtvorhandensein von Krebs anzeigten. Diese Patienten wurden aus anderen Gründen behandelt, wie in Tabelle 2 gezeigt wird. Die Diagnose von 149 in Tabelle 2

κι aufgeführten Patienten wurde als unbekannt klassifiziert, jedoch ohne Verdacht auf Krebs. Einige der Patienten in dieser unbekannten Gruppe können Krebs gehabt haben, der wegen diagnostischer Schwierigkeiten nicht festgestellt wurde. Die mit »Verschiedenes«

->"> bezeichnete Kategorie enthielt 5 Patienten mit schweren Verbrennungen von 20% ihrer Körperoberfläche. Alle Patienten mit Verbrennungen hatten positive B-Protein-Werte.
Insgesamt entsprachen die Testergebnisse bei 116 der

'» 1000 Patienten nicht dem klinischen Befunde, während der Befund nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in 884 Fällen oder bei 88,4% der getesteten Patienten mit dem klinischen Befund in Übereinstimmung war.

Tabelle 1

Ergebnisse der B-Proteinuntersuchung bei Krebspatienten

Krebs	l'atienten-	Testergebnisse	negativ	Anteil der
Lokalisierung oder System")	zahl		2	positiven
		positiv	4	Befunde (%)
Kopf und Hals	27	25	11	92,59
Magen/Darm	37	33	3	89,19
Genital/Harnwege	107	96	89,72
Retikulum/Kndothcl	29	26	89,66

Fortsetzung

Krebs

Lokalisierung oder System")

Patientenzahl

Testergebnisse¹¹)
positiv negativ

Anteil der
positiven
Befunde (%)

Äußere Haut	9	7	2	77,78
Brust	45	35	10	77,78
Andere Krebsarten	8	7	1	87,50
Unbekannte Krebsart	34	33	1	97,60
Atmungswege	26	25	1	96,15
Insgesamt	322	287	35	89,13

^h) Vom Arzt oder aus medizinischen Untersuchungsergebnissen erhaltene Information. '^b) Ein positives Testergebnis zeigt das Vorhandensein von Krebs an; ein hegatives Testergebnis zeigt das NichtVorhandensein von Krebs an.

Tabelle 2

Ergebnisse der B-Proteinuntersuchung bei PatienteD in der Kontrollgruppe

Patient bzw.	Patienten	Testergebnisseb)	negativ	Anteil der
Art der Krankheit8)	zahl		27	negativen
		positiv	75	Befunde (%)
Cardiovascular	28	1	18	96,43
Orthopädisch	81	6	214	92,59
Gynäkologisch	19	1	47	94,74
Entbindung	246	32	40	86,99
Chirurgisch	50	3	28	94,00
Innere Krankheiten	42	2	22	95,24
Neurologisch	32	4	126	87,75
Verschiedenes	31	9	597	70,97
Unbekannt	149	23	84,56
Insgesamt	678	81	88,05

^a) Vom Arzt oder aus medizinischen Untersuchungsergebnissen erhaltene Information.

^b) Ein positives Testergebnis zeigt das Vorhandensein von Krebs an; ein negatives Testergebnis zeigt das Nichtvorhandensein von Krebs an.

H| Beispiel 2

Bevölkerungsgruppe der Patienten

ι 2005 Patienten wurden in diesem Beispiel umfaßt. Die

¹ meisten Patienten waren in der Altersgruppe zwischen

I 25 und 65 Jahren. Von den 2005 untersuchten Patienten

f wurde bei 586 klinisch Krebs festgestellt, und 1419

: '< wurden aus anderen Gründen behandelt. Es wurden

ifr Daten zur Registrierung von Tumor erhalten, indem

i'_f eine zufällige Probeentnahme bei den Krebspatienten

durchgeführt wurde.

ι Die in Beispiel 1 angewandten Verfahrensweisen

ί wurden mit den folgenden Unterschieden wiederholt:

Extraktion desCoenzym A synthetisierenden
Proteinkomplexes (CoA-SPC) aus Bäckerhefe

Das CoA-SPC wurde durch durch das vorstehend erwähnte Verfahren (Bucovaz u. a.; modifizierte Arbeitsweise) hergestellt. 1,36 kg Bäckerhefe wurden zerbröckelt und 4 bis 6 Stunden lang in einer Äther-CC>2-Mischung gefroren. Die gefrorene Hefe wurde auftauen gelassen, und der restliche Äther und das CO2 wurden unter Vakuum entfernt. 15 g KCl wurden zu dem Homogenat hinzugegeben, und die erhaltene Mischung wurde bei 0 bis 4°C 3 Stunden lang gerührt. Durch dieses anfängliche Rühren wurden endogene Substrate aus dem CoA-SPC entfernt. 30 ml des Homogenats wurden in einen anderen Kolben umgefüllt und weitere 12 Stunden lang gerührt. Dieser Anteil des Homogenats wurde nur als Basis zur Bestimmung des Reinheitsgrades des CoA-SPC verwendet. Der Rest des Homogenats wurde mit 7700 xg 20 Minuten lang zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Ein Volumen einer 1 :10-Vcrdünnung von Puffer A (beschrieben unter »Nachweis von B-Protein«), das dem Volumen der verworfenen überstehenden Flüssigkeit gleichkam, wurde zu den in den Zentrifugengläsern befindlichen Pellets des Niederschlags hinzugegeben. Diese Pellets wurde wieder suspendiert und zentrifugiert, und die

überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Die Zugabe von Puffer A wurde wiederholt, und die Pellets wurde wieder suspendiert und vereinigt Das Rühren des wieder suspendierten Pelletmaterials wurde weitere 12 Stunden lang fortgesetzt Während dieses Rührverfahrens wurde das CoA-SPC fortscnreitend aus seinen Zellstrukturbindungen freigesetzt

Untersuchungsergebnisse

Wie Ir. Tabelle 3 gezeigt wird, wurde bei 586 der untersuchten Patienten klinisch Krebs festgestellt Die in Tabelle 4 aufgeführten Patienten befanden sich dagegen aus verschiedenen anderen Gründen im Krankenhaus. Bei 510 der durch diese Untersuchung umfaßten 586 Krebspatienten ergab die Prüfung auf B-Protein eine positive Reaktion, d. h. eine Übereinstimmung mit der klinischen Diagnose in 87% der Fälle. Annähernd 13% der Krebspatienten, bei denen die Krankheit klinisch diagnostiziert worden war, zeigten bei der Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren keinen nachweisbaren Gehalt an B-Protein in ihrem Serum. Die Daten der Tabelle 4 zeigen, daß 1306 der 1419 Patienten, bei denen klinisch kein Krebs festgestellt wurde, einen negativen B-Protein-Befund hatten, während 113 Patienten aus dieser Gruppe einen positiven B-Protein-Befund hatten. In dieser Gruppe befanden sich 50 starke Raucher, von denen keiner einen positiven Gehalt an B-Protein zeigte. Somit ergaben 92% der Patienten der in Tabelle 4 gezeigten Testgruppe Befunde, die die Abwesenheit von Krebs anzeigen. Nur Seren von Patienten, bei denen schwere Verbrennungen (über 20% ihrer Körperfläche) behandelt wurden, und Seren von Frauen während des dritten Schwangerschaftstrimesters ergaben ein ungewöhnlich hohes, positives Testergebnis, obwohl klinisch kein Krebs festgestellt wurde.

Insgesamt waren die Testergebnisse bei 189 der 2005 Patienten nicht in Übereinstimmung mit dem klinischen Befund, während der Befund nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in 1816 Fällen oder bei 90% der getesteten Patienten mit dem klinischen Befund in Übereinstimmung war.

Tabelle 3

Ergebnisse der Untersuchung bei Krebspatienten

Krebs	Patien	Tejtergebnisseb)	negativ
Lokalisierung	tenzahl		14
oder System")		positiv	1
Brust	69	55	7
Endokrine Drüsen	10	9	20
Magen/Darm	91	84	10
Genital/Harnwege	162	142	1
Haut	64	54	2
Verschiedene Krebsarten	9	8	4
Nerven	5	3	13
Atmungswege	47	43	4
Retikulum/Endothel	72	59	76
Unbekannte Krebsart	57	53
Insgesamt	586	510

°) Vom Arzt oder aus medizinischen Untersuchungsergebnissen erhaltene Information.

^b) Ein positives Testergebnis zeigt das Vorhandensein von Krebs an; ein negatives Testergebnis zeigt das Nichtvorhandensein von Krebs an.

Tabelle 4

Ergebnisse der B-Protein-Untersuchung bei Patienten der Kontrollgruppe

Patienten	Patien	Testergebnisse11)	negativ
	tenzahl		77
Typ")		positiv	50
Cardiovascular	79	2
Gynäkologisch	52	2	52
Entbindung			246
Geburt	63	11	183
Schwangerschaft	279	33	126
Orthopädisch	192	9
Heilbehandlung	130	4	1
Verschiedene Krankheiten			44
Verbrennungen	5	4	263
Sonstige Krankheiten	49	5	57
Unbekannte Krankheiten	291	28	157
Neurologisch	62	5	1306
Chirurgisch	167	10
Gesamtzahl	1419	113

^a) Vom Arzt oder aus medizinischen Reporten erhaltene Information.

^b) Ein positives Testergebnis zeigt das Vorhandensein von Krebs an; ein negatives Testergebnis zeigt das Nichtvorhandensein von Krebs an.

Es könnte angenommen weden, daß das Alter bei der Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einen größeren Einfluß hat, weil mit zunehmendem Alter eines Patienten die Wahrscheinlichkeit zunimmt, daß der Patient andere Krankheiten und körperliche Probleme aufweist, die die Untersuchung beeinflussen könnten. Wie die Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 zeigen, wird dies im vorliegenden Fall nicht bestätigt. Wie in Tabelle 2 und 4 gezeigt wird, haben andere Krankheiten und andere körperliche Probleme keinen wesentlichen Einfluß auf die Ergebnisse der Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Gegenwärtig gibt es nur unzureichende Informationen hinsichtlich der Bestimmung der Entwicklungsstufe des Krebses, die zur Bildung des B-Proteins führt. Einige Krebspatienten scheinen in ihrem Serum ein höheres Verhältnis von B-Protein zu Normalprotein aufzuweisen als andere Krebspatienten. Es gibt einige Anzeichen dafür, daß die Bildung von B-Protein während der frühen Entwicklungsstufe des Krebses stattfinden kann. Von den untersuchten Krebspatienten hatten einige sehr frühe Anzeichen von abnormalen Änderungen in der Zellstruktur, während bei anderen Krebspatienten der Krebs in einem fortgeschritteneren Entwicklungsstadium war. Bei den meisten untersuchten Krebspatienten waren jedoch die morphologischen Änderungen in den Geweben in einem solchen Ausmaß offensichtlich, daß Krebs diagnostiz-ert oder vor der Untersuchung des Serums befürchtet worden war. Es ist unwahrscheinlich, daß sich ein Krebs bis zum Anfangsstadium des Auftretens von Metastasen entwickelt haben muß, bevor ein Nachweis durch die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist. Falls das Anfangsstadium des Auftretens von Metastasen erreicht sein muß, muß in einigen Fällen ein früherer Beginn der Metastasenbildung im krebsartigen Gewebe angenommen werden als bisher. Auf jedem Fall scheint

es festzustehen, daß der Nachweis von B-Protein eine frühere Diagnostizierung der meisten Krebsarten mit innerem Ursprung ermöglichen kann als bisher möglich war.

Beispiel 3

Die folgenden Verfahren wurden sowohl zur Kennzeichnung der Art der Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als auch zur Sicherstellung ihrer Wirksamkeit und Zuverlässigkeit durchgeführt.

Ermittlung der CoA-SPC-Freisetzungsaktivität

Die Zusammensetzung des Reagenz, das zur Ermittlung der CoA-SPC-Freisetzungsaktivität des bindefähigen Proteins eingesetzt wurde, war die gleiche, wie sie vorstehend unter »Arbeitsweise zum Nachweis von B-Protein« beschrieben ist. Das Serum wurde nicht hinzugegeben. 20 ml des Reagenz wurden bei 36°C inkubiert. Proben für die Untersuchung wurden in Zeitabständen von 30 Minuten während einer 150minütigen Inkubationsperiode entnommen. Die Bestimmung der Reaktion jeder zur Untersuchung entfernten Probe wurde durch Zugabe von 2 ml 10%igem TCA und 5minütiges Erhitzen der Probe auf 95⁰C durchgeführt. Die Röhrchen wurden dann in einem Eisbad abgekühlt, und die erhaltenen Niederschläge wurden durch Filtration unter Anwendung einer Millipore-Filtervorrichtung und von MM-Papierscheiben (Whatman Nr. 3) gewonnen. Die auf den Papierscheiben gesammelten Niederschläge wurde wurde viermal mit jeweils etwa 2 ml Wasser gewaschen. Die Papierscheiben wurden in einem Ofen unterhalb von 100°C getrocknet und danach in Scintiliationsampuüen zur Radioaktivitätsbestimmung hineingegeben.

Im Anschluß an die 150minütige Inkubationsperiode wurde eine weitere Probe aus dem Reaktionsgefäß entnommen, auf eine Säule mit Sephadex G-200 aufgegeben und mit Puffer A mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml je Minute eluiert.

Proteinbestimmung

Die Proteinkonzentration wurde durch das von Lowry u.a. in J. Biol. Chem., 193. 265-275 (1951). beschriebene Verfahren bestimmt.

Gelfiltration

Annähernd 40 g grobes Sephadex G-200 (Pharmacia) wurden 4 Tage lang im Puffer A ins Gleichgewicht gebracht. Eine Säule (2,5 χ 60 cm) wurde mit dem Material gefüllt, und das Material wurde 2 Tage lang absitzen geiabicn. Die Säule wurde bei 0 4°C gehalten.. Das CoA-SPC wurde unter Verwendung von Puffer A mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml je Minute eluiert.

Beweise für die Protein-Protein-Umsetzung
bzw.-Bindung

100 ml eines Reagenz mit der gleichen Konzentration von Bestandteilen wie das unter »Arbeitsweise zum Nachweis von B-Protein« beschriebene Reagenz. jedoch ohne Serum, wurden 2 Stunden lang bei 36⁼C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Inkubationsgemisch in zwei gleiche Teile geteilt. Eine Hälfte des Inkubationsgemisches wurde unter Verwendung von Amicon-Centriflo-Kegeln mit einem Ausfilterungsvermngen für Moleküle mit einem Molekulargewicht über 000 filtriert. Die andere Hälfte des Inkubationsgemisches wurde unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationsmembran UM-2 mit einem Ausfilterungsvermögen für Moleküle mit einem Molekulargewicht über 1000 filtriert.

Jedes Filtrat wurde einzeln bei der B-Proteinuntersuchung getestet, indem man 1 ml des Filtrats zu jedem Röhrchen einer Reihe mit einem Gehalt des zu bestimmenden Serums hinzufügt. Die Mischungen wurden danach bei 36°C 30 Minuten lang inkubiert.

ίο Nach der Inkubation wurde die Reaktion durch 5minütiges Erhitzen der Röhrchen auf 68 bis 70°C beendet. Die übrige Verfahrensweise folgte der unter »Arbeitsweise zum Nachweis von B-Protein« beschriebenen Verfahrensweise. Für das CoA-SPC, das beim Nachweis von B-Protein eine Funktion haben soll, stützen die experimentellen Daten die Behauptung, daß das CoA-SPC eine Freisetzungsaktivität für niedermolekulares Protein (bindefähiges Protein) besitzen muß. Ein Beweis für die Protein-Protein-Umsetzung zwisehen dem bindefähigen Protein und entweder dem B-Protein oder seinem Gegenstück, dem Normalserum, ist weitgehend nahegelegt, jedoch nicht endgültig. Alle bisher zusammengetragenen Beweise stützen jedoch die Annahme einer Protein-Protein-Umsetzung.

Jedes Filtrat wurde einzeln zu einer zweiten Reihe von Röhrchen mit einem Gehalt des zu bestimmenden Serums hinzugegeben. Ferner wurden zu diesen Reaktionsmischungen einzeln 0,20 mMol L-Cystein, D-Pantothensäure, ATP, CoA, Dephospho-CoA, Pantethein und 4'-Phosphopantethein als mögliche Inhibitoren der Reaktion hinzugegeben.

Der annähernd fünffache Überschuß von L-Cystein, D-Pantothensäure, ATP, CoA, Dephospho-CoA, Pantethein und 4'-Phosphopantethein störte bei Zugabe zu dem Reaktionsmedium den Nachweis von B-Protein nicht. Dieses Ergebnis würde erwartet werden, falls der Nachweis von B-Protein auf einer Protein-Protein-Umsetzung zwischen dem B-Protein des Serums und dem radioaktiv markierten, bindefähigen Protein beruht.

Falls weiteres radioaktiv markiertes 4'-P-Pantethein aus dem bindefähigem Protein der Hefe in das B-Protein überführt würde, könnte erwartet werden, daß die unmarkierten Komponenten, die zu der Reaktionsmischung hinzugefügt wurden, den Nachweis von B-Protein stören würden.

Ein zusätzlicher Beweis zur Stützung der Annahme, daß das bindefähige Protein das funktionelle Produkt von CoA-SPC beim Nachweis von B-Protein ist, wurde dadurch geliefert, daß man die andere Hälfte des Inkubationsgemisches durch eine Amicon-UM-2-Membran (Ausfilterungsvermögen für Moleküle mit einem Molekulargewicht von 1000) filtriert. Diese Filtration ermöglicht den Durchgang von nur niedrigmolekularen Komponenten des Inkubationsgemisches in das Filtrat.

In diesem Falle war das Filtrat, das kein radioaktiv markiertes, bindefähiges Protein enthielt, beim Nachweis von B-Protein nicht wirksam.

Molekulargewichtsbestimmung

Die mit Sephadex G-200 gefüllte Säule, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, wurde angewendet. Das gesamte Bettvolumen, das innere Gelvolumen, das Gelvolumen und das Porenvolumen der Säule wurden bestimmt. Eine Eichkurve (Andrew, Bic-chem. J, 91,222 - 223 [1964]) wurde zur Bestimmung des Molekulargewichts des Komplexes, des bindefähigen Proteins, des B-Proteins und des spezifischen Proteins von normalem Serum, das mit dem bindefähi-

gen Protein reagiert, verwendet. Die Eichkurve wurde erhalten, indem man eine Mischung von Glutathion (Sigma Chemical), Rinderserumalbumin (Sigma Chemical), «-Chymotrypsin der Rinderbauchspeicheldrüse (Sigma Chemical) und Rinderribonuclease (Sigma Chemical) chromatografierte.

Inhibierung der CoA-SPC-Aktivität

Die Inhibierung der CoA-SPC-Aktivität wurde bestimmt, wie es unter »Ermittlung der CoA-SPC-Freisetzungsaktivität« beschrieben ist, wobei jedoch die Inkubationszeit eine Stunde betrug und 0,20 mMol CoA, Dephospho-CoA, Pantethein und 4'-Phosphopantethein einzeln zu den Reaktionsmischungen hinzugesetzt wurden.

Ergebnisse

Nicht alle Präparate von CoA-SPC setzen bindefähiges Protein frei, das für die Funktion des Nachweises von B-Protein benötigt wird. Somit wurde jedes neue Präparat von CoA-SPC in der folgenden Weise getestet, um zu bestimmen, ob Freisetzungsaktivität des bindefähigen Proteins vorhanden war.

Profil von CoA-SPC mit funktioneller
Freisetzungsaktivität

Der Zeitverlauf der an CoA-SPC gebundenen Aktivität wird in Fig. 1 gezeigt. Bei ,dieser Untersuchung wurde [³⁵S]-L-Cystein als radioaktiv markiertes Substrat verwendet. Die experimentelle Verfahrensweise war die gleiche, wie die unter »Ermittlung der CoA-SPC-Freisetzungsaktivität« beschriebene. Wie in F i g. 1 gezeigt wird, wurde eine 5- bis 6minütige Verzögerung beobachtet, bevor eine meßbare Menge der Protein-gebundenen Aktivität, die eine Dephospho-CoA-Bildung anzeigt, nachgewiesen wurde. Dieser Verzögerungsperiode folgte ein linearer Anstieg, an den sich dann eine Abflachungsperiode anschloß. Bei der Mehrzahl der CoA-SPC-Präparate, bei denen eine Freisetzungsaktivität funktionell war, wurde während der zweiten Inkubationsstunde eine erhebliche Abnahme im Gehalt der gebundenen Aktivität beobachtet (gestrichelte Linie von Fig. 1). Bei einigen Präparaten von CoA-SPC, die Freisetzungsaktivität verloren haben, wurde der Plateaubereich der Kurve während der zweiten Inkubationsstunde (ausgezogene Linie von Fig. 1) beibehalten. Diese beiden Muster wurden ebenso erhalten, als in dem Versuch [¹⁴C]-D-Pantothensäure oder [¹⁴C]-ATP anstelle von [³⁵S]-L-Cystein als radioaktiv markiertes Substrat verwendet wurden.

Nach der 150minütigen Inkubationsperiode wurde eine andere Probe des Inkubationsgemiscnes aus dem Reaktionsgefäß entfernt und auf eine Säule mit Sephadex G-200 aufgegeben.

Gel-Filtration

Das Sephadex-G-200-Elutionsmuster einer Reaktionsmischung, bei der CoA-SPC mit Freisetzungsaktivität verwendet wurde, wird in Fig.2 gezeigt Die gesammelten Säulenfraktionen wurden nach dem Verfahren von Lowry u. a. auf Protein und im Hinblick auf die Radioaktivität untersucht. Wie gezeigt wird, wurden bei den aus der Säule eluierten Fraktionen zwei Radioaktivitätspeaks erhalten. Ein Anteil, der den Hauptanteil des Proteins und der Radioaktivität enthielt, wurde in den Fraktionen 33 bis 100 eluiert. Der zweite Anteil der Radioaktivität war an ein Protein mit niedrigem Molekulargewicht (Fraktionen 106—160) gebunden.

Unter Anwendung des von Andrew beschriebenen Verfahrens wurde festgestellt, daß die höhermolekulare

to Komponente, die das CoA-SPC darstellte, ein abgeschätztes Molekulargewicht von mehr als 200 000 hatte und daß das niedermolekulare Protein (bindefähige Protein) ein abgeschätztes Molekulargewicht von 10 000-15 000hatte.

Ein ähnliches Elutionsmuster wie in Fig.2 wurde jedesmal erhalten, wenn [^uC]-D-Pantothensäure oder [³⁵S]-L-Cystein das radioaktive Substrat in dem Versuch war. Die CoA-SPC-Präparate, die keinen Anstieg der Radioaktivität während der zweiten Inkubationsstunde (F i g. 1) zeigten, zeigten auch, daß kein bindefähiges, aus CoA-SPC freigesetztes Protein vorhanden war (F i g. 2). Nur CoA-SPC-Präparate, die eine Freisetzungsaktivität für das bindefähige Protein aufwiesen, hatten bei der B-Proteinbestimmung eine Funktion.

Einfluß der Reaktionsprodukte und verwandter
Verbindungen auf die CoA-SPC-Aktivität

Die Reaktionsprodukte und Verbindungen mit verwandten Strukturen wurden als Inhibitoren für die Bildung des an CoA-SPC gebundenen Dephospho-CoA getestet, wie es unter »Inhibierung der CoA-SPC-Aktivität« beschrieben ist. CoA, Dephospho-CoA, Pantethein und 4'-Phosphopantethein inhibierten bei einer Konzentration von 0,20 mMol die CoA-SPC-Aktivität zu wenigstens 90%.

Einfluß der Reaktionskomponenten und der
Produkte auf die B-Proteinermittlung

Das unter »Beleg für die Protein-Protein-Umsetzung« beschriebene Verfahren wurde durchgeführt. Das radioaktiv markierte, bindefähige Protein und andere niedermolekulare Komponenten wurden in dem erhaltenen Filtrat gesammelt, indem man eine Reaktionsmischung unter Anwendung von Amicon-Centriflokegeln mit einem Ausfilterungsvermögen für Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 000 filtrierte. Ein weiteres Filtrat, das kein bindefähiges, Protein, jedoch Reaktionskomponenten mit einem Molekulargewicht von 1000 oder weniger enthielt, wurde erhalten, indem man eine Reaktionsmischung unter Anwendung einer Amicon-Ultrafiltrationsmembran UM-2 filtrierte. Nur das Filtrat mit einem Gehalt des radioaktiv markierten, bindefähigen Proteins lieferte bei Zugabe zu einer Reihe von Röhrchen mit dem zu bestimmenden Serum eine funktionell B-Proteinermittlung.

Die Zugabe von 0,02 mMol L-Cystein, D-Pantothensäure, ATF, CoA, Dephospho-CoA, Pantethein und 4'-Pantethein zu Untersuchungsmischungen, die das Filtrat enthielten, das ein radioaktiv markiertes, bindefähiges Protein aufwies, störte den Nachweis von B-Protein nicht.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (13)

Patentansprüche.

1. Verfahren zum Nachweis eines im Serum von Krebspatienten vorkommenden, spezifischen Proteins durch Zugabe eines bindefähigen Proteins zu einer Serumprobe, dadurch gekennzeichnet, daß als bindefähiges Protein ein solches verwendet wird, das durch Einwirkung einer aus Bäckerhefe extrahierten, einen Coenzym A synthetisierenden Proteinkomplex (CoA-SPC) enthaltenden Proteinfraktion auf die drei Substrate ATP oder dessen Salz, D-Pantothensäure oder deren Salz und L-Cystein oder dessen Salz gewonnen wird.

2. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine aus Bäckerhefe extrahierte, einen Coenzym A synthetisierenden Proteinkomplex enthaltende Protebfraktioii und die Substrate ATP oder deren Salz, D-Pantothensäure oder deren Salz und L-Cystein oder dessen Salz enthält oder ein Filtrat des Inkubationsgemisches aus dem Extrakt und den Substraten enthält.

3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es einen pH von 6,2 bis 7,6 besitzt.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Substrate radioaktiv markiert ist.

5. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Puffer in einer zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes wirksamen Menge enthält.

6. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,01 bis 10 mMol ATP oder dessen Salz, 0,01 bis 1,OmMoI D-Pantothensäure oder deren Salz und 0,01 bis 0,6 mMol L-Cystein oder deren Salz je ml Reagenz enthält.

7. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,01 bis 0,1 ml des Extraktes und bis zu 0,8 ml des Puffers je ml Reagenz enthält.

8. Reagenz nach einem der Ansprüche 4 bis 7. dadurch gekennzeichnet, daß es als radioaktives Substrat [³⁵S]- oder ['⁴C-U]-L-Cystein oder ['⁴C]-D-Pantothensäure enthält.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es pro ml Lösung 0,04 bis 0,06 ml CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt, 1,5 bis 5 mMol ATP oder ein Salz davon, 0,5 bis 0,6 mMol D-Pantothensäure oder ein Salz davon, 0,05 bis 0,15 mMol L-Cystein oder ein Salz davon und bis zu 0,8 ml eines Puffers, der den pH des Reagenz im Bereich von 6,5 bis 7,2 hält, und als Rest destilliertes Wasser enthält, wobei das L-Cystein in radioaktiver [³⁵S]- oder [¹⁴C-U]-Form und/oder die D-Pantothensäure in radioaktiver [¹⁴C]-Form vorliegt.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ATP als Dinatriumsalz und D-Pantothensäure als Halbcalciumsalz vorliegt und ein Puffer vorhanden ist, bestehend aus 0,001 bis 25 mMol Trisacetat, 0,01 bis 50 mMol Magnesiumacetat und 0,001 bis 250 mMol KCl.

11. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer Fraktion einer Lösung vorliegt, wobei die Fraktion ein Molekulargewicht von 8000 bis 18 000, vorzugsweise von 10 000 bis 15 000, besitzt.

12. Reagenz in Form eines Filtrates nach einem

der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es erhalten wurde durch Filtration einer inkubierten Lösung, enthaltend pro ml Lösung 0,01 bis 0,1 ml CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt, 0,01 bis 10 mMol ATP oder dessen Salz, 0,01 bis 1,0 mMol D-Pantothensäure oder deren Salz, 0,01 bis 0,6 mMol L-Cystein oder dessen Salz und bis zu 0,8 ml eines Puffers, der den pH der Lösung im Bereich von 6,5 bis 7,2 hält, und als Rest destilliertes Wasser, wobei das L-Cystein in radioaktiver [³⁵S]- oder [¹⁴C-U]-Form bzw. die D-Pantothensäure in radioaktiver [¹⁴C]-Form vorliegen und wobei die Lösung vor der Filtration 1,5 bis 3,5 Stunden bei einer Temperatur von 0 bis 4O⁰C inkubiert wurde, durch ein Filter, das Moleküle in einem Molekulargewichtsbereich von 20 000 bis 100 000 herausfiltert.

13. Reagenz in Form eines Filtrates nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es erhalten wurde durch Filtration einer inkubierten Lösung, enthaltend pro 1 ml Lösung 0,04 bis 0,06 ml CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt, 1,5 bis 5 mMol ATP oder dessen Salz, 0,5 bis 0,6 mMol D-Pantothensäure oder deren Salz, 0,05 bis 0,15 mMol L-Cystein oder dessen Salz und bis zu 0,8 ml eines Puffers, der den pH der Lösung im Bereich von 6,5 bis 7,2 hält, und als Rest destilliertes Wasser, wobei die Lösung vor der Filtration 1,5 bis 3,5 Stunden bei einer Temperatur von 0 bis 40° C inkubiert wurde, durch e^;n Filter, das Moleküle in einem Molekulargewichtsbereich zwischen 20 000 und 100 000 herausfiltert.