DE2333740C2

DE2333740C2 - Verwendung eines Hämagglutinations-Hemmverfahrens zur Ermittlung von Krebs

Info

Publication number: DE2333740C2
Application number: DE2333740A
Authority: DE
Inventors: Knut Dr.med. Bromma Bertil
Original assignee: Aktiebolaget Bonnierföretagen, Stockholm
Priority date: 1972-07-10
Filing date: 1973-07-03
Publication date: 1987-01-22
Also published as: SE440597B; ZA734632B; BE802126A; SE440697B; JPS5817168B2; ATA600773A; IT1009527B; BR7305142D0; DE2366609C2; IL42594A0; SU581842A3; NO146338C; NO146338B; CA1039650A; DD113918A5; DE2333740A1; NL7309257A; IL42594A; JPS6018011B2; FI60567B

Description

Die Gegenwart von Antigenen, die mit Adenokarzinom des Dickdarms und des Verdauungssystems verbunden sind, ist in J. expt. Med., 121 (1965), Seiten 439 bis 462 und J. expt. Med. 122 (1965), Seiten 467 bis 487 beschrieben. In diesen Berichten wird Bezug genommen auf frühere Arbeiten von B. Björklund, die die Existenz von menschlichem, mit Krebs verbundenem Antigen zeigen, welches bei dem größeren Teil aller bekannten bösartigen Tumore mit Epithelursprung üblich ist (siehe Internat. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1966, 8, Seite 179 und Internat. Arch. Allergy and Appl Immunol. 1958, 12, Seite 241). In der US-PS 36 63 684 ist ein karzinomembryonisches Antigen beschrieben, das sogenannte "CEA- Aktivität" zeigt. Dieses Antigen ist jedoch vollständig verschieden von dem erfindungsgemäß verwendeten Antigen, was im einzelnen nachfolgend gezeigt wird.
In Internat. Arch. Allergy 36, Seiten 191 bis 203 (1969) wird berichtet, daß in menschlichen Krebszellen und He-La- Zellen Antigene festgestellt wurden. Eine Isolierung der Antigene erfolgte jedoch nicht, und auf Seite 202 ist ausdrücklich gesagt, daß die Natur des Tumorantigens undurchsichtig sei. Über die Möglichkeit, durch Bestimmung von Antigen eine Aussage über die Entwicklungsstadien von Krebs zu machen, läßt sich keiner der Literaturstellen etwas entnehmen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand nun darin, eine Methode zur Ermittlung der unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Krebs zu bekommen. Diese Aufgabe wird mit der in Anspruch 1 aufgeführten Verwendung gelöst.
Ein Material, das CAPA-Aktivität besitzt, kann gewonnen werden, indem man bösartige Gewebe von Autopsien homogenisiert und Karzinomgewebe verschiedener Typen und Stellen sammelt.
Ein stattdessen verwendbares Ausgangsmaterial ist Gewebe aus menschlicher Plazenta oder Kulturen bösartiger Zellen in vitro (bezüglich der Einzelheiten bei solchen Kulturen, siehe B. Björklund, V. Björklund und I. Hdlöf, J. Nat. Cancer Inst., 26, Seiten 533 bis 545, 1961 und "Antigenicity of Pooled Human Malignant and Normal Tissues by Cytoimmunological Technique. III. Distribution of Tumor Antigen"). Normale Gewebe werden parallel zu den bösartigen Geweben ebenfalls gesammelt. Die Isolierung eines reinen Antigens läßt sich folgendermaßen durchführen:
Krebsgewebe und normale Gewebe werden im gefrorenen Zustand mit Wasser mit einer Temperatur von etwa 0°C vermischt und auf solche Weise homogenisiert, daß keine überschüssige Reibungswärme erzeugt wird, die eine Inaktivierung des betreffenden Antigens verursacht würde. Die Temperatur der Suspension sollte man nicht oberhalb etwa 0°C ansteigen lassen.
Das resultierende kalte Gemisch von flüssigem Homogenisat und Feststoffen wird mit einem organischen Lösungsmittel mit der Fähigkeit, Lipide, wie neutrale Fette, aufzulösen, wie beispielsweise Aceton oder Ethylether, bei einer Temperatur innerhalb etwa 0°C behandelt, was eine Entfernung unter anderem von Lipoidsubstanzen zum Zweck hat und zur erhöhten Freilegung antigener Gruppen führt. Die Feststoffe werden von dem Gemisch, zweckmäßig durch Zentrifugieren, abgetrennt, und die wäßrige Schicht und die Lösungsmittelschicht werden verworfen. Die Temperatur sollte etwa 4°C nicht überschreiten.
Die gewonnenen Feststoffe werden lyophilisiert, und das lyophilisierte Gewebepulver wird, beispielsweise in einer Kugelmühle aus rostfreiem Stahl, bei einer niedrigen Temperatur gemahlen, vorzugsweise unterhalb etwa 0°C und zweckmäßig bei einer Temperatur unterhalb etwa -70°C. Das Mahlen führt zu einem feinen graubraunen Pulver.
Wenn erwünscht, wird das resultierende Pulver mit einer Salzlösung, wie beispielsweise mit einer Kochsalzlösung, bei einem neutralen pH-Wert bei niedriger Temperatur, zweckmäßig bei etwa 0°C, extrahiert, wobei die nach dem Zentrifugieren oben liegende Schicht verworfen wird. Das resultierende Sediment kann erneut in kaltem Wasser suspendiert werden, worauf das Sediment gewonnen und lyophilisiert wird. Das resultierende Pulver kann jahrelang in geschlossenen Flaschen bei etwa 4°C gelagert werden.
Nach einem Extrahieren des Pulvers mit Wasser bei einem alkalischen pH-Wert werden die Extrakte bei einer Zugabe von NaCl bei neutralem oder etwas alkalischem pH-Wert trübe. Diese Trübheit beruht hauptsächlich auf der Anwesenheit von Verunreinigungen von Nucleinsäurecharakter. Nach dem Zentrifugieren der mit Salzlösung behandelten Extrakte bleibt die gesamte Aktivität in der klaren Flüssigkeit. Diese kann isoelektrisch bei saurem pH-Wert, zweckmäßig bei etwa 4,8, einer Ausfällung unterzogen werden, und die resultierenden Niederschläge werden in einer wäßrigen mit Phosphat gepufferten Lösung eines pH-Wertes von etwa 7,0 aufgelöst.
Die aus dem obigen Verfahren resultierenden Lösungen werden mit einem geeigneten Molekularsiebgel in Perlenform filtriert, was eine Fraktionierung von Verbindungen mit einem Molekulargewichtsbereich von 10 × 10&sup6; bis 20 × 10&sup6;, besonders etwa 15 × 10&sup6;, gestattet, wobei das Molekularsieb mit einem Puffer von etwa neutralem pH-Wert eluiert und die Molekulargewichtsfraktion von 10 × 10&sup6; bis 20 × 10&sup6;, besonders von etwa 15 × 10&sup6;, gewonnen wird. Das Molekularsieb kann ein Polyacrylamidgel, vernetztes Dextrangel, Agar- und Agarosegel oder äquivalentes Gel sein. Das Gel wird mit einer geeigneten Pufferlösung bei einem pH-Wert von etwa 7,0, wie Sörensen-Puffer (1/15 molare Pufferlösung, bezogen auf die Natrium- und Kaliumphosphate), 1 : 10 verdünnt, äquilibriert. Bezüglich weiterer Einzelheiten der Gelfiltrationsmethode wird auf H. Determann "Gelchromatographie", Springer- Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1967) hingewiesen. Das für die Filtration verwendete Eluiermittel ist eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 7, und in dem Auslauf findet sich die Antigenaktivität in der Fraktion, die diesen Molekulargewichtsbereich enthält. Diese Fraktion wird gewonnen.
Die aktiven Fraktionen aus der obigen Gelfiltration werden in einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0, wie einem auf 1 : 10 verdünnten Sörensen-Puffer, gelöst, und die resultierenden Lösungen werden durch eine Säule filtriert, die mit einem schwachen Ionenaustauscher-Molekularsiebgel mit schwachen Ionenaustauscheigenschaften, wie beispielsweise einem Polyacrylamidgel, gefüllt ist, wobei die Säule mit einem ähnlichen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0 äquilibriert ist. Die Antigenaktivität zeigende Fraktion ist die erste Fraktion der Lösung, die die Säule verläßt, und diese Fraktion wird gewonnen.
Diese Fraktion wird wie folgt weiter gereinigt: Ein Gemisch von Proteinen oder konjugierten Proteinen wird durch isoelektrische Einstellung des pH-Wertes ausgefällt. Die dabei erhaltene Ausfällung wird mit einem geeigneten Gel vermischt. Das resultierende Gemisch von Ausfällung und Gel wird als Schicht auf eine Säule aufgegeben, die ein identisches Gel des gleichen pH-Wertes, der für die Proteine isoelektrisch ist und diese in der vorausgehenden Stufe ausgefällt hat, enthält. Die Säule wird dann unter allmählicher Steigerung oder Herabsetzung des pH-Wertes eluiert. In dem Eluat sind die gewonnene Fraktion oder gewonnenen Fraktionen jene, die das erwünschte Protein oder die erwünschten Proteine enthalten.
Hierfür brauchbare Gele sind vernetztes Polyacrylamid mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von etwa 2000 oder vernetzte Dextrangele, die beispielsweise eine Molekulargewichtsausschlußgrenze von etwa 25 000 besitzen. Diese Gele sind Molekularsiebe und werden gewöhnlich in Perlenform verwendet. Jedes derartige Molekularsiebgel mit Molekulargewichtsausschlußgrenzen von wenigstens etwa 2000 bis 3000 kann verwendet werden.
Die normale Fraktion und die CAPA-Fraktion, die bei der obigen Chromatographie gewonnen wurden, werden bei einem pH- Wert von etwa 5 einer Ausfällung der aktiven Substanz unterzogen, wobei das Sediment gewonnen und in Wasser mit einem pH-Wert von etwa 8,5 aufgelöst wird. Die klaren Lösungen werden dann mit Ameisensäure angesäuert, zweckmäßig auf einen pH von etwa 5,0, und diese Behandlung führt zu einer Ausfällung. Jede Ausfällung wird mit einem Schlamm eines der obigen Gele vermischt, das mit HCOOH-HCOONH&sub4; auf etwa pH 5,0 äquilibriert wurde. Jedes dieser Gemische wird auf eine wie oben äquilibrierte Gelsäure aufgegeben.
Zum Eluieren der Ausfällungen wird ein pH-Gradient verwendet, in diesem Fall mit einem nach und nach abnehmenden pH- Wert. Ein geeignetes Puffersystem ist HCOOH/HCOONH&sub4; und NH&sub4;HCO&sub3;/NH&sub3;. Die Antigenaktivität findet sich in dem Auslauf im pH-Bereich vom Anfangs-pH bis etwa pH 3.
Die in dem obengenannten pH-Bereich gewonnene Auslauffraktion enthält das erwünsche CAPA (mit Krebs verbundenes Polypeptidantigen), das durch Gefriertrocknung gewonnen werden kann.
Das CAPA kann aus der aktiven Fraktion nach der Filtration durch Gefriertrocknung gewonnen und lange Zeit im Vakuum, in der Kälte und in der Dunkelheit gelagert werden.
Das isolierte Antigen besteht aus einem Polypeptid auf der Grundlage einer einzigen Peptidkette, wie durch Behandlung mit Perameisensäure gezeigt wird. Das CAPA zeigt basische Reaktion und ist bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 1 bis 3,5 löslich. Das ungeschützte Polypeptid denaturiert irreversibel bei neutralen pH-Werten, nämlich bei pH-Werten oberhalb 5. Das Antigen ist hygroskopisch und wird gelb, inaktiviert und schmierig, wenn es Feuchtigkeit aufnimmt.
Das gereinigte CAPA enthält eine fluoreszierende Gruppe, die bei einer Aktivierung bei einer Wellenlänge von etwa 288 nm fluoreszierendes Licht einer Wellenlänge von etwa 350 nm emittiert.
Das CAPA zeigt eine spektrophotometrische Spitzenabsorption bei einer Wellenlänge im Bereich von etwa 229 bis etwa 233 nm.
Außerdem zeigt das CAPA eine starke Neigung zur Aggregation und ist auf normalen Filtermedien, die für Sterilisation benutzt werden, nicht filtrierbar. Es wurde bewiesen, daß das CAPA aus den Krebszellenwänden stammt, da Antikörper, die durch Injektion des CAPA in einem lebenden Tierkörper gebildet wurden, eine vollständige Zersetzung von Krebszellen in vivo verursachen, wenn solche Zellen dem Einfluß solcher Antikörper ausgesetzt werden.
Das CAPA hat ein Molekulargewicht im Bereich von 20 000 bis 27 000, spezieller von 23 200 ± 2500, besonders von etwa 24 000. Analysen zeigen, daß es kein Kohlenhydrat enthält, und die Spektrophotometrie zeigt, daß das CAPA frei von Nucleinsäuren ist.
Wie oben angegeben wurde, denaturiert das ungeschützte CAPA irreversibel bei neutralen pH-Werten, was bedeutet, daß eine Injektion einer sauren Lösung des CAPA in einen lebenden Tierkörper zu einer unmittelbaren Denaturierung des CAPA führt, wenn dieses in Berührung mit den neutralen Körperflüssigkeiten kommt. Um eine solche Denaturierung zu verhindern, wird eine Ölemulsion hergestellt, worin eine wäßrige Lösung des CAPA mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis etwa 3 die disperse Phase ausmacht, die von der Ölphase umgeben ist. Beim Injizieren einer solchen Ölemulsion in einen lebenden Tierkörper wird die saure wäßrige Lösung des CAPA durch die umgebende Ölphase geschützt, wenn sie in Berührung mit den neutralen Körperflüssigkeiten kommt. Auf diese Weise behält das CAPA seine Aktivität in vivo und kann zu den Antikörper produzierenden Zellen befördert werden.
Ein Versuch, die Antigenaktivität in vitro bei neutralen pH-Werten beizubehalten, besteht in der Komplexbildung des CAPA mit einem inerten Protein, wie Menschen- oder Rinderalbumin. Wenn man hiervon Gebrauch macht, bildet sich ein Komplex, der bei neutralen pH-Werten löslich ist, während die Antigenaktivität in vitro beibehalten wird.
Die erfindungsgemäße Methode kann beispielsweise mit Patientenseren, Geweben, Sekretionen und Extraktion aus lebenden Tierkörpern, einschließlich beispielsweise Biopsiematerial, chirurgischer Proben, Punktierungen und Abstrichen durchgeführt werden.
Die für die erfindungsgemäße Ermittlung von Krebsstadien verwendeten Materialien wurden wie folgt hergestellt:

A. Isolierung von reinem Antigen

Krebsgewebe verschiedener Typen und von verschiedenen Stellen wurde gesammelt. Es bestand aus makroskopisch reinen, histologisch bestätigten Krebsgeweben von den folgenden Organen (Autopsie): Brust, Bronchien, Blinddarm, Dickdarm, Zwölffingerdarm, Gallenblase, Niere, Kehlkopf, Leber, Lunge, Speiseröhre, Eierstock, Pankreas, Prostata, Mastdarm, Magen, Uterus.
Normale Gewebe wurden von einer Reihe von Personen gesammelt, um eine Ansammlung von Isoantigenen, Gewebeantigenen und Einzelantigenen zu bekommen.
Die Krebsgewebe und die normalen Gewebe wurden von Nachbargeweben befreit und zu 2 bis 3 cm langen Würfeln zerschnitten, die in 0,9%iger NaCl bei 0°C gewaschen wurden, bis sie kein Blut mehr abgaben. Die gewaschenen Würfel wurden eingefroren und bei -24°C gelagert.
Noch in gefrorenem Zustand wurden die Gewebewürfel mit 10 ml H&sub2;O (0°C) je Gramm gefrorenen Gewebes vermischt und in einem gekühlten Mischhomogenisator mit rotierenden Messern bei halber Geschwindigkeit für drei Perioden von je 1 min homogenisiert. Dabei wurde darauf geachtet, daß die Temperatur der Suspension auf etwa 0°C, vorzugsweise etwas unterhalb dieser Temperatur, gehalten wurde.
Das kalte homogenisierte Gemisch wurde in kalte 1000-ml-Polyethenflaschen gegossen. 400 ml Suspension und 400 ml Ethylether von -20°C mit einem Gehalt von 0,002% Diphenylamin wurden in jeder Flasche miteinander vermischt und 120 min bei -2°C in einer Schüttelzentrifuge mit einer Motorgeschwindigkeit von 300 U/min bewegt. Das Gemisch wurde mit 1000 G bei -2°C während 5 min zentrifugiert. Während dieser Stufe mischte sich die Lipidschicht nicht mit der Gewebeschicht. Der Ethylether und das Lipid wurden verworfen, und eine zweite Extraktion wurde während 60 min durchgeführt, worauf während 5 min zentrifugiert und die Ether-Lipidschicht entfernt wurde. Schließlich wurde mit 1000 G bei -2°C 30 min zentrifugiert, und die Wasserschicht wurde entfernt, obwohl sie etwa CAPA enthielt. Die verbleibenden unlöslichen Bestandteile wurden genommen, der restliche Ethylether wurde durch Anlegen von Vakuum während 5 min entfernt.
Das antigene Material wurde in 50 ml H&sub2;O von 0°C suspendiert, in 500-ml-Infusionsflaschen überführt und bei -70°C (Trockeneis und Ethanol) gefroren.
Es wurde in einem Lyophilisator bei kontrollierter Temperatur lyophilisiert.
Das lyophilisierte Gewebepulver wurde in einer Kugelmühle aus rostfreiem Stahl bei einer Temperatur von etwa -70°C während 2 h bei 40 U/min zu einem feinen, graubraunen Pulver gemahlen. Dieses Pulver wurde mit vorgekühltem Ethylether von -2°C in einer Schüttelapparatur mit 300 U/min während 60 min extrahiert mit mit 1000 G bei -2°C während 30 min zentrifugiert. Die Etherschicht wurde entfernt und das Sediment im Vakuum getrocknet.
5 g des resultierenden Rohgewebepulvers wurden bei neutralem pH-Wert in 500 ml Kochsalzlösung suspendiert, die sterile Eiswürfel enthielt. Die Suspension wurde in einem Mischer bei halber Geschwindigkeit für drei Perioden von 1 min homogenisiert. Die Temperatur wurde auf 0°C gehalten. Das Gemisch wurde 30 min bei langsamem Rühren auf 0°C gehalten. Es wurde mit 1000 G bei 0°C 40 min zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit wurde weggegossen.
Das Sediment wurde erneut in 500 ml kalten destillierten Wassers suspendiert und langsam bei 0°C während 30 min gerührt. Nach dem Zentrifugieren mit 1000 G bei 0°C während 40 min wurde die obenschwimmende Schicht weggeworfen. Das verbleibende Sediment wurde in 25 ml kalten destillierten Wassers suspendiert und bei -70°C (Trockeneis und Ethanol) gefroren. Lyophilisieren führte zu einem gewaschenen Gewebepulver.
Wäßrige Extrakte von CAPA und normalem gewaschenem Gewebepulver mit einem pH-Wert von 9,5 wurden hergestellt und 10 mal durch isoelektrische Ausfällung bei pH 4,8 und Auflösung des Niederschlages in 1/10 des Volumens an Wasser von pH 9,5 konzentriert. Das resultierende Konzentrat wurde durch schnelles Erhitzen auf eine Temperatur von 98 bis 100°C während 5 bis 10 min stabilisiert. Diese Hitzebehandlung zerstört Enzyme, die sonst das CAPA inaktivieren würden. Der stabilisierte Extrakt wurde bei der Zugabe von Kochsalzlösung von pH 7,5 infolge der Ausfällung restlicher Verunreinigungen von Nucleinsäurecharakter trübe. Um solche restlichen Verunreinigungen auszufällen, wurden 8,0 ml CAPA und normale wäßrige Extrakte getrennt durch Zugabe von 0,8 ml einer 10%igen Lösung von NaCl ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren mit 27 000 G bei 0°C während 1 h wurde die klare, obenschwimmende Flüssigkeit bei pH 4,8 (pH-Einstellung mit 0,1 n HCl oder 0,1 n HCOOH) einer isoelektrischen Ausfällung unterzogen. Die Ausfällungen wurden in 2 bis 3 ml m/150 Phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst.
Die resultierenden Lösungen, die von Tumor und normalem Gewebepulver stammten, wurden mit dem oben definierten vernetzten Polyacrylamid in gekühlten Säulen mit einem Innendurchmesser von 2,50 cm und einer Länge von 138 cm mit einer Fließgeschwindigkeit von 6,3 ml/cm²/h filtriert. Das Gel wurde mit m/150 Phosphatpuffer von pH 7,0 mit 2% n-Butanol äquilibriert und mit dem gleichen Puffer eluiert. Bei jedem Durchgang wurden 4 bis 8 ml Extrakt mit einem Gehalt einer Gesamtmenge von 50 bis 100 mg Protein verwendet.
Die Antigenaktivität fand sich in der Mittelfraktion des Auslaufs des Tumorextraktes. Anteile von 1,0 ml dieser Fraktion, insgesamt 160 bis 180 ml, wurden 3 mal verdünnt und auf verschiedene pH-Werte im Bereich von 2,0 bis 9,0 eingestellt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurden die Proben auf Küvetten überführt, und ihre Lichtstreuung bei 500 nm wurde bei einem Winkel von 90° gemessen. Die Streuungsintensitäten, aufgetragen gegen den pH-Wert, ergaben ein Maximum bei pH 4,8, wobei dieser pH-Wert der isoelektrische Punkt der Fraktion ist.
Der restliche Teil der aktiven Mittelfraktion wurde bei pH 4,8 mit Hilfe von 0,1 n HCl ausgefällt. Zentrifugieren mit 3800 G bei 0°C während 5 min führte zu einer quantitativen Aktivitätsausbeute.
Um eine weitere Reinigung des CAPA zu bewirken, wurden die sedimentierten aktiven Mittelfraktionen aus fünf Polyacrylamid- Säulen mit m/150 Phosphatpufferlösung von pH 7,0 (Sörensen-Puffer in 2% n-Butanol) auf das 20fache des ursprünglichen Auslaufvolumens verdünnt. Diese Lösung, die 130 m Protein in 8,5 ml enthielt, wurde durch eine Polyacrylamid- Säule (wie oben definiert) mit einem Verhältnis von Durchmesser zur Höhe von 1/35 und mit einer Fließgeschwindigkeit von 35 ml/cm²/h filtriert. Die Säule war mit m/150 Phosphatpuffer von pH 7,0 (Sörensen-Puffer in 2% n- Butanol) äquilibriert worden. Für jedes Milligramm Protein wurde ein Schichtvolumen von 10 ml zugelassen.
Die erste Fraktion war aktiv und wurde mit dem Eluierpuffer von pH 7,0 abgetrennt, während Verunreinigungen auf dem Gel bei der angewendeten niedrigen Ionenstärke absorbiert wurden.
Die aktive Substanz wurde bei pH 4,8 mit 0,1 m HCOOH ausgefällt und mit 3800 G bei 0°C während 5 min zentrifugiert. Das Sediment wurde in 8,5 ml H&sub2;O aufgelöst und der pH-Wert mit 0,1 m NH&sub4;OH auf 8,5 eingestellt. Die klare Lösung wurde 3 mal mit 0,1 m HCOOH bei pH 4,8 umgefällt, in der Zentrifuge bei dem gleichen pH-Wert gewaschen und bei pH 8,5 aufgelöst. Das Verschwinden von n-Butanol wurde durch Gas-Flüssigkeitschromatographie verfolgt. Die fertige Lösung wurde in Ampullen gelagert, mantelgefroren und lyophilisiert. Das resultierende Produkt war ein trockenes fast weißes Pulver, und dieses Pulver wurde bei -24°C in den evakuierten und dicht verschlossenen Ampullen gelagert.
Ein identisches Verfahren wurde mit einem entsprechenden Extrakt, der aus normalem Gewebe stammte, und es wurde keine Aktivität gefunden.
Für eine weitere Reinigung des bei dem obigen Chromatographieverfahren erhaltenen Produktes wurde ein Eluierverfahren mit pH-Gradient entwickelt. Dieses Verfahren besteht im Prinzip aus folgenden Stufen: Das bezüglich seiner aktiven Komponente zu reinigende Proteingemisch wird durch eine isoelektrische Einstellung des pH-Wertes ausgewällt. Die Ausfällung wird mit einem geeigneten Gel vermischt. Dieses Gemisch wird als Schicht auf eine Säule aufgegeben, die ein identisches Gel mit dem gleichen isoelektrischen pH-Wert enthält. Die Säule wird dann einer Eluierung mit pH-Gradient unter konstanter Fließgeschwindigkeit und Temperatur unterzogen. So wird die Säule mit einem Medium mit kontinuierlich oder stufenweise steigendem oder fallendem pH-Wert eluiert.
Im vorliegenden Fall erfolgte das Eluieren mit pH-Gradient mit 15 mg lyophilisiertem und salzfreiem CAPA-Pulver und normalem Antigenpulver, das gemäß dem vorausgehenden Abschnitt gereinigt worden war, und in diesem Fall wurden abnehmende pH-Werte angewendet. Die Pulver wurden getrennt in H&sub2;O gelöst, und der pH-Wert wurde mit 0,1 n NH&sub4;OH auf 8,5 eingestellt. Der pH-Wert der klaren Lösungen wurde dann mit 0,1 n HCOOH auf 5,0 eingestellt, was zu einer Ausfällung führte. Jeder Niederschlag wurde mit 10 ml Polyacrylamid-Gel-Schlamm, der mit einer aus 0,02 m HCOOH und 0,02 m HCOONH&sub4; hergestellten wäßrigen Lösung unter Herstellung eines pH-Wertes von 5,0 äquilibriert worden war, vermischt. Jedes dieser Gemische wurde auf eine mit Silikon behandelte 15 ml-Polyacrylamid Säule mit einem Innendurchmesser von 16 mm und einer Länge von 150 mm aufgegeben, die wie oben äquilibriert worden war.
Es wurde ein pH-Gradient zum Eluieren der Niederschläge verwendet. Mit Hilfe eines Gradientenmischers wurde der pH-Wert während einer kurzen Zeit auf etwa 5 gehalten, um den Niederschlag zu waschen, und dann wurde der pH-Wert allmählich auf 2,8 gesenkt. Schließlich wurde der pH-Wert auf 9 gesteigert. Das Puffersystem enthielt 0,02 m HCOOH-HCOONH&sub4; und 0,02 m NH&sub4;HCO&sub3;-NH&sub3;, und das Eluieren erfolgte bei Raumtemperatur. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 27,7 ml/cm² Säulenquerschnitt je Stunde gehalten.
Der Auslauf aus dem Tumorextrakt wurde durch Fluoreszenzspektrometrie (Aktivierung bei 288 nm, Fluoreszenz bei 350 nm emittiert) geprüft. Die zwischen dem Anfangs-pH-Wert und einem pH-Wert von etwa 3 eluierte Fraktion wurde für weitere Verwendung gewonnen. Nach dem Lyophilisieren und Gefriertrocknen konnte das Produkt in dicht verschlossenen Ampullen nach Luftentfernung bei -24°C gelagert werden.
Zur Kennzeichnung der Molekülgröße und zur Bestätigung der Reinheit wurde das Antigenmaterial in der Form von Lösungen derselben mit Polyacrylamidgel (wie oben definiert) filtriert, das mit einem Puffer von 0,02 m HCOOH-HCOONH&sub4; von pH 3,0 äquilibriert worden war. Das pH-eluierte CAPA wurde in einer kleinen Menge des gleichen Puffers aufgelöst. Die Fließgeschwindigkeit betrug 3,25 ml/cm²/h, und die gesammelten Fraktionen umfaßten 1,24 ml. Die aktiven Fraktionen zeigten ein spektrophotometrisches Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 229 bis 233 nm und eine Fluoreszenz von 350 nm, wenn sie bei 288 nm aktiviert wurden.
In einem typischen Versuch führten 10,4 mg CAPA, gelöst in 3,0 ml des obigen Puffers, auf einer silikonisierten Polyacrylamidgel- Säule (Innendurchmesser 2,54 cm, Länge 50 cm) zu einer vollständigen Gewinnung der Substanz und der Aktivität. Nach dem Gefriertrocknen erhielt man ein weißes hygroskopisches Pulver, das in der Kälte und in Abwesenheit von Licht und Sauerstoff gelagert werden kann. Beim Analysieren des Produktes wurden keine Kohlenhydrate und keine Nucleinsäuren gefunden. Analysen mit Hilfe eines Aminosäureanalysators ergaben Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht, das durch Gelfiltration bestimmt wurde. Analysen der Aminosäuren zeigten die folgenden Molprozentsätze, wobei die Werte eine Genauigkeit von ± 5% haben. Das berechnete Molekulargewicht war 23 200 ± 2500 (Standardabweichung):

Alanin 8,62
Arginin 4,57
Asparaginsäure 10,39
Cystein 0,95
Glutaminsäure 17,04
Glycin 6,87
Histidin 1,00
Isoleucin 4,75
Leucin 10,49
Lysin 3,69
Methionin 1,91
Phenylalanin 2,75
Prolin 3,79
Serin 7,74
Threonin 5,92
Tyrosin 3,21
Valin 6,36

Dieser Aminosäuregehalt entspricht einem theoretischen Stickstoffgehalt von 16,2 bis 17,8%. Bestimmung des Gesamtstickstoffs nach Dumas ergab einen Wert von 17,0 ± 0,5%. Wie durch Behandlung mit Perameisensäure gezeigt wurde, beruht das Polypeptid auf einer einzelnen Peptidkette. Außerdem denaturiert das Polypeptid, wenn es nicht durch Komplexbildung mit Albumin geschützt wird, irreversibel bei pH-Werten oberhalb etwa 5.

B. Herstellung von CAPA-Albuminkomplex

Ein Anteil des CAPA, wie es gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, wird in Ameisensäure (beispielsweise 0,05 molarer, der pH- Wert sollte im Bereich von 2 bis 3 liegen) gelöst. Man erhielt eine klare Lösung. Zu dieser Lösung wurde Albuminpulver oder eine Lösung von Albumin mit dem gleichen pH-Wert wie die obige Ameisensäurelösung (200 Gew.-Teile Albumin je Gew.-Teil CAPA) zugesetzt, was zu einer klaren Lösung von CAPA und Albumin führte. Sodann wurde der pH-Wert der Lösung langsam durch Zugabe einer Base (beispielsweise einer wäßrigen Natronlauge oder von Ammoniak) gesteigert, bis der pH-Wert etwa 7,5 erreichte. Dies führte zu einer klaren Lösung, die CAPA und Albumin in der Form eines Komplexes enthielt.
Diese Lösung mit einem Gehalt von 12 µg CAPA/ml konnte direkt in dem nachfolgend beschriebenen diagnostischen Verfahren verwendet werden.

C. Herstellung von gegerbten und markierten roten Blutzellen

Frisches Schafsblut (1 Volumenteil) wurde zu steriler Alsever- Lösung (1,2 Volumenteil) (Alsever-Lösung wird aus 250 g Glukose, 80 g Natriumcitratdihydrat, 42 g NaCl und Wasser auf 10 Liter unter Einstellung des pH-Wertes auf 6,1 mit 10%-igem Zitronensäuremonohydrat hergestellt) zugesetzt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und die roten Blutzellen wurden erneut einmal in Alsever-Lösung und zweimal in einer Pufferlösung von pH 6,8 suspendiert. Schließlich wurde eine Suspension der roten Blutzellen in dem Puffer von pH 6,8 mit einer Konzentration von 10&sup9; Zellen/ml bereitet.
Ein Volumenteil der wie oben hergestellten Suspension der roten Blutzellen wurde zu einem Volumenteil Pufferlösung von pH 6,8 mit einem Gehalt von 18 µg Gerbsäure je ml unter Rühren zugesetzt. Die so gegerbten roten Blutzellen wurden zentrifugiert und erneut zweimal in Puffer von pH 7,5 suspendiert. Schließlich wurden die roten Blutzellen in Puffer von 7,5 mit einer Konzentration von 10&sup9; Zellen je ml suspendiert.
Ein Anteil des gemäß B. hergestellten CAPA-Komplexes wurde in einer Pufferlösung von pH 7,5 gelöst und ergab eine Konzentration von 3 µg CAPA je ml (berechnet auf reines CAPA). Ein Volumenteil der oben hergestellten Suspension von gegerbten roten Blutzellen wurde tropfenweise bei 0°C zu einem Volumenteil der CAPA-Komplexlösung während 10 Minuten zugesetzt. Die markierten Zellen wurden zentrifugiert und erneut in einer Pufferlösung von pH 7,5 mit einem Gehalt einer stabilisierenden Menge (etwa 1,2 Volumenteile je Volumenteil) von inertem menschlichem Serum suspendiert, um eine Suspension zu ergeben, die 1,6 × 10&sup8; markierte Zellen je ml enthielt. Diese markierten Zellen wurden, wie nachfolgend gezeigt, in dem diagnostischen Verfahren nach der Erfindung verwendet.

D. Herstellung von Antiserum

816 µg reines CAPA wurden in 1,0 ml 0,02 m HCOOH von pH 2,8 aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde tropfenweise 1,0 ml Öl unter gleichzeitigem Emulgieren zugesetzt. Das Emulgieren erfolgte nach Freund mit Hilfe einer Injektionsspritze, wobei das Gemisch in der Spritze bis zur Bildung einer gleichförmigen weißen Emulsion mit etwa der gleichen Konsistenz wie Schlagsahne auf- und abgezogen wurde. Ein Tropfen dieser Emulsion wurde mit Eiswasser getestet, um zu bestätigen, daß er schwamm und intakt geblieben war. Die resultierende halbflüssige Emulsion wurde für subkutane und intramuskuläre Injektionen bei Kaninchen verwendet.
In der ersten Injektion wurde ein sogenannter vollständiger Hilfsstoff verwendet, und in den nachfolgenden Injektionen wurde ein sogenannter unvollständiger Hilfsstoff verwendet. Nach dem anfänglichen Blutablassen von jedem der fünf Kaninchen, um O-Werte zu bestimmen, wurden insgesamt 408 µg emulgiertes CAPA bei einem pH-Wert von 2,8 subkutan an jeder rechten und linken Pfotenfläche injiziert. In zehntägigen Intervallen wurden zusätzlich drei Injektionen verabreicht, die erste intramuskulär in jedes Hinterbein und die zweite und dritte subkutan an beiden Vorderseiten bzw. Hinterseiten. Die Auswahl der Injektionsstellen erfolgte, um die Zugangsbereiche der regionalen Lymphdrüsen auszunutzen. Insgesamt erhielt jedes Kaninchen etwa 1,6 mg CAPA in der Form der Emulsion. 14 und 24 Tage nach der letzten Injektion wurden Testproben von Blut abgenommen, die einer Hämagglutinationsanalyse bezüglich des Vorhandenseins spezifischer Antikörper gegen CAPA unterzogen wurden. Zwei Tage nach der letzten Probenabnahme wurde eine maximale Menge an Blut abgelassen, das in der Form von Serum gewonnen wurde, welches seinerseits steril filtriert und in kleinen Anteilen auf sterile Röhrchen überführt wurden. Diese Röhrchen konnten in der Kälte gelagert werden, wobei sie ihre Spezifität erhielten.

Beispiel

a) Einzelne Blindprobe

Blutproben wurden aus verschiedenen Krankenhäusern erhalten. Die Gesamtzahl der Blutproben war 431. Es bestand kein Verdacht auf eine bösartige Erkrankung.
Venenblut wurde auf Wassermann-Röhrchen ohne Zusatz überführt und in das Laboratrium gebracht, in einigen Fällen nach der Entfernung von Koagulum und Blutzellen durch Zentrifugieren.
Das Hämagglutinations-Hemmverfahren mit CAPA wurde wie folgt durchgeführt:
25 µl von Patientenserum, das an roten Blutkörperchen vom Schaf absorbiert worden war, wurden in acht Stufen mit doppelter Verdünnung in Verdünnungsplatten titriert, und dann wurden 25 µl von spezifischem Antiserum in Grenzverdünnung (etwa 1: 2000) jedem Hohlraum zugesetzt. Nach einer Inkubation bei 22°C während 10 min wurden jedem Hohlraum 50 µl einer Suspension von etwa 6 bis 8 Mio roter Blutkörperchen vom Schaf zugesetzt, die entsprechend der in C. oben dargestellten Methode gegerbt und mit isoliertem CAPA, das mit menschlichem Albumin verknüpft war, markiert worden waren (etwa 2 bis 4 µg je 10&sup9; Blutkörperchen). Es können auch andere feinteilige Träger, wie Latex, Bentonit und Kollodium anstelle der roten Blutkörperchen verwendet werden.
Die Reaktion wurde mit Hilfe eines geneigten Spiegels und einer Standardreihe nach 4 bis 24 h Inkubation bei 1 bis 2°C aufgezeichnet. Zu Kontrollzwecken wurde folgendes verwendet:

1. Mit CAPA markierte Blutzellen plus Antiserum;
2. mit CAPA markierte Blutzellen ohne Antiserum;
3. Patientenserum plus mit menschlichem Albumen markierte Blutzellen;
4. Patientenserum und unbehandelte Blutzellen;
5. mit CAPA markierte Blutzellen und Antikörper in einer Reihe, wo eine Hemmung durch stufenweise Abnahme bekannter Mengen von CAPA erreicht wird.

Die verwendeten Verdünnungsflüssigkeiten enthielten gesammeltes (d. h. von vielen Personen vereinigtes) inaktiviertes neutrales menschliches Serum für die Stabilisierung der Blutzellen.
CAPA-Reagens wurde wie oben angegeben isoliert und gereinigt.
Als Antiserum wurde Pferdeanti-He-La vom 19. November 1962, absorbiert von normalen Geweben und angesammelten menschlichem Serum, verwendet. Die Immunisierung erfolgte mit gewaschenen Bruchstücken von HeLa-Zellen, die in Eagle&min;s- Medium mit einem Gehalt von 20% inaktiviertem menschlichem Serum in flachen Glasflaschen gewachsen waren. Die Zellen waren mit EDTA gewonnen, zentrifugiert und dreimal mit Wasser gewaschen worden. In Gegenwart von CAPA in Patientenserum wurden die Pferdeantikörper neutralisiert, was nicht zu einer Agglutination führte, wenn die mit Polypeptid markierten Blutzellen anschließend zugesetzt wurden. Die Aufzeichnung erfolgte nach einer steigenden Punktebewertung von 0 bis 6, wobei 0 die Abwesenheit von Hemmung und 6 die maximale Hemmung der Agglutination anzeigt. Das Verhältnis zwischen den Bewertungspunkten und der Konzentration an CAPA je ml Serum ergibt sich aus Tabelle I, die man durch Eichung von Verdünnungen vorbestimmter Mengen an CAPA in neutralem Serum erhielt. Tabelle I &udf53;vz14&udf54; &udf53;vu10&udf54;
Die Aufzeichnungen erfolgten ohne Kenntnis des Gesundheitszustandes der Patienten. Das untersuchte Material wurde gemäß der nachfolgenden Tabelle II eingestuft. Tabelle II &udf53;vz27&udf54; &udf53;vu10&udf54;
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die höchsten Bewertungspunkte mit den Gruppen erhalten wurden, die durch "primären Krebs mit Metastasen" (lokal), "ausgedehnten Krebs" und "Neugeborene" (Nabelschnurblut) gekennzeichnet sind.
Niedrige Bewertungspunkte erhielt man für Blutspender. Eine mittlere Position bekommt man bei der Gruppe "primärer unbehandelter Krebs" und bei der Gruppe "nicht radikal behandelter Krebs". Bewertungspunkte, die etwa denen der Blutspender gleich waren, fand man in der Gruppe "radikal entfernter Krebs".
Die Mittelwerte für CAPA in allen Gruppen wurden paarweise verglichen und sind in der nachfolgenden Tabelle III gezeigt. Tabelle III &udf53;vz36&udf54; &udf53;vu10&udf54;
Aus der obigen Tabelle ist klar ersichtlich, daß bei "primärem Krebs mit Metastasen" sowie bei "ausgedehntem Krebs" wesentlich höhere mittlere Bewertungspunkte auftreten als bei allen anderen Gruppen, jedoch mit der Ausnahme von Neugeborenen (siehe auch Tabelle II).
Für die Gruppen "nicht radikal behandelter Krebs" sowie "unbehandelter primärer Krebs" sind die durchschnittlichen Wertungspunkte wesentlich höher als bei allen anderen Gruppen, mit Ausnahme der beiden oben erwähnten, und im Vergleich mit der Gruppe "bösartige Krankheit, aber kein Krebs", gegenüber der der Unterschied wesentlich ist (0,01 < P < 0,05).
Die Gruppen 5 bis 9 zeigen keine wesentlichen gegenseitigen Unterschiede, mit Ausnahme des wesentlichen Unterschiedes zwischen 7 und 9. Dieser Unterschied kann durch die Tatsache erklärt werden, daß unter den Fällen echte, verborgene Krebsfälle vorliegen können, die Bewertungspunkte zwischen 1 und 4 ergeben.
Die positive Indikation in Nabelschnurblut verdient einige Aufmerksamkeit. Um festzustellen, ob das CAPA aus der Plazenta stammt, wurden Stücke eines solchen Gewebes extrahiert. Mengen von 300 mg gefrorenen Plazentagewebes je ml gepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,5 wurden bei 0°C homogenisiert und mit 1000 G während 30 Minuten bei 0°C in konischen Röhrchen (nach Markham) zentrifugiert. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde hinsichtlich der Anwesenheit von CAPA mit Hilfe der oben beschriebenen Hämagglutinationsmethode getestet. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die erhaltenen Hemmungsreaktionen durch unspezifische Inaktivierung des reinen, auf die Blutkörperchen aufgebrachten CAPA verursacht wurden, wurden diese Blutkörperchen nach jeder Aufzeichnung geschüttelt, und es wurde eine Standardmenge von Antikörpern, die für CAPA spezifisch sind, zugesetzt. Die Antigeninaktivierung konnte in jedem dieser Fälle aufgezeigt werden. Als Kontrollmaterial wurde ein Extrakt von Antigenpulver verwendet, das aus menschlichen Krebsgeweben unterschiedlicher Herkunft und unterschiedlicher Lokalisierung gewonnen worden war. Die Ergebnisse zeigen, daß von 26 Plazentas von ebensoviel Individuen alle ohne Ausnahme wesentliche Mengen an CAPA enthielten. Der Mittelwert (der geometrische) für die 26 Plazentas betrug 297 ± 8 Mikrogramm je Gramm feuchtes Gewebe (0,03%).

b) Doppelblindprobe

Um die Gültigkeit der obigen Schlußfolgerungen weiter zu erhärten, wurde eine Doppelblindprobe unter den am strengsten kontrollierten Bedingungen durchgeführt. Verschlüsselte Blutproben wurden von verschiedenen Abteilungen des Zentralkrankenhauses von Eskilstuna in Schweden geliefert. In diesem Fall wurden quantitative Messungen des CAPA-Gehaltes der Patientenseren durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Doppelblindprobe sowie die Ergebnisse der vorausgehenden Einzelblindprobe sind in Tabellen IV bis VIII nachfolgend zusammengestellt. Darin zeigt
Tabelle IV die Gesamtzahl der geprüften Patienten und die Zahl der Krebsdiagnose zeigenden Patienten,
Tabelle V die Zahl der Patienten der unterschiedlichen Gruppen zusammen mit ihrem Durchschnittsalter und den Abweichungen hiervon,
Tabelle VI die Anwesenheit von CAPA in den Seren aller geprüfter Patienten,
Tabelle VII die Prozentsätze der Patienten mit einer CAPA- Konzentration = &udf53;sa10&udf54;V&udf53;sa21&udf54; 0,15 µg/ml Serum unter Ausschluß der Gruppen 9, 10 und 12 der Tabelle V,
Tabelle VIII die Anwesenheit von CAPA in Beziehung zu Tumorlokalisierungen für die Gruppen 1 bis 3 in Tabelle V. Die Stellennummern beziehen sich auf "Cancer Incidence in Sweden 1968", worauf hier Bezug genommen wird. Tabelle IV &udf53;vz10&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle V &udf53;vz31&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle VI &udf53;vz31&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle VII &udf53;vz22&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle VIII &udf53;vz49&udf54; &udf53;vu10&udf54;
Eine sorgfältige statistische Analyse der in dieser Doppelblindprobe erhaltenen Werte zeigt wiederum die äußerst wichtige Wechselbeziehung zwischen der positiven Krebsdiagnose und einer erhöhten CAPA-Konzentration (P < 0,001). Diese Doppelblindprobe bestätigt auch das Verhältnis zwischen der Größe der untersuchten Tumormasse und der erhöhten CAPA- Konzentration innerhalb der gleichen Altersgruppen (P < 0,001). Der erhöhte Serumgehalt an CAPA zeigte sich in Verbindung mit etwa 20 verschiedenen Typen und Lokalisierungen von Krebs. Somit bestätigt die Doppelblindprobe vollständig die Gültigkeit der neuen Erkenntnisse und ihrer praktischen Brauchbarkeit.

Claims

1. Verwendung eines Hämagglutinations-Hemmverfahrens mit den Stufen:

a) Durch Reihenverdünnung des zu untersuchenden Materials wird eine Reihe von Proben hergestellt;

b) jeder dieser Proben wird eine vorbestimmte Menge Antiserum, das gegenüber dem Antigen spezifische Antikörper enthält, zugesetzt;

c) nach der Inkubation jeder dieser Proben wird eine vorbestimmte Menge des isolierten und dann stabilisierten (komplexgebundenen) Antigens auf einem feinteiligen Träger zugesetzt;

d) die resultierende Reihe behandelter Proben wird mit Kontrollproben abnehmender bekannter Mengen an stabilisiertem (komplexgebundenem) Antigen, denen eine vorbestimmte Menge von Antiserum, das die gegenüber dem Antigen spezifischen Antikörper enthält, und danach eine vorbestimmte Menge des Antigens auf einem feinteiligen Träger zugesetzt wurde, verglichen; und

e) durch Vergleich dieser Probenreihe und der Kontrollproben wird die Menge an Antigen in dem zu untersuchenden Material ermittelt,

zur Ermittlung der unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Krebs durch Bestimmung eines mit Krebs verbundenen Polypeptidantigens (CAPA) mit einem Molekulargewicht von 20 000 bis 27 000, mit einer spektrophotometrischen Spitzenabsorption bei einer Wellenlänge im Bereich von 229 bis 233 nm, das auf einer einzelnen Peptidkette, gezeigt durch Behandlung mit Perameisensäure, basiert, das in nicht durch Komplexbildung mit Albumin geschütztem Zustand irreversibel bei pH-Werten oberhalb 5 denaturiert und das eine fluoreszierende Gruppe enthält, die fluoreszierendes Licht einer Wellenlänge von etwa 350 nm emittiert, wenn sie bei einer Wellenlänge von etwa 288 nm aktiviert wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptidantigen die folgenden Aminosäuren in den angegebenen Molprozentsätzen enthält:

Alanin 8,62
Arginin 4,57
Asparaginsäure 10,39
Cystein 0,95
Glutaminsäure 17,04
Glycin 6,87
Histiden 1,00
Isoleucin 4,75
Leucin 10,49
Lysin 3,69
Methionin 1,91
Phenylalanin 2,75
Prolin 3,79
Serin 7,74
Threonin 5,92
Tyrosin 3,21
Valin 6,36