DE3752007T2

DE3752007T2 - Mittel zur Entziehung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glycosylation

Info

Publication number: DE3752007T2
Application number: DE3752007T
Authority: DE
Inventors: Michael Brownlee; Anthony Cerami; Helen Vlassara
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1986-09-12
Filing date: 1987-09-14
Publication date: 1997-05-28
Anticipated expiration: 2007-09-15
Also published as: EP0259893B1; AU7827587A; JP2644767B2; GR3022382T3; ES2099059T3; JPS63146833A; EP0259893A2; ATE147991T1; EP0259893A3; AU600306B2; DE3752007D1

Description

Die Anmelder sind Ca-Autoren der folgenden Artikel, die auf den Gegenstand der vorliegenden Erfindung gerichtet sind: "FUNCTION OF MACROPHAGE RECEPTOR FOR NONENZYMATICALLY GLYCOSYLATED PROTEINS IS MODULATED BY INSULIN LEVELS", Vlassara, Brownlee und Cerami, DIABETES (1986), Bd. 35 Supp. 1, Seite 13a; "ACCUMULATIQN OF DIABETIC RAT PERIPHERAL NERVE MYELIN BY MACROPHAGES INCREASES WITH THE PRESENCE OF ADVANCED GLYCOSYLATION ENDPRODUCTS", Vlassara, H., Brownlee, M., und Cerami, A. J. EXP. MED. (1984), Bd. 160, Seiten 197-207; "RECOGNITION AND UPTAKE OF HUMAN DIABETIC PERIPHERAL NERVE MYELIN BY MACROPHAGES", Vlassara, H., Brownlee, M., und Cerami, A. DIABETES (1985), Bd. 34, Nr. 6, Seiten 553-557; "HIGH- AFFINITY-RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE AND DEGRADATION OF GLUCOSE- MODIFIED PROTEINS: A POTENTIAL MECHANISM FOR THE REMOVAL OF SENESCENT MACROMOLECULES", Vlassara, H., Brownlee, M., und Cerami, A., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (Sept. 1985), Bd. 82, Seiten 5588-5592; "NOVEL MACROPHAGE RECEPTOR FOR GLUCOSE- MODIFIED PROTEINS 15 DISTINCT FROM PREVIOUSLY DESCRIBED SCAVENGER RECEPTORS", Vlassara, H., Brownlee, M., und Cerami, A. JOUR. EXP. MED. (1986) (in Druck) "ROLE OF NONENZYMATIC GLYCOSYLATION IN ATHEROGENESIS", Cerami, A., Vlassara, H., und Brownlee, M., Journal of Cellular Biochemistry (1986), Bd. 30, Seiten 111-120.

Hintergrund der Erfindung

Die Umsetzung von Glukose und Proteinen ist seit einiger Zeit bekannt und wurde in ihrer frühesten Erscheinungsform beim Auftreten von braunen Pigmenten während des Kochens von Nahrungsmitteln erkannt. Dieses Phänomen wurde von Maillard 1912 erkannt, der beobachtete, daß Glukose und andere reduzierende Zucker mit Aminosäuren reagieren, um Addukte zu bilden, die einer Reihe von Dehydratationen und Umlagerungen unterliegen, um stabile braune Pigmente zu bilden. Maillard L.C. (1912) C.R. Acad. Sci. Bd. 154, Seiten 66-68.
Man hat von diesem Phänomen in den letzten Jahren gefunden, daß es sein Analogon in vivo hat. Demzufolge wurde von der nichtenzymatischen Reaktion zwischen Glukose und den freien Aminogruppen an Proteinen, die ein stabiles Amino 1-deoxyketosyl-Addukt bildet, das als das Amadori-Produkt bekannt ist, gezeigt, daß sie mit Hämoglobin eintritt, wobei eine Umlagerung des Amadon-Produktes, das an dem Amino-Ende der Beta-Kette des Hämoglobins durch Umsetzung mit Glukose gebildet wird, das Produkt bildet, das als Hämoglobin A1c bekannt ist. Von dieser ersten Reaktion der Maillard-Abfolge wurde auch gefunden, daß sie bei einer Vielzahl von anderen Körperproteinen wie Linsenkristallinen (lens crystallins), Collagen und Nervenproteinen abläuft. Siehe Bunn, H.F., Haney, D.N., Gabbay, K.H. und Gallop, P.H., (1975) Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 67, Seiten 103-109; Koenig, R.J., Blobstein, S.H. und Cerami, A., (1977) J. Biol. Chem., Bd. 252, Seiten 2992-2997; Monnier, V.M. und Cerami, A., (1983) MAILLARD REACTION IN FOOD AND NUTRITION, Hrsg. Waller, G.A., American Chemical Society, Bd. 215, Seiten 431-448; und Monnier, V.M. und Cerami, A., (1982) Clinics in Endocrinology and Metabolism, Bd. 11, Seiten 431- 452.
Weiterhin wurden auch braune Pigmente mit spektralen und fluoreszenten Eigenschaften, die denen der Maillard-Produkte in später Phase ähnlich sind, in vivo in Verbindung mit mehreren langlebigen Proteinen wie Linsenproteine und Collagen von gealterten Individuen beobachtet. Eine altersbezogene lineare Vermehrung des Pigmentes wurde bei menschlichem Dura-Collagen zwischen den Altern von 20 und 90 Jahren beobachtet. Siehe Monnier, V.M. und Cerami, A., (1981) SCIENCE, Bd. 221, Seiten 491-493; Monnier, V.M. und Cerami, A, (1983) BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA., Bd. 760, Seiten 97-103 und Monnier, V.M., Kohn, R.R. und Cerami, A., "Accelerated Age-related Browning of Human Collagen in Diabetes Mellitus", (1984) PROC. NAT. ACAD. SCI., Bd. 81, Seiten 583-587. Interessanterweise kann die Alterung von Collagen in vitro durch die durch Glukose induzierte Vernetzung nachgeahmt werden; und von dem Einbinden anderer Proteine bei der Bildung von Addukten über Collagen, was auch erwähnt ist, wird gedacht, daß sie über eine Vernetzungsreaktion erfolgt, und von der man annimmt, daß sie für die beobachtete Ansammlung von Albuminen und Antikörpern in der Basalmembran der Niere und dem Cholesterin-tragenden Low-Density-Lipoprotein in den Arterienwänden verantwortlich ist. Siehe Brownlee, M., Pongor, S. und Cerami, A., (1983) J. EXP. MED., Bd. 158, Seiten 1739- 1744; und Kohn, R.R., Cerami, A. und Monnier, V.M., (1984) DIABETES, Bd. 33, No. 1, Seiten 57-59. Cerami, A., Vlassara, H., und Brownlee, M., (1985) METABOLISM, Bd. 34, Seiten 37-44.
In Pongor, S.M. et al, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, Seiten 2684-2688, Mai 1984", wurde ein fluoreszierendes Chromophor isoliert und identifiziert, von dem man fand, daß es in bestimmten gebräunten Polypeptiden wie Rinderserumalbumin und Poly-L-lysin vorhanden ist, und dem man eine Struktur 2-(2- Furoyl)-4(5)-2-furanyl)-1H-imidazol (im folgenden "FFI") zuwies. Man hat bei der Verbindung gefunden, daß sie in einem tautomeren Zustand vorliegt und daß diese in ihre Struktur zwei Peptid-abstammende Aminstickstoffe eingebaut hat. Der Einbau dieser Aminstickstoffe und zweier Glukosereste in die Verbindung legte nahe, daß deren Peptid-gebundene Vorläufer bei der in vivo Vernetzung von Proteinen über Glukose, die in der späten Phase des Maillard-Prozesses beobachtet wird, eingebunden sein könnte. Siehe Chang, J.C.F., Ulrich, P.D., Bucala, R., und Cerami, A., (1985) J. Biol. Chem., Bd. 260, Seiten 7970-7974. Dieses Chromophor ermöglichte die Identifizierung der Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung und unterstützte zusätzliche Untersuchungen, die versuchen, den Proteinalterungsprozeß aufzuklären und, wenn möglich, die spezifische Chemie, die beteiligt ist, aufzuklären, um Anstrengungen zu unterstützen, neue Verfahren und Mittel für deren Inhibierung zu entwickeln. Die Entwicklungsarbeit von einem der Erfinder hier hat zu der Identifizierung von bestimmten Verbindungen geführt, die die Fähigkeit zeigen, daß sie fortgeschrittene Glykosylierung inhibieren.
Die internationale PCT-Anmeldung, die unter der Veröffentlichungsnummer WO85/04149 veröffentlicht ist, eine zuvor von den Erfindern hier eingereichte Patentanmeldung, offenbart die Charakterisierung und Isolierung eines fluoreszierenden Chromophors, das in Proteinen beobachtet wird, die eine Zeitlang gegenüber Glukose ausgesetzt wurden, und deren Fluoreszenzeigenschaften denen von einem Polypeptid, nachdem es eine fortgeschrittene Glykosylierung begeht, sehr ähneln. Das Chromophor wurde strukturell identifiziert und als 2-Furoyl-4 (5)-(2-furanyl)-1H-imidazol bezeichnet, und von dem man annimmt, daß es eines der Endprodukte einer ausgedehnten nichtenzymatischen Polypeptidglykosylierung ist, die im Stand der Technik als nichtenzymatische Bräunung (NEB) bekannt ist. Die Anmeldung offenbart, daß die Messung von diesem Chromophor eine qualitative und quantitative Bestimmung des Altersgrades ermöglicht.
Weitere Arbeit seit der Entwicklung der oben erwähnten Inhibitoren hat zu der Identifizierung dessen geführt, was ein endogenes Mittel für die in vivo Eliminierung oder Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung zu sein scheint. Dieses Konzept wurde entwickelt und ist im folgenden dargestellt, und es ist entsprechend diesem Zweck, worauf die vorliegende Anmeldung gerichtet ist.

Zusammenfassung der Erfindung

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Mittel für die Inhibition und Behandlung von Proteinalterung bei Tieren offenbart, wobei man die Körper solcher Tiere stimuliert, deren Erkennung und die Affinität für Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung zu verstärken. Insbesondere werden phagozytische Zellen wie Monozyten und Makrophagen mit einem Mittel behandelt, das geeignet ist, die phagozytischen Zellen zu veranlassen, daß sie ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen wie diesen Zielproteinen steigern.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine Zusammensetzung zur Förderung der Abtrennung und der Entfernung von Zielmakromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, aus dem Körper eines Tieres, umfassend ein Mittel, das geeignet ist, den Körper zu veranlassen, seine Aktivität in bezug auf das Erkennen und Entfernen der Makromoleküle zu steigern, gekennzeichnet dadurch, daß das Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus einem Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, einem Endprodukt der fortgeschritten Glykosylierung, das an einen Träger gebundenen ist, einem Monokin, das den Körper stimuliert, die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen das Makromolekül zu steigern, in Verbindung mit einem costimulatorischen Mittel, das von dem stimulatorischen Mittel verschieden ist.
Die Mittel der vorliegenden Erfindung umfassen eine oder mehr Stimulatorverbindungen der Reihe nach, die umfassen ein natürliches oder synthetisches Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung allein oder an einen Träger gebunden, wobei der Träger ein Material, das aus Kohlenhydraten, Proteinen, synthetischen Polypeptiden, Lipiden, biokompatiblen natürlichen und synthetischen Harzen, Antigenen, und Mischungen davon ausgewählt wird, einschließt. Die Stimulatorverbindungen können andere Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung, die über die Umsetzung von Zuckern mit anderen Makromolekülen hergestellt werden können, und Monokine, die phagozytische Zellen stimulieren, daß sie ihre Aktivität gegen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung steigern, einschließen.
Demzufolge kann die Stimulatorverbindung die Verbindung FFI, die an ein Protein wie Albumin gebunden ist, umfassen. Alternativ kann die Stimulatorverbindung ein synthetisch erhaltenes Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung umfassen, das z.B. über die Reaktion von Glukose oder Glukose- 6-phosphat mit Albumin hergestellt wird. Dieses Reaktionsprodukt kann allein oder mit einem Träger auf die gleiche Weise wie der FFI-Albuminkomplex verwendet werden.
Ein Monokin, das als eine Stimulatorverbindung wirkt, umfaßt das Protein, das als Tumornekrosefaktor (TNF) bekannt ist und deren entdeckte und durch einen der Erfinder hier isolierte und als "Cachectin" bezeichnete Variante. Dieses Material kann allein oder in Verbindung mit anderen Stimulatorverbindungen verabreicht werden.
Zusätzlich können die Stimulatorverbindungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Materialien, die hiernach als "costimulatorische Mittel" bezeichnet werden, verabreicht werden. Bei der gemeinsamen Verabreichung der stimulatorischen Verbindung mit den costimulatorischen Mitteln wurde gefunden, daß sie die Aktivität der ersteren fördern. Geeignete costimulatorische Mittel schließen Monokine wie Interleukin-1 (IL-1) und gamma-Interferon ein.
Eine Behandlung, die gemäß der Erfindung unabhängig oder gemeinsam mit dem oben erwähnten Verfahren durchgeführt werden kann, ist die ex vivo Behandlung der phagozytischen Zellen, wobei man sie gegenüber den Stimulatorverbindungen aussetzt. Zum Beispiel kann einem Patienten eine extrakorporale Blutbehandlung verabreicht werden, bei der das Blut des arteriellen und venösen Systems aus dem Körper abgeleitet wird und durch eine Vorrichtung geführt wird, die stimulatorische Verbindungen und/oder costimulatorische Mittel enthält, die geeignet angeordnet sind, daß sie mit den phagozytischen Zellen im Blut in Kontakt kommen. Die Stimulatorverbindungen und/oder costimulatorischen Mittel können immobilisiert werden oder man läßt sie in den Strom der Körperflüssigkeit eintreten.
In dem Beispiel, wo die Behandlung die in vivo Verabreichung der Stimulatorverbindung und/oder stimulatorischen Mittel umfaßt, kann eine solche Verabreichung durch bekannte Techniken, die orale Techniken und parenterale Techniken wie intradermale, subkutane, intravenöse oder intraperitoneale Injektion, Katheterisierung oder andere herkömmliche Mittel einschließen, erzielt werden. Die Stimulatorverbindungen oder -mischungen von diesen können in geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine solche Verabreichung hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können phagozytische Zellen stimuliert werden, um deren Fähigkeit, daß sie Zielmakromoleküle durch Einstellung des Insulinspiegels in der Körperflüssigkeit erkennen und entfernen, zu steigern. Insbesondere kann die künstliche Verringerung der Insulinspiegel durch diätetische Beeinflussung und/oder durch die Verwendung von pankreatischer Beta-Zellsuppression, die allein oder in Kombination mit der Verabreichung der oben diskutierten Mittel durchgeführt wird, erzielt werden. Somit übt dieses zusätzliche Verfahren eine positive Wirkung auf die Aktivität der phagozytischen Zellen aus und fördert die vermehrte Aufnahme und Eliminierung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
Verschiedene Krankheitsbilder wie altersbedingte oder diabetesbedingte Verhärtung der Arterien, der Hautrunzelung, der arteriellen Blockade und diabetischer retinaler und renaler Schädigung sind alle das Ergebnis des übermäßigen Aufbaus oder Abfangens, was auftritt, wenn das Vorhandensein von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung ansteigt. Demzufolge berücksichtigt ein therapeutisches Verfahren, bei dem die Erfindung angewendet werden kann, das allgemein versucht, solche Krankheitszustände abzuwenden, die Verabreichung der Mittel der vorliegenden Erfindung entweder direkt oder in geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen, um die phagozytischen Zellen zu stimulieren, daß sie die Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung mit größerer Geschwindigkeit und Wirksamkeit aus dem Körper entfernen und dadurch den Beginn der hier erwähnten Krankheitszustände abwenden. Spezifische Verabreichungsprotokolle können variieren und würden über die spezifische Anweisung von qualifizierten medizinischen oder veterinärmedizinischen Anwendern bestimmt werden.
Das vorliegende Verfahren hat eine besondere therapeutische Verwendung, da sich der Maillardprozeß auf mehrere der bedeutenden Proteinmengen im Körper, darunter Collagen, Elastin, Linsenproteine und die glomerulären Basalmembranen der Niere, akut auswirkt. Diese Proteine verschlechtern sich sowohl mit dem Alter (daher die Verwendung des Begriffes "Proteinalterung") als auch als ein Ergebnis der verlängerten Aussetzung gegenüber Blutzucker und der AGE-Bildung. Folglich führt die gesteigerte Fähigkeit, Endprodukte der Glykosylierung aus dem System des Tieres zu entfernen, zu der Aussicht einer vorteilhaften Behandlung der bedeutenden nachteiligen Wirkungen zahlreicher Krankheitszustände einschließlich Diabetes und natürlich zur Verbesserung der Qualität und wahrscheinlich zur Verlängerung des Tierlebens.
Eine weitere therapeutische Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt auf dem Gebiet der Immunologie. Insbesondere können Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung im allgemeinen und FFI im besonderen an Antigene gekoppelt werden, und phagozytische Zellen können dann gegenüber diesem gekoppelten Komplex ausgesetzt werden, um die Aufnahme und den Verdau dieses gekoppelten Komplexes von solchen Zellen zu fördern. Die phagozytischen Zellen würden dann den verdauten Komplex dem Immunsystem des Herkunfttieres präsentieren, um die Entwicklung von Antikörpern gegen das besondere Antigen hervorzurufen. Auf diese Weise können Antigene, die anderenfalls keine immunologisch signifikante Antwort hervorrufen könnten, immunologisch reaktiver gemacht werden, um wirksame Abwehrmittel (defenses) gegen das Antigen zu entwickeln. Das vorstehende Verfahren könnte in vivo oder ex vivo ausgeführt werden, da zum Beispiel der gekoppelte Komplex, der das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung oder FFI einschließt, entweder in den Körper des Tieres eingebracht werden könnte oder phagozytische Zellen könnten auf extrakorporale Weise aus dem Tier isoliert werden und dadurch mit dem gekoppelten Komplex in Berührung kommen, wonach die phagozytischen Zellen mit ihren vermehrten Rezeptoren in den Tierkörper wieder eingebracht werden könnten, um das Immunsystem geeignet zu stimulieren, Antikörper zu entwickeln.
Eine Variante des vorstehenden Protokolls beabsichtigt, daß die Stimulation der phagozytischen Zellen eine direkte Wirkung gegen das Antigen entfaltet. In diesem Verfahren wird ein für das Zielantigen spezifischer Antikörper markiert mit einem oder an ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung wie FFI gekoppelt, und das markierte/gekoppelte Material wird dann in vivo eingebracht, um die Anregung der Aktivität der Phagozyten gegen dieses Material zu fördern. Das markierte/gekoppelte Material würde an das Zielantigen binden und der sich ergebende Komplex würde von den Phagozyten, die das AGE oder FFI erkennen, angegriffen werden. Der Angriff würde entweder direkt oder über die Sekretion eines Monokins wie Cachectin erfolgen, wobei die Nekrose des Antigens verursacht wird. Die Phagozyten könnten durch die vorher beschriebenen Mittel in vivo oder ex vivo zuvor aktiviert werden. Dieses Protokoll besitzt, wie das oben beschriebene, eine besondere Verwendbarkeit als eine mögliche Behandlung des erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrome) und anderen, tumorösen oder viralen Infektionen.
Zusätzlich berücksichtigt die vorliegende Erfindung bestimmte diagnostische Anwendungen einschließlich der Entwicklung eines Untersuchungssystems zum Screening nach möglichen Drogen, die wirksam sind, als Mittel zu wirken, die Aktivität von besonderen phagozytischen Zellen gegen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung zu stimulieren. In einem Beispiel könnte eine mögliche Testdroge an eine Makrophagenprobe verabreicht werden, um deren stimulatorische Wirkung zu bestimmen, wobei Kontroliproben jeweils eine bekannte Stimulatorverbindung, wie die oben aufgeführten, und überhaupt keine Stimulation erhalten. Weiter könnte eine besondere phagozytische Zeliprobe untersucht werden, um unter den bekannten die Mittel, die am wirksamsten bei der Stimulierung einer solchen zellulären Aktivität sind, wenn eine solche Stimulation möglich ist, durch die Beimpfung von Reihen identischer Probenkolonien mit verschiedenen der bekannten oben aufgeführten Mitteln zu bestimmen, wobei solche Mittel geeigneterweise durch eine radioaktive Markierung oder anders markiert sind, um die Aktivität oder den Fortschritt bei der Stimulation durch die Aufnahme von solchen Mitteln von der besonderen Zellkolonie zu erfassen. Auf solche Weise würde die Kolonie, die die größte Aufnahme und Entfernung der markierten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung zeigt, das entsprechende Mittel identifizieren, das am wirksamsten bei dieser stimulatorischen Eignung ist.
Bei den obigen diagnostischen Techniken könnten Zellkolonien, die zur Stimulation geeignet sind, bestimmt werden, und in dem Beispiel, wo eine solche Eignung ersichtlich ist, könnten die Kolonien weiter untersucht werden, um zu bestimmen, ob bei dem besonderen Mittel, das geeignet ist, eine solche Stimulation zu erzielen, eine Unterscheidung ersichtlich ist.
Zusätzliche diagnostische Anwendungen betreffen das Studium einer Vielzahl von Parametern, die die Erkennung und Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung durch phagozytische Zellen begleiten, und die Bedeutung dieses Phänomens in bezug auf das Funktionieren des tierischen Systems. In einer ersten Ausführungsform können phagozytische Zellen wie Makrophagen aus dem Tierkörper entnommen werden und ex vivo durch Aussetzen gegenüber den Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung aktiviert werden. Diese aktivierten phagozytischen Zellen können dann mit Technetium radioaktiv markiert und danach in das Tier wieder eingebracht werden und man sie durch das tierische System zirkulieren läßt, wobei man die Radioaktivität abbildet, um die letztliche Lokalisierung der Zellen aufzuzeichnen. Auf diese Weise könnte die Lokalisierung von Konzentrationen an Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in dem tierischen Körper erkannt werden. Diese Technik ist insbesondere beim Erkennen unerwünschter Konzentrationen von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung wie atheromatöser Plaques verwendbar. Auf eine solche Weise könnte die Lokalisierung von systemischen Fehlfunktionen erkannt werden.
Auch könnte der Zustand des Systems für die Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung aus dem Körper durch die Herstellung von radioaktiv markierten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung und die Verabreichung dieser radioaktiv markierten Materialien an den Körper, um die Zeit, die für deren Erkennung, Aufnahme und Entfernung benötigt wird, zu bestimmen, gemessen werden. Solche Messungen könnten dann mit Standardmessungen, die durch die Untersuchung normaler Systeme unter den gleichen Parametern bestimmt werden, verglichen werden. Der vorstehende Test könnte zum Beispiel als ein Test für Diabetes oder andere Fehlfunktionen, die die Funktionsfähigkeit des AGE- Entfernungsystems des Körpers nachteilig beinflussen würden, durchgeführt werden. Alternativ kann dieses Verfahren ebenfalls auf extrakorporale Weise durchgeführt werden, wobei man aus dem Körper phagozytische Zellen entnimmt und sie auf ihre Wirksamkeit und Geschwindigkeit des Vorganges ex vivo mit radioaktiv markierten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung untersucht.
Eine weitere diagnostische Technik könnte das Vorhandensein eines Krankheitszustandes als eine Funktion des Aktivierungszustandes der phagozytischen Zellen in dem Körper des Tieres unter Untersuchung messen. So könnten Makrophagenzellen gegenüber besonderen radioaktiv markierten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, von denen man weiß, daß sie in Verbindung mit bestimmten Krankheitszuständen gefunden werden, ausgesetzt werden, und der Zustand der Stimulation der phagozytischen Zellen könnte dann im Vergleich mit geeignet entwickelten Normen beobachtet werden, um zu bestimmen, ob die phagozytischen Zellen in einem Aktivierungszustand sind, und, wenn dem so ist, den wahrscheinlichen Ursprung einer solchen Stimulation. Somit gibt das Vorhandensein besonderer AGEs in dem Körper entsprechend besondere Krankheitszustände wieder, und die Beobachtung der phagozytischen Zellen und die Bestimmung ihrer Empfindlichkeit und gesteigerten Stimulation in bezug auf besondere Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung würde das Vorhandensein eines besonderen Krankheitszustandes nahelegen.
Demzufolge ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das eine verbesserte Abtrennung und Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung aus tierischen Systemen zuläßt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wie vorstehend genanntes Verfahren bereitzustellen, daß durch die Stimulation von phagozytischen Zellen gekennzeichnet ist, deren Affinität und Fähigkeit für die Bindung, Aufnahme und den Abbau von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung zu steigern.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereitzustellen, die geeignet sind, bei dem vorstehend genannten Verfahren phagozytische Zellen zu stimulieren, daß sie fortgeschrittene Endprodukte binden, aufnehmen und abbauen.
Andere Aufgaben und Vorteile werden für solche Fachleute aus einer Betrachtung der nachfolgenden Beschreibung, die mit einem Hinweis auf die folgenden erläuternden Abbildungen fortfährt, ersichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

FIGUR 1 ist ein Diagramm, das die relative Bindung und Aufnahme von roten Blutzellen, die mit verschiedenen Mittel, einschließlich einem der Mittel der vorliegenden Erfindung, verändert wurden, darstellt.
FIGUR 2 ist ein Diagramm, das die kompetitive Inhibition bei der Bindung von roten Blutzellen, die durch die Einbringung eines Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung in eine Probe verursacht wird, veranschaulicht.
FIGUR 3 veranschaulicht die Bindung und Aufnahme von roten Blutzellen, die durch Umsetzung mit einer Vielzahl von Zuckern verändert wurden, durch Monozyten.
FIGUR 4 ist ein Liniendiagramm, das die Halbwertszeit von roten Blutzellen, die markiert und durch Verbindung mit einem Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung verändert wurden, im Vergleich mit einer Kontrolle veranschaulicht.
FIGUR 5 ist ein Balkendiagramm, das die relative Aufnahme und den Abbau von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung durch Mausmakrophagen, die gegenüber verschiedenen Stimulatorverbindungen ausgesetzt wurden, veranschaulicht.
FIGUR 6 ist ein Balkendiagramm, das ähnliche Daten wie in FIGUR in bezug auf einen Tag alte humane Monozyten veranschaulicht.
FIGUR 7 ist ein Balkendiagramm, das ähnliche Vergleichsexperimente veranschaulicht, die mit humanen Monozyten durchgeführt wurden, wobei das costimulatorische Mittel, gamma-Interferon, auch zugegeben und getestet wurde.
FIGUR 8 ist ein Diagramm, das die Wirkung von Insulin auf die Bindungsfähigkeiten von Mausmakrophagenzellen veranschaulicht, wobei eine normale Probe und eine durch Alloxan induzierte diabetische Makrophagenprobe verglichen wurden.
FIGUR 9 ist ein Diagramm ähnlich FIGUR 8, das einen Vergleich zwischen einer normalen oder Kontrollprobe von humanen Makrophagen mit solchen von hypo- und hyperinsulinämischen diabetischen Makrophagen in bezug auf die Bindungsfähigkeiten jeder der Proben veranschaulicht.
FIGUR 10 ist ein Diagramm ähnlich FIGUR 9, das ein Vergleich zwischen den gleichen Makrophagenproben in bezug auf deren Fähigkeit, Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung abzubauen, durchführt.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine Zusammensetzung und damit verbundene Verfahren zur Steigerung der Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in Tieren entwickelt, um die Proteinalterung zu behandeln und dadurch deren nachteiligen Wirkungen zu inhibieren. Im besonderen werden phagozytische Zellen wie Monozyten und Makrophagenzellen gegenüber einem oder mehreren Mitteln oder Stimulatorverbindungen ausgesetzt, die die Fähigkeit von solchen phagozytischen Zellen steigern, daß sie Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung erkennen, binden und abbauen.
Die vorliegende Erfindung ist auf der Beobachtung begründet, daß Monozyten und Makrophagenzellen die Fähigkeit haben, Makromoleküle, die einer Glukose-vermittelten Schädigung unterworfen wurden und die somit der Bildung eines Endproduktes 35 der fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu erkennen, zu entfernen und abzubauen. Insbesondere wurde bestimmt, daß Monozyten und Makrophagen spezifische Oberflächenrezeptoren für die Glukose-veränderten Makromoleküle haben, die den Zellen deren diesbezügliche Erkennung, Entfernung und Abbaufunktionen ermöglichen.
Die bisherige Arbeit hat in bezug auf Glukose-vermittelte Änderungen bei Proteinen ergeben, daß Glukose mit solchen Makromolekülen reagiert und zu Änderungen bei deren Eigenschaften führt, die sich mit deren normalen Funktion überlagern. Von Glukose ist bekannt, daß sie spezifisch mit den Aminogruppen von Proteinen ohne die Hilfe von Enzymen reagiert, wobei bewirkt wird, daß sie vernetzt oder covalent gebunden werden und dadurch andere Proteine einfangen.
Insbesondere kann Glukose zu Beginn mit einer Aminogruppe auf einem Protein reagieren und dadurch das bilden, was als ein reversibles Schiff-Basenaddukt bekannt ist. Das Addukt lagert sich dann um, um eine stabileres, aber noch reversibles Amadori-Produkt zu bilden. Das Amadori-Produkt, das ein zu Beginn glykosyliertes Protein ist, kann dann weitere Reaktionen durchführen, was in einem Beispiel die Reaktion mit einer zweiten glykosylierten Aminogruppe eines Proteines einschließt, wobei eine Vernetzung gebildet wird. Das Ergebnis dieser Reaktion ist die Umwandlung der beiden Glukosekomponenten und deren Aminogruppen in eine Verbindung, die früher von einem der Erfinder hier identifiziert und früher als FFI bezeichnet wurde. Diese Verbindung ist Teil einer komplexen Familie von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, die eine gelbe und fluoreszierende Erscheinung zeigen. Das Vorhandensein dieser Verbindung wurde durch die in vitro Reaktion von Glukose und Proteinen bestätigt, wobei bei der sich ergebenden Masse beobachtet wird, daß sie in der Farbe gelb bis braun wird. Diese Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung bilden sich einfach aus der Reaktion von Zuckern mit Proteinen und anderen Makromolekülen einschließlich DNA.
Das Amadori-Produkt kann auch mit einer zweiten Glukose reagieren, und das sich ergebende doppelt glykosylierte Derivat kann dann direkt mit der Aminogruppe eines nichtglykosylierten Proteines reagieren, um ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung (AGE, advanced glycosylation endproduct) zu bilden und dadurch die Proteine miteinander zu verbinden. Dieses Phänomen wurde "Einfangen" ("trapping") genannt und es wurde in vitro durch die Reaktion von Collagen, einem normalerweise unlöslichen Strukturprotein, und einem Low- Density-Lipoprotein, das ein zirkulierendes, lösliches Protein ist, als auch von Collagen mit Albumin und IgG gezeigt. Siehe Brownlee, M., et al., DIABETES, Bd. 34, Seiten 938-941 (1985); Brownlee, M., Pongor, S., und Cerami A., J. EXP. MED., Bd. 158, Seiten 1739-1744 (1983).
Die Glukose-vermittelte Vernetzung und das Einfangen von Proteinen ist in dem Körper ein normaler Vorgang, der über die Zeit zu Krankheitszuständen in vielen Geweben und Organen führt. Die interne Vernetzung von Proteinen oder die Vernetzung von zwei benachbarten Proteinen kann die mechanischen Eigenschaften von Strukturproteinen verändern. Änderungen in den immunologischen, enzymatischen, physikalischen und anderen Eigenschaften sind auch als ein Ergebnis der Vernetzung und des Einfangens bekannt. Zum Beispiel wurde beobachtet, daß die anomal hohen Glukosespiegel im Blut von Diabetikern zu einem anomalen Anstieg bei der Bildung von Vernetzungen und eingefangenen Proteinen führen, und es wurde postuliert, daß dies für die gesteigerte Krankhaftigkeit und Sterblichkeit der Gewebe verantwortlich sein könnte.
Das Einfangen führt zu einer anomalen Ansammlung von Proteinen in anomalen Bereichen, die zu Krankheitszuständen führen können. Beispiele des Krankheitszustandes, der durch Glukosevermittelte Vernetzung und Einfangung verursacht werden kann, schließt die Anhaftung von Lipoproteinen und anderen Plasmaproteinen an die Wände von koronaren Arterien ein, und die nachfolgende Ansammlung von Proteinen und Cholesterin führt zu arterieller Blockade und Herzanfällen. Ähnlich kann die Vernetzung von Collagen in der arteriellen Wand die mechanischen Eigenschaften der arteriellen Wand durch Versteifung von deren Struktur ändern und dadurch Kreislaufprobleme verursachen. Eine Verdickung der Basalmembran von kleineren Blutgefäßen in dem Körper und in der Niere, die sich aus der Einfangung und Vernetzung ergibt, führt zu einer peripheren Gefäßkrankheit und Verdickung der Basalmembran der Niere mit nachfolgendem Verlust der Nierenfunktion (Nephropathie). Außerdem führt die Verdickung von Gefäßwänden im Gehirn zu einem verringertem Blutfluß und kann zu dem Beginn von Senilität beitragen.
Die Vernetzung von Collagen und anderen Makromolekülen in der Haut kann zur Runzelbildung und anderen Änderungen führen als auch zu Änderungen bei dem diabetischen Auge, und schädigt insbesondere die Linse und die Gefäße der Retina, wobei das letztere Ereignis zu einem Verlust der visuellen Acuity und letztlich zur Blindheit führt. Schließlich ist von Glukose bekannt, daß sie mit DNA zu reagiert, und Experimente haben gezeigt, daß AGE-DNA in Bakterien mutagen sein kann.
Wie vorher erwähnt, sind phagozytische Zellen in der Lage, anomale Makromoleküle mittels Rezeptoren auf ihren Oberflächen, die spezifische chemische Strukturen erkennen und an sie binden, zu erkennen und zu entfernen. Sobald das anomale Makromolekül auf diesem Weg erkannt wurde, kann die phagozytische Zelle das Makromolekül oder das Teilchen, das das anomale Makromolekül enthält, internalisieren und kann es dann abbauen. In einigen Beispielen kann die phagozytische Zelle zusätzlich Enzyme und andere Faktoren sekretieren, um den extrazellulären Abbau des Moleküles oder des Teilchens zu unterstützen, wenn es nicht internalisiert werden kann. Nachdem das geschädigte Protein entfernt wurde, kann ein neues Wachstum von normalem Gewebe folgen, und eine normale Funktion des betroffenen Bereiches kann sich einstellen.
Phagozytische Zellen in dem Körper umfassen zahlreiche Arten von weißen Blutzellen. Eine Art weißer Blutzelle, der Monozyt, wird im Knochenmark hergestellt und zirkuliert kurz im Blut und geht danach in die Gewebe über, wo er ein Makrophage wird. Eine Aussetzung der phagozytischen Zelle, entweder als ein Monozyt oder ein Makrophage, gegenüber bestimmten Molekülen kann das Auftreten von Rezeptoren für diese Moleküle auf der Oberfläche der Zelle steuern.
Somit ist die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung begründet, daß die phagozytischen Zellen einschließlich Monozyten und Makrophagen durch Aussetzung gegenüber bestimmten Mitteln oder Stimulatorverbindungen, die die Fähigkeit dieser Zellen in bezug auf deren Erkennung und Affinität für Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung und die Fähigkeit, die Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung abzubauen, verstärken, verändert werden können. Insbesondere wurde gefunden, daß die Aussetzung dieser Zellen gegenüber bestimmten Stimulatorverbindungen, die Zahl der Rezeptoren, die auf diesen Zellen ausgebildet werden, vergrößert und dadurch die Kapazität und Wirksamkeit dieser Zellen in bezug auf die Erkennung und den Abbau von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung steigert.
Demzufolge umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung allgemein das Aussetzen des tierischen Körpers gegenüber Mitteln oder Stimulatorverbindungen, die den Körper und insbesondere dessen phagozytische Zellen veranlassen, aktiviert zu werden und deren Erkennung und Entfernung von Zielmakromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern.
Geeignete Stimulatorverbindungen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen Materialien einschließlich Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, die entweder natürlich oder synthetisch gebildet wurden, die allein oder gebunden an einen Träger verwendet werden können.
Geeignete Stimulatorverbindungen beinhalten die Verbindung FFI, die an ein Trägerprotein wie das Protein Albumin gebunden ist. Die Stimulatorverbindung kann auch ein synthetisch erhaltenes Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung umfassen, das zum Beispiel durch die Reaktion eines Proteines oder anderen Makromoleküles mit einem Zucker wie Glukose, Glukose-6- phosphat, oder anderen hergestellt wurde. Dieses Reaktionsprodukt könnte allein verwendet werden oder es könnte mit einem Träger auf die gleiche Weise wie der FFI-Albumin- Komplex verbunden werden.
Der Träger kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Kohlenhydraten, Proteinen, synthetischen Polypeptiden, Lipiden, biokompatiblen natürlichen und synthetischen Harzen, Antigenen, und Mischungen davon besteht.
Wie hier verwendet beeinhaltet der Begriff "Antigen" verschiedene eindringende Stimuli, die den Beginn eines Krankheitszustandes oder einer anderen organischen Störung wie Protein- und Lipidfragmente, Bakterien, Viren und/oder anderen Organismen eines ähnlichen Ursprungs und Wirkung umf aßen oder verursachen können.
Stimulatorverbindungen schließen auch Monokine ein, die phagozytische Zellen stimulieren, daß sie ihre Aktivitäten gegen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung steigern.
Ein besonderes Monokin, das als eine Stimulatorverbindung wirkt, umfaßt das Protein, das als Tumornekrosefaktor (TNF) bekannt ist, und dessen Variante, die von einem der Erfinder hier entdeckt und isoliert und als "Cachectin" bezeichnet wurde. Dieses Material kann allein oder in Verbindung mit anderen Stimulatorverbindungen verabreicht werden.
Außerdem können die Stimulatorverbindungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Materialien, die hiernach als "costimulatorische Mittel" bezeichnet werden, verabreicht werden. Bei der gemeinsamen Verabreichung der stimulatorischen Verbindung mit den costimulatorischen Mitteln wurde gefunden, daß sie die Aktivität des ersteren steigern. Geeignete costimulatorische Mittel schließen Monokine wie Interleukin-1 (IL-1) und gamma-Interferon ein.
In bezug auf die Herstellung der Stimulatorverbindung, die FFI, das an ein Trägermolekül wie Albumin gekoppelt ist, umfaßt, kann die synthetische Verbindung FFI-Hexansäure bei dessen Herstellung verwendet werden. Somit wird ein wasserlösliches Carbodiimid verwendet, um die Säuregruppe der FFI-Hexansäure an eine Aminogruppe an dem Protein zu binden. Dieses Konjugat wird nach der Reinigung in vitro verwendet, um Makrophagen zu stimulieren. Nach einer Inkubation für 4 bis 24 Stunden kann gezeigt werden, daß solche Makrophagen aktiver AGE-Albumin binden, internalisieren und abbauen.
Die nachteiligen Wirkungen der Ansammlung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung bei Tieren führt zu solchen Zuständen wie alters- oder diabetesbezogene Verhärtung der Arterien, Hautrunzelung, arteriellen Blockade und diabetische retinale und renale Schädigung durch die übermäßige Ansammlung oder das Einfangen, das erfolgt, wenn die Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung mengenmäßig ansteigen. Demzufolge umfaßt ein therapeutisches Verfahren, das versucht, die Krankheitszustände, die wenigstens zum Teil durch die Ansammlung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in dem Körper verursacht werden, abzuwenden, die Verabreichung der Mittel der vorliegenden Erfindung entweder direkt oder in geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen, um den Körper zu stimulieren, daß er seine Aktivität in bezug auf die Erkennung und Entfernung von solchen Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung steigert. Insbesondere werden die Mittel verabreicht, um die phagozytischen Zellen in dem Körper zu stimulieren, deren Aktivität in bezug auf die Erkennung und Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung zu steigern, so daß die Entfernung mit größerer Geschwindigkeit und Wirksamkeit erfolgt. Spezifische Verabreichungsprotokolle würden variieren und würden gemäß der Anweisung eines qualifizierten medizinischen oder veterinärmedizinischen Anwenders bestimmt werden.
Demzufolge beinhaltet die vorliegende Erfindung auch geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung bei den therapeutischen Verfahren der Erfindung, die die Mittel der vorliegenden Erfindung, die in einem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger hergestellt werden, umfassen. Solche Träger sind bekannt und können in der Zusammensetzung und/oder der Konzentration, was von der Art der Verabreichung, d.h. oral, parenteral, etc. abhängt, variieren.
Die vorliegende Erfindung wird aus einer Betrachtung der folgenden veranschaulichenden Beispiele und Daten, die die Aktivitäten der phagozytischen Zellen und deren Bezug zu den entdeckten Stimulatorverbindungen, die hiermit in Übereinstimmung sind, bestätigen, besser verstanden.

Beispiel 1

In der Untersuchung, die folgt, wurde das Vorhandensein des in vivo Klärsystemes von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung bestätigt und studiert, und die Grundsätze der vorliegenden Erfindung wurden aufgestellt.

Materialien und Verfahren

RBZ-Herstellung:

Humanes Blut (2,0 ml) von normalen, gesunden erwachsenen Freiwilligen wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt. Nach dem Entfernen von Plasma und der Leukozytenschicht (buffy coat) wurden die RBZ viermal mit 10 Vol an Ca²&spplus;- und Mg²&spplus;-freier Phosphat gepufferter Sahne (PBS, phosphate buffered saline), pH 7,4, gewaschen und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium resuspendiert.

Herstellung von opsonisierten RBZ:

0,1 ml einer 15% RBZ- Suspension eines B&spplus;-Spenders wurden zu 0,5 ml eines Anti-D- Serums mit großem Titer gegeben und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS (GIBCO) gewaschen und in 3 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium resuspendiert.

FFI-RBZ-Herstellung:

Das spezifische Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung (AGE) [2- (2-Furoyl)-4(5)-(2- furanyl)-1H-imidazol]-hexansäure (FFI-HA) wurde wie früher beschrieben hergestellt(Pongor et al., PNAS (1984) Bd. 81, Seiten 2684-2688). In Kürze, Furylglyoxalhydrat (10 mmol) in 3:1 Dioxan/Wasser wurde mit 6-Aminohexansäure (15 mmol) und Triethylamin (15 mmol) behandelt und bei 25ºC für eine Stunde gerührt. Nach der Zugabe von konzentriertem wässrigen Ammoniak wurde die Mischung mit 5% NaH&sub2;PO&sub4; verdünnt und mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, in Salzlösung gewaschen und über Aktivkohle und MgSO&sub4; filtriert. Das Rohprodukt wurde durch Mitteldruckchromatographie auf Kieselgel gereinigt, wobei man FFI-HA als strohfarbene Flocken (Fp. 105-106ºC) erhielt. Frisch gewaschene normale RBZ wurden in PBS mit und ohne 10 mM wasserlöslichen 1-Cyclohexyl-3-[2-(4-morpholinyl)-ethyl]- carbodiimid (CMC) (Vlassara, et al., (1985), Bd. 82, Seiten 5588-5592) resuspendendiert, zu denen FFI-HA in verschiedenen Konzentrationen (10-100 M) gegeben wurde. Die Mischungen wurden unter kontinuierlichem Mischen für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Parallele Mischungen, die RBZ allein in PBS oder RBZ und Carbodiimid (10 mM) enthielten, wurden wie die Kontrollen identisch behandelt. Nach drei Waschgängen wurden die Zellen in 1 mM Glycin in PBS resuspendiert, und man ließ sie für 30 Minuten inkubieren. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in RPMI vor dem Phagozytose-Test in einem 100-fachen Überschußverhältnis mit Monozyten suspendiert.

Glykosylierte RBZ-Herstellung:

Um nichtenzymatisch glykosylierte Erythrozyten herzustellen, wurde Glukose, Glukose-6-phosphat, Xylose und Arabinose zu den frisch isolierten normalen humanen roten Zellen, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium suspendiert sind, in 100 mM Konzentrationen zugegeben und für 48 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. RBZ-Suspensionen ohne zugegebenen Zucker wurden als Kontrollzellen verwendet. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und in RPMI suspendiert.
AGE-BSA wurde durch Inkubieren von Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin) in 50 mM Glukose bei 37ºC für 6 Wochen in der Gegenwart von Proteaseinhibitoren (PMSF 1,5 mM, EDTA 0,5 mM) und Antibiotika (Penicillin 100 E/ml, Gentamicin 40 mg/ml) hergestellt. Siehe Vlassara et al. oben.)

Bereitstellung menschlicher Monozyten:

Die Leukozytenschicht (buffy coat) aus 100 ml frischem menschlichen Blut wurde zweifach mit Saline, 1 mM EDTA, pH 7,4, verdünnt, und mononukleäre Zellen wurden von anderen Bestandteilen des Blutes durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Hipoque-Paque-Gradienten abgetrennt, wie vorher beschrieben (Gimelig-Meyling et al. (1950), J. IMMUN. METHODS, Bd. 33, Seite 1). Die mononukleären Zellen wurden dreimal in kaltem RPMI 1640 (GIBCO) gewaschen, um Thrombozyten zu entfernen, und die Zellen wurden in RPMI, das 10%ig in normalem humanen Serum hergestellt wurde, suspendiert. Um Suspensionen von Monozyten für die Verwendung in diesen Experimenten zu erhalten, wurde das vorher beschriebene Percoll-Reinigungsverfahren verwendet (Gimelig-Meyling, oben). Das Percoll wurde durch die Zugabe von 0,1 Vol an 10-X konzentriertem PBS isoton eingestellt. Ein ml an normalem humanen Serum, 14,7 ml PBS und 22 ml an isotonischem Percoll wurden in einem sterilen 50 ml Zentrifugationsröhrchen gemischt und für 25 Minuten mit 18000 Upm bei 5ºC in einem Sorvall SS-34 Rotor zentrifugiert. Fünf ml der mononukleären Suspension wurden auf den sich einstellenden Gradienten geschichtet, und die Röhrchen wurden mit 1500 g für 25 Minuten bei 5ºC in einem Ausschwingrotor zentrifugiert. Die sich ergebenden Banden wurden mittels Lichtstreuung detektiert, und Bande 1, die den Monozyten entspricht, wurde überführt und in Schraubverschluß- Teflongefäßen (Savillex, Minnetonka, MN) mit 10&sup6;/ml in RPMI mit 12,5% humanem Serum bei 37ºC unter 5% CO&sub2; für 5-7 Tage kultiviert. Die Zellebensfähigkeit wurde durch Trypanblau- Ausschluß (GIBCO) beurteilt, und der Ausplattierungswirkungsgrad von Phagozyten auf einer Gewebekulturplastikoberfläche wurde mittels eines Hämozytometers vor und nach der Anhaftung gemessen. Wenn gebrauchsfertig, wurden Teilmengen von 10&sup6; Monozyten in sterilen Petrischalen ausplattiert, die vorgereinigte runde Deckplättchen (coverslips) enthielten, und für zwei Stunden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; inkubiert.

Phagozytosetest:

Vor der Zugabe von RBZ wurden die Monozytenkulturen zweimal mit RPMI 1640 gewaschen. Die verschiedenen roten Zellsuspensionen wurden in jeden Napf in einem 100-fachen Überschuß zu den Monozyten zugegeben, und man ließ sie bei 37ºC und 5% CO&sub2; für bis zu zwei Stunden inkubieren. Zu diesem Punkt wurden die Deckplättchen aus den Näpfen entnommen, dreimal mit RPMI gewaschen, um nichtanhaftendes Material zu entfernen, in sauberen Näpfen angeordnet und mit 1,25% Glutaraldehyd in PBS für 30 Minuten fixiert. Um die an der Oberfläche anhaftenden von aufgenommenen Erythrozyten zu unterscheiden, wurde eine hypotone Lösung (PBS verdünnt 1:4 in H&sub2;O) zu ausgewählten Näpfen für 10 Sekunden zugegeben, gefolgt von der Zugabe eines Fixiermittels. Um den Test auszuwerten, wurden die Deckplättchen im Doppel unter Verwendung von 40X Phasenmikroskopie ausgezählt. Wenigstens 300 Monozyten aus drei oder mehr zufällig ausgewählten Feldern wurden pro Napf gezählt. Die Daten wurden als die Zahl an positiven Monozyten (Monozyten mit anhaftenden oder aufgenommenen Erythrozyten) pro 100 Monozyten (Bindung in Prozent) ausgedrückt. Der Aufnahmeindex wurde auch als die Zahl von aufgenommenen oder anhaftenden roten Zellen pro positivem Monozyt bestimmt (Bianco et al. (1976) J. EXP. MED., Bd. 144, Seite 1531).

FFI-RBZ Halbwertszeittest:

BALB/c Inzuchtmäuse wurden durch Herzpunktion geblutet, wobei man annähernd 2,0 ml Blut erhielt. Die roten Blutzellen wurden mit großen Volumina PBS, die frei von divalenten Kationen war, gewaschen und mit FFI-HA wie oben beschrieben in der Gegenwart von 10 mM CMC gekoppelt. Weiterhin wurden RBZ, die in CMC allein oder PBS allein inkubiert wurden, als Kontrolle verwendet. Nachfolgend wurden alle Zellsuspensionen mit &sup5;¹Cr durch Zugabe von 0,2 mCi Na&sub2;[&sup5;¹Cr]O&sub4; zu 2 ml mit 50% vorliegenden RBZ (packed RBC) in RPML-1640 Medium für 1 Stunde bei 37ºC markiert. Die markierten Zellen wurden wenigstens viermal gewaschen, um nichtgebundenes Isotop zu entfernen. Zwölf BALB/c Mäusen wurden dann intravenös 200 l RBZ Suspension injiziert. Jede Probe wurde an drei BALB/c Mäusen verabreicht. In geeigneten Zeitabständen wurden die Mäuse geblutet (0,2 ml), und die Radioaktivitätslevel wurden durch Zählen gemessen.

Ergebnisse

Die maximale Bindung von roten Zellen wurde in vitro am Tag-7 der Monozyteninkubation beobachtet. Die maximale Bindung und Endozytose von FFI-RBZ war innerhalb von 30-45 Minuten vollständig, wobei opsonisierte Zellen innerhalb von 15 Minuten maximal gebunden wurden. Am Ende der einstündigen Inkubation von FFI gekoppelten RBZ mit kultivierten humanen Monozyten wurden die Prozent an Phagozytose und der phagozytische Index bestimmt. Wie in Figur 1 gezeigt, waren die % Erythrophagozytose von FFI-modifizierten roten Zellen (55%) und IgG-beschichteten roten Zellen (70%) bedeutend höher als bei den Kontroll-PBS-behandelten Zellen (4%). Ähnlich war der phagozytische Index von FFI-behandelten RBZ stark erhöht (3,4) verglichen mit normalen Kontrollen (1,2).
Um die Spezifität der Wechselwirkung von FFI-RBZ mit den humanen Monozyten zu ermitteln, wurden Kompetitionsexperimente ausgeführt, bei denen die Bindung und Aufnahme von roten Zellen in der Abwesenheit und Anwesenheit von AGE-BSA, das wie in den beschriebenen Verfahren (Vlassara et al., oben) hergestellt wurde, beobachtet wurde. Wie in Figur 2 gezeigt, inhibierte die Zugabe von AGE-BSA bei Konzentrationen von 500 g/ml die FFI- RBZ Bindung zu mehr als 70%, bezogen auf die Kontrolle. Im Gegensatz dazu inhibierte AGE-BSA nicht die Bindung und Phagozytose von opsonisierten oder PBS-behandelten roten Zellen, sogar bei maximalen Konzentrationen (1 mg/ml). Diese Daten legten nahe, daß FFI-modifierte rote Zellen erkannt und spezifisch über die Monozyten AGE-Bindestelle gebunden wurden.
Die Bildung des Endproduktes der fortgeschrittenen Glykosylierung (AGE) wurde dann auf den Oberflächen von roten Zellen durch 48-stündige Inkubation in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das verschiedene Zucker wie Glukose, Glukose-6- phosphat, Xylose und Arabinose in 100 mM Konzentrationen enthielt, bei Zimmertemperatur induziert. Am Ende dieses Zeitraumes zeigten die Medien keine Merkmale von Zellyse, und die roten Zellen erschienen selbst mikroskopisch ununterscheidbar von den Kontrollen. Wie durch RIA gezeigt wurde (das Verfahren von Chang et al., (1985) J. BIOL. CHEM., Bd. 260, Seiten 7970-7974), bildeten alle Zellen, die in Zucker inkubiert wurden, eine signifikante Menge an Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung auf deren Zellmembranen, verglichen mit den Kontrollen. An diesem Punkt wurden die RBZ aus allen Gruppen einem normalen humanen Monozyten-Phagozytosetest unterworfen. Wie in Figur 3 angezeigt, zeigten in Glukose-inkubierte RBZ eine 15prozentige Bindung und Aufnahme und G6P-behandelte RBZ eine 26%, verglichen mit 6% Bindung und Aufnahme von Kontroll-PBS-RBZ. Einen wesentlich geringerer Bindungslevel wurde mit roten Zellen, die mit Xylose und Arabinose vorinkubiert wurden (jeweils 7,5%), festgestellt.
Um zu bestimmen, ob autologe rote Blutzellen, die durch ein AGE wie FFI-HA verändert wurden, in vivo von Makrophagen erkannt und aus der Zirkulation schneller als die nichtmodifizierten Zellen entfernt werden können, vermutlich durch den gleichen AGE-Rezeptor, der auf Leber- und Milzmakrophagen vorhanden ist, wurden rote Zellen aus einer BALB/c Inzuchtmaus entweder mit FFI-HA, wie bei den Verfahren beschrieben, oder mit PBS allein für eine Stunde bei Zimmertemperatur behandelt. Als eine weitere Kontrolle wurden Mauszellen mit Carbodiimid allein (10 mM) behandelt. Im Anschluß an die &sup5;¹Chrom-Markierung wurden alle drei Gruppen von Zellen intravenos in syngene Mäuse reinjiziert, und die Erythrozytenradioaktivität wurde für 20 Tage beobachtet. Ungefähr 9% der anfänglichen Radioaktivität wurde bei allen Gruppen innerhalb der 1 Stunde nach der Injektion in der Serumfraktion zurückgewonnen, vermutlich aufgrund traumatischer Hämolyse, die durch die ex vivo Behandlung verursacht wurde, da sie auf 0,4% innerhalb der ersten 24 Stunden verringert wurde. Wie in Figur 4 gezeigt, wurde die Halbwertszeit von FFI-behandelten roten Zellen auf sieben Tage verringert, verglichen mit der Halbwertszeit unbehandelter Kontrollzellen von ungefähr 20 Tagen. Ähnlich hatten Zellen, die mit Carbodiimid allein behandelt wurden, einen annähernd normalen in vivo Zeitverlauf.

Diskussion

Die obigen Untersuchungen erweitern die bisherigen Beobachtungen bei der Erkennung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung (AGE) durch einen spezifischen Monozyten/Makrophagen-Rezeptor und beweisen, daß solche Addukte, sobald sie chemisch gebunden oder in vitro auf der Oberfläche von intakten humanen Zellen gebildet sind, die Zellbindung und Aufnahme durch normale humane Monozyten induzieren können. Es wird gezeigt, daß das Vorhandensein von AGE auf der Zelloberfläche in signifikanten Mengen gegenüber den nichtmodifizierten Zellen in vivo zu deren verkürzten Überleben führt, vermutlich aufgrund der schnelleren Entfernung dieser AGE-Zellen durch die phagozytischen Zellen der Milz und Leber. Der Mechanismus der Erkennung und Entfernung von solchen modifizierten Zellen scheint über den spezifischen Makrophagen AGE-Rezeptor vermittelt zu werden, wie durch die kompetitive Inhibition allein von AGE-roter Zellbindung in der Gegenwart eines großen Überschußes an AGE-BSA gezeigt wird (Vlassara et al., oben).
Mit der Alterung werden nichtenzymatisch glykosylierte Proteine normalerweise weiteren Modifikationen und Umlagerungen unterworfen, die zu der Bildung von steigenden Mengen an AGEs führen, wie es bei normalem humanen Dura-Collagen (Monnier et al. (1984) PNAS, Bd. 81, Seiten 583-587) gezeigt wurde. Ein spezifisches Endprodukt, das FFI, wurde in vivo auf normalem humanen Serumalbumin und Globin identifiziert (Pongor et al., (1984) PNAS, Bd.81, Seite 2684). Die AGE-Rezeptorerkennung verstärkt sich mit der Menge an AGE und kann daher ein zeitabhängiges Signal für die Entfernung von alternden Makromolekülen bevorzugt erkennen (Vlassara et al. oben).
Bei der nichtenzymatischen Glykosylierung von Erythrozyt- Membranproteinen ist früher gezeigt worden(Miller et al., (1980) J. CLIN INVEST. Bd. 65, Seiten 896-901), daß sie primär auf den Lysinresten von allen der Hauptproteinbanden ohne Unterscheidung erfolgt und daß sie bei Diabetes verstärkt ist, während sie bei einer hämolytischen Anämie verringert ist. Diese Ergebnisse haben nahegelegt, daß die Veränderung von Membranproteinen, anders als die durch Blutglukose, nicht nur von der Glukosekonzentration, sondern auch von dem Erythrozytenalter abhängt. Die vorstehenden Experimente zeigen, daß AGE auf normalen intakten roten Blutzellen vorhanden ist, was zum Teil für die tägliche Entfernung von Erythrozyten aus der Zirkulation durch den Monozyten/Makrophagen AGE-Rezeptor verantwortlich sein könnte. Weiterhin kann die AGE-Ansammlung durch Aussetzung gegenüber hohen Glukosespiegeln beschleunigt werden, was wiederum zu einer verstärkten Monozyten AGE- Rezeptorbindung und Aufnahme von mit Glukose-modifizierten roten Blutzellen führt, und dieses könnte eine Rolle bei dem mittelmäßig verkürzten Erythrozytenfortbestand bei Diabetes spielen (Peterson, C.M., et al., (1977) ANN. INT. MED., Bd. 86, Seiten 425-429).
Der Unterschied bei der Erythrozytenbindung zwischen Glukose- und Glukose-6-phosphat-behandelten Zellen ist wahrscheinlich auf die größere Menge an gebildetem AGE zurückzuführen, infolge des Vorhandenseins eines höheren Prozentsatzes an reaktiveren offenen Ringstrukturen in der Inkubationsmischung im Fall von Glukose-6-phosphat. Obwohl Xylose und L-Arabinose beide schneller als Glukose mit Proteinaminogruppen reagieren können, wie durch die Menge an gebildeten AGE gezeigt wird, induzieren diese überraschenderweise nicht eine Bindung und Aufnahme, die oberhalb der normalen Kontrollzellen liegt. Dieses Phänomen rechtfertigt eine weitere Untersuchung, obwohl es wahrscheinlich auf die Bildung von Glykosylierungsprodukten zurückzuführen ist, die nicht durch den AGE oder einen anderen Monozytenrezeptor erkannt werden.

Beispiel 2

Die folgende Serie von Experimenten wurde durchgeführt, um die Eignung von Mitteln zu messen, phagozytische Zellen zu stimulieren, die Aufnahme und den Abbau von Endprodukten (AGEs) zu stimulieren.
Demzufolge wurde eine Anzahl von AGEs unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie oben in Beispiel 1 offenbart, hergestellt. Somit wurde FFI-HA wie beschrieben hergestellt und Mengen davon wurden sowohl an humanes als auch an Rinderalbumin gebunden. Ein wasserlösliches Carbodiimid wurde verwendet, um die Säuregruppe des FFI-HA an eine Aminogruppe an dem Protein zu binden. Nach der Herstellung wurde das Konjugat gereinigt und dann in vitro verwendet, um Makrophagen durch eine Inkubation für 4 bis 24 Stunden zu stimulieren. Die AGEs, die in bezug auf die Aufnahme und den Abbau beobachtet werden sollten, wurden geeignet radioaktiv markiert, so daß sie beobachtet werden konnten. Danach wurden die stimulierten Makrophagen durch Aussetzen gegenüber den radioaktiv markierten AGEs untersucht, gefolgt von einem Aussetzen gegenüber verschiedenen Mitteln, um die Wirkung zu messen, die diese Mittel auf die Fähigkeit der Makrophagen hatten, die markierten AGEs aufzunehmen und abzubauen. Die obigen Verfahren und die Studien, die folgen, sind in Übereinstimmung mit dem Protokoll, das von Vlassara et al., oben angewandt wurde.
So zeigt Figur 6, Teil 1 die Aufnahme von AGE-BSA von humanen Monozyten nach der Stimulation mit bestimmten Mitteln in der Abwesenheit von gamma-Interferon. Das FFI-humane Albumin hatte bei 0,1 und 0,2 mg/ml eine stimulatorische Wirkung auf das Aufnahmesystem (jeweils Balken E und F), verglichen mit der Kontrolle (Balken A). FFI-Rinderalbumin ist auch stimulatorisch (Balken E', F' und G'). Gamma-Interferon allein (Balken C) oder Lipopolysaccharid allein (Balken B) oder Interleukin-1 allein (Balken W) haben keine stimulatorische Wirkung.
Figur 6, Teil II zeigt den Abbau von AGE-BSA durch humane Monozyten in der Gegenwart dieser Mittel bei Abwesenheit von gamma-Interferon. Die FFI-BSA-Herstellungen waren leicht stimulatorisch (Balken Y). In Figur 7, Teil 1 wird die Wirkung der Stimulation auf die Aufnahme von AGE-BSA von denselben Mitteln in der Gegenwart von 10 Mikrogramm/ml an humanem gamma- Interferon gezeigt. Wie gesehen werden kann, verstärkt gamma- Interferon die Stimulation durch 0,01, 0,02, und 0,05 mg/ml an FFI-BSA (Balken N, O und P) stark (bis zu 8-fach). Der Abbau wird in der Gegenwart dieser Mittel plus gamma-Interferon auch verstärkt (Figur 7, Balken V).
Es ist auch gezeigt worden, daß Monozyten- oder Makrophagenzellen auch durch AGE-Trägermoleküle stimuliert werden können, was zu Zellen mit gesteigerter Fähigkeit führt, andere AGE-Moleküle zu binden, aufzunehmen und abzubauen. Die AGE-Trägermoleküle werden zum Beispiel über die Umsetzung von Glukose oder Glukose-6-phosphat mit Albumin hergestellt. Nach der Reinigung des Reaktionsproduktes wird die AGE-Albumin Aufnahme von AGE-Makromolekülen wie oben in (A) gezeigt. Das AGE-BSA (hergestellt über die Inkubation von Glukose-6-phosphat mit Albumin für 6 bis 8 Wochen) hat mit 0,1 mg/ml eine stimulatorische Wirkung auf die AGE-BSA-Aufnahme von humanen Monozyten (Figur 6, Balken AA) und zeigt eine leichte Stimulation bei höheren Konzentrationen (Balken BB und CC).
Figur 7, Balken S, zeigt, daß, in der Gegenwart von gamma- Interferon, 0,5 mg/ml aus Glukose-6-phosphat hergestelltes AGE- BSA die Aufnahme von AGE-BSA durch Makrophagen stark stimuliert. Die niedrigeren Konzentrationen zeigen eine leichte stimulatorischen Wirkung (Balken Q und R).
Der Abbau von AGE-BSA durch humane Monozyten wird auch durch AGE-BSA in der Gegenwart von gamma-Interferon stimuliert (Figur 7, Balken X) . Ohne Interferon ist die Stimulation leicht (Figur 6, Balken Z).
Peritoneale Makrophagen aus der Maus zeigten eine verstärkte Aufnahme von AGE-BSA, wenn sie mit AGE-BSA, das aus Glukose-6- phosphat hergestellt wurde, stimuliert werden (Figur 5, Balken GG). Der Abbau ist auch verstärkt (Figur 5, Balken NN).
Wie vorher diskutiert, können phagozytische Zellen wie Makrophagen stimuliert werden, um aktiviert zu werden und AGE- Makromoleküle zu entfernen, nachdem man die Makrophagen mit einem Monokin wie mit Cachectin (Synonym = Tumornekrosefaktor) behandelt. Die Struktur und Eigenschaften des Cachectins sind früher durch einen der Erfinder hier aufgeklärt worden. Es wurde bestimmt, daß Cachectin bei einer Konzentration von 20 ng pro Milliliter an Kulturflüssigkeit Macrophagen stimuliert, den AGE-Rezeptor zu exprimieren und die Bindung, Aufnahme und den Abbau von AGE-Makromolekülen zu steigern. Die Vorinkubation von Mausmakrophagen für 24 Stunden mit 20 ng/ml an Cachectin/TNF (ohne gamma-Interferon), gefolgt von einer Inkubation mit AGE- BSA, führt zu einem 4-fachen Anstieg bei der AGE-BSA (hergestellt aus Glukose, die mit Albumin umgesetzt wurde) Aufnahme (Figur 5, Balken FF). Der Abbau ist auch bei 50% der Kontrolle verstärkt (Balken MM).
Ähnlich führt die Vorinkubation von 1-Tag-alten humanen Monozyten für 24 bis 48 Stunden mit Cachectin ohne gamma- Interferon zu einer annähernden Verdopplung der Aufnahme und des Abbaus von AGE-BSA (Figur 6, Balken D). Der Abbau ist auch verstärkt (Balken 1).
Die obigen Beispiele an Mitteln, die Makrophagen stimulieren, um die Fähigkeit zu steigern, AGEs aufzunehmen und abzubauen, sollten nicht einschränkend sein. Andere Mittel beinhalten zusätzliche synthetische spezifische AGEs, die an Trägermoleküle gebunden sind, andere AGEs, die über die Reaktion von Zuckern mit Makromolekülen hergestellt sind, und andere Monokine, die Makrophagen stimulieren, daß sie deren Aktivität gegen AGEs steigern.
Diese Verfahren schließen die gemeinsame Verabreichung dieser Mittel und ein oder mehr costimulatorische Mittel wie Interleukin-1 und gamma-Interferon ein, um eine noch größere Stimulation des AGE-Entfernungssystems des Körpers zu erzielen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung könnten Makrophagen ex vivo mit diesen Mitteln behandelt und in den Körper zurückgegeben werden. Zum Beispiel kann eine extrakorporale Blutbehandlung durchgeführt werden, bei der Dauerzugänge (indwelling lines) in dem arteriellen und venösen System eines Patienten angeordnet werden, und dem Körper Blut entnommen wird, das durch eine Vorrichtung geleitet wird und dann dem Patienten zurückgegeben wird. Die Vorrichtung ist ausgelegt, daß sie Mittel zu enthält, die bei Kontakt mit oder bei Aussetzung gegenüber Monozyten/Makrophagen diese stimulieren, daß sie die Aktivität des AGE-Entfernungssystems steigern. Weiterhin können die Mittel entweder immobilisiert sein oder können geeignet sein, daß sie in den Blutstrom übergehen. Ein solches extrakorporales Verfahren kann allein oder gemeinsam mit der Verabreichung von anderen Mitteln an den Patienten, wie dem oben beschriebenen gamma-Interferon, um das Verfahren zu verbessern, durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der hier vorliegenden Erfindung betrifft die Beobachtung der Wirkungen des Insulins auf das Makrophagen AGE-Klärsystems. Man hat gefunden, daß Tiere mit niedrigeren als normalen Insulinspiegeln im Blut ein gesteigertes Makrophagen-AGE-Klärsystem haben. Dieses wurde sowohl bei Labortieren, bei denen die Insulin-herstellenden Pankreaszellen durch Injektion von Alloxan in das Tier zerstört wurden als auch bei genetischbedingt diabetischen Tieren, die niedrige Insulinspiegel haben, gezeigt. In beiden Gruppen sind die Blutglukosespiegel höher als normal. Wie in Figur 8 gezeigt, hatten Tiere mit experimentell induziertem Diabetes (unter Verwendung von Alloxan) und den sich einstellenden niedrigen Seruminsulinspiegeln (25 ± 6 E/ml) eine zweifach größere Aktivität in bezug auf die Bindung von AGE-BSA an Makrophagen verglichen mit normalen Tieren (Seruminsulin von 74 ± 28 E/ml). In Figur 9 ist ersichtlich, daß C57BL/KsJ, db/db Mäuse mit genetischbedingt niedrigen Insulinspiegeln (8,2 ± 2 E/ml) einen größeren Grad an AGE-BSA-Bindung an Makrophagen haben als Kontrollmäuse.
In Gegensatz dazu haben Tiere mit hohen Insulinspiegeln im Blut wie genetischbedingt hyperinsulinämische Tiere (C57BL6, db/db, Seruminsulin > 300 E/ml, Figur 9) eine Verringerung der Aktivität der Bindung von AGE-BSA an Makrophagen um ungefähr 50% verglichen mit normalen Tieren. Diese Unterdrückung des Entfernungssystemes würde eine negative Wirkung haben, da die Klärung von AGE-Makromolekülen verringert werden würde. Der Abbau von AGE (Figur 10) zeigt die gleiche Beziehung zu den Insulinspiegeln.
Es ist wichtig, anzumerken, daß sowohl die hypomsulinämischen als auch die hyperinsulinämischen Tiere gleich anomale Erhöhungen von Glukose im Blut hatten.
Die Wirkung von Insulin auf andere Makrophagenrezeptoren ist bekannt, jedoch ist dieses der erste Bericht über die Rolle von Insulin bei der Regulation des AGE-Rezeptors. Da Insulin den Glukosespiegel im Blut reguliert und Glukose für die Herstellung von AGEs, die von Makrophagen entfernt werden, verantwortlich ist, legt dieses neue Ergebnis einen tatsächlichen Zusammenhang zwischen diesen drei Phänomenen nahe.
Eine zusätzliche Beobachtung, die aus der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist, und eine, die einen möglichen Mechanismus für die Wirkungen des vorliegenden Verfahrens vorschlägt, ist, daß Makrophagen nach der Stimulation mit FFI- Trägerproteinen oder AGE-Proteinen Cachectin in die umgebende Flüssigkeit sekretieren. Man weiß von Makrophagen, daß sie Cachectin als Antwort auf bestimmte Stimuh herstellen, aber dieses ist der erste Bericht von dem Monokin, daß es als Antwort auf FFI und AGE-Proteine hergestellt wird. Da diese Gruppen im Körper vorhanden sind, kann die Herstellung von Cachectin während der Erkennung, Internalisierung oder dem Abbau von AGEs erfolgen. Da von Cachectin bekannt ist, daß es das Entfernungssystem stimuliert, legt diese Beobachtung nahe, daß Cachectin an einem Verstärkungsphänomen beteiligt ist, um anderen Makrophagen zu signalisieren, daß sie die Aktivität des Entfernungssystems steigern. Die Sekretion des Cachectins durch Zellen, die AGEs ausgesetzt wurden, können auch andere Wirkungen auf Zellen haben.
Demzufolge umfaßt eines der therapeutischen Verfahren der vorliegenden Erfindung das Bereitstellen von Cachectin oder eines Derivates von Cachectin in Mengen, die ausreichend sind, das Entfernungssystem zu stimulieren. Die genauen Mengen an Cachectin, die verabreicht werden, können variieren, und die in den Experimenten mit Cachectin verwendeten Mengen, wie hierin ausgeführt, sind beispielhaft. Natürlicherweise würden spezifische Mengen von dem begleitenden Arzt oder Tierarzt bestimmt werden, der die Behandlung verabreicht.
Eine weitere therapeutische Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt auf dem Gebiet der Immunologie. Insbesondere erleichtert die Erkennung und der Abbau von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung wie FFI durch phagozytische Zellen den Kontakt mit solchen Zellen mit bestimmten Antigenen, gegen die es gewünscht ist, eine Immunität zu erzeugen. Folglich könnte das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung oder FFI auf die gleiche Weise, wie hierin für die Kopplung an jeden anderen Träger offenbart, an ein Antigen gekoppelt werden. Danach könnten die besonderen phagozytischen Zellen, von denen man wünscht, diese zu stimulieren, gegenüber dem gekoppelten Komplex ausgesetzt werden, worauf die Zellen letzteren erkennen und abbauen würden und gleichzeitig spezifische Rezeptoren dafür entwickeln würden. Diese aktivierten Phagozyten könnten dann in das Immunsystem des Tieres eingebracht werden und würden die Entwicklung von Antikörpern gegen das anfängliche Antigen durch das Immunsystem fördern.
Das obige Verfahren kann ex vivo oder in vivo durchgeführt werden. Wenn ex vivo, würde das Verfahren die anfängliche Entnahme von Phagozyten aus dem Körper und deren Aussetzung gegenüber dem gekoppelten Komplex einschließen, um deren Sensitivität gegenüber dem besonderen Antigen zu entwickeln. Danach würde eine Probe von Zellen des Tieres, von der bekannt ist, daß sie für das Entstehen von Antikörpern verantwortlich ist, und die ähnlich isoliert und dem Tier entnommen worden wäre, oder Zellen aus anderen Quellen, die die gleiche Funktion erfüllen können, gegenüber den aktivierten Phagozyten für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um Antikörper gegen das Antigen von Interesse hervorzurufen, ausgesetzt werden. Die Antikörper könnten an Tiere verabreicht werden, um die nachteiligen Wirkungen jeglicher Erkrankungen, die durch das Eindringen des Antigenes verursacht sein könnten, abzuwenden oder abzuschwächen.
Alternativ könnten die ex vivo aktivierten Phagozyten als ein Impfstoff verwendet werden, um Tiere gegen das Antigen zu impfen und dadurch die in vivo Entwicklung von Antikörpern dagegen zu fördern.
Ein in vivo Protokoll berücksichtigt die Herstellung des gekoppelten Komplexes zwischen dem AGE/FFI und dem Antigen und die Verabreichung dieses gekoppelten Komplexes direkt an das Tier, um die in vivo Aktivierung von Phagozyten und die nachfolgende Entwicklung von Antikörpern durch das Immunsystem des Tieren zu fördern.
Eine weitere Alternative beabsichtigt vielmehr die Bildung einer Mischung denn eines gekoppelten Komplexes zwischen dem AGE/FFI und dem Antigen. Diese Mischung könnte anstelle des gekoppelten Komplexes bei den obigen Protokollen verwendet werden.
Eine besondere Durchführung der ex vivo Ausführungsform des immunologischen Protokolles könnte die Immobilisierung entweder des gekoppelten Komplexes oder der phagozytischen Zellen während der gesamten oder teilweisen Durchführung des besonderen Verfahrens einschließen. Somit könnten zum Beispiel die Zellen oder der gekoppelte Komplex immobilisiert werden und das ungebundene Material zirkuliert dann dort vorbei, um die Aktivierung zu erzielen. Wenn es gewünscht ist, dem Tier das gebundene Material zu verabreichen, könnte es von dem Träger nach der Aktivierung durch bekannte Techniken freigesetzt werden.
Ein weiteres therapeutisches Protokoll wird durch die vorstehenden immunologischen Protokolle nahegelegt, das auf der Bindung, Markierung oder auf einer anderen Kombination des AGE/FFI, wie es in diesem Beispiel zu einem besonderen Antigen hier definiert wird, basiert. Somit könnte das AGE/FFI mit einem Antikörper, der spezifisch für das besondere Antigen ist, verbunden werden, und die sich ergebende assoziierte Mischung oder das verbundene Material wird dann in Kontakt mit den phagozytischen Zellen des Tieres/menschlichen Wirtes gebracht, um solche Zellen zu stimulieren, daß sie das Antigen erkennen und angreifen. In einem solchen Beispiel, kann die Art, durch die der Kontakt zwischen dem verbundenen Material und den Phagozyten eintritt, variieren.
Danach kann eine Menge des verbundenen Materials in vivo eingebracht werden, um das Zielantigen zu binden. Die stimulierten Phagozyten würden dann eingebracht werden, oder die Stimulation der Phagozyten würde gleichzeitig mit der in vivo Einbringung des verbundenen Materials stattfinden, worauf die Phagozyten angreifen und den Komplex, der aus dem verbundenen Material und dem Zielantigen gebildet ist, entweder direkt oder mittels der Sekretion des Monokins Cachectin/TNF angreifen und zerstören. Unbeachtet des genauen Mechanismusses der letztlichen Wirkung würden die Phagozyten spezifisch gegen das Zielantigen vorgehen, aufgrund von deren Erkennung des besonderen AGE/FFI, das nun damit mittels des Antikörpers verbunden ist.
Das vorstehende therapeutische Verfahren kann hinsichtlich der Dosierung, der Art der Verabreichung und der Periodizität variieren, was von dem besonderen Wirt und dem begleitenden Krankheitszustand abhängt, und das der Anordnung durch den ausgebildeten Arzt oder Tierarzt unterliegt. Diese Therapie bietet einen möglicherweise wirksamen Weg der Behandlung von Patienten, die an dem erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS, Aquired Immune Deficiency Syndrome) leiden, im Hinblick auf die Unfähigkeit herkömmlicher Therapien den Zustand zu lindern.
Die obigen immunologischen und therapeutischen Protokolle können alle die gemeinsame Verabreichung von einem oder mehr der costimulatorischen Mittel, in der Art wie vorher hier ausgeführt, einschließen, um, wo möglich, die Wirksamkeit eines solchen Protokolls zu verstärken. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich demzufolge auf solche Abwandlungen für deren Anwendung.
Wie vorher erwähnt, beabsichtigt die vorliegende Erfindung zahlreiche diagnostische Anwendungen. In einer ersten Anwendung kann ein Testsystem zum Screening nach möglichen Drogen, die wirksam sind, daß sie als Mittel wirken, um die Aktivität von spezifischen Phagozyten gegen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung zu stimulieren, entwickelt werden. Demzufolge könnte eine voraussichtliche Testdroge einer Makrophagenprobe verabreicht werden, um deren stimulatorische Wirkung zu bestimmen, und die Makrophagenprobe könnte nach der Inkubation mit der Testdroge mit einer Flüssigkeit oder Gewebeprobe, wobei darin eine Menge geeignet markierter Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung vorhanden sind, inkubiert werden, so daß dann Vergleichsstudien der Aufnahme und des Abbaus durchgeführt werden könnten. Bei diesem Test könnten mehrere Makrophagenkolonien zu Beginn mit verschiedenen der bekannten Mitteln inkubiert werden, so daß eine Vergleichsuntersuchung der voraussichtlichen Droge mit größerer Genauigkeit stattfinden könnte.
Ein alternatives diagnostisches Protokoll berücksichtigt die Untersuchung von besonderen Phagozyten, um zu bestimmen, welche der bekannten Mittel am wirksamsten beim Stimulieren der zellulären Aktivität gegen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung sind. So könnten auf ähnliche Weise wie bei dem oben beschriebenen Protokoll mehrere vergleichbare Mengen einer besonderen phagozytischen Zellkolonie isoliert und mit mehreren verschiedenen bekannten Mitteln inkubiert werden, und danach inkubiert man sie mit identischen entsprechenden Proben, die geeignet markierte Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung enthalten, so daß dann ein Vergleich des Ausmaßes der Aktivierung der phagozytischen Zellen durchgeführt werden könnte, und dadurch das wirksamste Mittel beim Stimulieren der zellulären Kolonie identifiziert wird. Auf eine solche Weise würde die Kolonie, die die größte Aufnahme und Entfernung des Endproduktes der fortgeschrittenen Glykosylierung zeigt, entsprechend das Mittel identifizieren, das am wirksamsten ist.
Ein weiterer diagnostischer Nutzen wird auf der Studie der verschiedenen Parameter, die die Erkennung und Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung begleiten, und deren Bedeutung in bezug auf den Ablauf des Systems des tierischen Körpers begründet. In einer ersten Ausführungsform werden phagozytische Zellen wie Monozyten und Makrophagen dem tierischen Körper entnommen und ex vivo durch Aussetzung gegenüber den Mitteln der vorliegenden Erfindung aktiviert. Dieses kann durch einen extrakorporalen Zugang, wie er vorher hierin beschrieben wurde, erzielt werden. Nach einer solchen Aktivierung werden die phagozytischen Zellen, anstatt daß sie in den Körper unmittelbar zurückgeführt zu werden, geeignet radioaktiv markiert wie mit Technicium und dann in den Körper zurückgegeben, worauf das Tier einem radioaktiven Abbilden unterworfen werden kann, um den Bewegungsfluß der Phagozyten aufzuzeigen und dadurch den Bereich mit den Konzentrationen an Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in dem Körper zu bestimmen. Auf diese Weise können unerwünschte Konzentrationen von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung wie atheromatöse Plaques entdeckt werden und die klinische Bedeutung dieser Konzentrationen jeweils beurteilt werden. Dieses Verfahren würde zusätzliche lebenswichtige Informationen beim Versuch, den Krankheitszustand des Tieres oder Patienten zu beurteilen, bereitstellen.
Eine weitere diagnostische Anwendung, die gleichfalls versucht, lebenswichtige Informationen in bezug auf den Krankheitszustand bereitzustellen, beabsichtigt die Herstellung von radioaktiv markierten Mitteln und deren Inkubation oder Kontakt mit Phagozyten aus einem besonderen Tier und die nachfolgende Messung der verstrichenen Zeit, bevor die markierten Mittel erkannt und abgebaut werden. Solche Zeitmessungen könnten mit Standardmessungen, die durch die Untersuchung von Zellen, die normalen Tieren oder Patienten entnommen wurden, die nach dem gleichen Protokoll untersucht wurden, ermittelt werden, verglichen werden. Diese Daten könnten dann das Vorhandensein von Krankheitszuständen wie Diabetes oder die anderen vorher hierin erwähnten oder andere Fehlfunktionen, die die Funktionsfähigkeit des AGE-Entfernungssystems des Körpers nachteilig beinflußen können, identifizieren. Dieses diagnostische Verfahren kann durch Verabreichung der markierten Mittel an das Tier oder den Patienten in vivo durchgeführt werden, oder könnte alternativ durch die Isolierung von phagozytischen Zellen aus dem Tier oder Patienten außerhalb des Körpers und der Inkubation dieser Zellen mit den markierten Mitteln ex vivo durchgeführt werden.
Eine zusätzliche diagnostische Technik beabsichtigt eine weitere qualitative Analyse des Tierkörpers. Bei diesem Verfahren können besondere Krankheitszustände durch ein Verfahren identifiziert werden, wobei die Aktivität der phagozytischen Zellen des Tieres gemessen werden und mit den Aktivitäten, die mit normalen Zellen gefunden werden, verglichen werden können. In so einem Fall könnten zum Beispiel radiaktiv markierte Mittel in den Körper eingebracht werden, oder phagozytische zelluläre Kolonien könnten aus dem Körper isoliert und mit den radioaktiv markierten Mitteln inkubiert werden, und der Aktivitätslevel der phagozytischen Zellen könnte dann mit größerer Genauigkeit in bezug auf besondere Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung gemessen werden. Das ist aufgrund der spezifischen Natur der zellulären Rezeptoren möglich, die sich auf den phagozytischen Zellen in bezug auf besondere Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung entwickeln. Somit könnten die Makrophagen oder Monozyten mit der größten Beteiligung bei der Entfernung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, die anderenfalls atheromatöse Plaques entwickeln, isoliert und auf deren Aktivität untersucht werden, und wenn deren Aktivität anomal verstärkt zu sein scheint, kann die Entwicklung solcher Plaques angezeigt sein. Ähnliche Untersuchungsprotokolle könnten verwendet werden, um das Vorhandensein von diabetischer Alterung und ähnlichem zu bestimmen. Somit würden die spezifischen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung, die mit besonderen Zuständen verbunden sind, Reaktionen der Phagozyten hervorrufen, die eine anomale Ansammlung von diesen Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung im Körpersystem nahelegen würden. Das Vorhandensein besonderer AGEs in dem Körper spiegelt dementsprechend besondere Krankheitszustände wieder und die vorstehende Beobachtung der Phagozyten und die Bestimmung von deren Sensitivität und gesteigerten Stimulation in bezug auf besondere Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung würde das Vorhandensein eines besonderen Krankheitszustandes nahelegen.

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und damit verbundene Mittel für die Inhibition und Behandlung von Proteinalterung in Tieren, wobei man die Körper der Tiere stimuliert, deren Erkennung und Affinität für Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung zu steigern. Genauer beabsichtigt das Verfahren, die Verabreichung von bestimmten Mitteln wie Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, solchen Endprodukten, die an einen Träger gebunden sind, Monokine, die phagozytische Zellen stimulieren, daß sie ihre Aktivität gegen Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung steigern, und Mischungen dieser Materialien entweder allein oder in Verbindung mit anderen costimulatorischen Mitteln. Zahlreiche diagnostische und therapeutische Anwendungen werden definiert, und pharmazeutische Zusammensetzungen werden auch betrachtet.

Claims

1. Eine Zusammensetzung zur Förderung der Abtrennung und der Entfernung von Zielmakromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, aus dem Körper eines Tieres, umfassend ein Mittel, das geeignet ist, den Körper zu veranlassen, seine Aktivität in bezug auf das Erkennen und Entfernen der Makromoleküle zu steigern, gekennzeichnet dadurch, daß das Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus einem Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, einem Endprodukt der fortgeschritten Glykosylierung, das an einen Träger gebundenen ist, einem Monokin, das den Körper stimuliert, die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen das Makromolekül zu steigern, in Verbindung mit einem costimulatorischen Mittel, das von dem stimulatorischen Mittel verschieden ist.

2. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung das nichtenzymatische Reaktionsprodukt eines proteinhaltigen Makromoleküls und eines Zuckers umfaßt.

3. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus dem Reaktionsprodukt von Albumin und Glukose, dem Reaktionsprodukt von Albumin und Glukose-6- Phosphat, dem fluoreszierenden Chromophor 2-(2-Furoyl)-4(5)-(2- furanyl)-1H-imidazol, das an einen Träger gebunden ist, und Mischungen davon.

4. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Kohlenhydraten, Proteinen, Lipiden, synthetischen Polypeptiden, biokompatiblen natürlichen und synthetischen Harzen, Antigenen und Mischungen davon besteht.

5. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das costimulatorische Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Interleukin-1 und gamma-Interferon besteht.

6. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monokin das 5 als Tumornekrosefaktor identifizierte Polypeptid umfaßt.

7. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß diese formuliert ist, um das Mittel über parenterale Mittel zu verabreichen.

8. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei die parenteralen Mittel die Injektion umfassen.

9. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei die parenteralen Mittel die Katheterisierung umfassen.

10. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß diese formuliert ist, um das Mittel über orale Mittel zu verabreichen.

11. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Mittel mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hergestellt ist.

12. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß diese formuliert ist, um das Mittel sowohl parenteral als auch extrakorporal der Körperflüssigkeit zuführen zu lassen.

13. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß diese formuliert ist, um einem Körper, der eine Insulinmenge enthält, verabreicht zu werden, und um es dem Körper, der behandelt wird, zu ermöglichen, den verfügbaren aktiven Insulinspiegel davon zu erniedrigen.

14. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Tier, um die Abtrennung und Entfernung eines Zielproteines, das einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurde, aus dem Körper des Tieres zu fördern, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Mittels, das geeignet ist, phagozytierende Zellen in dem Körper zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens der Zielproteine zu steigern, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, gekennzeichnet dadurch, daß das Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus einem Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, das an einen Träger gebunden ist, einem Monokin, das die phagozytischen Zellen stimuliert, um die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen die Zielproteine zu steigern, und optional jedes der obigen in Kombination mit einem costimulatorischen Mittel.

15. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung das Reaktionsprodukt eines proteinhaltigen Makromoleküles und eines Zuckers umfaßt.

16. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus dem Reaktionsprodukt von Albumin und Glukose, dem Reaktionsprodukt von Albumin und Glukose-6-phosphat, dem fluoreszierenden Chromophor 2-(2- Furoyl)-4-(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol, das an einen Träger gebunden ist, und Mischungen davon.

17. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Kohlenhydraten, Proteinen, Lipiden, synthetischen Polypeptiden, biokompatiblen natürlichen und synthetischen Harzen, Antigenen, und Mischungen davon besteht.

18. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das costimulatorische Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Interleukin-1 und gamma-Interferon besteht.

19. Ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Materials, von dem vermutet wird, daß es als ein Mittel wirkt, den Körper eines Tieres zu stimulieren, um bestimmte Makromoleküle, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu erkennen und aus dem Körper zu entfernen, umfassend:

das Herstellen einer Vielzahl von biologischen Proben, die aus dem Körper des Tieres stammen, die darin phagozytische Zellen enthalten;

das Inkubieren einer der Proben mit dem voraussichtlichen Mittel unter Beobachtung;

das Inkubieren aller bis auf einen der Probenreste mit verschiedenen bestimmten Mitteln, von denen bekannt ist, die phagozytischen Zellen gegen fortschrittene Glykosylierungsendprodukte zu stimulieren, wobei das Mittel ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, das an einen Träger gebunden ist, das fluoreszierende Chromophor 2- (2-Furoyl)-4(5)- 2(2-furanyl)-1H-imidazol, das an einen Träger gebunden ist, ein Monokin, das die phagozytischen Zellen stimuliert, die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen die Zielproteine zu steigern, jedes der obigen optional in Verbindung mit einem costimulatorischen Mittel oder eine Mischung davon ist;

das Halten der letzten der biologischen Proben als eine Kontrolle;

das Einbringen jeder der Proben in eine individuelle Teilmenge eines bekannten Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, das eine damit verbundene geeignete Markierung hat;

das Inkubieren jeder dieser Proben für bis zu etwa 24 Stunden; und

das Untersuchen der Proben danach, um die Aufnahme und den Abbau von dem markierten Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung zu messen, und Vergleichen der Aktivität der Zellen, die mit dem voraussichtlichen Mittel unter Beobachtung inkubiert wurden, mit denen der Proben, die mit bekannten Mitteln inkubiert wurden, um das Vorhandensein und das Ausmaß der stimulierenden Aktivität des voraussichtlichen Mittels zu bestimmen.

20. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Tieres mit einem Krankheitsbild, das wenigstens zum Teil durch die Ansammlung von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, in dem Körper des Tieres verursacht wurde, umfassend die Isolierung einer Menge an Zellen aus dem Tier, das Wachsenlassen einer zusätzlichen Menge der phagozytischen Zellen von den isolierten phagozytischen Zellen in einem Nährstoffmedium, das frei von Insulin ist, dem Ernten der so gezogenen phagozytischen Zellen, und das Einbringen von diesen in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, der geeignet ist, in den Tierkörper eingebracht zu werden.

21. Ein Verfahren zur Gewinnung von aktivierten Zellen, die geeignet sind, die nachteiligen Folgen der Ansammlung von fortgeschrittenen Glykosylierungsendprodukten in dem Körper eines Tieres zu verhüten, umfassend:

das Isolieren einer Menge an phagozytischen Zellen aus dem Tier; und

das Behandeln der so isolierten phagozytischen Zellen mit einem Mittel, das geeignet ist, die phagozytischen Zellen zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern.

22. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die geeignet ist, ein Tier gegen ein besonderes Antigen zu immunisieren, umfassend:

das Herstellen einer Mischung des Antigens und eines Mittels, das geeignet ist, phagozytische Zellen in dem Körper des Tieres zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern; und

das Gewinnen der Mischung in einer Form, die dem Tier verabreichbar ist, um die Entwicklung von Antikörpern gegen das Antigen durch das Immunsystem des Tieres zu stimulieren.

23. Ein Verfahren zur Herstellung von aktivierten phagozytischen Zellen, die geeignet sind, in den Körper eines Tieres eingebracht zu werden, um das Tier gegen ein besonderes Antigen, das in vivo die Entwicklung von Antikörpern gegen das Antigen unterstützt, zu immunisieren, wobei das Verfahren umfaßt;

das Isolieren einer Menge an phagozytischen Zellen aus dem Tier;

das Herstellen einer Mischung des Antigens und eines Mittels, das geeignet ist, die phagozytischen Zellen zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern; und

das Inkubieren der so isolierten phagozytischen Zellen mit der Mischung, um die phagozytischen Zellen dagegen zu aktivieren.

24. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die geeignet ist, ein Tier gegen ein besonderes Antigen zu immunisieren, indem man die Entwicklung von Antikörpern gegen das Antigen durch das Immunsystem des Tieres stimuliert, wobei das Verfahren den Schritt der Herstellung eines gekoppelten Komplexes zwischen dem Antigen und einem Mittel, das geeignet ist, phagozytische Zellen in dem Körper des Tieres zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern, umfaßt.

25. Ein Verfahren zur Gewinnung von aktivierten phagozytischen Zellen, die angepaßt sind, in den Körper eines Tieres zum Immunisieren des Tieres gegen ein besonderes Antigen eingebracht zu werden, umfassend;

das Isolieren einer Menge an phagozytischen Zellen aus dem Tier;

das Herstellen eines gekoppelten Komplexes zwischen dem Antigen und einem Mittel, das geeignet ist, phagozytische Zellen zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern; und das Inkubie ren der so isolierten phagozytischen Zellen mit dem gekoppelten Komplex, um die phagozytischen Zellen dagegen zu aktivieren.

26. Das Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 25, wobei man bewirkt, daß man die Zellen, bevor sie mit der Mischung oder dem Komplex inkubiert werden, an einem immobilisierten Träger binden läßt, und, nachdem sie mit der Mischung oder dem Komplex inkubiert wurden, die Zellen von dem Träger freigesetzt werden.

27. Ein Verfahren zum Erhalten von zellulärern Material, das geeignet ist, ein Tier gegen ein besonderes Antigen zu immunisieren, wobei man das Antigen vernichtet, wobei das Verfahren umfaßt:

das Isolieren einer Menge an phagozytischen Zellen aus dem Tier; das Herstellen eines gekoppelten Komplexes zwischen dem Antigen und einem Mittel, das geeignet ist, die phagozytischen Zellen zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern;

das Inkubieren der so isolierten phagozytischen Zellen mit dem gekoppelten Komplex, um die phagozytischen Zellen dagegen zu aktivieren; und

das Isolieren von zellulärern Material aus dem Tier, das bei der Entwicklung der Immunantwort des Tieres teilnimmt, und Inkubieren der damit aktivierten phagozytischen Zellen für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, das zelluläre Material zu veranlassen, Antikörper gegen das Antigen zu entwickeln.

28. Das Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei der gekoppelte Komplex an einen immobilisierten Träger gebunden ist.

29. Das Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Zellen an einen immobilisierten Träger gebunden sind.

30. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, 25 oder 27, wobei das Mittel ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, das an einen Träger gebunden ist, das fluoreszierende Chromophor 2-(2- Furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol, das an einen Träger gebunden ist, oder eine Mischung davon ist.

31. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, 25 oder 27, wobei ein Monokin, das den Körper stimuliert, um die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen das Zielmakromolekül zu steigern, zur Mitverabreichung mit dem gekoppelten Komplex, den aktivierten phagozytischen Zellen oder dem zellulären Material beinhaltet ist.

32. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, 25 oder 27, wobei ein costimulatorisches Mittel für die Mitverabreichung mit dem gekoppelten Komplex, den aktivierten phagozytischen Zellen oder dem zellulären Material eingeschlossen ist.

33. Ein Verfahren zur Gewinnung von Mitteln zum Identifizieren und Vermessen des Ausmaßes von pathologischen Zuständen in einem Tier, umfassend:

das Isolieren einer Menge an phagozytischen Zellen aus dem Tier;

das Anheften einer radioaktiven Markierung an die Zellen, so daß, wenn die markierten Zellen in den Körper des Tieres eingebracht werden, die markierten Zellen nachgewiesen werden können, um den Ort und das Ausmaß der Ansammlung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung zu bestimmen, und um dadurch den entsprechenden Ort und das Ausmaß von Krankheitsbildern mit solchen Ansammlungen als eine Erscheinungsform davon zu bestimmen.

34. Das Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei vor dem Einbringungsschritt die phagozytischen Zellen mit einem Mittel, das geeignet ist, die phagozytischen Zellen zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern, inkubiert werden.

35. Ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Vermessung des pathologischen Zustandes eines Tieres, umfassend:

das Herstellen eines Mittels, das geeignet ist, phagozytische Zellen des Tieres zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennnens und Entfernens von Makromolekülen, die einer nichtenzymatischen fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern;

das Anbringen einer geeigneten Markierung an dem Mittel, so daß, wenn das markierte Mittel dem Tier verabreicht wird, der pathologische Zustand durch Messen der Zeit, die der Körper benötigt, um das markierte Mittel zu erkennen und zu entfernen, und durch Vergleichen der erhaltenen Zeitergebnisse mit den Zeitergebnissen, die bei Tieren in einem normalen Zustand beobachtet werden, angezeigt wird.

36. Ein Verfahren zum Bestimmen des pathologischen Zustandes eines Tieres, umfassend:

das Herstellen eines Mittels, das geeignet ist, phagozytische Zellen des Tieres zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer nichtenzymatischen fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern;

das Anbringen einer geeigneten Markierung an dem Mittel;

das Isolieren einer Probe von phagozytischen Zellen aus dem Tier und Inkubieren der Zellen mit dem markierten Mittel;

das Bestimmen der Zeit, die von der Probe benötigt wird, um das markierte Mittel zu erkennen und zu entfernen; und

das Vergleichen der erhaltenen Zeitergebnisse mit den Zeitergebnissen, die bei zellulären Proben von Tieren in einem normalen Zustand beobachtet wurden.

37. Ein Verfahren zum Vermessen der Identität und des Ausmaßes an fortgeschrittenen Glykosylierungsendprodukten in einer zellulären Probe aus einem Tierkörper, umfassend:

das Isolieren einer Kolonie von phagozytischen Zellen aus dem Körper;

das Inkubieren der Kolonie mit einem fortgeschrittenen Glykosylierungsendprodukt, das eine daran gebundene Markierung besitzt;

das Messen der Aufnahme und/oder des Abbaus von dem markierten Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung durch die Kolonie;

das Vergleichen der Ergebnisse der Messung mit den Ergebnissen, die von identischen Messungen, die von Zellen bei normaler Aktivierung bestimmt wurden, stammen; und

daraus das Bestimmen des Ausmaßes der Aktivierung der Zellen der Kolonie durch die Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung und damit die Menge und Identität der Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung, die in der zellulären Probe vorhanden sind.

38. Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 21, 22, 23 oder 27, wobei das Mittel ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, ein Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, das an einen Träger gebunden ist, das fluoreszierende Chromophor 2-(2-Furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H- imidazol, das an einen Träger gebunden ist, ein Monokin, das den Körper stimuliert, um die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen die Zielmakromoleküle zu steigern, jedes der obigen in Kombination mit einem costimulatorischen Mittel, oder eine Mischung davon ist.

39. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Zellen auf eine solche Art behandelt werden, daß sie in den Körper über parenterale Mittel wieder eingebracht werden können.

40. Das Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die parenteralen Mittel die Injektion umfaßt.

41. Das Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die parenteralen Mittel die Katheterisierung umfaßt.

42. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine assoziierte Mischung eines Antikörpers an Zielproteine von Zellen, und ein Mittel, das geeignet ist, phagozytische Zellen in einem Tier zu veranlassen, ihre Aktivität des Erkennens und Entfernens von Makromolekülen, die einer fortgeschrittenen Glykosylierung unterworfen wurden, zu steigern, für die Herstellung einer Mischung zum Behandeln eines Krankheitsbildes eines Tieres mit gleichzeitiger Schwächung von bestimmten Zielproteinen oder Zellen, durch Verabreichung der Mischung an das Tier, um einen Komplex zwischen der Mischung und den Zielproteinen oder Zellen zu bilden, und Stimulation der phagozytischen Zellen des Tieres, um die spezifische Erkennung und Entfernung der Mischung zu steigern, so daß die Phagozyten wirken, um die Mischung zu erkennen und zu entfernen, und dabei den Abbau der Zielproteine oder Zellen bewirken.

43. Die Verwendung gemäß Anspruch 42, wobei das Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus einem Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, einem Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung, das an einen Träger gebunden ist, einem Monokin, das den Körper stimuliert, die Erkennungs- und Entfernungsaktivität gegen die Zielmoleküle zu steigern, und die obigen in Kombination mit einem costimulatorischen Mittel, und Mischungen davon.

44. Die Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung das Reaktionsprodukt eines proteinhaltigen Makromoleküles und eines Zuckers umfaßt.

45. Das Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei das Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus dem Reaktionsprodukt von Albumin und Glukose, dem Reaktionsprodukt von Albumin und Glukose-6- phosphat, dem fluoreszierenden Chromophor 2-(2-Furoyl)-4(5)-(2- furanyl)-1H-imidazol, das an einen Träger gebunden ist, und Mischungen davon.

46. Die Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Kohlenhydraten, Proteinen, Lipiden, synthetischen Polypeptiden, biokompatiblen natürlichen und synthetischen Harzen, Antigenen und Mischungen davon besteht.

47. Die Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei das Monokin das als Tumornekrosefaktor identifizierte Polypeptid umfaßt.

48. Die Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei das costimulatorische Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Interleukin-1 und gamma-Interferon besteht.