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Verfahren zur Feststellung von neoplastischem Zellmaterial
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung von neoplastischem Zellmaterial. Ferner ermöglicht die Erfindung die Unterscheidung von neoplastischen Zellen von normalen Zellen. Neoplastische Zellen sind Zellen, die für anormale Neubildungen verantwortlich sind. Diese Neubildungen werden üblicherweise als bösartiges Neoplasma oder bösartige Tumore gekennzeichnet, und die bösartigen Tumore und bsöartigen Neoplasmen werden als Krebs bezeichnet. Der Ausdruck "Krebs" bezeichnet eine Gruppe von Krankheiten, die alle die Umwandlung von normalen Körperzellen in anomal wachsende Parasitenzellen gemeinsam haben. Diese anomalen oder neoplastischen Zellen sind grundsätzlich bei sämtlichen Krebsarten vorhanden und die Grundlage dieses Identifizierungstestes.
Krebs steht heute hinsichtlich der Todesursachen in den Vereinigten Staaten an zweiter Stelle.
Nach dem Bericht"President's Commission on Heart Disease, Cancer and Stroke" war Krebs im Jahre
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fälle werden durch Krebs verursacht, der zahlreiche verschiedene Stellen im menschlichen Körper befällt. Zu den bisher bekannten Krebsarten gehören Krebs der Lunge, der Prostata, des Dick- und Mastdarms, des Magens, der Bauchspeicheldrüse, des Lymphsystems, wobei er als Lymphom bezeichnet wird, das eine neoplastische Störung des Lymphgewebes ist, wozu das plasmozytische Lymphom, das Follikularriesenlymphom. das lymphoplastische Lymphom und lymphozytische Lymphom gehören, Leukämie, Krebs des Rektum, der Blase, der Harnröhre, der Mundhöhle, des Rachens, der Brust, des Uterus, der Eierstücke und der Leber-und Gallenwege.
Ausser der Bezeichnung der Krebsarten nach den Organen, die davon befallen werden, kann die Krankheit weiterhin nach den speziellen Geweben gekennzeichnet werden, die angegriffen werden. Insbesondere gibt es ein Karzinom, das eine Neubildung ist, die aus Epithelialzellen besteht, die die umgebenden Gewebe zu infiltrieren und Metastasen zu bilden pflegen. Es gibt ferner das azinöse Karzinom, das ein Karzinom mit traubenförmiger Struktur ist, die Adenomatose, eine Krebsart, die eine sackartige granulöse Struktur bildet, Alveolarkarzinom, bei dem die neoplastischen Zellen in Gruppen auftreten, die im Bindegewebe eingeschlossen sind, Chorionkarzinom, Kolloidkarzinom, bei dem die Zellen eine Kolloiddegeneration erfahren haben.
Zylinderzellkarzinom, bei dem die Zellen zylindrisch sind, Ductuskarzinom, bei dem die Zellen die Milchgänge befallen, das Cephaloidkarzinom, das eine weiche, hirnartige Struktur befällt, das Epibulbärkarzinom, das am Rand der Hornhaut beginnt und sich über die Hornhaut und Bindehaut des Auges ausbreitet, das Epithelialkarzinom, das Drüsenkarzinom, bei dem die Zellen zum glandulären oder sekretbildenden Typ gehören, Menticularkarzinom, ein szirrhöses Karzinom der Haut, lipomatöses Karzinom, ein Karzinom, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es viel Fett enthält, mastidoides Karzinom, das eine schnell wachsende Art von Brustkrebs ist, das Medullarkarzinom, das Periportalkarzinom, bei dem der
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Krebs die Leber befällt und sich längs der Portalgefässe und um die Portalgefässe ausdehnt, das
Schneidersche Karzinom,
das die Nase und die Nasennebenhöhlen befällt, das szirrhöse Karzinom, das durcheine harte Struktur gekennzeichnet ist, die aus mit Alveolen gefülltem Bindegewebe besteht, und das Karzinom tuberosum, ein Karzinom der Haut.
Ausser den Karzinomen gibt es Sarkome, die Tumore in Form einer Neubildung sind, die embryonalem Bindegewebe ähnelt. Einige der häufigeren Sarkome sind das Sarcom adiposus, das eine reichli- che Fettmenge enthält, das Alveolarsarkom, das ein vernetztes faseriges Gerüst hat, das Gruppen von
Sarkomzellen einschliesst, das Betryosarkom, das die Vagina befällt, das chloromatöse Sarkom, das die Knochenhaut des Schädels befällt, das Faszialsarkom, das in den Faszien um die Bindungen entsteht, das Hodgkinche Sarkom, das leukozytische Sarkom, d. 11. Leukämie, das lymphatische Sarkom, d. h.
das Lymphosarkom, das osteoblastische Sarkom, das Gewebe hervorbringt, die knochenartig oder knorpelartig sind, das osteogene Sarkom, zu dem Tumore gehören, die im Knochen auftreten und aus den Knochenzellen entstehen, das polymorphe Sarkom, das eine Vielfalt von verschiedenen Zellen enthält, das Retikulumzellsarkom, ein bösartiges Lymphom, und das Spindelzellensarkom, bei dem die Zellen spindelförmig sind.
Alle vorstehend genannten Arten von Krebs haben eine gemeinsame Basis, nämlich die neoplastische Zelle, die, wie im oben genannten Bericht der Presidential Commission Report erwähnt, eine grund- legende biologische Veränderung erfährt, die sie von normalen Zellen unterscheidet. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die stattfindende Veränderung eine permanente Änderung der Nucleinsäuren ist, die in der Zelle enthalten sind. Insbesondere wird angenommen, dass die Veränderung die Desoxyribonucleinsäure und die Ribonucleinsäure beeinflusst. Die Desoxyribonucleinsäure ist ein Bestandteil der Zellgene, und die Ribonucleinsäure hat die Aufgabe, Enzyme und Proteine zu bilden. Ferner ist eine gewisse Veränderung in der Morphologie der Zellmembran festzustellen, die alle Zellen umgibt.
Diese biochemische Veränderung in der Struktur der Membran von neoplastischen Zellen gilt als verantwortlich für den Verlust der Kontaktinhibition, der bei neoplastischen Zellen im Gegensatz zu normalen Zellen vorhanden ist, und kann der Grund für einige Unterschiede im Zellteilungsprozess zwischen neoplastischen und normalen Zellen sein.
Grosse Anstrengungen wurden in der Vergangenheit gemacht, einen verhältnismässig einfachen Test zu entwickeln, mit dem mit Hilfe einer schnellen Laboratoriumsmethode oder chirurgischen Methode neoplastische Zellen und normale Zellen erkannt und unterschieden werden können. Diese Bemühungen führten zur Entwicklung von Tests, zu denen die Einspritzung von Blut in Hühnerembryos gehört. Wenn beim Hühnerembryotest das Blut von einer Person stammt, die Krebs hat, wird das Hühnerembryo entweder getötet, oder es entsteht ein Küken mit auffallenden Missbildungen. Wenn dagegen das Blut von einem gesunden Patienten stammt, entwickelt sich das Hühnerembryo normal. Bei einer weiteren Testmethode werden Bakterien verwendet, deren Wachstum durch Krebszellen, aber nicht durch normale Zellen zum Stillstand gebracht wird.
Weitere Methoden sind der Papanicolaou-Vaginalzytologietest, gewöhnlich als Pap-Test bezeichnet, die Röntgenuntersuchung mit und ohne Verwendung von undurchsichtigen Materialien, die Verwendung eines tumorspezifischen Farbstoffes, die Verwendung von radioaktiven Materialien, die Analyse von Blut auf Enzyme, Antigene, Antikörper, Polysaccharide, Glycoproteine, Trümmer-von normalen und Tumorgeweben, Proteine, Albumine, Globuline, Vitamine, Spurenmetalle, Aminosäuren, Fette, Lipide, Zellgifte usw., mikroskopische Untersuchung des Gewebes und Urinanalyse. Alle diese Tests sind darauf abgestellt, irgendein Unterscheidungsmerkmal zwischen normalen Patienten und von Krebs befallenen Patienten aufzuspüren.
Einige dieser Tests mögen bisher nicht zuverlässig gewesen sein, jedoch haben alle den gemeinsamen Nachteil, dass sie für einen ganz bestimmten Typ von Tumor, Krebs oder Malignität spezifisch sind. Mit andern Worten, es gab keinen Test, mit dem ein Arzt in jedem Fall das Vorhandensein irgendeines Krebstyps in einem lebenden Organismus feststellen kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Feststellung von neoplastischen Zellen, das es ermöglicht, einzelne Krebszellen in Gegenwart einer grösseren Zahl von normalen Zellen durch die spezielle Verbindung beliebiger Krebszellen mit einem markierten Agglutinin nachzuweisen. Das erfindungsgemässe Verfahren besteht in seinem Wesen darin, dass man das Zellmaterial mit einem aus Weizenkeimen bzw. Weizenkeimlipasen extrahierten Glycoprotein, welches, z. B. durch einen Farbstoff oder eine fluoreszierende oder radioaktive Substanz, markiert ist, zusammenbringt und die bei Vorhandensein von neoplastischen Zellen mit dem Glycoprotein eintretende Reaktion misst.
In den der Veranschaulichung der Erfindung dienenden Zeichnungen sind auf der Ordinate Durch- lässigkeitswerte"D"angegeben, während auf der Abszisse die Wellenlänge X in mu aufgetragen ist. Die auf der Ordinate aufscheinenden Werte 0 bis 1, 0 sind Relativwerte im Vergleich zu einer Bezugszelle
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und stellen keine absoluten Masseinheiten dar.
Die Erfindung ist auf die Differenzierung von neoplastischem Zellmaterial von normalem Zellmaterial durch Reaktion eines Zellmaterials mit einer für neoplastische Zellen spezifischen Substanz gerichtet, die sichtbar oder messbar anspricht, wenn neoplastische Zellen vorhanden sind. Als Substanz, die für neoplastische Zellen spezifisch ist, wird für die Zwecke der Erfindung ein Glycoprotein verwendet, das aus Weizenkeimen oder einem rohen Präparat von Weizenkeimlipase isoliert wird. Der hier gebrauchte Ausdruck"Glycoprotein"bezeichnet ein Agglutinin, das aus Weizenkeimen oder deren Derivaten extrahiert wird und mit neoplastischen Materialien spezifisch reagiert.
Das Glycoprotein wird wie folgt hergestellt : Die Weizenkeime oder ein rohes Präparat von Weizenkeimlipase wird in einem Lösungsmittel, wie Wasser, Alkohole, organische Lösungsmittel, Gemische dieser Lösungsmittel oder in beliebigen andern geeigneten Lösungsmitteln suspendiert. Die Suspension wird anschliessend gemahlen, um das Material darin zu homogenisieren. Die Suspension wird dann auf etwa 750C erhitzt und anschliessend unter Entfernung der gebildeten Fällung zentrifugiert. Die Suspension kann auf eine beliebige Temperatur erhitzt werden, bei der die biologische Aktivität des Glycoproteins nicht verringert oder das Glycoprotein nicht deaktiviert wird. Ammoniumsulfat, Kalziumsulfat, Ammoniumchlo-
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wird, wobei wieder eine Fällung entsteht, die auszentrifugiert wird.
Die Geschwindigkeit der verwendeten Zentrifuge ist nicht entscheidend wichtig. Geeignet ist jede Geschwindigkeit, die genügt, um das Fällmittel abzutrennen. Die Fällung aus der Behandlung mit dem Salz wird dann in Wasser gelöst und dann gegen Wasser in der Kälte nach üblichen Methoden dialysiert, eingeengt und erneut in Wasser, Alkohol, organischen Lösungsmitteln, deren Gemischen. oder ändern geeigneten Lösungsmittelsystemen gelöst und durch ein Austauschmedium geleitet. Die bei dieser Dialysenmethode angewendeten Temperaturen liegen normalerweise zwischen etwa 0 und 40C, jedoch kann die Dialyse auch bei andem geeigneten Temperaturen durchgeführt werden.
Geeignet sind Trennmedien, die eine Trennung von Molekülen auf Grund eines Unterschiedes in ihrer relativen Grösse oder Ladung ermöglichen. Geeignet sind beispielsweise die Ge1filtrationsmedien. der Handelsbezeichnung"Biogel" (vernetztes PolyacrylamidgelderFa. Bio-Rad.) und"Sephadex" (ver- netztes Dextrangel der Fa. Pharmacia) und die Harze Diäthylaminoäthylcellulose und Carboxymethylcellulose. Zur Reinigung des gewünschten Glycoproteins eignen sich ferner die üblichen Methoden der Proteinreinigung, z. B. die Elektrophorese auf beliebigen Trägem, wie Stärke, Schaumgummi und Polyacrylamid. Geeignet sind ferner die chromatographischen Methoden, die eine selektive Adsorption der gewünschten Verbindung ermöglichen.
Als Materialien werden bei den chromatographischen Methoden häufig beispielsweise Kalziumphosphatgel, Aluminiumoxydgel, Diatomeenerde, Stärke und Hydroxyapatit verwendet.
Ausser nach der vorstehend genannten Reinigungsmethode kann das brauchbare Glykoprotein nach beliebigen üblichen Fällungs-Reinigungsmethoden hergestellt werden, bei denen die vorstehend genannten Reinigungsmedien zusätzlich zu andern Differenzierungsmaterialien von üblicher Grösse verwendet werden. Das gewünschte Glycoprotein kann ausserdem nach andern Fä1lmethoden erhalten werden, die gewöhnlich in Verbindung mit proteinhaltigen Materialien angewendet werden, d. h. durch Salzfällung, isoelektrische Fällung und Fällung mit organischen Lösungsmitteln.
Ferner kann das gewünschte Glycoprotein in reiner Form mit Hilfe eines Hapten-Elutionsverfahrens erhalten werden, d. h. durch Aufbringung eines Haptens auf einen Träger, Absorption des Präparates, das das unreine Agglutinin enthält, an das an den Träger gebundene Hapten und Elution des Agglutinins speziell mit einem löslichen Hapten.
Das durch diese Extraktion und Reinigung erhaltene Produkt ist ein reines Glycoprotein, das eine maximale optische Dichte (D) bei 278 mg und eine minimale optische Dichte bei 252 mg hat. Ferner wurde keine Absorption oberhalb von 300 mil festgestellt (s. Fig. 1). Bei der Ermittlung der Kurve der Fig. 1 betrug die Glycoproteinkonzentration 0, 360 mg/ml ; das Lösungsmittel war 0, 2-molares Phosphat mit PH = 7, 5. Der Extinktionskoeffizient bei 280 mit betrug 15,0 und das Verhältnis der optischen Dichte bei 280 mg zur optischen Dichte bei 260 mg 1, 34. Ferner wurde festgestellt, dass ein typisches Fluoreszenzerregungsmaximum bei 280 mu und eine maximale Emission bei ungefähr 340 mu auftrat.
Ferner hatte das Glycoprotein einen Sedimentationskoeffizienten von 2, 74 bei 200C in Wasser, einen Diffusionskoeffizienten von 9, 2 x 10- cm/sec bei 200C in Wasser, ein partielles spezifisches Volumen (aus Pyknometrie) von 0, 71 ml/g und ein partielles spezifisches Volumen (aus der Aminosäurezusammensetzung) von 0, 72 ml/g. Die Grenzviskosität (intrinsic viscosity) betrug 8 bis 10 ml/cm- 1 sec -1.
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Dieses Glycoprotein hat ein Molekulargewicht von etwa 26000, ein Reibungsverhälti1is von 1, 2 und ein Axialverhältnis von 4 bis 5. Ferner beträgt die Grenzviskosität des Glycoproteins etwa 9bei 250C. Das Glycoprotein besteht aus allen üblichen Aminosäuren (s. Tabelle) und enthält grosse Mengen Glutamin-
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gewünschten Glycoproteins besteht fast ausschliesslich aus Glucoseeinheiten.
Tabelle I : Aminosäurezusammensetzung von Weizenkeim-Agglutinin
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<tb>
<tb> Berechnete <SEP> -Z. <SEP> à1il. <SEP> von <SEP> : <SEP> Resten <SEP> pro
<tb> Molekül <SEP> (Molekulargewicht <SEP> = <SEP> 26000) <SEP>
<tb> Dauer <SEP> der <SEP> Hydrolyse <SEP> Angenommene
<tb> Aminosäure <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Reste
<tb> Lysin <SEP> 7, <SEP> 90 <SEP> 6, <SEP> 91 <SEP> 8-9 <SEP>
<tb> Histidin <SEP> 2, <SEP> 86 <SEP> 2, <SEP> 23 <SEP> 3
<tb> Amid <SEP> NI-4 <SEP> 25, <SEP> 99-26 <SEP>
<tb> Arginin <SEP> 9, <SEP> 75 <SEP> 9, <SEP> 65 <SEP> 10
<tb> Asparaginsäure <SEP> 14, <SEP> 28 <SEP> 14, <SEP> 17 <SEP> 15
<tb> Threonin <SEP> 7, <SEP> 82 <SEP> 7, <SEP> 54 <SEP> 8-9 <SEP>
<tb> Serin <SEP> 12, <SEP> 44 <SEP> 11, <SEP> 05 <SEP> 13-14 <SEP>
<tb> Glutaminsäure <SEP> 19, <SEP> 0 <SEP> 19,
<SEP> 0 <SEP> 19
<tb> Prolin <SEP> 14, <SEP> 70 <SEP> 14, <SEP> 39 <SEP> 15
<tb> Glycin <SEP> 24, <SEP> 10 <SEP> 24, <SEP> 05 <SEP> 24-25 <SEP>
<tb> Alanin <SEP> 19, <SEP> 41 <SEP> 18, <SEP> 94 <SEP> 19-20 <SEP>
<tb> Halb-Cystin <SEP> 13, <SEP> 60 <SEP> 13, <SEP> 20 <SEP> 13-14 <SEP>
<tb> Valin <SEP> 11, <SEP> 71 <SEP> 12, <SEP> 98 <SEP> 13-14 <SEP>
<tb> Methionin <SEP> 3, <SEP> 67 <SEP> 3, <SEP> 81 <SEP> 4
<tb> Isoleucin <SEP> 4, <SEP> 54 <SEP> 4, <SEP> 80 <SEP> 5
<tb> Leucin <SEP> 12, <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 13 <SEP> 12-13 <SEP>
<tb> Tyrosin <SEP> 6, <SEP> 46 <SEP> 6, <SEP> 95 <SEP> 7
<tb> Phenylalanin <SEP> 4, <SEP> 81 <SEP> 4, <SEP> 88 <SEP> 5
<tb> Tryptophan <SEP> a) <SEP> 3, <SEP> 92 <SEP> 4
<tb>
a) Spetophotometrisch ermittelt *)
Die Säurehydrolyse wurde in einem konstant bei 105 bis 1060C gehaltenen Ölbad 24 h und 72 h nach der Standardmethode für den Beckman-Aminosäure-Analysator zur Bestimmung saurer und basischer Aminosäuren durchgeführt. Die Cystinhalbreste wurden durch Oxydation mit Perameisensäure ge- mäss Hirs et al., J. Biol. Chem. 219 [1956], S. 611 ermittelt.
Beim Verfahren gemäss der Erfindung kann dieses reine Glycoprotein mit einer Verbindung, die fluoresziert, mit einer Verbindung, die Licht im sichtbaren Ultraviolett-und Infrarotspektrum emittiert, mit einem radioaktiven Isotop markiert oder als reine chemische Substanz beim Test gemäss der Erfindung verwendet werden.
Der spezielle Typ der radioaktiven Markierung, der in Verbindung mit dem Glycoprotein angewendet wird, ist abhängig von der Art, in der der Test durchzuführen ist. Im einzelnen kann das Glycoprotein mit einem leichten Isotop, einer radio-undurchlässigen Substanz oder einem schweren Isotop markiert werden. Die Wahl ist abhängig von den speziellen Bedingungen, unter denen der Test durchzuführen ist. Das Glycoprotein kann mit einem schweren Isotop von Elementen, wie Jod, Cer, Xenon, Cäsium, Barium usw. durch Mischen des Glycoproteins mit einer alkalischen Lösung, z. B. Natriumcarbonat, nach der Methode markiert werden, die in "Proceedings of the Society of Experimental Biology and Medicine" 80 [1952], S. 741 beschrieben ist, markiert werden.
Ein schwerer Isotop als Markierungsmaterial, wie Jodles', das durch Zusatz von Jod 1S1 zu Natriumjodid- und Natriumnitritlösung hergestellt wird, wird tropfenweise unter Rühren zur Glycoproteinlosung gegeben. Das erhaltene Produkt wirddanndurcheine Ionenaustauschsäule gegossen, deren Ablauf mit Natriumchlorid isotonisch gemacht wird. Diese isotonische Lösung wird dann filtriert, wobei ein radioaktives jodiertes Glycoprotein erhal-
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ten wird.
Weitere bekannte Methoden zur Markierung von Proteinen, z. B. des Glycoproteins gemäss der Erfindung, sind die Methoden, die von L. Lutwack in "Proceedings of the Society of Experimental Biology andMedicine", 80[1952], S.741, vonRC.Gilmore jr. etalin"Nucleonics",12, Nr.2[1954], S.65 und von McFarIane in "Biochemical Journal", 62 [1956], S. 135 beschrieben sind.
Es ist auch möglich, das Glycoprotein mit einem leichten Isotop, z. B. H3 oder Cl durch Umsetzungdes Glycoproteins mit auf diese Weise markiertem Essigsäureanhydrid zu markieren. Dies kann erreicht werden durch Zusatz von markiertem Essigsäureanhydrid zu einer alkalischen Lösung des Glycoproteins und Extraktion des Produktes durch Chromatographie. Die Markierung kann auch nach den Methoden von R. F. Coleman et al ("Journal of Biological Chemistry", 241 [1966], S. 3652) oder S. P.
Colowick et al ("Methods in Enzymology", IV, S. 251, Academic Press, New York [1957]) vorgenommen werden.
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Weise wie die Markierung von Jod131 verwendet werden kann.
Ausser der Markierung der Verbindungen mit einer radioaktiven Substanz kann das gemäss der Erfindung verwendete Glycoprotein auch mit einer fluoreszierenden Verbindung umgesetzt werden. Als fluoreszierende Mittel eignen sich beispielsweise Fluoreszeinisothiocyanat, 5-Dimethylamino-l-naphthalinsulfonylchlorid oder Lissamin-rhodamin-ss-200-chlorid oder andere ähnliche reaktionsfähige Verbindungen, die fluoreszieren. Diese Verbindungen können entweder in freier Form oder an"Celite"ge- bunden verwendet werden."Celite"ist eine Kieselerde oder Diatomeenerde, die auch als Infusorienerde und Kieselgur bezeichnet wird.
Die Markierung des Glycoproteins mit der fluoreszierenden Verbindung kann im allgemeinen vorgenommen werden, indem eine alkalische Lösung des Glycoproteim mit dem fluoreszierenden Material an Kieselgur umgesetzt wird. Nach beendeter Reaktion wird das nicht umgesetzte Material durch Zentrifugieren entfernt und das markierte Glycoprotein nach einer beliebigen üblichen Methode gereinigt.
Die Markierung mit Fluoreszenzmaterial nach dieser Methode und andere brauchbare Verfahren werden von Rinderknecht in "Ultra-Rapid Fluorescent Labeling of Proteins", Nature 193 [1962], S. 167 und "Experientia", VI [1960], S. 430 beschrieben.
Das Glycoprotein kann auch mit einem Farbstoff umgesetzt werden, der im sichtbaren Farbbereich liegt, z. B. mit Fluordinitrobenzol, Trinitrobenzol, Sulfonsäure und Diazonium-1, 4-tetrazol. Im einzelnen kann eine Substanz, wie Fluordinitrobenzol, mit dem Glycoprotein in einem alkalischen Medium umgesetzt und gereinigt werden, wobei ein gelbes Produkt entsteht, das für das menschliche Auge sichtbar ist. Spezielle Methoden, die zur Markierung des Glycoproteins mit einem sichtbaren Farbstoff geeignet sind, werden von Colowick et al. an der bereits genannten Schrifttumsstelle"Methods in En- zymology"und F. Sanger in"Biochemical Journal", 39 [1945], S. 507, beschrieben.
Das auf diese Wei- se markierte Glycoprotein kann mit dem blossen Auge oder nach andern üblichen optischen Methoden einschliesslich mikroskopischer und photometrischer Methoden wahngenommen werden.
Beim Verfahren gemäss der Erfindung wird das markierte Glycoprotein verwendet, das mit einem Zellmaterial so zur Reaktion gebracht wird, dass normales Zellmaterial von neoplastischem Zellmaterial differenziert wird.
Die Testmethode kann auch auf eine Suspension von Zellmaterial angewandt werden, das einem krebsverdächtigen Patienten entnommen worden ist. In diesem besonderen Fall würde die Suspension mit dem Glycoprotein behandelt und auf die charakteristische Reaktion beobachtet, wenn neoplastisches Material vorhanden ist.
Wenn beim Verfahren gemäss der Erfindung das Glycoprotein mit neoplastischem Zellmaterial in Berührung gebracht wird, bewirkt es eine Agglutination dieses Materials und seine Zusammenballung zu Klumpen. Diese Reaktion unterscheidet das neoplastische Material vom normalen Zellmaterial, dessen Zellen isoliert und nicht nennenswert agglutiniert bleiben. Der genaue Prozess, nach dem dies stattfindet, ist zur Zeit unbekannt. Eine Festlegung auf eine Theorie ist nicht beabsichtigt, jedoch wird angenommen, dass das Glycoprotein mit einer Substanz reagiert, die für die Zellmembran des neoplastischen Materials spezifisch und in normalen Zellmembranen nicht vorhanden ist.
Die Theorie wird aufgestellt, dass ein Teil dieser Substanzen aus N-Acetylglucosamin besteht, das einen Bestandteil eines grösseren Moleküls bildet, und das spezifisch mit dem Glycoprotein gemäss der Erfindung reagieren und zur beobachteten Agglutination führen kann. Diese Reaktion findet jedoch im wesentlichen nicht statt, wenn das Glycoprotein mit normalem Zellmaterial in Berührung kommt. Ferner kann bei Markierung
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des verwendeten Glycoproteins mit einem fluoreszierenden, radioaktiven oder sichtbaren Farbstoff die entsprechende Fluoreszenz, Strahlung oder Farbbewegung oder-Charakteristik an einzelnen Krebszellen festgestellt werden. Diese Erscheinungen wären jedoch nicht nennenswert erkennbar, wenn nur normales Zellmaterial im Testmaterial vorhanden wäre.
Vorschrift l Das Glycoprotein wurde aus Weizenkeimlipase nach dem Verfahren extrahiert, das in einem Artikel "Identification of a Tumor Specific Determinant on Neoplastic Cell Surfaces" von M. M. Burger, A. R. Goldberg in"Proceedings ofthe NationalAcademyofSciences"57 : 2, fFebefl967], S. 359 bis 366, beschrieben ist. 10 g Weizenkeimlipase wurden in 500 ml destilliertem Wasser suspendiert, in einem Mörser gemahlen und dann homogenisiert. Teilmengen von je 100 ml der Suspension wurden 15 min in einem bei 63 C gehaltenen Wasserbad gehalten. Diese Suspensionen wurden dann zentrifugiertunddas Fällmittel durch Dekantieren abgetrennt, jedoch können auch andere Trennverfahren angewandt werden.
Die hiebei erhaltenen oben stehenden flüssigen Anteile wurden vereinigt und geklärt, indem sie durch ein Glaswollefilter geleitet wurden. 425 ml dieser geklärten Flüssigkeit wurden auf 00C gekühlt. Diese Temperatur wurde angewandt, um die Ammoniumsulfatlösung im Sättigungszustand zu halten. Die Temperatur kann in Abhängigkeit von dem Salz, das beim Aussalzen verwendet wird, so variiert werden, dass das Salz im Sättigungszustand gehalten wird. 113 g Ammoniumsulfat wurden zur gekühlten, geklärten Flüssigkeit gegeben. Die gebildete Suspension wurde 20 min zentrifugiert. Die Fällung wurde abgetrennt und erneut in 14 ml Wasser gelöst und dann in der Kälte dialysiert. Eine Fällung, die während dieser Dialyse gebildet wurde, wurde durch Zentrifugieren abgetrennt.
Die dialysierte Fraktion wurde dann durch Rotationsverdampfung (auch andere Kondensations- verfahren können angewandt werden) bei 40Ckondensiertund durch eine Polysaccharidgelsäule (Sephadex G-75) geleitet, die ebenfalls auf 4 C gekühlt war, und mit Wasser verdünnt. Das Glycoprotein wurde im Ablauf erhalten, nachdem 300 bis 375 ml Flüssigkeit abgelaufen waren.
DieReinheitdieses Produktes wurde in der Ultrazentrifuge "Spinco Modell E"ermittelt. Das Glycoprotein zeigt einen einzelnen Peak mit einem Sedimentationskoeffizienten von 2,74 bei 200C in Wasser. Ausserdem wurde das Produkt der Elektrophorese auf einem Schaumgummistreifen als Unterlage nach der Methode von M. M. Burger und L. Glaser unterworfen, die in "Journal of Biological Chemistry" 239 [1964], S. 3168 beschrieben ist. Das Glycoprotein erwies sich als rein, und die Ergebnisse der Extraktion waren reproduzierbar.
Vorschrift 2 : Das gemäss Vorschrift 1 hergestellte reine Glycoprotein wurde mit Jod 131 wie folgt markiert : 25 mg Glycoprotein wurden mit Wasser gemischt. Zum Gemisch wurden 1, 25 mg Natriumcarbonat gegeben. Ein Jodierungsgemisch wurde durch Mischen von 1, 2 ml einer 0,002-molaren Na-
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hydroxyd neutralisiert. Das neutralisierte Jodierungsgemisch wurde mit 16, 5 ml Wasser verdünnt und zur alkalischen Glycoproteinlösung gegeben.
Das erhaltene Gemisch wurde auf eine Säule des Ionenaus- tauschharzes"Amberlite IR-4B"gegossen. Der Ablauf aus der Säule, der den grösseren Teil des aktiven markierten Materials enthielt-bestimmt durch Standard-Infrarotanalyse-, wurde dann durch eine weitere Austauschsäule aus"Amberlite IR-100H"geleitet. Das aus dieser zweiten Säule erhaltene Produkt war radioaktives jodiertes Glycoprotein.
Vorschrift 3 : Das Glycoprotein wurde mit einem leichten Isotop wie folgt markiert : 100 mleiner Glycoproteinlösung, die 5% Glycoprotein enthielt, wurde mit 100 ml einer gesättigten Natriumacetatlösung umgesetzt. Das Gemisch von Glycoprotein und Natriumacetat wurde dann in einem Eisbad gekühlt. Mit H3 markiertes Essigsäureanhydrid (5% in Aceton) wurde dann in fünf gleichen Teilen von je 2 mg innerhalb von 2 h zugesetzt, während die Temperatur des Reaktionsgemisches bei 00C gehalten wurde. Das erhaltene Produkt (acetyliertes Glycoprotein) wurde dann vom nicht umgesetzten H3-markierten Essigsäureanhydrid und Acetat durch Dialyse gegen Wasser abgetrennt.
Vorschrift 4 : Das Glycoprotein wurde mit einem leichten Isotop wie folgt markiert : 50 ml Glycoproteinlösung, die 2% Glycoprotein in Wasser enthielt, wurde mit Natriumbicarbonat auf den bevorzugten pH-Wert von 8, 5 gepuffert. Der genaue pH-Wert und das spezielle PuSermediumsind für das Verfahren gemäss der Erfindung nicht entscheidend wichtig. Zur gepufferten Glycoproteinlösung wurden 5 ml C14 -mar1 {iertes Essigsäureanhydrid (10/0 in Aceton) gegeben. Die Lösung wurde etwa 10 h bei Raumtemperatur gehalten, bis die Reaktion vollendet war.
Das C14 -markierte Glycoprotein wurde dann von der Essigsäure und nicht umgesetztem Essigsäureanhydrid mit Hilfe einer Sephadex-Säule abgetrennt, bis der grössere Teil des biologisch aktiven Materials eluiert war, bestimmt nach der in Beispiel 2 be-
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:Beispiel 3 : Eine Blutprobe wurde von einem an Leukämie erkrankten Patienten nach einer Modifikation der Amos-Methode hergestellt, die im Bericht über den 9. Kongress der Europäischen Gesellschaft für Hämotologie [1963], S. 1132, beschrieben ist. Die Blutprobe wurde mit einer 51eigen Lösung des Dinatriumsalzes von Äthylendiamintetraessigsäure (nua. EDTA) und 5% Polyvinylpyrrolidin behandelt, wodurch Sedimentation der roten Blutkörperchen eintrat.
Die Suspension wurde zentrifugiert und die oben stehende Flüssigkeit abgezogen und mit einer phosphatgepufferten Salzlösung auf eine Konzentration von 5 x 106 Zellen/mI verdünnt. Eine Probe von normalem Blut wurde in der gleichen Weise
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die normalen Leukozyten und die zweite die Leukozyte aus dem leukämischen Blut enthielten, wurden wie folgt behandelt : Eine Probe von 0, 3 ml jeder Zellsuspension wurde mit Glycoprotein bis zu einer Endkonzentration von 20 /ml behandelt. Je ein Tropfen der erhaltenen Suspensionen wurde dann auf ein Deckglas gelegt und in einer Sykes-Moore-Zellkammer eingeschlossen und auf Agglutination beobachtet.
Hiebei zeigtesich, dass die Probendes leukämischen Blutes einen hohen Agglutinationsgrad hatten, der sich aus der folgenden Tabelle ergibt, während die Suspension aus dem normalen Blut eine verhältnismässig unbedeutende Agglutination zeigte. Durch diesen Test werden somit die neoplastischen Zellen deutlich von den normalen Zellen unterschieden.
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<tb>
<tb>
Leukozytenpräparat <SEP> Relativer <SEP> Agglutinationsgrad
<tb> Normale <SEP> Zellen <SEP> + <SEP>
<tb> Leukämische <SEP> Zellen <SEP> +1+ <SEP>
<tb>
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agglutinierter Zellen, während der grösste Teil der Zellen isoliert geblieben ist, "+t !' die Anwesenheit einiger kleiner Zusammenballungen von Zellen,"-m"Zusammenballung sämtlicher vorhandener Zellen, und"+kW bezeichnet massive Zusammenballung aller Zellen.
Beispiel 4 : Ein Zellpräparat wurde aus L2-Lymphom, 6C3HED-Lymphom und TA3-Adenokar- zinom hergestellt. Das L2- Lymphom wurde durch Bestrahlung nach der Methode von E. Shelton hergestellt, die in "Journal of the National Cancer Institute", 12 [1952], S. 1203, beschrieben ist. Das 6C3HED-Lymphom wurde durch Reaktion von Zellen mit Östradiolbenzoat nach der Methode von W. V.
Gardner et al hergestellt, die in "Cancer Research", 4 [1944], S. 73 beschrieben ist. Das TA3-Adeno- karzinom wurde einem natürlich vorkommenden mammären Tumor in einer weiblichen Maus vom Stamm A entnommen. Die Zellsuspensionen wurden hergestellt, um die Zellen durch Injektion in die Bauchhöhle einer normalen Maus zu injizieren. Die Aszites-Sublimate wurden abgezogen und in Tyrodes-Puffer suspendiert, nach unten zentrifugiert und dann erneut in 5%iger Äthylendiamintetraessigsäure und Tyrodes-Puffer suspendiert. Eine Suspension von normalen Zellen von Milz, Thymus und Lunge einer Maus wurde hergestellt, indem das Zellmaterial vom zugehörigen Bindegewebe durch Pressen der Fragmente durch ein feines Sieb abgetrennt wurde.
Das erhaltene Zellmaterial wurde dann in der gleichen Weise wie bei den neoplastischen Zellen zentrifugiert und erneut suspendiert. Normale Ieberzellen wurden in der gleichen Weise hergestellt, nachdem das Lebergewebe in situ in EDTA-Lösung gewaschen worden war. Epidermal- und Knochenmarksuspensionen wurden nach der Methode hergestellt, die in "Transplantation of Tissue and Cells", herausgegeben vonR. E. Billingham (Philadelphia : Wistar Institute Press [1961], S. 12 und 91) beschrieben ist. Da normale Zellen im allgemeinen kleiner sind als Tumorzellen, wurden die Zellkonzentrationen so eingestellt, dass gleich grosse Zelloberflächen dargeboten wurden. Diese Konzentrationen betrugen etwa 5 x 106 Milzzellen/ml Puffer gegenüber 2 x 106 L2-Zellenfml Puffer.
Eine 0, 3 mI-Probe jedes Zellpräparates wurde dann mit einer Suspension (10 mg/ml) von mit Fluordinitrobenzol markiertem Glycoprotein, das nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode erhalten worden war, bis zu einer Endkonzentration von 20 y/ml behandelt. Wie die folgende Tabelle zeigt, agglutinierte in jedem Fall das die neoplastischen Zellen enthaltende Präparat, wobei sichtbare Zusammenballungen beobachtet wurden. Im Gegensatz hiezu zeigten die Präparate, die normale Zellen enthielten, weder die Verfärbung durch Fluordinitrobenzol noch den Agglutinationsgrad, der bei neoplastischen Zellen festzustellen ist.
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb>
Zellmaterial <SEP> Beobachtete <SEP> Reaktion
<tb> L2- <SEP> Lymphom <SEP> +µ+ <SEP> (1) <SEP>
<tb> 6C3HED-Lymphom <SEP> +1+ <SEP> (1) <SEP>
<tb> TAS-Adenokarzinom-t+H- <SEP> (l) <SEP>
<tb> Normale <SEP> Milzzellen <SEP> +
<tb> Normale <SEP> Thymuszellen <SEP> 0
<tb> Normale <SEP> Lungenzellen <SEP> 0
<tb> Normale <SEP> Epidermalzellen <SEP> 0
<tb> Normale <SEP> Knochenmarkzellen <SEP> 0
<tb> Normale <SEP> Leberzellen <SEP> +
<tb>
1) Sichtbare Zusammenballung und gleichzeitige Farbreaktion wurden beobachtet,
Die in dieser Tabelle gebrauchten Symbole haben die gleiche Bedeutung, wie sie in Beispiel 10 angegeben ist.
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass das bei diesem Test verwendete Glycoprotein wertvoll für die Unterscheidung normaler und neoplastischer Materialien Ist. Die Zellen können beim Verfahren gemäss der Erfindung als Suspension in beliebigen üblichen Puffermedien, z. B. Tyrodes-Puffer, "Versene", PPS u. dgl. verwendet werden.
Die Konzentration des Glycoproteins ist nicht entscheidend wichtig und kann bis etwa 20% oder mehr je nach den Erfordernissen betragen.
Beispiel 5 : L-1210-Lymphomzellen wurden auf die oben beschriebene Weise hergestellt und suspendiert. Jeder dieser Zellsuspensionen, die eine Konzentration von 5 x 106 Zellen/ml hatten, wurden zahlreiche Lösungsmittel zugesetzt, um deren Einfluss auf die Zusammenballungsreaktion festzustellen. Zu 0, 3 ml der Zellsuspension, die eine Konzentration von 5 x 108 Zellen/ml hatte, wurde Glycoprotein (10 mg/ml in Wasser) in einer solchen Menge gegeben, dass die Konzentration 40 y/ml betrug. Wie die Werte in der folgenden Tabelle zeigen, hatte der Zusatz des Glycoproteins die Zusammenballung der Krebszellen zur Folge, während eine Zusammenballung nicht stattfand, wenn Itetn Glycoprotein verwendet wurde.
EMI9.2
<tb>
<tb>
Zusammenballung
<tb> L-1210 <SEP> +6% <SEP> Essigsäure <SEP> 95% <SEP> MeOH <SEP> 3-4+
<tb> L-1210 <SEP> + <SEP> PPS <SEP> 0- <SEP>
<tb> L-1210 <SEP> + <SEP> Glycoprotein <SEP> +4
<tb> L-1210 <SEP> + <SEP> PPS <SEP> 0
<tb> L-1210 <SEP> 10% <SEP> Äthanol <SEP> +Glycoprotein <SEP> +4
<tb> L-1210 <SEP> 100/0 <SEP> Äthanol <SEP> 0
<tb> L-1210 <SEP> 500/0 <SEP> Äthanol <SEP> + <SEP> Glycoprotein <SEP> +3 <SEP>
<tb> L-1210 <SEP> Sclo <SEP> Äthanol <SEP> 0-1
<tb>
Be is p ie I 6 : Krebsiges Vaginal- und Urinzellmaterial wurde von Patienten entnommen, von denen bekannt war, dass sie von Krebs befallen waren. Diese Zellen wurden ebenfalls suspendiert und auf eine Konzentration von etwa 5 x 106 Zellen/ml verdünnt. Einer Probe von 0, 3 ml wurde Glycoprotein bis zu einer Konzentration von 50 y/ml zugesetzt, um die agglutinierende Wirkung festzustellen.
Wie die folgende Tabelle zeigt, fand in jedem Fall, in dem das Glycoprotein zugesetzt wurde, eine starke Zusammenballung der Zellen im Gegensatz zu dem Zellmaterial statt, das suspendiert, aber nicht mit Glycoprotein behandelt worden war.
EMI9.3
<tb>
<tb>
Zusammenballung
<tb> Vaginalzellen <SEP> + <SEP> PPS <SEP> 0
<tb> Vaginalzellen <SEP> + <SEP> PPS <SEP> + <SEP> Glycoprotein <SEP> +2
<tb> Urinzellen <SEP> +PPS <SEP> 0
<tb> Urinzellen <SEP> + <SEP> PPS <SEP> + <SEP> Glycoprotein+2-3 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Beispiel 7 : Krebsige Nierenzellen von Hamsterembryos, die in Hanks-Eagle-Medium gehalten wurden, wurden auf 370C erwärmt und mit 0,2 ml 2. 55o ! gem Trypsin behandelt. Die Zellsuspensionen wurden 2 bis 3 min absitzen gelassen, worauf die Zellen abgetrennt wurden. Die Suspensionen wurden dann abgesaugt, kondensiert, zentrifugiert, mit PPS gewaschen, gepuffert und auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen/ml verdünnt. Eine Probe von 0, 3 ml der Zellsuspension wurde mit Glycoprotein bis zu einer Endkonzentration von 20 y/ml behandelt.
Die Zellsuspension zeigte einen Zusammenballungsgrad von 4 auf der in den vorstehenden Beispielen erläuterten Skala. Die unbehandelte Probe zeigte keinerlei Zusammenballung.
Beispiel 8 : In Hanks-Eagle-Lösung gehaltene HeLa-Zellen wurden auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise isoliert und verdünnt. Eine Probe von 0, 3 ml der Zellsuspension wurde mit Glycoprotein bis zu einer Endkonzentration von 20 y/ml behandelt. Die Zellsuspension zeigte einenZusam- menballungsgrad von 4 auf der oben erläuterten Skala. Die unbehandelte Probe zeigte keinerlei Zusammenballung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Feststellung von neoplastischem Zellmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass man das Zellmaterial mit einem aus Weizenkeimen bzw. Weizenkeimlipasen extrahierten Glycoprotein, welches, z. B. durch einen Farbstoff oder eine fluoreszierende oder radioaktive Substanz, markiert ist, zusammenbringt und die bei Vorhandensein von neoplastischen Zellen mit dem Glycoprotein eintretende Reaktion misst.