JPH072685A

JPH072685A - 安定化された標準化ヤドリギレクチン製剤、ヤドリギレクチン濃縮物の製法及びヤドリギレクチンフラクションを含有する製剤の製法、及び自然免疫抵抗を高めるため及び腫瘍治療のための医薬品

Info

Publication number: JPH072685A
Application number: JP5320005A
Authority: JP
Inventors: Tibor Hajto; ハイトティボル; Katarina Hostanska; ホスタンスカカタリーナ
Original assignee: Madaus AG
Current assignee: Madaus Holding GmbH
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 1995-01-06
Also published as: DE4242902A1; EP0602686B1; DE59310211D1; EP0602686A2; DK0602686T3; PT602686E; EP0602686A3; ES2164059T3; ATE205394T1

Abstract

(57)【要約】【目的】免疫学的に活性のガラクトシド特異性ヤドリ
ギレクチン含分の高いヤドリギレクチン濃縮物の製造【構成】２工程分別法を用いて免疫学的に活性のガラ
クトシド特異性ヤドリギレクチン含分の高いヤドリギレ
クチン−濃縮物を製造し、更に標準化された免疫学的に
活性のヤドリギレクチン−フラクションを含有する製造
を製造する。【効果】このヤドリギレクチン−製剤は、免疫学的に
活性のガラクトシド特異性ヤドリギレクチンの規定量を
含有し、規定の生物学的活性を有し、相応して、正確に
調節可能で、その都度の処置目的に適合された用量を可
能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、種々のフィルター及び
洗浄液の使用下に、ヤドリギ水性抽出物を分別濾過する
方法で、ヤドリギ水性抽出物から免疫学的に活性のガラ
クトシド特異性ヤドリギレクチン分の多いヤドリギレク
チン−濃縮物を製造する方法、更に、免疫学的に活性の
ヤドリギレクチン−フラクションを含有する標準化製剤
の製法並びに自然免疫抵抗を高めるため及び／又は腫瘍
治療に使用することのできる、免疫学的活性ヤドリギレ
クチンフラクションの規定含分を有する、標準化製剤の
製法、このような製剤を含有する医薬品並びに、ヒト及
び哺乳動物における自然免疫抵抗を高めるため及び腫瘍
治療でこの医薬品を使用することに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヤドリギ（Ｖｉｓｃｕｍａｌｂｕｍ）
は、古くから治療剤及び魔法薬（Ｚａｕｂｅｒｍｉｔｔ
ｅｌ）として知られており、その抽出物並びにヤドリギ
葉を含有する茶ミックスは、現在でもなお血圧降下性、
コリン類似作用をする薬剤として、並びに関節症及びリ
ューマチ疾患の処置用薬剤として使用されている。更
に、ヤドリギ抽出物を癌抑制剤として使用することは、
東ドイツ特許（ＤＤ−Ａ１−）第２３５４１８号明細書
に記載されている。この場合、有効成分は、非常に特異
的に糖類及び多糖類を、脂質−又は蛋白質−結合された
形でも、認識し、結合することのできる蛋白質である、
レクチンと称される内容物質である。その都度考慮され
るレクチンの特異性は、主として、その起源に依存し、
血清学的診断法での及び他の生物化学的方法及び分子生
物学的方法での使用のために重要である。

【０００３】ヤドリギ植物及びその抽出物は、糖複合体
（Ｇｌｕｃｏｋｏｎｊｕｇａｔｅ）の炭化水素分に対す
る特異性を有する３種の毒性蛋白質、即ち、レクチンＭ
ＬＩ、ＭＬＩＩ及びＭＬＩＩＩを含有する［Ｆｒａｎ
ｚ，Ｈ．Ｚｉｓｋａ．Ｐ．Ｋｉｎｄｔ，Ａ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．１９５（１９８１）４８１〜４８４］。ヤド
リギ抽出物の毒性は、少なくとも当初は、ガラクトシド
特異性レクチン（ＭＬＩ）の存在で記載された［Ｈｏｌ
ｔｓｋｏｇ，Ｒ．Ｓａｎｄｖｉｇ，Ｋ．Ｏｌｓｎｅｓ，
Ｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４５（１９８８）、１７２〜１
７９］。ＭＬＩの細胞毒作用は、ヒト末稍単核血液細胞
（ＰＢＭＣ）培養物の使用下に、３種の互に無関係な方
法で試験された。この場合に、細胞の生存可能性は、≧
１０ｎｇ／ｋｇのレクチン濃度により著るしく影響され
ることが判明した。レクチン濃度に関するこの値は、糖
の結合のために寄与するその生物学的活性分のみに相当
し、これは、最適酵素テストを用いて測定された［Ｈｏ
ｊｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕ
ｓ，Ｈ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｃ．４９（１９８
９）、４８０３〜４８０８］。少量の無害な用量での適
用の際には、ＭＬＩは、明らかに軽いマイトジェン作用
を示し、Ｋ₅₆₂−標的細胞に対する天然キラー細胞（Ｎ
Ｋ）の細胞毒性の増加をもたらした。この免疫系に対し
て無害のレクチン用量を適用する際にも類似のＮＫ−増
加が観察された。ヤドリギ抽出物中の糖結合性の活性レ
クチンの最適使用（ＥＬＬＡを用いて測定）は、受容者
の種々の防衛機構を強化し、患者の腫瘍生長の減少を可
能とした。

【０００４】ヤドリギ抽出物の細胞毒作用は、既に記載
のように、主としてＭＬＩの存在のせいであった。僅か
に、他の種類のレクチン（ＭＬＩＩ及びＭＬＩＩＩ）並
びに分子量５ｋｄの強塩基性蛋白質の僅かな群即ちビス
コトキシン（Ｖｉｓｃｏｔｏｘｉｎ）Ａ２、Ａ３及びＢ
が、ヤドリギ抽出物の細胞毒作用に寄与している。ＭＬ
Ｉは、Ｄ−ガラクトースに対して、ＭＬＩＩＩはＮ−ア
セチルアミノガラクトサミンに対して特異的であり、Ｍ
ＬＩＩは、Ｄ−ガラクトースに対しても、Ｎ−アセチル
アミノガラクトサミンに対しても特異的である。ヤドリ
ギレクチンの高い毒性も確認された。ＬＤ₅₀−値は、
０．００１〜０．０００１ｇ／ｋｇの範囲にある［Ｆｒ
ａｎｚ，Ｈ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４３、追補１．（１９８
６）、２３〜３４及びＺｉｓｋａ，Ｐ．Ｇｅｌｂｉｎ，
Ｍ．Ｆｒａｎｚ，Ｈ．Ｌｅｃｔｉｎｓ，Ｖｏｌ．８（１
９９１）、］。結果的に、ヤドリギレクチンの毒性で最
適化されていない高用量の使用は受容者の種々の防衛機
構に抑止作用を惹起させることができる。しかしなが
ら、この免疫系に無害な少用量での使用は、他のレクチ
ンにおけると同様に、ヤドリギレクチンが免疫変性に応
答を惹起させることができる可能性を与えている［Ｆｒ
ａｎｚ，Ｈ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４３、追補１（前記）
及びＭｅｔｚｎｅｒ，Ｇ．Ｆｒａｎｚ，Ｈ．Ｋｉｎｄ
ｔ，Ａ．Ｆａｈｌｂｕｓｃｈ，Ｂ．Ｓｕｅｓｓ，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｂｉｏｌ．１６９（１９８５）、４６１〜４７
１］。実際に、この方法で最適化された精製ＭＬＩの用
量は、受容者の防衛機構の種々のパラメータを生体内に
刺激することができ［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｓｔａｎ
ｓｋａ，Ｋ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９（１９８９）、４８０３〜４８０８］、こ
のことは、少なくとも部分的に、腫瘍−壊死−因子−α
［ＴＮＦ−α］、インターロイキン−１［ＩＬ−１］及
びインターロイキン−６［ＩＬ−６］のレクチン誘導増
大分泌により媒介される［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｓｔ
ａｎｓｋａ，Ｋ．Ｆｒｅｉ，Ｋ．Ｒｏｄｏｒｆ，Ｃ．Ｇ
ａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０
（１９９０）、３３２２〜３３２６］。特異的糖（Ｄ−
ガラクトース）の存在は、ヒト末稍単核血液細胞［ＰＢ
ＭＣ］からのサイトカインのレクチン誘導放出を減少さ
せ、この免疫学応答への蛋白質−糖−代謝作用の共同作
用を保証した［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈａｓｔａｎｓｋａ，
Ｋ．Ｆｒｅｉ，Ｋ．Ｒｏｄｏｒｆ，Ｃ．Ｇａｂｉｕｓ，
Ｈ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０（前記）］。

【０００５】ヤドリギ抽出物もしくはその中に含有して
いるレクチン、殊にＭＬＩの強い毒性に基づき、かつ生
物学的活性及び免疫系への作用及びそれに伴なうヤドリ
ギ抽出物及びその内容物の認容性は、その著るしく、そ
の用量殊にその正確かつ可能な調節に依存する事実に基
づき、治療及び予防のために、免疫学的活性ガラクトシ
ド特異性ヤドリギレクチン分が高く、正確に知られてい
る組成を有するヤドリギ抽出物の濃縮物を、まず、有効
内容物質の正確な周知濃度で提供可能にし、選択された
免疫学的に活性のヤドリギレクチン−フラクションの正
確に規定された含分の標準化製剤を提供することは、決
定的に重要である。ヤドリギレクチンの腫瘍治療の分野
での使用は、有望であることが明らかになったので、こ
のために好適なヤドリギレクチン−フラクション及びこ
れを含有する製剤への強力な需要が生じた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、（ａ）免疫学的活性ガラクトシド特異性ヤドリギレ
クチン分の高いヤドリギレクチン−濃縮物を製造する方
法を提供し、（ｂ）腫瘍治療での使用及び自然の免疫抵
抗を高めるために使用可能な製剤を、前記のヤドリギレ
クチンフラクションを標準化され、安定化された形で含
有し、その都度の治療又は予防のための使用に必要な正
確な配量を可能にする前記ヤドリギレクチンフラクショ
ンの使用下に、製造することを可能にする方法を提供す
ることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この課題は次のようにし
て解決される：（ａ）免疫学的活性のガラクトシド特異性ヤドリギレ
クチン含分の高いヤドリギレクチン−フラクションを製
造するために、ヤドリギ水性抽出物を、種々のフィルタ
ー及び洗浄液体の使用下に、分別濾過し、この際、２つ
の分別工程を実施し、この際、第１分別工程で分子量２
００００〜１０００００の物質を有するフラクションの
取得のために未発酵ヤドリギ水性抽出物を少なくとも１
回限外濾過し、この限外濾過により得られた濃縮物を第
２の分別工程で少なくとも１回滅菌濾過し、この際に得
られる最終濃縮物を稀釈して所望最終量とし；かつ
（ｂ）免疫学的に活性のヤドリギレクチンフラクショ
ンを含有する標準化製剤の製造のために、（ａ）に記載
の方法で得られたヤドリギレクチン−濃縮物の生物活性
を測定し、得られたフラクション中の免疫学的に活性の
ガラクトシド特異性ヤドリギレクチンの濃度を測定し、
このフラクションを生理学的に認容性の緩衝液で稀釈
し、適当な安定剤で安定化し、かつ、所定の治療的使用
のために必要なレクチン含分に調節し（この際、レクチ
ン含分は生物学的単位で示す）、分割し（この際、各々
の部分量は、治療及び／又は予防における所定の使用の
ために必要な量の生物学的活性ガラクトシド特異性ヤド
リギレクチンを含有する）、この部分量を個々に滅菌条
件下に無菌の、及びパイロジエン不含のアンプル中に封
入する。

【０００８】（ａ）に記載の方法の実施の際には、次の
ように行なう：第１の分別工程で、２回の限外濾過を行
ない、この際第１限外濾過のために、再蒸溜水で洗浄さ
れた、無菌の１０００００ＮＭＧＴを有するポリスルホ
ンフィルターを使用し、この濾過を圧力の使用下に実施
し、引続き、得られた濾液を緩衝液で２回洗浄し、第２
の限外濾過のために、再蒸溜水で洗浄された、無菌の、
２００００ＮＭＧＴを有する酢酸セルロースフィルター
を用い、濾過を圧力の使用せずに実施する。

【０００９】この第１の分別工程の後に、第２工程とし
て、選択限度０．２μｍのフィルターを用いる滅菌濾過
を、最大６００ｋＰａで実施するのが有利である。

【００１０】一般にｐＨ７．０の領域で操作する。

【００１１】この第１及び第２の分別工程を直接前後し
て、２時間以内に実施するのが有利である。

【００１２】この２つの分別工程の終りに得られる最終
濃縮物を、所定の量まで稀釈し、適当な安定剤で安定化
させ、貯蔵のために、無菌の、パイロジエン不含のアン
プル中に封入し、場合によっては凍結乾燥させるのが有
利である。

【００１３】既に稀釈され、緩衝された溶液の安定化の
ために、安定剤を添加する。これらは、アルカノール、
殊にポリオール及びその誘導体、例えば炭水化物例えば
グルコース、サッカロース、シクロデキストリン、誘導
体化されたシクロデキストリン、ペンタエリスリット、
マンニット、ソルビット及びポリヒドロキシ脂肪酸例え
ばポリ乳酸及びポリ乳酸エステル並びに他の親水性ポリ
マー例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル並びにアミノ酸含有化合物例えばグリシン又はアルブ
ミン殊にヒト血清アルブミンであってよい。

【００１４】（ｂ）に記載の方法の実際の際には、次の
ように行なう：生物学的活性の測定を、３種の無関係の
試験法を用いて試験管内で実施し、この際、糖結合性活
性レクチン分を、最適化酵素テストの使用下に測定し、
培養液中ヒト末稍単核細胞（ＰＭＮＣ）の細胞活力をト
リパンブルー及びフルオレッセインジアセテート（これ
は加水分解されてフルオレッセインになる）を用いて測
定し、レクチン敏感な白血病細胞［Ｋ₅₆₂］の場合に
は、［Ｈ³］−チミジンの吸収を測定する。

【００１５】得られた生物学的活性ガラクトシド特異性
ヤドリギレクチンフラクションを含有する製剤の標準化
は、生物学的活性の測定から得られる値を用いて行なう
のが有利である。

【００１６】

【実施例】次に、製造法の実施例記載及び生物学的もし
くは免疫学的活性の測定のための実験の記載並びに図面
につき本発明を詳述する。図面は、生体内でのＭＬＩ
１回注射後２４〜７２時間のＮＫ−細胞のレクチン誘発
細胞毒活性の最大増加を示している。

【００１７】製造法ヤドリギレクチン−濃縮物の製造この方法の実施のために、サルトリウス社（Ｓａｒｔｏ
ｒｉｕｓＧｍｂＨ）のサルトコン−ミニ−クロスフロ
ー系（Ｓａｒｔｏｃｏｎ−Ｍｉｎｉ−Ｃｒｏｓｓｆｌｏ
ｗ−Ｓｙｓｔｅｍ）を使用するのが有利である。これ
は、蛋白質及び一連の他の物質の濃縮及び分離のための
モジュラール限外濾過システム（ｍｏｄｕｌａｒｅｓ
Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｓｓｙｓｔｅｍ）及び
マイクロ濾過システムである。ここで、ヤドリギ水性抽
出物は、新鮮な又は乾燥されたヤドリギ葉の水での抽出
により、又は新鮮葉の場合には、水性緩衝液（ＰＢＳ１
％）を用いて得られ、１００〜９００ｌ／ｈの搬送率
のホース絞りポンプを用いて貯蔵容器から、この系に入
れられ、個々のフィルター工程に送られる。１個以上の
フィルターを通過した後に得られる濾液を、収集容器中
に捕集するか又は更なる濃縮のために、貯蔵容器に戻
し、そこで改めてこの系中に入れる。この系中に入れら
れた水性抽出物を、有利にｐＨ７に調節し、まず、再蒸
溜水で洗浄された、無菌の１０００００ＮＭＧＴを有す
るポリスルホンフィルターの使用下に、第１の限外濾過
を行なう。この限外濾過は、圧力を使用せずに実施する
のが有利である。得られた濾液を、同様に無菌の、再蒸
溜水で洗浄された、２００００ＮＭＧＴを有する酢酸セ
ルロースフィルターの使用下に第２の限外濾過をし、こ
の際、この限外濾過を圧力使用せずに実施する。この際
に得られる濃縮物を集め、場合によっては、中間的に、
無菌条件下でアンプル中に封入し、少なくとも１回滅菌
濾過する。この滅菌濾過は、選択限度（Ｓｅｌｅｋｔｉ
ｏｎｓｇｒｅｎｚｅ）０．２μｍの膜フィルターを用い
て実施するのが有利である。

【００１８】標準化（ｓｔａｎｄａｒｓｉｅｒｔｅｎ）
製剤の製造滅菌濾過の後に得られた抽出物を、生物学的に活性のレ
クチンレクチン類の含分の測定の後に、他の後に記載の
方法で、最適稀釈度に調節し、無菌条件下でアンプル中
に充填する。この際、稀釈度は、測定された生物学的活
性（これは生物学的単位で示され、アンプル上に記載さ
れる）に依り、かつこれで製造される製剤の所望用途に
依り決まる。前記方法で得られた標準化製剤は、正確に
規定された量の免疫学的活性ガラクトシド特異性ヤドリ
ギレクチンを含有し、その正確な配量を可能にするか
ら、不所望の過剰配量による患者の障害又は過少配量に
よる無効を排除することができる。

【００１９】冒頭に記載の種類のヤドリギ濃縮物の製造
のために実施すべき分別工程は、直接前後して実施する
のが有利であり、この際、引続く標準化製剤の製造の際
と同様に、無菌条件の厳しい保持に注意すべきである。

【００２０】緩衝された稀溶液の安定化ガラクトシド特異性ヤドリギレクチン活性を保持するた
めに、安定剤を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範
囲で、有利に５ｍｇ／ｍｌで添加する。

【００２１】このために好適な安定剤は、アルカノー
ル、殊にポリオール及びその誘導体、例えば炭水化物例
えばグルコース、サッカロース、シクロデキストリン、
誘導体化されたシクロデキストリン、ペンタエリスリッ
ト、マンニット、ソルビット及びポリヒドロキシ脂肪
酸、例えばポリ乳酸及びポリ乳酸エステル、並びに他の
親水性ポリマー例えばポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルアルコール並びにアミノ酸含有化合物例えばグリシン
又はアルブミン殊にヒト血清アルブミンである。

【００２２】生物学的もしくは免疫学的活性の測定試験管内検査材料及び方法この検査のために、ヤドリギ植物から得た抽出物を使用
し、これからヤドリギレクチンを単離した。糖結合性レ
クチンの含分を、酵素テスト−酵素−結合−レクチン−
アッセイ［ＥＬＬＡ］−を用いて、Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈ
ｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．によ
る記載［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４９（１９８９）４８
０３〜４８０８］のようにして測定した。この検査のた
めに、更に、過沃素酸塩−酸化され、ホルムアルデヒド
で処理されたＭＬＩに対するポリクローナル抗体及びア
シアロフェチュイン、タイプＩ（Ａｓｉａｌｏｆｅｔｕ
ｉｎ，ＴｙｐｅＩ）(Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．
ＵＳＡから)を使用した。

【００２３】細胞の活力の測定ヒト末稍単核血液細胞（ＰＢＭＣ）を種々の給血者か
ら、Ｆｉｃｏｌｌによるグラジエント遠心により単離し
た。洗浄後に、このＰＭＢＣをＬ−グルタミン（２ｍ
Ｍ）及びゲンタマイシン５μｇ／ｍｌを補充した、低蛋
白質含分の血清不含ハイブリドーム−培地（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）中に懸
濁させた。細胞を、平型滴定プレート（９６ウエル）中
で、ウエル１個当り細胞１×１０⁶の濃度で、後記の種
々の試薬の存在又は不存在下に、ＣＯ₂５％を含有する
湿った雰囲気中で、３７℃で２４時間インキュベートし
た。これとは無関係に、細胞の活力を、トリパンブルー
溶解テスト（Ｔｒｉｐａｎ−Ｂｌａｕ−Ａｕｓｓｃｈｌ
ｕｓｓｔｅｓｔ）並びにフルオレッセインアセテートの
吸収及びそれに引続くフルオレッセインまでの加水分解
を用いて測定した。

【００２４】細胞毒性の測定天然のキラー細胞の細胞毒性(以後ＮＫ−細胞毒性と称
する)の検査を、Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋ
ａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．による詳細［Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ．４９（前記）］及びＨａｊｔｏ，
Ｔ．，Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．による［Ｃｌｉｎ．Ｔ
ｒｉａｌｓＪ．２２（１９８５）、５１４〜５２０］
の記載のように実施した。この場合に、単核細胞をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ−Ｇｒａｄｉｅｎｔｅｎを用
いて単離した。所定量のＮＫ−敏感なＫ₅₆ ₂−標的細胞
即ち細胞２．５×１０³を、最終エフェクトで、１個の
ウエル当り２００μｌの最終量でエフェクター細胞対標
的細胞の混合比１００：１、５０：１、２５：１及び１
０：１を得るために、エフェクター細胞に種々異なる濃
度で添加した。細胞懸濁液の製造直後に、ウエルに、
［メチル−³Ｈ］−チミジン（特異活性：２５Ｃｉ／ミ
リモル）２μＣｉを入れた。１８〜２０時間のインキュ
ベーション時間の後に、細胞を収獲し、［³Ｈ］−チミ
ジン吸収をシンチレーションカウンターを用いて定量的
に測定した。ラベルされた物質の自然吸収は、標的細胞
の活性と関係していた。エフェクター細胞の細胞毒性指
数により、表現される特異性抑止率（Ｐｉ）を次式から
算出した：Ｐｉ＝（１−試験吸収／自然吸収）×１００エフェクター細胞中の［³Ｈ］−チミジンビルトイン
（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｂａｕ）を同様に類似の方法
で測定した。しかしながら、この場合に得られた値は、
無視しうる程度に低かったので、このファクターは度外
視できた。３３％の特異的抑止率（Ｐｉ−３３）を示し
たエフェクター細胞の数を半対数尺度を用いて算出し
た。このＰｉ３３−値は、種々の実験結果の比較のため
の重要な手段として使用され、特異的細胞毒性と表現さ
れた。更に、ＮＫ−検査のために単離されたモノクロー
ナル細胞集団で形態学的検査を実施した。リンパ球以外
の細胞に関して修正ファクターを測定した。ＮＫ−活性
の生体内−検査のために、白ニュージーランド家兎（Ｎ
ＺＷ）１２匹の群を使用した。

【００２５】エンドトキシンでの汚染を、Ｈａｊｔｏ，
Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａａｂｉｕｓ，Ｈ．
Ｊ．［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４９（前記）］に記載の
ように厳格に排除した。全てのデータを、統計的な方法
の使用下に、しかも、スチュデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）
によるｔ−テストを用いて調査した。

【００２６】ヤドリギレクチンＩ（ＭＬＩ）の存在下に
おけるヒト末稍単核血液細胞の生存能力ＭＬＩの細胞毒及び／又は静細胞作用を説明するため
に、レクチンの種々の濃度の存在で試験管内でのＰＢＭ
Ｃの生存能力を測定した。細胞の生存能力はレクチン濃
度≧１０ｎｇ／ｍｌにより著るしく（ｐ＜０．０５）影
響された（Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．
Ｆｒｅｉ，Ｋ．ＲｏｒｄｏｒｆＣ．Ｇａａｂｉｕｓ，
Ｈ．Ｊ．［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０（前記）］）。
少量の無害な用量の使用の際に、ＭＬＩは、軽いマイト
ジェン作用を示し、これは他の文献の認識［Ｆｒａｎ
ｚ．Ｈ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４３、追補１（１９８
６）、２３〜２４；Ｍｅｔｚｎｅｒ，Ｇ．Ｆｒａｎｚ，
Ｈ．Ｋｉｎｄｔ，Ａ．Ｆａｈｌｂｕｓｃｈ，Ｂ．Ｓｕｅ
ｓｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｂｉｏｌ．１６９（１９８５）４
６１〜４７１；Ｌｕｔｈｅｒ，Ｐ．Ｔｈｅｉｓｅ，Ｈ．
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｂ．Ｋａｒｄｕｃｋ，Ｄ．Ｕｈ
ｌｅｎｂｒｕｃｋ，Ｇ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１１（１９８０）、４２９〜４３５］と一致する。刺激
指数１．７のリンパ球増殖に関する最適免疫応答は、
０．０１ｎｇ／ｍｌのレクチン濃度で認められた。細胞
毒作用もマイトジェン作用も、特異的な糖（Ｄ−ガラク
トース）の存在の際に、レクチン−結合の阻止により相
殺された。このことから、ＭＬＩの細胞反応の経過での
蛋白質と炭化水素との間の交換作用の重要性が判る。

【００２７】試験管内でのＮＫ−敏感な標的細胞［Ｋ
₅₆₂］及びＮＫ−細胞毒性に対するヤドリギレクチンの
作用Ｋ₅₆₂−細胞は、ＮＫ−細胞の細胞毒性に対して著るし
く敏感で、ＰＭＢＣのＮＫ−活性の測定のために広範囲
に使用されうる、ヒト骨髄性白血病細胞である。Ｋ₅₆₂
−細胞の培養物中で、ヤドリギレクチンの全３種は、比
較的強い細胞毒作用を示した［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏｓ
ｔａｎｓｋａ，Ｋ．ＩｎｔｅｒｌｅｃＭｅｅｔｉｎｇ．
Ｂｅｒｌｉｎ１９９１］。レクチンに対する前記の過
敏性は、他の白血病細胞（ＭＯＬＴ４）の培養物中でも
観察された［Ｒｉｂｅｒｅａｕ−Ｇａｙｏｎ，Ｇ．Ｊｕ
ｎｇ，Ｍ．Ｌ．ＤｉＳｃａｌａ，Ｄ．Ｂｅｃｋ，Ｊ−
Ｐ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４３追補１（１９８６）、３５〜
４１］。この腫瘍細胞系とは反対に、健康なヒトＰＭＢ
Ｃの培養物中でＭＬＩは、白血病細胞の培養物中におけ
るものの３〜４分の１の細胞毒作用を示した。結果的
に、ヤドリギレクチンが、それがリンパ球に無害で、軽
いマイトジェン作用で、標的細胞に対しては無害の低い
濃度でインキュベートされる場合には、Ｋ₅₆₂−細胞に
対するＮＫ−細胞の細胞毒作用を高めることができるこ
とは意外ではない［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋ
ａＫ：ＩｎｔｅｒｌｅｃＭｅｅｔｉｎｇ，Ｂｅｒｌ
ｉｎ１９９１］。従って、ＮＫ−細胞の生体内観察
が、免疫系に関して無害で、臨床使用に好適な、腫瘍患
者にヤドリギ抽出物の形で適用されうる最適レクチン用
量を見つけることを可能にするか否かを研究することが
特に重要であった。

【００２８】生体内試験生体内でのＮＫ−細胞の細胞毒活性に対するヤドリギレ
クチンＩの作用臨床でのヤドリギレクチンの有効使用のためのＮＫ−ア
ッセイの重要性を確認するため、次に、ＭＬＩの種々異
なる用量の作用をＮＺＷ−ウサギの群で試験した。ＮＫ
−活性の最大増加は、静脈注射後２４〜７４時間に観察
され、使用用量に依存する生体内での免疫応答が、試験
管内で認められたと同様に示され［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈ
ｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ：ＩｎｔｅｒｌｅｃＭｅｅｔｉ
ｎｇ．Ｂｅｒｌｉｎ１９９１］、図面から明らかなよ
うに、適用量の１回静脈注射の後２４〜７２時間の間の
ＮＺＷ−ウサギの末稍血液中のＮＫ−活性の増加の依存
性が認められる。このことから、免疫系にとって有害な
レクチン用量の低下は、ウサギで０．８ｎｇ／ｋｇの最
適量（これはＭＬＩのＬＤ₅₀−値の４〜５分の１であ
る）で、ＮＫ−刺激作用を生ぜしめることが明らかであ
る。更に、糖結合性レクチンの含分に基づき標準化され
たヤドリギ抽出物で処置された患者でこの抽出物のこの
成分の同様に最適の用量（１ｎｇ／ｋｇ）が発見された
［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉ
ｕｓ，Ｇ．Ｈ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｋｏｎ，４（１９
９０）、１３６〜１４５］。ＮＫ−活性も、血液中で循
環するＬＧＬ細胞の頻度も、ＭＬＩにより刺激された
［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．，Ｇａｂ
ｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４９（前
記）］。

【００２９】ヤドリギレクチン（ＭＬＩ及びＭＬＩＩ）
の生体内でのＮＫ−細胞毒に対する作用の比較整理された方法で、ヤドリギ抽出物中に含有される３種
のレクチン（ＭＬＩ、ＭＬＩＩ及びＭＬＩＩＩ）が相互
に交換作用することを立証された。この事実は、ＥＬＩ
ＳＡ又はＥＬＬＡを用いるそれらの測定を考慮すべきで
ある：Ｚｉｓｋａ，Ｐ．Ｆｒａｎｚ，Ｈ［Ｌｅｃｔｉｎ
ｅｓ，Ｖｏｌ．ＩＶ（１９８５）、４７３〜４８０］。
ヤドリギ植物又は多くのその抽出物中のＭＬＩＩ及びＭ
ＬＩＩＩ分がＭＬＩの全量の約１５％である事実にもか
かわらず［Ｚｉｓｋａ，Ｐ．Ｆｒａｎｚ，Ｈ．Ｌｅｃｔ
ｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＶ（前記）参照］、その混合比の一
定の変化は、種々の抽出物（ＩＳＣＡＤＯＲ）における
製造法の結果として、排除できない。その結果、この抽
出物の治療的使用のために、ＭＬＩＩ及びＭＬＩＩＩの
免疫学的作用の検査が同様に必要である。ＭＬＩＩＩ
は、ＭＬＩで最適と立証されたと同じ量で適用する際に
は、家兎血液中のＮＫ−細胞毒を有意に（Ｐ＞０．０
５）刺激することができなかった。ＭＬＩＩＩとは反対
に、ＭＬＩＩは、有意を示した（Ｐ＜０．０２５）が、
好適な量での適用の際に、ＭＬＩに比べてＮＫ−活性に
関する定量的に低い作用を示した［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈ
ｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ．４９（前記）］。

【００３０】サイトカイン及びリンホカインのネットワ
ークに対するヤドリギレクチンＩの作用ＮＫ−細胞の観察により、受容者の防御系の多くのパラ
メータを刺激することのできる［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏ
ｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．４９（前記）及びＨａｊｔｏ，Ｔ．Ｈｏ
ｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｇ．Ｈ．Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｋｏｎ４、（前記）］、かつサイトカイン
の可能な役割を推量させるレクチンの最適使用を発見し
た。この仮定は、先行研究で立証できた［Ｈａｊｔｏ，
Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｆｒｅｉ，Ｋ．Ｒｏｒｄ
ｏｒｆ，Ｃ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．５０（前記）］。ヒトＰＢＭＣの培養物中でのＭ
ＬＩの細胞毒濃度をリンパ球に対して無害である範囲ま
で低下する際に、腫瘍−壊死−因子−α（ＴＮＦ−
α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及びインター
ロイキン−６（ＩＬ−６）の分泌の増加が観察された。
このレクチンにより増加されたサイトカインの分泌は、
細胞グルコ接合体へのレクチンの特異的結合に依存す
る。更に、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血清濃度は、８人
の癌患者で、最適レクチン含分（１ｎｇ／ｋｇ）の抽出
物の注射の後に高められた。

【００３１】サイトカイン−ネットワークに関するこれ
らの試験は、従来未完であるが、おそらく、ＴＮＦ−
α、ＩＬ−１及びＩＬ−６が受容者の種々の防衛機構の
レクチン−誘導強化の仲介の際に決定的役割をすること
はありうる。レクチン誘導されたＮＫ−増加は、ＩＬ−
１、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの放出の増加にも関係する
ことができ、これは、ＮＫ−細胞及びＩＬ−２に対する
ＩＬ−２−レセプターの間の交換作用（ＣＤ２５−出現
及びＩＬ−２−合成の強化）を増大させることができ
る。この疑問を解明するために更に試験をした。

【００３２】ヤドリギレクチンにより仲介された免疫変
性作用と抗腫瘍−活性との間の関係ヤドリギレクチンの最適免疫変性用量の測定により、こ
のレクチンが、長時間使用される際に、抗腫瘍作用を惹
起しうるか否かの疑問が起った。ＭＬＩの種々の用量で
の試験で、最適用量（１ｎｇ／ｋｇ）だけが、ヒト腫瘍
で異種移植されたヌードマウスでの腫瘍生長の低下作用
をしたことが判明した［Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ等、Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔａｅｔＥｓｓｅｎ（ＢＲＤ）、非公開デ
ータ］。同様な方法で、糖結合レクチンの含分に基づ
き、標準化され、かつ最適用量式に応じて適用されたヤ
ドリギ抽出物は、進行した病期の腫瘍を有する患者で抗
腫瘍−活性を誘発することができた［Ｈａｊｔｏ，Ｔ．
Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｆｏｒｎａｌｓｋｉ，Ｍ．Ｋ
ｉｒｓｃｈ，Ａ．Ｄｔｓｃｈ．Ｚｅｉｔｓｃｈｒ．Ｏｎ
ｋｏｌ．２３（１９９１）１〜６］。更に、動物モデル
での試験は、放射線治療と組み合せたその適用の際に、
臨床観察と一致している非公開データにおけるように、
ＮＫ−系に対するＭＬＩの保獲作用を示した［Ｈａｊｔ
ｏ，Ｔ．Ｈｏｓｔａｎｓｋａ，Ｋ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｇ．
Ｈ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｋｏｎ，４（前記）］。

【００３３】結果及びこれから引き出すべき結論前記試験の経過で得られた結果に基づく前記の態様は、
細胞毒活性及び／又は血液中を循環するＮＫ−細胞の頻
度に関するＮＫ−系の観察が、高毒性のヤドリギレクチ
ンに関し、ヤドリギ抽出物中に含有されていて、受容者
の防衛メカニズムを刺激する作用をすることのできる、
最適用量を提示することを可能とすることが明らかにし
ている。

【００３４】前記の結果は、更に、ヤドリギレクチンの
抗腫瘍活性並びにその細胞毒活性を得るために、その免
疫変性作用がいかに必要であるかを確実に限定された確
率で推考させる。

【００３５】得られた結果は、なお、標準化ヤドリギレ
クチン製剤の適用が、その生物学的活性に基づき、正確
に規定された生物学的活性ヤドリギレクチンの含有率
で、最適用量計画により、腫瘍治療での使用及び例え
ば、自然の免疫抵抗を高めることにより、他の病気の治
療のために使用することが推奨されることも認識させ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】適用量と細胞毒性の最大増加との関係を示す
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】安定化された標準化ヤドリギレクチン製剤、ヤドリギレクチン濃縮物の製法及びヤドリギレクチンフラクションを含有する製剤の製法、及び自然免疫抵抗を高めるため及び腫瘍治療のための医薬品

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫学的に活性の、ガラクトシド特異性
ヤドリギレクチンを、ヤドリギレクチン−Ｉ−標準とし
て測定して（ここでレクチン量は、生物学的に活性のレ
クチンのみに関する）、規定の高含分で含有する、安定
化された標準化ヤドリギレクチン製剤。
【請求項２】免疫学的に活性のガラクトシド特異性ヤ
ドリギレクチン５０ｎｇ／ｍｌ〜３５０ｎｇ／ｍｌを含
有し、７．０〜７．５のｐＨ値を有する溶液としての、
請求項１に記載の安定化された標準化ヤドリギレクチン
製剤。
【請求項３】溶液は凍結乾燥されている、請求項２に
記載の安定化された標準化ヤドリギレクチン製剤。
【請求項４】ヤドリギ水性抽出物を種々のフィルター
及び洗浄液の使用下に分別濾過する方法でヤドリギ水性
抽出物から免疫活性ガラクトシド特異性ヤドリギレクチ
ン分の高いヤドリギレクチン濃縮物を取得する方法にお
いて、第１分別工程で未発酵水性ヤドリギ抽出物を少な
くとも１回限外濾過して分子量２００００〜１００００
０の物質を有するフラクションを取得し、この限外濾過
により得られた濃縮物を、第２分別工程で少なくとも１
回の滅菌濾過に供することよりなる２工程分別を実施
し、この際に得られる最終濃縮物を、所望の最終量まで
稀釈し、場合により安定化させることを特徴とする、ヤ
ドリギレクチン濃縮物の製法。
【請求項５】第１分別工程で２回の限外濾過を実施
し、この際、第１限外濾過のために、１０００００ＮＭ
ＧＴを有するポリスルホンフィルターを使用し、引続
き、得られた濾液を緩衝液で２回洗浄し、第２限外濾過
のために、２００００ＮＭＧＴを有するセルロースアセ
テートフィルターを使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】第１分別工程の後に、第２分別工程とし
て滅菌濾過を実施する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】ｐＨ７．０〜７．５の範囲で操作する、
請求項４から６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】第１及び第２の分別工程を、直接連続し
て２時間以内に実施する、請求項４から７のいずれかに
記載の方法。
【請求項９】２つの分別工程で得られた最終濃縮物
を、所定の量まで稀釈し、場合により安定化させる、請
求項４から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】得られた抽出物を凍結乾燥させる、請
求項４から９までのいずれかに記載の方法。
【請求項１１】免疫活性ヤドリギレクチンフラクショ
ンを含有する標準化製剤を製造するために、請求項４に
記載の方法で得られたヤドリギレクチン−濃縮物の生物
学的活性を測定し、得られたフラクション中の免疫学的
に活性のガラクトシド特異性ヤドリギレクチンの濃度を
測定し、フラクションを生理学的に認容性の緩衝液で稀
釈し、ここで変法として安定化し、所定の治療に使用す
るために必要なレクチン含分に調節し（この際、レクチ
ン含分は生物学的単位で示す）、かつ分割し（この際、
各々の部分量は、治療及び／又は予防における所定使用
のために必要な用量の生物学的に活性のガラクトシド特
異性ヤドリギレクチンを含有する）、かつ部分量を、個
々に滅菌条件下で滅菌し、かつパイロゲン不含でアンプ
ル中に封入することを特徴とする、標準化免疫活性ヤド
リギレクチンフラクションを含有する製剤の製法。
【請求項１２】安定剤として、アルカノール、殊にポ
リオール及びそれらの誘導体、例えば炭水化物例えばグ
ルコース、サッカロース、シクロデキストリン、誘導体
化されたシクロデキストリン、ペンタエリスリット、マ
ンニット、ソルビット及びポリヒドロキシ脂肪酸、例え
ばポリ乳酸及びポリ乳酸エステル、更に他の親水性ポリ
マー例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、更に、アミノ酸含有化合物例えばグリシン又はアル
ブミン殊にヒト血清アルブミンを使用する、請求項１１
に記載の方法。
【請求項１３】安定剤を、稀釈された又は緩衝された
溶液に対して０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範
囲、有利に５ｍｇ／ｍｌの量で使用する、請求項４，
９，１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】試験管内での３つの無関係な試験法を
用いて生物学的活性の測定を実施する方法で、この際、
最適酵素−テストの使用下に糖結合性活性レクチン分を
測定し、トリパンブルー及び加水分解されてフルオレッ
セインになるフルオレッセインジアセテートを用いて、
ヒト末稍単核細胞（ＰＭＮＣ）の培養液中での細胞活力
を測定し、レクチン敏感な白血病細胞［Ｋ₅₆₂］におけ
る［Ｈ³］−チミジンの吸収を測定する、請求項１１に
記載の方法。
【請求項１５】得られた、生物学的活性ガラクトシド
特異性ヤドリギレクチンフラクション含有製剤の標準化
を、生物学的活性の測定から得られた値を用いて行な
う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】請求項１１から１５のいずれかに記載
の方法で得られる、免疫学的に活性のガラクトシド特異
性ヤドリギレクチンの規定含分を有する生物学的活性を
有する、安定化された標準化ヤドリギレクチン製剤。
【請求項１７】請求項１から３のいずれかに記載の安
定化された標準化ヤドリギレクチン製剤より成る、自然
免疫抵抗を高めるための医薬品。
【請求項１８】請求項１から３まで又は１６に記載の
安定化された標準化ヤドリギレクチン製剤より成る、腫
瘍治療用医薬品。