JPH02131428A - ヒノキ科植物由来の多糖類含有活性成分の白血球障害の治療に対する使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，ヒノキ科植物，特にスジャ　オクシデンタリ
スＬ，　　（Ｖ阻Ｄエｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｌ．
　）由来の．多ｔＩ類含有成分の使用に関する。この成
分は，例えば，レトロウイルスおよびレンチウィルスの
疾病および電離放射線の影響による疾患のような白血球
の障害を伴う疾病の治療に用いられる。

（従来の技術） 植物エキスによる有効なリンパ球の免疫調節は．従来，
例えばレクチン類として知られている一群の物質．すな
わち分裂促進作用を有するプロテオグリカン類によって
，非特異的な多クローン性リンパ球を刺激することしか
できなかった。しかし，レクチン類が高い毒性を有し不
利なことが証明されているので，これらの物質を生体内
で利用することは不可能になっている。

さらに，特にキク科植物（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の薬
種由来で，水性または水性アルカリ性エキスから得られ
た多糖類画分が報告されている〔ワグナーら（Ｗａｇｎ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　，　Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆ
ｏｒｓｃｈｕｎｇ　３５巻，１０６９〜１０７５頁，　
１９８５年，参照〕。これらの多糖類画分は．顆粒球，
および単球もしくはマクロファージの食作用が非特異的
に増大することを示した。

Ｂリンバ球およびＴリンパ球の両分が弱い多クローン性
刺激性を示すことは，エシナシー　ププリ−（Ｈｃｈｉ
ｎａｃｅａ　　匹匹匹Ｌ）から単離された多糖類（ｅｐ
ｓ　）にも観察された（ワグナーら，　Ａｎｇｅｗａｎ
ｄｔｅ　Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｉｅ，　　２巻．１６
６頁，　１９８１年参照〕。

ミクロおよびマクロの食細胞の多クローン性刺激性も．
上記の多糖類によって得られる。

高等植物由来の多Ｉ１！類で，白血球の増殖を選択的に
再形成するものは，今まで全く報告されていない。

（発明の目的） 本発明の目的は．白血球の障害を伴う疾病の治療に用い
られる薬物を製造することにある。

本発明の目的は，特にレトロウイルスおよびレンチウィ
ルスによる疾病の治療，および．例えば電離放射線照射
または細胞分裂を阻止する治療の影響を受けた後の骨髄
の再構築のための新規な薬物を徒供することにある。

（発明の構成） 本発明は，ヒノキ科植物由来の多糖類含有成分の．白血
球障害を伴なう疾病を治療するための使用であって．該
成分は，次の（ａ）〜（ｆ）により得られる：（ａ）破
砕し有機溶媒で洗浄したヒノキ科植物の地上部を，アル
カリ水性溶媒で抽出すること．　（ｂ）得られた抽出物
を有機溶媒と混合し，該抽出物から多＃Ｍ類とタンパク
とを沈澱させること，（Ｃ》沈澱物を分離し，該沈澱物
を常温を下まわる温度の水に溶解させること，（ｄ）得
られた溶液を酸性にしてタンパクを沈澱させること．（
ｅ）該沈澱物を分離し，上澄み液を有機溶媒と混合する
こと，および（ｆ）得られた沈澱物を透析し次いで乾燥
すること。

請求項１の薬物の用途は．これらの目的を達成するため
に提案され，請求項２〜７は．この発明の好ましい実施
態様に関する。

この発明によれば．予想外のことであるが，ヒノキ科植
物，特にスジャ　オクシデンタリス　し．由来の成分が
，以下に詳細に述べる多Ｗ類を含有し．白血球障害の治
療に有用な薬物であることが見出された。この成分は，
脊椎動物の健康な白血球細胞に対するレンチウィルスお
よびレトロウイルスの複製と感染性とを減退させ，白血
球の増殖を刺激し，例えば放射線照射のような電離放射
線で起こる障害に対して保護効果を発揮する（実施例１
０参照）。本発明は，後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ
）を治療するためにも使用される。

本発明のヒノキ科植物の多Ｉ！類含有成分は，ヒノキ科
植物，特に好ましくはスジャ　オクシデンタリス　し．
の地上部から，カルデスら（Ｃａｌｄｅｓｅｔ　ａｌ　
）　，　Ｊ．　Ｇｅｎ．＾ｐｐｌ．　Ｍｉｃｏｂｉｏ１
．，２７巻，１５７頁，　１９８１年．に記載の方法に
よって製造することができる。

この目的のため．まず，該植物の上記の部分を例えば破
砕して，大きさを小さくする。次いで，石油エーテル，
ジクロ口メタンおよび／またはメタノールのような有機
溶媒で予備抽出して原料を破砕し．洗浄することが好ま
しい。

残渣を乾燥し，次に実際の抽出操作に付される．抽出操
作は，アルカリ水溶液で１〜１０゜Ｃ，好ましくは２〜
６゜Ｃにて行なわれる。好ましくは，０．１〜１．Ｏ　
Ｎ，特に０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液が抽出に用
いられる。抽出物を濾過し，次いでアルコール．好まし
くはエタノールで沈澱させるが，エタノール：水の最終
比率は約３：１が好ましい。

得られた沈澱を，例えば超遠心分離法で濾取し．次いで
水に溶解させる。

次に，得られた溶液を．例えばトリクロロ酢酸で酸性に
することによって．公知の手法によりタンパクを沈澱さ
せる。残渣を分離してから上澄み液を再度エタノールで
処理し，多糖類を含有する本発明の成分が得られる。

上記の方法では，本質的に，ヘミセルロース類が得られ
る。得られた物質を水に取り，分離限界が１００ダルト
ンの透析チューブにより透析し．次いで乾燥される。凍
結乾燥が好ましい。得られた生成物（ＴＰＳ　）は，実
質的に．タンパクとヌクレオチドとを含有していない。

さらに分離するために，　ＴＰＳを水溶液とし．限外濾
過法によって細分割して．分子量による両分を得ること
ができる。

分子量が少なくとも１００ＤのＴＰＳ全画分とそのＴＰ
Ｓ細分画分が本発明の活性を有し．その活性は，特に少
なくともＩＸ１０’Ｄとの分子量を有する画分に観察さ
れるということが，この発明で明らかになった（実施例
３参照）。

驚くべきことには，ヒノキ科植物から得た成分は，本発
明による多Ｉｉ類を含有するが，高い投与量でもインビ
トロの毒性が全くないということが，さらに判明した。

ヒトの末梢血液細胞によるインビト口での実験によって
，最適効果が活性物質の濃度約０．１〜１■／ｄの水溶
液で得られ（実施例３参照）．高分子量の両分の方が高
い比活性を有することがわかった。

本発明によるヒノキ科植物由来の成分ＴＰＳは，医薬品
の活性物質として使用することができ．分裂促進効果（
ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）を得るには，少な
くともＩＸ１０’Ｄの分子量を有する画分を使用するこ
とが好ましい。

本発明に対するヒノキ科植物由来の活性物質は，通常の
担体と補助物質とが投与形態に適したもので薬学的に安
全なものであれば．これらを用いて医薬品とすることが
できる。ＴＰＳは．生理食塩水の溶液として非経ロルー
トで投与するのが好ましい。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明の実施例について説明する。

薬物（植物の断片）の処理： 乾燥させて粉砕した薬物を．石油エーテル，ジクロロメ
タン，およびメタノールによるデプリーティングソック
スレー抽出法に供した。このようにして予備抽出された
薬物を，さらに処理するために風乾した。

アルカリ水溶液による抽出物からの粗製多糖類の獲得： 特に断らない限り，すべての工程は４゜Ｃで実施した。

予備処理して乾燥させた８００ｇの薬物（上記参照）を
，　０．５　Ｎの水酸化ナトリウム溶液１０ｆと混合し
て一晩攪拌した。

残留物を遠心分離し，５ｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム
溶液で洗浄した。合わせた濾液を．絶えず攪拌しながら
，３倍容量の９６％エタノール（非変性）と徐々に混合
した。一晩で生成した沈殿を，注意深く傾瀉し，超遠心
分離（１５，ＯＯＯｒｐｍ，　１５分間）により，残り
の上澄み液から最終的に分離した。

得られた沈澱を，　　３．１！の蒸留水に溶解し．水浴
中で，　　３．ＦＭ！の１０％トリクロ口酢酸（ＴＣＡ
　）と徐々に混合し，この水浴中に１時間放置した。次
いで，生成したゼリー状の残留物を遠心分離し，残った
約６１の上澄み液を，３ｆずつに分画し，その各々の両
分に１２２の９６％エタノールを滴下して混合した。２
４時間後，両方の両分から生成した沈澱を遠心分離し，
これらの沈殿を合わせて，できる限り少量の２％酢酸ナ
トリウム溶液に取った．不溶成分は遠心分離（１０．Ｏ
ＯＯｇ．　２０分間）で除去された。

得られた透明な溶液を，８ｆの９６％エタノールと混合
し，生成した沈殿を４゜Ｃで４日間放置した。

次いで，遠心分離を行い，生成した粗製多塘類を，蒸留
水に対して９６時間透析（透析チューブ，透析限界１０
０Ｄ．約４゜Ｃ）し，そして凍結乾燥した。

収率：１５．６６ｇの粗製物＝１．９％。

精製： １０ｇの粗製多Ｉｉ類を．　　５００ｄの蒸留水に溶解
した。得られた溶液を，４゜Ｃで絶えず攪拌しながら５
５００　ｍの９６％エタノールに滴下した。

生成した沈殿を．４日後に遠心分離（１５．　００Ｏｒ
ｐｍ，１０分間）シ，上澄み液を同量のエタノールと同
様に混合し，そしてさらに処理した。

４倍容量のエタノールを用いて処理を繰返した。

得られた沈殿を少量の蒸留水に取り，透析した後，凍結
乾燥した。

出発物質：１０ｇの薬物 ＴＰＳ収率：１：１沈殿法： ８．７６ｇ　（粗製物基準で８７．６０％のＴＰＳに相
当する）。

ＴＰＳ収率：１：４沈殿法： ０．７６７　ｇ　（粗製物基準で７．６７％のＴＰＳに
相当する） スｍ亀 υ主Δ副ｊ』プυ１除 副画分の単離を限外濾過法で実施した。実施例１で得た
ＴＰＳを蒸留水に溶解し．２■／ｄの濃度にした。１０
　０　ｍｌの溶液を，限外濾過セル（ＵｌｔｒａＳａｒ
ｔ　５０，　Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，西独）で，　１．５
ｂａｒの窒素圧下にて．連続的に濾過した。

下記のタイプのフィルターを使用した。使用したフィル
ターは，すぺてＳａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｃｏｍｐａｎｙの
ものである。

ＳＭ　１１３　２８　　　　＞１，０００．０００　Ｄ
ＳＭ　１１３　１Ｂ　　　　　＞３００，０００　Ｄ〜
＜１．０００，０００　ＤＳＭ　１４６　６９　　　　
　＞１００，０００　Ｄ　〜＜３００．０００　０ＳＭ
　１４９　４９　　　　　＞２０，０００　Ｄ〜＜１０
０．０００　０上記のようにして得た副画分を，再蒸留
水に対して４８時間透析した後，凍結乾燥した。

収量： ＴＰＳ　１．分子量＞１，０００．０００　Ｄ・・・・
・・・・・・・・・・・・５．４５ｇＴＰＳ　２，分子
量＞３００，０００　Ｄ　〜＜１．０００．０００　Ｄ
　・．−１．４２ｇＴＰＳ　３，分子量＞１００，００
０　Ｄ　〜＜３００．０００　０　・−・−０．７４ｇ
ＴＰＳ　４，分子量＞２０，０００　Ｄ　〜＜１００，
０００　Ｄ　・・・・・・０．５３ｇＴＰＳ　５，分子
量＞２０，０００　Ｄ・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・０．２５ｇ透析： 透析は．透析ホース（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ，透
析膜，１−８ｘｌＯＯＦＰ　）または透析チューブ（Ａ
ｓａｈｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ，ＡＭ−１００Ｈ　）を用い
て実施した。透析チューブによる透析では，被透析物を
ホースポンプで連続的にチューブを通して汲み上げた。

透析液（蒸留水）は，透析チューブの導入ノズルおよび
排出ノズルの位置で．ウォータージェットポンプ（圧力
は１．５ｂａｒ以下）によりチューブを連続的に通過さ
せた。

これらの透析チューブは分離効率が高いので，透析を１
０時間に制限することができた。

すべての副画分を．全ＴＰＳと共に，ヌクレオチドおよ
びタンパクの存在について標準法により試験した。得ら
れた結果は，タンパクおよびヌクレオチドのいずれも検
出可能な量では存在していないことを示した。

カーボゾル試験法（Ｎａ　Ｌｕｒｅ，■弧，４８３を参
照されたい）を用いて，酸性多糖類を定量した。この定
量用に．一連の対照物として，５〜４０μｇのガラクツ
ロン酸およびグルクロン酸一τラクトンを調製した。

被検試料をＨ．ＳＯ４で処理し，吸光度を測定した。

一連の対照物を基準にして，約５％のウロン酸が含有さ
れていることがわかった。

ＴＰＳおよび副画分ＴＰＳＬ　１〜４を，　１０％ヒト
ＡＢ血清を加えた［ダルベッコの修正イーグル培地（Ｄ
ＭＥ）　Ｊに溶解した。活性物質の濃度は各々１０■／
ｄであった。

５■／ｄ〜１００ｎｇ／ａｔ！の活性物質希釈シリーズ
を作製した。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ　）を，ポリ
サッカロース匂配（Ｐｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ．　Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）で濃縮し．３７゜Ｃの温度に保持した
リン酸緩衝食塩水溶液（０．９％）で５回洗浄し．１０
％ＡＢ血清を加えたＤＭＨに取り，そしてマイクロタイ
ターウエル当り１００μ！中に５Ｘ１０’細胞の細胞密
度で，９６ウエルの平底マイクロタイタープレート（Ｇ
ｒｅｉｎｅｒＣｏｍｐａｎｙ　）に配分した。

試験溶液は上記の最終濃度で３回分析した。インキュベ
ーションは，　Ｈｅｒａｅｕｓのインキュゝ一ターを用
い，３７゜Ｃ．　　５％Ｃｏｔ　，および湿度１００％
の条件下で行った。１０％ＡＢ血清を加えた１００μｌ
のＤＩ’ｌｌＥを負の対照として用い，正の対照として
は，フィトヘムアグルチニン（ＰＩＩＡ　）として知ら
れるファセオルス種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｓｐｐ．）
の植物（インゲンマメ）のレクチン溶液を，最終濃度１
０μｇ／一に調整して用いた。

上記の試料は．分裂促進活性に関するすべての試験に用
いたが，　ＴＰＳで誘発されたＤＮＳ合成を測定するた
めに，　ＴＰＳおよび上記の対照培養物についテ下記の
インキュベーションをさらに行った。

すなわち．マイクロタイターウエル当り，最終濃度／ウ
ェルで０．２〜１．５μＣｉの３Ｈチミジンを添加し，
そしてインキュベーター内で１２時間インキユベートし
た。次いで．放射標識した細胞を，細胞採取装置を用い
て濾紙上に取り，シンチレーションカクテル（　ｐｏｐ
ｐｏｐ　）を添加することにより，放射能をｃｐＩ１（
カウント数／分）で測定した。

得られた結果を第１図〜第４図に示す。これらの図は，
　ＴＰＳおよびＴＰＳ　１〜４がＰＢＬに対する分裂促
進活性を有することを示している。

牌臓由来の細胞懸濁液の調製： ＢＡＬＢ／Ｃ系のマウスを頚部脱臼により殺した。これ
らマウスの肺臓を滅菌状態で取り出し，外科用鉗子で小
片に引き裂いて，１０−のＢＳＳ　（ｐＨ安定化食塩水
）を満たしたペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ，　Ｎｕｅｒｔ
ｉｎｇｅｒ）に入れた。

単一細胞の懸濁液を得るために，バスツールピペットで
出し入れすることにより．細胞を組織の断片から洗い出
した。得られた懸濁液を滅菌金網で濾過して組織の残留
物を除去した。

このようにして調製した細胞を，　ＢＳＳで５回洗浄し
た（２００　ｇ，　１０分間，’Ｍｉｎｉｆｕｇｅ＋　
Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｏｓ　ｔｅｒｏｄｅ　）。

ナチュラルキラー細胞の誘発に対するＴＰＳの効果を，
クロム５１遊離試験法で評価した。

標的細胞の調製； 肺臓細胞を上述のようにして調製した。マウスの線維肉
腫ＹＡＣ−１は，優れたＭＬ標的細胞である。

これらの細胞をＢＳＳで３回洗浄し，細胞数を約５×ｌ
ＯＳに調整した。この細胞数の細胞を．　０．１　ｍｌ
ｌのＮａｔ”Ｃｒｏｐ　（３７，０００キロベクレル／
　ｍｌ　，　ＡｍｅｒｓｈａｍＢｕｃｈｌｅｒ＋　Ｂｒ
ａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ　）と共に，３７゜Ｃで１時間イ
ンキユベートし，　ＢＳＳで３回洗浄し，そして４×１
０ｓ細胞／ウエルに調整した。これらの細胞を，９６ウ
ェルの平底マイクロタイタープレートの１００μ！ステ
ージにプレートした。

クロムの遊離： 様々な濃度のＴＰＳと共に．６時間または１８時間にわ
たって予めインキユベートした様々な量のエフェクター
細胞を，マイクロタイタープレートの標的細胞に添加し
た（１００　　：　１　；５０：　１　；２５：　１；
　１２．５　：　１　；　１　ｍｇ／ｒｒｄｌ　〜１０
０　ｍｇ／ｍｆｆｉ）。

培養物の最終容量は，　０．２　ｍｌｌであった。ＳＩ
Ｃｒの最大遊離量を，水酸ナトリウム溶液（　Ｉ　Ｍ，
　Ｍｅｒｃｋ）による全細胞溶解法で測定した。標的細
胞のみが自然遊離の値を示した。細胞を３７゜Ｃのイン
キエベーター内で６時問および１８時間にわたってイン
キエベートした。

測定： 各バッチから０．１ｄずつ取り出し，それらが有する放
射能をγ線カウンターで測定した。

エフェクター細胞の溶解活性は，次式により．クロム遊
離量の百分率（％）として算出した：得られた結果を第
５図に示す。これらの結果は，ＹＡＣ−１標的細胞に対
するキラー細胞活性がＴＰＳにより増加することを示し
ている。

第１の試験系では，逆転写酵素の活性を，　Ｂ．Ｂｒｏ
ｉｅｓｙらの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ．　　７７，７４１５　（１９
８０）　）により測定した。ウイルス固有の逆転写酵素
の活性は．ウイルス活性の指標とじて役立つ。この活性
は　３｝１−エチルで標識したデオキシチミジン−５゜
−三リン酸（ＴＴＰ　）を導入することにより測定され
る。

第２の試験系では，ヒトレトロウイルスに固有の膜タン
パクｐ２４を，　Ｐｏｐｏｖｉｃらの「抗原捕捉」ＥＬ
ＩＳＡ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２２４．　（１９８４）
）により測定した。この試験では．　４１０ｎｍにおけ
る吸光度として測定した染色強度は，存在するｐ２４の
濃度に比例している。

両方の試験系では，　ＨＩＶウイルスに感染させた末梢
血白血球を，　ＴＰＳで３日間前刺激を行い，次いでイ
ンターロイキン２培地で．１１日間インキュベーション
を行った。合計１４日経過してから．これら末梢血白血
球（ＰＢＬ　）の培養上澄み液と，比較のために導入し
た適切な試料の培養上澄み液とのウイルス力価を，両方
の試験法を用いて測定した。得られた結果を表１および
表２に示す。これらの結果は，　ＴＰＳが，Ｔヘルパー
細胞，未熟Ｔ細胞，およびゼロ細胞に対する分裂促進活
性を保持しながら，　ＴＰＳ効果により形成されたＴヘ
ルパー細胞の新しい惑染を阻害する効果を有すると共に
．用いたウイルスの初期濃度を著しく減少させることを
示している。

紅 Ｐｏ　ｏｖｉｃらの　法による 試 非感染のＰＢＬ． ＰＨＡ−Ｐで活性化 ？感染のＰＢＬ，増殖の刺激なし 非感染のＰＢＬ，　ＰＨＡ−Ｐで活性化非感染のＰＢＬ
．　ＴＰＳで活性化 ２５，０００単位のＨＴＬＶ　Ｉ■，を感染させたＰＢ
Ｌ，増殖の刺激なし ０．０４６ ０．０３５ ０．０４４ ０．０６１ ＰＨＡ−Ｐで刺激したＰＢＬ， ２５，０００単位１７）　ＨＴＬＶ　ｒ　ｒ　ｒ　ｂを
惑染ＴＰＳで刺激したＰＢＬ， ２５．０００単位ノＨＴＬＶ　ｒ　ＩＩｂを惑染増殖刺
激なしのＰＢＬ， ｓｏ．ｏｏｏ単位（ＤＨＴＬＶ＋＋＋ｂを惑染ＰＨＡ−
Ｐで刺激したＰＢＬ， ５０，０００単位（７）ＨＴＬＶ＋ｔ＋ｂを惑染ＴＰＳ
で刺激したＰＢＬ． ｓｏ．ｏｏｏ単位＋７）ＨＴＬＶ＋＋＋ｂを怒染増殖刺
激なしのＰＢＬ． ３００，０００単位の｝ｌＴＬＶｚ＋ｂを感染０．３５
３ ０．０５１ ０．０５９ ０．８０４ ０．０５５ ０．２５６ ＴＰＳで刺激したＰＢＬ， ３００．０００単位（ＤＨＴＬＶ＋＋＋ｂを感染０．１
８７ スＪｌ１ｉ Ｔ１ｌｌ胞の濃縮： Ｔ細胞を濃縮するために，ヒト末梢血白血球をポリサッ
カロース匂配法により得た後，　Ｇａｒｔｎｅｒらの付
着法（Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２３３，　２１５　（１９８
６））により単球細胞を除去した。

マウスの牌臓細胞について述べられたＪｕｌｉｕｓらの
分離法（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．．　　３．
　６７８５　（１９７３））を用いて，Ｔ細胞を濃縮し
た。

Ｔ細胞画分の濃縮： ナイロン綿（Ｌｅｕｋｏ−Ｐａｋ＋　Ｆｅｎｈａｌｌ　
Ｌｂ．，　Ｄｅｒｆｔｅｌｄ．ＵＳＡ　）を使用前に再
蒸留水で１０回煮沸することにより，水溶性の妨害不純
物を定量的に除去した。

次いで，上記のナイロン綿を乾燥し，ほこりが付かない
ようにして保存した。５　ｒｎ１の再蒸留水を入れた１
０　ｍｌのガラス製シリンジに．予め洗浄した１ｇのナ
イロン綿を入れ，オートクレープにかけて分離カラムを
作製した。

そして，作製したカラムに，滅菌したタップおよびカニ
ューレを取り付けた。次いで，このカラムを３７゜Ｃに
加熱し，５％ＡＢ血清を加えた７５ｍｌのＢＳＳですす
ぎ，そしてタップを閉じて３７゜Ｃで１時間加熱した。

ヒト末梢血白血球の細胞懸濁液を，先に述べたようにし
て調製した。非付着性の細胞を攪拌して遠心分離した。

このようにして得られた非付着性の細胞を，５％ヒ｝Ａ
Ｂ血清を加えた２〜３ｄのＢＢＳに取り，カラムに入れ
た。この充填力ラムを，インキュベーター内で３７゜Ｃ
に１時間放置した。ナイロン綿に付着していない細胞を
注意深く洗い出して，約３５戚の抽出物を収集した。こ
のようにして得られた細胞は，Ｉ縮Ｔ細胞画分を必要と
する試験処方物用に用いた。

Ｂ細胞画分の濃縮： Ｂ細胞画分は，ヒ１・末梢血白血球を，　Ｇａｒｔｎｅ
ｒらによる付着分離法（上記文献中）のボリサッ力ロー
ス匂配および上記の処理に供することにより得られた。

溶出されずにナイロンカラ仏に付着している細胞を，　
Ｃａ”およびＭｇｌ＊を含有しない２５ｄの氷冷したＰ
ＢＳ溶液で洗い出した。

これらの細胞は，濃縮Ｂ細胞画分として，上記の試験系
に用いた。

ＤＮＡ合成速度に対するＴＰＳの効果は　３Ｈ−チミジ
ンの取り込みにより測定される。１０％ヒトＡＢ血清を
補充したＲＰＭＩ−１６４０培地が，試験培地として用
いられる。

濃縮されたＴ細胞およびＢ細胞の両分とＰＢＬとは，９
６ウェルの平底マイクロタイタープレートに，５Ｘ１０
’細胞／ウエルの濃度で接種された。自己単球を，５Ｘ
１０’細胞の濃度で対応する試料に添加した。ＴＰＳは
，１■／Ｉｄ／ウェルの最終濃度で用いられた。これら
のプレートを３７゜Ｃで４日間インキユベートしたが．
最後の１２時間には，マイクロタイタープレートのウエ
ル当りｏ．ｓｃｔが存在していた。

次いで，取り込み率を実施例３に記載の方法で測定した
。

得られた結果を第６図および第７図に示す。これらの結
果は，　ＴＰＳが濃縮Ｂリンパ球画分に対して顕著な効
果を持たないのに対し，Ｔリンバ球は単球またはマイク
ロファージの存在下で選択的に刺激されることを示して
いる。

（以下余白） ス１韮コ− 抗インターロイキン２試験を，　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｇｅ
ｎｚｙｍｅＣｏｒｐ．　　，（ＵＳＡ　）のメーカー情
報書類，　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ２ｍに従って行った。末梢
血白血球画分の細胞培養物の上澄み液（調整培地）を，
ｌＯ％ＡＢ血清を加えたＤＭＥ中で，予め４日間インキ
エベートしておいて，試験画分として用いた。

試験手順： 試験開始２日前に，マイクロタイタープレートを，モノ
クローナル抗インターロイキン２抗体で被覆した。これ
を実施するために，モノクローナル抗体を．　１１．５
ｄの「被覆緩衝液」に再懸濁した。

この溶液１００μβずつを５マイクロタイタープレート
（（；６ｎｚｙｍｅ　）のウェルに分配した。次いで，
このプレートを，４゜Ｃの湿潤チャンバー内で，上記の
時間インキユベートした。

試験の日に，Ｍｌ換え体ヒトＩＬ２　　（ｒＩＬ２）か
らなるインターロイキン２標準品を，１０％ＡＢ血清を
加えたＤＭＥで再構成し，以下の一連の希釈液を調製し
た：凍結乾燥したｒｌＬ２をＩＩｄの培地内に取った。

この溶液は，　５００　ＩＩ　／ｄのＩＬ２濃度に相当
するものであった。この溶液から０．１ｄを取り，「被
覆緩衝液」を加えて，１ｍｌにした。

この工程では，前の標準希釈液０．１ａ＋ｆ！を取り，
「被覆緩衝液」を加えて１　ｍｆｔにするという操作を
３回繰り返した。このようにして，　５００　Ｕ　／一
〜０．５　Ｕ　／ｍｌ　　ｒｌＬ２の濃度系列を得た。

ｒｌＬ２で被覆した後，これを洗浄緩衝液で３回洗浄し
た。次いで，インターロイキン２の標準希釈液を．マイ
クロタイターフ゜レートのウェノレ当り１００μｌずつ
，２つのウエルに分配した。１００μ！／ウェルの培地
を，調整培地の調製に用いたのと同じ条件下でインキユ
ベートしたが．これは負の対照として役立つ。次いで．
プレートを３７゜Ｃで１時間インキユベートし．再び洗
浄緩衝液で３回洗浄した。

他方，第２の抗体である多価ウサギ抗ヒ｝ＩＬ２抗体を
，　０．３　ｄの抗体溶液と，１４滅のＰＢＳ　／Ｔｗ
ｅｅｎ洗浄緩衝液とを混合して調製した。この溶液を１
マイクロタイターウェル当り１００μｌずつ分配した。

インキュベーションを３７゜Ｃで１時間行った。

次いで，これをＰＢＳ　／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液で再度
３回洗浄し，第３の抗体と共にインキユベートした。こ
れは，アルカリホスファターゼが結合されたヤギ抗ウサ
ギ抗体であった。この抗体複合体２００ａｐｔを，１２
ｄのＰＢＳ　／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液と混合し，ウェル
当り１００／７ｊｌ！ずつ分配した。

インキュベーションを３７゜Ｃで１時間行った。

ＰＢＳ　／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液で３回洗浄後．以下の
組成を有する基質と共に，２０゜Ｃで１時間インキユベ
ートした。

基！緩衝液　６ｄ ＭｇＣ１２溶液　６一 ｐ−ＮＰＰ一基質　１０■ 上記の基質を，ウェル当り１００μβずつ分配して，２
０゜Ｃで１時間インキユベートした。

ｐ−二トロフェノールのｐ−ＮＰＰからの酵素による遊
Ｍ量は．結合したインターロイキン２の量に比例してい
る。

測定結果の定量は，　ＥＬＩＳＡ−ＩＪ−グー（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ　）を用い，　４１０ｎｍの波長で行った。

得られた結果を各測定値の平均値で表３および表４に示
す。これらの結果は，　ＴＰＳによってインターロイキ
ン２の生産が増大することを示している。

紅 インターロイキン２ インターロイキン２ インターロイキン２ インターロイキン２ インターロイキン２ インターロイキン２ ５０００　　　　　　　０．６６７ ５００　　　　　　　０．３５０ ５０　　　　　　　　０．２０３ ０．５ｔｌ　　　　　　Ｏ．１５４ ０．０５Ｕ　　　　　　Ｏ．０６３ ００　　　　　　　　０．００３ ｔｉ 処方生 ＰＨＡ−Ｐ　　（１０μｇ／戚） ＴＰＳ　　（　１　ｍｇ／ｄ） 対照 （ＲＰＭＩ　１６４０　＋１０％ＡＢ血清）段Ｊ１支　
　り１ｂ唾Ｌ Ｏ．２２９　　　　１６．５ ０．２７６　　　　２４．０ ０．１５８　　　　　０．８３ インターロイキン１およびインターフェロンＴは．Ｔ細
胞および単球の活性化に決定的な役割を果たす必須のサ
イト力インである。インターフェロンＴは活性化Ｔ細胞
によって生産されるだけであるが，インターロイキン１
の生産は，主として単球もしくはマクロファージで起こ
る。Ｔ細胞の活性化は，インターフェロンγおよびイン
ターロイキン１に対する抗体により．投与量に依存して
ほとんど完全に特異的に阻止される。これとは対照的に
，対照の抗体は．非常に高濃度であってもごくわずかの
阻止しか行わない。

手順： ヒト末梢血白血球をポリサッカロース勾配法で得，マイ
クロタイタープレートのウエル当り５×１０Ｓ細胞の濃
度で接種した。ＴＰＳをＤＭＥ培地に溶解し，ｌＯ％ヒ
｝ＡＢ血清を補充して，最終濃度１ｇ／蔵で試験に用い
た。ＴＰＳの活性は，実施例３に記載した３Ｈ−チミジ
ン取込み率を用いて測定した。

特異的な抗インターロイキン１抗体および抗Ｔインター
フェロン抗体は，　Ｇｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｍｐａｎｙか
ら入手した。これらの抗体を．試験開始の４８時間前に
，滅菌条件下で蒸留水に対して透析し，保存剤のナトリ
ウムアシッド（ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｉｄ　）を定量的に
除去した。次いで，抗体の力価を２０００　７１００μ
！に調整した。これらの抗体は，９６ウエルの平底マイ
クロタイタープレートのウェル当り，　１０％ＡＢ血清
を加えた１００μｌの叶Ｅ培地中．　１００　０〜ＩＵ
の滴定最終濃度で用いた。末梢血白血球およびＴＰＳを
，５０μ！の補足培地に添加した。次いで，これらのプ
レートを，標準条件下，インキュベーター内でインキユ
ベートした。

得られた結果を表５および第８図に示す。

これらの結果から，　ＴＰＳのＰＢＬに対する効果は，
抗ＩＬＩおよび抗γ−ＩＦＮの投与量が高いと減少し得
ることがわかる。さらに，この効果は，非特異的な受容
体阻止によるものでないことを示すことができた。

表エ ＰＢＬ＋ＴＰＳ（ｌｍｇ／ｒｎｌ） ＰＢＬ　（ＴＰＳなし） ＰＢＬ＋１００Ｕ抗ＩＬＬ　（ＴＰＳなし）ｐＢＬ＋１
００１Ｊ抗ＩＬ１＋ＴＰＳ　（ｌｍｇ／ｄ）ＰＢＬ＋１
０Ｕ抗ＩＬ１＋ＴＰＳ　（Ｉｍｇ／ｄ）ＰＢＬ＋　１υ
抗ＩＬ１＋ＴＰＳ　（ｌｍｇ／ｒｄ）ｐＢ１＋１ｏｏｕ
抗インターフェロンＴ　（ＴＰＳなし）ＰＢＬ＋１００
Ｕ抗インターフェａン７　＋ＴＰＳ（１■／　Ｉｎ１）
ＰＢＬ＋１０ｔｌ抗インターフｚＤ：／　ｒ　＋ＴＰＳ
（ｌｍｇ／ｍｌ）ＰＢＬ＋ｌＵ抗インターフェａン７　
＋ＴＰＳ（ｌｍｇ／ｍ）ＰＢＬ，＋マウスＩｇＧ＋ＴＰ
Ｓ　　（ｌｍｇ／慈ＯＰＢＬ＋ヒトＩｇＧ一画分＋ＴＰ
Ｓ（ｌｍｇ／ｍｌ！）ｃｎ＋ １４５１３７十八１５２３ １６３０３＋／−　　５３４ ２７０６９＋／−　　７４９ ３３０４７＋／−　　８７１ ４９９８５＋／−１００３ ８２９１３＋／−１３２４ ３７７３８＋／−　　６５６ ４３８７５＋／−　　６３７ ４６７２６＋／−　　５２７ ７８６８１＋／−　　７９９ １００８０７＋／−１９５６ １０７７６５＋／−２０９７ 実１ｌ吐１ この試験は，　Ｍ．Ａ．Ｄ．　Ｍｏｏｒｅらの方法［　
”ＳｔｏｌｍａｎＬｅｃｔｕｒｅ″，　　”Ｍｏｄｅｒ
ｎ　Ｔｒｅｎｄｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｅｍｉ
ａＷｉｌｓｅｄｅ　（１９８８）　，　Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｖｅｒｌａｇ　　（印刷中）］に従って行った。ｌ
Ｏ匹のＢＡＬＢ−Ｃ−マウスを１組として，　０．５　
ｄのＲＰＭＩ１６４０培地またはＩｌｌＰＭＩ１６４０
培地に最終濃度１■／５００μ！／マウスで溶解したＴ
ＰＳを静脈注射した。ＴＰＳグループと，　ＲＰ旧１６
４０の対照グループとの５匹のマウスに．コバルトボン
ベから亜致死照射線量の６００　ｒａｄを照射した。後
部眼窩の静脈叢を穿刺することによって．各マウスの血
液を採取した。処理前に．正常値を決定するため採血し
，　ＴＢＳもしくは培地で処理後および照射後に同様に
採血を行った。白血球のカウント／戚を．上記のように
して得た血液から．ノイバウアーチャンバ−（Ｎｅｕｂ
ａｕｅｒ　ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて決定した。このチ
ャンバーでは，赤血球ゲンチアナバイオレットによる処
理で破壊され．白血球の数をチャンバーからカウントし
て決定した。得られた結果を第９図に示す。これらの結
果は，インビボでもＲＰＭＩ１６４０標準処理に比べて
，　ＴＰＳ処理の方が．白血球を増加させることを示し
ている。ＴＰＳで処理したグループのマウスは，　ＲＰ
ＭＩによって処理した対照グループのマウスよりも，亜
致死線量放射線による処理後も白血球カウント数が高い
。

（以下余白） （発明の要約） 本発明は．ヒノキ科植物由来の多ｖＭ類含有活性成分の
，白血球障害を伴なう疾病の治療のための薬剤としての
使用に関する。

この活性成分は，レトロウイルスおよびレンチウィルス
による疾病，および電離放射線（例えば，放射線の照射
）により引き起こされる白血球障害をなおすことに特に
有用である。

４　　゜゛　　の　　　な量゛ロ 第１図〜第９図は，それぞれ，本発明に使用する多糖類
含有活性成分の性能を説明するグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒノキ科植物由来の多糖類含有成分の、白血球障害
   を伴なう疾病を治療するための使用であつて、 該成分が、次の（ａ）〜（ｆ）により得られる、ヒノキ
   科植物由来の多糖類含有成分の使用：（ａ）破砕し有機
   溶媒で洗浄したヒノキ科植物の地上部を、アルカリ水性
   溶媒で抽出すること、（ｂ）得られた抽出物を有機溶媒
   と混合し、該抽出物から多糖類とタンパクとを沈澱させ
   ること、（ｃ）沈澱物を分離し、該沈澱物を常温を下ま
   わる温度の水に溶解させること、 （ｄ）得られた溶液を酸性にしてタンパクを沈澱させる
   こと、 （ｅ）該沈澱物を分離し、上澄み液を有機溶媒と混合す
   ること、および （ｆ）得られた沈澱物を透析し次いで乾燥すること。 ２、レトロウィルスおよびレンチウィルスによる疾病を
   治療する、請求項１に記載の使用。 ３、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療する、請
   求項２に記載の使用。 ４、電離放射線によって引き起こされる白血球障害の予
   防および治療のための、請求項１に記載の使用。 ５、前記成分の分子量が少なくとも１００Ｄである、請
   求項１に記載の使用。 ６、限外濾過法によって得られる前記成分の分子量が少
   なくとも１００，０００Ｄである、請求項１に記載の使
   用。 ７、多糖類を含有する前記成分が、スジャ　オクシデン
   タリス　Ｌ．（￥Ｔｈｕｊａ￥　￥ｏｃｃｉｄｅｎｔａ
   ｌｉｓ￥　Ｌ．）を起源とする成分である、請求項１か
   ら３のいずれかに記載の使用。