KR20030021176A - 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 - Google Patents

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KR20030021176A
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레녹스에드윈에스
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Abstract

아스트라갈루스 멤브레나세우스, 특히 아트라갈루스 멤브라나세우스의 뿌리로부터 제조되는, 산 개질 이전 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만 또는 80% 미만의 아라비노오스-갈락토오스 비를 갖는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 수성의 정맥내 주사가능한 제형물로 재구성될 수 있고; 포유류에게 정맥내 투여되는 경우 포유류에서의 조혈 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-1β, IL-6, TNF-α, INF-γ, GM-CSF 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 또는 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증 치료, 세포독성제 또는 방사선으로의 노출 (예컨대 치료적 노출 뿐만 아니라, 우연하거나 비치료적인 노출) 로부터의 회복 가속화, 악액질, 구토 또는 약물 금단 증상의 치료, 또는 B 형 간염에서 간세포의 보호 또는 생물학적 반응의 조절에 유용하다.

Description

산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 {ACID-MODIFIED ARABINOGALACTAN PROTEIN COMPOSITION}
황기 (Radix Astragali) 는 아스트라갈루스 멤브라나세우스 Bge. var. 몬골리쿠스 (mongholicus) (Bge.) 히샤오 (Hsiao) 또는 아스트라갈루스 멤브라마세우스 (Fisch.) Bge. (Fabaceae) 의 건조 뿌리이다. 황기는 전통 중국 의약에 널리 알려진 매우 오래된 약물이다. 상기물은 중국 약전에 공식 등재되어 있고, 신장염 및 당뇨병의 치료를 위해 및 강장제로서 주로 사용된다. 상기물은 단독으로 탕약 또는 "차" 로서, 또는 다른 식물과 함께 전통 의약 시-카-론 (목초 리토스페르멈 에리트로리존 (Lithospermum erythrorhizon) 및 리구스티쿰 왈라치 (Ligusticum wallachii) 와의 배합물) 및 렌-셴-양-롱-탕 (황기를 포함하는 12 개 목초의 배합물) 에서 일반적으로 사용된다 ["Chinese Drugs of Plant Origin" 의 "Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge." 제하의 절인 26 절, 191-197 페이지, W. Tang 및 G. Eisenbrand 편저, Springer Verlag, Berlin, 1992].
황기 탕약 및 알콜 침전 탕약으로부터 제조된 용액은 또한 주사에 의해 투여되고 있으며, 위궤양 및 십이지장 궤양의 증상을 개선시키고, 만성 백혈구감소증에서 백혈구 수를 증가시키는 것으로 보고되어 있다 ["Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica" 의 "Huangqi" 제하의 절, 페이지 1041-1046, H.-M. Chang 및 P. P.-H. But 편저, World Scientific Publishing Co., Singapore, 1987]. 저분자량 분획 (예컨대 25,000-35,000 MW) 으로부터 정제된 황기 탕약, 및 황기를 포함하는 목초 혼합물의 탕약은 또한 국소적 이종동물 이식 대 숙주 반응에서 면역계의 복구 [D.-T. Chu 등, "Immunotherapy with Chinese medicinal herbs. I....",J. Clin. Lab. Immunol.,25, 119-123 (1988)], 시클로포스파미드 유도 면역 저하의 반전 [D.-T. Chu 등, "Immunotherapy with Chinese medicinal herbs. II....",J. Clin. Lab. Immunol.,25, 125-129 (1988)], rIL-2 에 의해 일어나는 LAK 세포 세포독성의 증강 [D.-T. Chu 등, "Fractionated extract of Astragalus membranaceus.",J. Clin. Lab. Immunol.,25, 183-187 (1988)], 면역저하 마우스에서 면역 반응의 증강 [K. S. Zhao 등, "Enhancement of the immune response in mice byAstragalus membranaceusextracts",Immunopharmacology,20, 225-234 (1990)], 단구 세포에서의 반응 촉진 [Y. Sun 등, "Preliminary observations on the effects of the Chinese medicinal herbs...",J. Biol. Response Modifiers,2, 227-237 (1983)], 및 마우스에서 골수 조혈의 촉진 [M. Rou 등, "The effect of radix astragali on mouse marrow hemopoiesis",J. Trad. Chin. Med.,33), 199-204 (1983); S.-I. Miura 등, "Effect of a traditional Chinese herbal medicine...",Int. J. Immunopharmacol.,7(11), 771-780 (1989); 및 Y. Ohnishi 등, "Effects of Juzen-taiho-toh (TJ-48)...",Exp. Hemato,18, 18-22 (1990)] 에 활성을 나타내었다.
Liu 는 미국 특허 제 4,843,067 호에서, 황기의 다당류 (아스트라갈루스 멤브라나세우스 Bge. 또는 아스트라갈루스 굼미퍼 라빌라드 (Astragalus gummiferLabillard) 로부터 추출가능하다고 언급됨) 및 당귀의 다당류를 함유하는 약학 조성물을 개시한다. 황기 다당류는 뿌리 분말의 물 추출 및 에탄올 침전에 의해 추출가능하다고 언급된다. Verbiscar 는 미국 특허 제 5,2868,467 호에서, "화학적 및 구조적 변화에 대한 다당류의 완전성을 보존하기 위해", 저온에서 제조된 아스트라갈루스 트라가칸타 (Astragalus tragacantha(트래거캔쓰)) 식물의 면역조절 다당류 분획을 개시한다. Josephson 등은 미국 특허 제 5,336,506 호에서, 수용체 매개 세포내이입을 할 수 있는 세포 수용체에 치료제를 표적화하기 위한 치료제와의 복합체를 형성시키기 위해, 식물 다당류, 예컨대 아라비노갈락탄 (낙엽송 라릭스 옥시덴탈리스 (Larix occidentalis) 에서 단리됨) 및 만난의 용도를 개시한다. Adams 등은 미국 특허 제 5,116,969 호에서, 밀도 구배 분리에 사용하기 적합하다는 초미세 아라비노갈락탄 산물을 개시한다. Jung 등은 미국 특허 제 5,478,576 호에서, 정제 아라비노갈락탄 (역시 라릭스 옥시덴탈리스로부터), 이들의 분해 산물 및 변형물과, 또한 수용체 매개 세포내이입을 할 수 있는 세포 수용체로의 치료제 전달에 있어서의 용도를 개시한다. Lewis 는 미국 특허 제 5,589,591 호에서, 다당류의 불순한 형태를 먼저 저분자량 컷오프 멤브레인을 통해 초여과하여 보유액을 유지한 후 고분자량 컷오프 멤브레인을 통과시켜 여과액을 유지함으로써 제조된, 내독소가 없는 다당류, 예컨대 아라비노갈락탄, 덱스트란, 만난 및 아라비아 고무를 개시한다.
그러나, 각각의 상기 참고문헌은 제품에 존재하는 다당류 (예컨대 아라비노갈락탄) 에 관심을 기울이고 있으며, 아라비노갈락탄 단백질을 배제시키고자 고안된 기법을 사용할 수도 있다.
아라비노갈락탄 단백질은 또한 개화 식물에서 발견되며, 대부분의 고등 식물에 널리 분포되어 있다. 때때로 아라비노갈락탄 펩티드로 불리는 아라비노갈락탄 단백질 (AGP) 은, 더 높은 단백질 함량을 갖는 AGP 가 공지되어 있기는 하지만, 고비율의 탄수화물 및 일반적으로 낮은 (10% 미만) 단백질 함량을 포함하는 당화 (glycosylated) 단백질이다. 식물에서 단리가능한 히드록시프롤린이 풍부한 당단백질 중에서, AGP 는 이들의 일반적으로 낮은 단백질 함량 및 이들의 β-글루코실 Yariv 시약인 1,3,5-트리스(4-β-D-글루코피라노실페닐아조)-2,4,6-트리히드록시벤젠으로의 결합능을 특징으로 한다 [J. H. Yariv 등,Biochem. J,85, 383-388 (1962); R. L. Anderson 등,Aust. J. Plant Physiol.,4, 143-158 (1977)]. AGP 는 식품 제품에서 유화제, 응결 예방제 및 향미 캡슐화제로 종종 사용되는, 아카시아 나무 (아카시아 세네갈 (Acacia senegal)) 의 고무질 추출물인 아라비아 고무의 성분이다. 니코티아나 알라타 (Nicotiana alata), 니코티아나 플럼바기나폴리아(Nicotiana plumbaginafolia) 및 피루스 콤무니스 (Pyrus communis) 로부터의 식물 AGP 유전자의 단리는 Chen 등의 미국 특허 제 5,646,029 호에 개시된다. AGP 에 대한 광범위한 논의는 문헌 [E. A. Nothnagel, "Proteoglycans and related components in plant cells",Int. Rev. Cytology,174, 195-291 (1997)] 에서 찾을 수 있다.
본 명세서를 통해 언급되는 상기 및 기타 문헌의 개시는 본원에서 참고문헌으로 도입된다.
본 발명은 아라비노갈락탄에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 아스트라갈루스 멤브라나세우스 (Astragalus membranaceus), 특히 아스트라갈루스 멤브라나세우스의 뿌리로부터 제조된, 산 개질 이전 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만 또는 80% 미만의 아라비노오스:갈락토오스 비를 갖는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물에 관한 것이다.
발명의 개요
제 1 요지에서, 본 발명은 아스트라갈루스 멤브라나세우스, 특히 아스트라갈루스 멤브라나세우스의 뿌리로부터 제조된, 산 개질 이전 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만, 바람직하게는 3.0:1 또는 80% 미만의 아라비노오스:갈락토오스 비를 갖는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 제공한다.
제 2 요지에서, 본 발명은 수성의 주사가능한 부형제 및 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 치료적 유효량을 함유하는 수성의 주사가능한 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물을 제공한다.
제 3 요지에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 유효량을, 특히 본 발명의 제 2 요지의 수성의 주사가능한 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물로서, 임의로 하나 이상의 다른 치료제 (예컨대 조혈을 촉진시킬 수 있는 것) 와 함께 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 또는 본 발명의 제 2 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물의 투여에 의해 치료될 수 있는 포유류의 질환 상태의 치료 방법, 예컨대 포유류에서 조혈 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 및 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증 치료, 세포독성제 또는 방사선으로의 노출 (예컨대 치료적 노출 뿐만 아니라, 우연하거나 비치료적인 노출) 로부터의 회복 가속화, 악액질, 구토 또는 약물 금단 증상 치료, 또는 바이러스성, 박테리아성, 진균성 및 기타 감염 및 기타 면역억제 조건에서 면역 반응의 복구 또는 촉진, 또는 B 형 간염에서 간세포의 보호 방법을 제공한다.
제 4 요지에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 및 본 발명의 제 2 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물의 제조 방법을 제공한다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
정의
"산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물" 이란, 조성물이 산 개질 이전 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만, 바람직하게는 3.0:1 미만 또는 80% 미만의 아라비노오스:갈락토오스 비를 갖도록 하는 조건 하에서 산 처리한 "아라비노갈락탄 단백질 조성물" (하기에 정의됨) 이다.
"아라비노갈락탄 단백질" 또는 "AGP" 는 탄수화물이 분자의 50 중량% 이상을 차지하고, 주요 탄수화물 성분이 아라비노오스 및 갈락토오스이며, 아라비노실 잔기가 주로 말단 위치에 있는, 일반적으로 β-글루코실 Yariv 시약에 침전성인 고당화 단백질이다. 상기물은 일반적으로 AGP 에 대한 단일클로날 항체인 MAC207 과 특이적으로 반응한다.
"아라비노갈락탄 단백질 조성물" 이란, 아라비노갈락탄 단백질 (상기에 정의된 바와 같음) 및 연합 아라비노갈락탄과 기타 다당류의 조성물의 70 중량% 이상, 구체적으로는 80 중량% 이상, 더욱 구체적으로는 90 중량% 이상을 차지하는 조성물이다.
"포유류" 에는 인간 및 비인간 포유류, 예컨대 애완 동물 (고양이, 개 등) 및 농장 동물 (소, 말, 양, 염소, 돼지 등) 이 포함된다.
"질환" 에는 특히 본 명세서의 "약리 및 효용" 부분에 기재된 질환의 상태를 포함하는, 의약 치료에 기인한 건강하지 못한 상태 ("부작용"), 예컨대 혈액 강화 효과가 치료적인 질환 상태를 포함하는 임의의 건강하지 못한 상태가 포함된다.
"약학적으로 허용가능한 부형제" 란, 일반적으로 안전하고 비독성이며 바람직한 약학 조성물의 제조에 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도 뿐만 아니라 인간 약학 용도에 허용가능한 부형제가 포함된다. 상기 부형제는 고체, 액체, 반고체이거나, 에어로졸 조성물의 경우 기체일 수 있다.
"치료적 유효량" 이란, 질환의 치료를 위해 동물에게 투여되는 경우 질환의치료에 효과를 나타내기 충분한 양을 의미한다.
질환의 "치료" ("Treating" 또는 "treatment") 에는, 질환에 소인이 있지만 아직 질환 증상을 겪거나 나타내지는 않는 동물에서 발생하는 질환의 예방 (예방적 치료), 질환의 억제 (그 진행을 느리게 하거나 중지시킴), 질환의 증상 또는 부작용의 경감 (경감적 치료 포함), 및 질환의 제거 (질환의 퇴보를 유도) 가 포함된다.
산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물
본 발명의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 아스트라갈루스 멤브라나세우스, 특히 아스트라갈루스 멤브라나세우스의 뿌리; 바람직하게는 아스트라갈루스 멤브라나세우스 Bge. var. 몬골리쿠스 (mongolicus) (Bge.) 히샤오 또는 아스트라갈루스 멤브라나세우스 (Fisch.) Bge. 의 뿌리로부터 단리된 아라비노갈락탄 단백질 조성물로부터 제조된, 상기 정의된 용어에서와 같은 "산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물" 이며; 바람직하게는 뿌리는 중화민국의 산서성 또는 내몽고, 특히 후자에서 재배되는 아스트라갈루스 멤브라나세우스 식물에서 유래되며, 바람직하게는 뿌리는 2 년생 아스트라갈루스 멤브라나세우스 식물에서 유래된다. 상기물은 약 30 내지 60 몰%, 구체적으로 약 35-55% 의 Ara; 약 5 내지 10% 의 Rha; 약 5 내지 15% 의 GalA; 약 20 내지 35% 의 Gal; 및 약 10% 미만, 특히 약 5% 미만의 Glc; 3.5:1 미만, 바람직하게는 3.0:1 미만의 Ara : Gal 비; 약 2 중량% 이하의 회 (ash) 함량; 약 20 중량ppm 이하의 전형적 중금속 함량; 및 약 1.0% 이하의 히드록시프롤린 함량을 함유하는 전형적인 당 조성물 (메탄올화 조성물의 트리메틸실릴 유도체의 GLC 로 측정됨) 이다. 상기물은 실질적으로 내독소가 없고 (즉 제조자의 지시에 따른 Endospecy [Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan] 분석으로 측정되는 1.0 EU/mg 미만, 구체적으로 0.8 EU/mg 미만, 보다 구체적으로 0.5 EU/mg 미만, 특히 0.3 EU/mg 미만의 내독소 함량을 가짐); 수용액 중에서 4 내지 7 의 pH 를 가지며, 수중에서 200 mg/mL 이상 가용성이다. 편의를 위해, 상기 물질을 추가로 "AMC" 로 언급할 수 있다.
조성물의 전형적 제제 중에서, 글리칸은 조성물의 대략 80 중량% 를 차지하며, 단백질 및 가능한 미량의 지질이 나머지를 차지한다. 단백질 코어는 히드록시프롤린이 풍부하며, 이것이 아미노산 잔기의 25% 가량을 차지한다. 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 수용액 중 크기 배제 크로마토그래피에 의해 2 개의 크기 군을 나타낸다. 조성물의 대략 40 중량% 를 차지하는 더 큰 크기 군은 풀루란 크기비교 표준물과 비교하여 대략 350 킬로달톤의 피크 분자량을 가지며; 크기가 더 작은 군은 대략 75 킬로달톤의 피크 분자량을 갖는다. 2 개 크기 군에 걸쳐 컴퓨터로 계산된 중량 평균 분자량은 약 1 내지 5, 특히 약 1.5 내지 3.5 의 계산된 다중분산성을 가지면서, 약 120 킬로달톤 내지 260 킬로달톤, 예를 들어 대략 200 킬로달톤이다.
산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 제조
산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 아스트라갈루스 멤브라나세우스 (건조 뿌리를 다듬고, 정제수로 문질러 70% 에탄올과 같은 소독 용액으로 세정하고 얇은 슬라이스로 잘라 무균 조건 하에서 건조하여 제조된, 전형적으로 깨끗이 가공하여 도막내거나 절단한 건조 뿌리, "드링크 칩" 으로 불림) 를 온수 (전형적으로 80℃ 이상, 구체적으로 90℃ 이상, 특히 약 100℃) 로, 임의로 공추출제, 예컨대, 알칼리 금속염, 특히 인산이수소칼륨 또는 인산이수소나트륨 (예컨대 pH 4.5 의 0.5 M KH2PO4) 의 존재 하에, 잠시 그 온도에서 추출함으로써 제조되며, 뿌리로부터 아라비노갈락탄 단백질 및 연합 다당류을 상당히 추출하기 위해서는 여러 추출 주기가 필요하거나 바람직하다 (전형적으로 각각 100℃ 에서 3 시간 동안 3 회). 바람직한 제조에서, 드링크 칩은 초기 고온 수성염 세척액 (예컨대, pH 4.5 및 100℃ 에서 0.5 M KH2PO4) 으로 잠시, 예컨대 30 분 동안 추출된 후 세척액은 추출 공정이 수행되기 전에 제거된다. 세분된 건조 뿌리의 제조 후 모든 단계는 전형적으로 멸균 장비 및 시약을 사용하는 무균 조건 하에서 수행된다. 온수 추출물은 예컨대 60 - 70℃ 에서 진공 하에 증발에 의해 농축되거나, 또는 초여과에 의해 (예컨대 100 킬로달톤 분자량 컷오프 (100K MWCO) 초여과 (UF) 시스템을 이용하는 초여과에 의해) 동시에 농축 및 물로 교환되고 (추출용 물에 공추출제가 함유되는 경우 특히 바람직함), 약 1 L/Kg 농도의 "드링크 칩으로" 농축된 후, 수불용성 물질을 제거하도록 처리된다, 예컨대 저급 알카놀 (예컨대 약 35% 에탄올 농도의 에탄올) 로 침전된다. 저급 알카놀 침전물, 예를 들어 35% 에탄올 침전물의 상청액은 더 높은 농도의 저급 알카놀, 예를 들어 40-80% 에탄올, 구체적으로 60-70% 에탄올로 더욱 침전되어 아라비노갈락탄 단백질 및 연합 다당류를 함유하는 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물이 침전된다. 침전물은 저급 알카놀의 제거를 보조하기 위해 물에 재용해 및 건조되어 (전형적으로 과도한 가열을 방지하기 위해 분무 건조 또는 동결 건조에 의함), 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물이 단리될 수 있다. 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 전형적으로 백색 내지 회백색 분말이다.
이어서, 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물을, 최종적인 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 아라비노오스:갈락토오스 비를 산 개질 이전 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만, 바람직하게는 3.0:1 미만 또는 80% 미만으로 감소시키기 위해, 적합한 시간 동안 적합한 온도에서 적합한 농도의 적합한 산으로 산 처리한다. 사용되는 산의 성질 및 그 농도, 가수분해에 사용되는 시간 및 온도는 저온 내지 실온에서 비교적 단시간 동안 저농도로 사용되는 광물성 산, 예컨대 염산으로부터 높은 온도에서 장시간 고농도로 사용되는 유기 약산, 예컨대 아세트산에 이르기까지 상당히 다양할 수 있다; 그러나, 약간 상승된 온도, 예컨대 실온 내지 40℃, 특히 30℃ 근처에서, 1 내지 24 시간 동안 또는 그 이상 (특히 낮은 농도에서) 0.1 내지 1 M 농도로 사용되는 트리클로로아세트산, 또는 바람직하게는 염산이 가수분해를 위해 적합함을 발견하였다. 산 가수분해는 갈락토오스에 비해 아라비노오스에 영향을 주지만 (따라서, 아라비노갈락탄 단백질의 다당류 측쇄가 짧아짐), 목적하는 정제 및 아라비노오스:갈락토오스 비를 달성하도록 충분한 가수분해를 일으키면서 활성인 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 수율을 감소시키는 과도한 가수분해를 방지하기 위해 주의를 기울어야 한다. 가수분해 후, 산 용액에 염기 (예컨대 0.5 M 수성 알칼리 금속 수산화물, 예컨대 수산화나트륨 또는 약염기, 예컨대 중탄산나트륨) 를 첨가하여 중화시킨다. 생성 용액은 (산으로 개질된) 연합 다당류와 함께 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질, 및 다량의 저분자량 가수분해 산물을 함유한다.
아스트라갈루스 멤브라나세우스 원료에서 회분 (batch) 대 회분 편차를 조절하기 위해, 공정 중 원료 물질, "드링크 칩" 및 중간체의 배합이 최종 산물의 점도를 수득하기 위해 사용할 수 있다.
이어서 용액을 초여과 및 이온교환 크로마토그래피로 정제한다. 이를 염 및 저분자량 물질을 추가로 제거하고 용액의 부피를 감소시키기 위해 초여과한다 (예컨대 100K MWCO UF 시스템을 이용함). 보유액을 직접 건조하여 (예컨대 60-70℃ 에서 진공 오븐 중에서, 또는 특히 용해 증강 부형제의 존재 하에 분무 건조 또는 동결 건조에 의해) 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 얻거나, 필요하다면 하기 기재되는 바와 같이 추가로 정제할 수 있다.
최적 추가 정제를 위해, 초여과에서 수득된 보유액을 이어서 양이온 교환 칼럼 (예컨대 pH 5.20 의 20 mM NaOAc 완충액으로 평형화된 SP Sepharose 양이온 교환 칼럼) 을 통해 용출시키고; 용출액을 음이온 교환 칼럼 (예컨대 동일한 NaOAc 완충액으로 평형화된 Q Sepharose 음이온 교환 칼럼) 상에 로딩하여 여과한다. 음이온 교환 칼럼으로부터의 용출액을 다시 초여과에 의해 탈염시킨 후 건조하여 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 얻는다.
정제 단계의 순서가 변형되거나, 단계 자체가 변형될 수 있다. 특히, 순차적 이온 교환 단계 크로마토그래피는 용액을 동일하거나 유사한 이온 교환 수지로 회분식 처리하여 처리 용액으로부터 수지를 여과함으로써 대체할 수 있고; 개별 음이온 교환 및 양이온 교환 수지의 사용은 음이온- 및 양이온-교환능을 둘 다 갖는 혼합층 수지를 칼럼으로서 또는 회분식 처리에 사용하여 대체할 수 있다. 또한, 이온 교환 처리는 산 변형 처리에 후속되는 대신 선행될 수 있다. 저분자량 물질의 제거 및 탈염을 위한 상이한 UF 멤브레인 (예컨대 저분자량 컷오프를 갖는 멤브레인) 의 사용이 가능하다. 공정의 필수 요소는 "드링크 칩" 의 제조, 이들로부터의 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 추출, 및 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 산 개질, 및 공정 중 하나 이상의 고분자량 (예컨대 100K MWCO) 초여과 단계이며; 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 수율을 증가시키고, 위와 같이 제조된 조성물의 성질에 비해 제조 수행을 용이하게 하기 위해 정제 단계의 순서 및 성질이 변화된다. 당연히, 아라비노갈락탄 단백질 조성물, 또는 특히 그 조성물의 >100K 분획은 임의의 다른 방법으로 제조되며, 그 조성물은 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 얻기 위해 산으로 개질될 수 있다.
약리 및 효용
본 발명의 제 1 요지의 정제 아라비노갈락탄 조성물 또는 본 발명의 제 2 요지의 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 유익한 활성은 여러 시험에서 나타났으며, 하기 효용을 도모한다.
화학 치료를 받는 환자의 호중구감소증의 치료
1. 활성화된 인간 말초 혈액 단구 세포 (PBMC) 로부터 G-CSF 의 생산
면역계 및 조혈계의 촉진은 다수의 시토카인 상호작용을 통해 일어나므로, AMC 가 시험관 내에서 G-CSF 의 생산을 유도하는 능력을 실시예 6 에 기재된 대로 검사하였다. AMC 는 PHA 로 활성화된 후 인간 PBMC 에 의해 현저한 용량 의존적 G-CSF 방출을 유도하였다. G-CSF 는 시험관 내 및 생체 내에서 호중구 생산/또는 작용에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 상기 데이타는 AMC 가 조혈 기능에 연관된 시토카인의 생산을 통해 골수억제된 환자에서의 호중구 생산 및 혈소판 수의 회복을 촉진할 수 있음을 제시한다. 유사하지만 더 약한 반응이 하기에서 나타났다: (1) "드링크 칩" 의 추출, 에탄올 침전, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 및 추가적 에탄올 침전으로 제조된 정제 아라비노갈락탄 조성물 (PAGC); 및 (2) "드링크 칩" 의 추출, 에탄올 침전, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제, 이온 교환 용출액의 100K MWCO UF 멤브레인 (보유액을 보존) 으로의 초여과, 및 추가적 에탄올 침전으로 제조된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 (AGPC). PAGC 가 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF 의 생산을 촉진하는 것으로 나타났으므로, 이것과 상기 결과는 AMC 가 동일한 작용을 할 것을 제시한다.
2. 플루오로우라실 처리 마우스에서 GM-CFC 전구 세포의 회복
PAGC 가 마우스에서 플루오로우라실 유도 골수억제로부터 골수 전구체 (GM-CFC) 회복을 증강시키는 것으로 나타났고; 상기 1 의 결과에 근거하여, AMC 는 본 분석에서 PAGC 이상의 활성이 있을 것으로 기대된다.
3. 준치사 조사된 마우스에서 말초 백혈구의 회복
BALB/c 마우스를 준치사 조사한 후, 실시예 7 에 기재된 프로토콜에 따라 식염수 또는 PAGC, AGPC, 또는 AMC 를 피하 처리하였다. 조사는 WBC 의 수를 극적으로 감소시켰다. PAGC, AGPC 및 AMC 의 처리는 식염수 처리 대조 동물에서 나타나는 값을 초과하도록 전체 WBC 수를 증가시켰고, 8 × 106/mL 이상으로 WBC 수의 회복 속도를 증가시켰다.
4. 화학치료 후 백혈구 수의 복구
PAGC 는 PAGC 가 주어지지 않은 인간 암 화학치료 환자에 비해 WBC 를 증가시키는 것으로 나타났다. 상기 1 및 3 에 나타난 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 는 동일한 이득을 나타낼 것으로 기대된다.
화학치료를 받는 환자의 혈소판감소증 치료
1. 준치사 조사된 마우스에서 말초 혈액 혈소판 수의 회복
BALB/c 마우스를 0 일째에 준치사 조사한 후 실시예 7 에 기재된 바와 같이 식염수 또는 AMC 로 피하 처리하였다. 조사는 혈소판의 수를 극적으로 감소시켰다. 50, 100, 및 250 mg/Kg 의 피하 AMC 처리는 마우스의 말초 혈액에서 혈소판 회복을 현저히 증강시켰다. 상기 발견은 AMC 가 혈소판 발달의 증강을 위한 강력 효능제이며, 혈소판감소증의 치료를 위해 유용한 것으로 간주될 수 있음을 제시한다. AGPC 및 PAGC 도 또한 상기 분석에서 활성이 있었다.
2. 골수 거핵세포의 증식/성숙
PAGC 는 시험관 내에서 골수 거핵세포의 증식 및/또는 성숙을 촉진하고, IL-3 의 차선 용량과 상승작용을 나타내는 것으로 나타났고; 상기 1 의 결과에 근거하여, AMC 는 본 분석에서 PAGC 이상의 효능이 있을 것으로 추정된다. 화학치료 또는 방사선 치료는 시토카인 생산 세포를 포함하는 여러 세포 및 조직에 손상을 입힐 것이므로, 이렇게 치료되는 환자는 더 낮은 수준의 내인성 시토카인 분비를 나타낼 수 있다. 이러한 낮은 수준의 내인성 시토카인은 조혈계의 정상 기능을 지지하지 못할 수 있고, 따라서 골수 억제로부터의 회복을 위해 적절한 수의 조혈 세포를 생성하지 못한다. PAGC 는 불충분한 수준의 내인성 시토카인의 존재 하에 골수 거핵세포의 증식/성숙을 정상 수준으로 증강시키고, 말초 혈액 혈소판의 회복을 촉진시키는 것으로 나타났으며, 거핵세포의 증식 및/또는 성숙의 유도에 의해 그렇게 하는 것으로 보인다. 데이타는 AMC 가 또한 골수 억제에 이차적으로 나타나는 혈소판감소증의 치료에 유용함이 증명될 수 있음을 제시한다.
3. 화학치료 후 혈소판 수의 증가
PAGC 는 인간 암 화학치료 환자의 혈소판 수를 증가시키는 것으로 나타났으며; 상기 1 의 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 는 동일한 이득을 나타낼 것으로 기대된다.
암 환자의 삶의 질의 개선
PAGC 는 인간 화학치료 환자에서 화학치료로 유도된 증상 (권태 및 피로, 무기력, 발한, 숨가쁨 및 식욕 감퇴) 으로부터의 회복 속도를 보다 빠르게 증가시키고, 카르노브스키 수행 지수 (Karnovsky Performance Index) 점수를 증가시키는 것으로 나타났으며; 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 는 동일한 이득을 나타낼 것으로 추정된다.
화학치료를 받는 암 환자에서의 호중구감소증의 예방
선행 부분에서, AMC 는 화학치료로 유도된 호중구감소증의 치료에 효과적임이 나타났다. 데이타는 또한 AMC 가 호중구감소증의 치료 뿐만 아니라, 호중구감소증의 예방에도 유용할 수 있음을 제시한다.
방사선 치료를 받는 암 환자에서의 호중구감소증의 치료
앞에 주어진 데이타는 또한 방사선 치료에서 호중구감소증의 회복을 위한 AMC 의 용도를 제시한다.
화학치료를 받는 암 환자에서의 빈혈의 치료
BALB/c 마우스를 준치사 조사한 후, 실시예 6 에 기재된 프로토콜에 따라 식염수 또는 다양한 용량의 AMC 로 처리하였다. 조사는 RBC 의 수를 극적으로 감소시켰다. AMC 처리는 더 많은 RBC 수를 가져왔다. 상기 결과는 AMC 가 적혈구 전구 세포 발달 및/또는 가동화에 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 그 방사선치료- 및 화학치료-유도 빈혈에서의 유용성을 제시한다. PAGC 및 AGPC 도 또한 상기 모델에서 활성을 나타낸다.
말초 혈액 전구 세포를 이식받고 있는 환자를 위한 단독 또는 G-CSF 와의 배합으로 말초 혈액 전구 세포의 가동화
CD34 항원은 집락 형성 세포, 예컨대 BFU-E (버스트 형성 단위 - 적혈구성), GM-CFC (과립구 대식세포 집락 형성 세포), 및 CFU-Mix (집락 형성 단위 - 혼합성) 세포를 포함하는 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 상에 존재한다. CD34+세포의 유세포측정에 의한 분석은 이식 조성물을 편리하게 측정할 수 있게 한다. 인간 말초 혈액 중 조혈 전구 세포의 존재는 1975 년에 최초로 설명되었다. 상기 말초 혈액 전구 세포 (PBPC) 는 거의 대다수의 전구세포가 골수 중에 존재하므로, 전체 수의 단지 작은 부분만을 차지한다. 화학치료에 따른 반향 도중 인간에서 말초 혈액 전구 세포 수의 증가가 1976 년 보고되었다. 보다 최근에는, 집락 자극 인자 G-CSF 및 GM-CSF 가 PBPC 의 수를 직접적으로 증가시킴이 나타났다. 화학치료 및 집락 자극 인자의 조합은 단독 방법에서 관찰되는 증가를 초과하여 PBPC 수를 크게 증가시킨다. 최근에는, G-CSF 가 인간에서 자가 및 동종이계 이식을 위한 PBPC 의 가동화에 사용된다. PBPC 의 이식은 종래 골수 이식에서보다 더 신속한 접목 (engraftment) 을 일으킨다. G-CSF 처리로 생성된 PBPC 의 수율은 상기 언급된 바와 같이 화학치료 또는 기타 시토카인과 조합으로 사용되는 경우 크게 증강될 수 있다. PAGC 는 단독제로서 투여되는 경우 PBPC 가동화를 유도하고/하거나, G-CSF 와 조합으로 투여되는 경우 G-CSF 와 협동하여 PBPC 가동화를 유도하는 것으로 나타났다. 시클로포스파미드로 처리된 마우스로의 유사 실험에서, PAGC 가 처리되지 않은 마우스에 비해 CD34+Lin-세포수의 증가가 나타났다. 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 는 상기 분석에서 활성을 나타낼 것으로 추정된다. PBPC 의 수율을 증가시키기 위해 G-CSF 와 협동하는 AMC 와 같은 치료제는 매우 유용할 것이다. 상기 유형의 협동은 공여자로부터 PBPC 를 수득하기 위해 필요한 혈장교환의 수를 감소시켜 비용을 줄일 수 있을 것이다. 추가적으로, 상기 유형의 병용 치료는 수령자가 G-CSF 단독에 충분히 반응하지 않거나 화학치료 약물의 사용이 바람직하지 않는 경우 도움이 될 수 있을 것이다.
세포독성제 또는 방사선으로의 노출로부터의 회복 가속화
상기에 주어진 결과, 및 동물 또는 인간을 방사선 또는 세포독성제에 고의로 노출시켜 치료되지 않은 동물 또는 인간 환자에 비해 가속화된 회복을 나타내는 PAGC 와의 연구로부터, AMC 는 또한 세포독성제 또는 방사선으로의 노출 (예컨대 치료적 노출 뿐만 아니라, 우연하거나 비치료적 노출) 로부터의 회복 가속화에도 유용할 것이다.
악액질의 치료
화학치료 및 방사선 치료의 가장 흔한 부작용의 하나는 환자가 식욕 감퇴 및 체중 감소로 고생한다는 것이다. PAGC 는 화학치료제인 시클로포스파미드 및 플루오로우라실로 처리된 마우스의 체중을 증가시키는 것으로 나타났다. 앞에서 논의된 바와 같이, PAGC 는 그 측정 인자의 하나가 식욕 개선인 환자의 삶의 질을 개선시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 상기 결과는 마우스 연구와 함께, PAGC 가 암과 같은 만성 질환 또는 그 치료에 의해 일어나는 일반적 물리적 소모 및 영양결핍인 악액질을 갖는 환자를 도울 수 있다고 제시한다. 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 가 동일한 이득을 제공할 것으로 기대된다.
호중구 회복을 증가시키고 G-CSF 의 사용을 감소시키기 위한, 골수억제 치료를 받는 암 환자에서의 G-CSF 와의 병용 치료
PAGC 는 활성화된 인간 말초 혈액 단구 세포로부터 시토카인 특히 G-CSF 의생산을 촉진하고, 방사선으로 유도된 골수억제 동물 모델에서 GM-CFC 및 말초 WBC 수의 회복을 촉진하며, 중화민국의 주요 임상 시험에서 화학치료 후 암환자의 WBC 수를 복구시키는 것으로 나타났다. 상기 결과는 PAGC 가 다양한 내인성 시토카인의 생산을 통해 조혈계 상에 간접적으로 작용할 수 있고, 상기 시토카인이 호중구 회복의 촉진을 위해 협동할 수 있음을 제시한다. PAGC 는 또한 상기 논의된 바와 같은 골수 거핵세포의 증식/성숙의 촉진에 있어서 IL-3 과 협동 작용을 갖는 것으로 나타났다. 또한, PAGC 의 투여는 안전하고 잘 관용되며, G-CSF 의 사용에서 보이는 부작용, 예컨대 뼈 통증, 근육통, 두통, 피로, 오심, 구토, 설사 등이 없다. 이러한 사실과 상기 논의된 협동 작용은, PAGC 가 G-CSF 와 함께 조합으로, 골수억제 치료를 받는 암 환자의 호중구 회복을 촉진시키기 위한 외인성 G-CSF 의 사용을 감소시킬 수 있음을 제시한다. 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 가 동일한 이득을 나타낼 것으로 추정된다.
자가 또는 동종이계 혈액 전구 세포 이식과 함께 고용량 세포독성 치료 후 호중구 회복을 가속화시키기 위한 G-CSF 와의 병용 치료
(골수 또는 말초 혈액) 혈액 전구 세포 (BPC) 이식으로 지지되는 고용량 화학치료 및/또는 방사선치료가 유방암, 임파종 및 다발성 골수종과 같은 상태의 다수 암 환자를 치료하기 위해 사용된다. BPC 의 이식은 보다 신속한 조혈 회복을 일으킨다. G-CSF 는 종종 감염과 관련된 호중구성 열을 예방하고, 입원 기간을 줄이고, 항생제 사용을 감소시키기 위한 호중구 회복을 가속화시키기 위해, BPC 이식 후에 사용된다. PAGC 는 화학치료 후 암환자의 WBC 수를 복구시키는 것으로 나타났으며; 앞부분에서 요약된 약리 효과와 함께, PAGC 도 또한 호중구 회복을 가속화시키기 위해 BPC 이식 후 G-CSF 와의 병용 치료로서 유용할 수 있음을 제시한다. 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 가 동일한 이득을 나타낼 것으로 추정된다.
B 형 간염 보균자에 대한 생물학적 반응 조절제 및 간 세포의 보호
시토카인은 바이러스성 감염에 대한 방어에 중요한 역할을 담당한다. 면역 반응에 관여하는 세포, 예컨대 대식세포, 및 CD4+ 및 CD8+T 임파구에 의해 생산되는 시토카인은 바이러스성 감염, 예컨대 B 형 간염 바이러스 (HBV) 감염에 보다 직접적인 역할을 담당한다. 동물 모델 및 인간 연구로부터, 세포성 면역 반응이 HBV 감염 및 질환 병인의 해결에 역할을 담당할 수 있음이 뚜렷하다. 급성 HBV 감염에서, 격렬한 폴리클로날 세포성 면역 반응이 중요하다. 항원 특이적 세포성 면역을 감작하고 유지하는, CD4+ T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ의 생산을 특징으로 하는 제 1 형 시토카인 방출은 바이러스성 감염에 대한 방어에 중요하다 [C. A. Biron, "Cytokines in the generation of immune response to, and resolution of, virus infection",Curr. Opin. Immunol.,6, 530-538 (1994)]. CD4+ 및 CD8+ 세포에 의해 방출되는 시토카인도 또한 HBV 복제의 억제조절에 중요한 역할을 담당한다. 급성 반응에 문제가 있다면, HBV 는 만성화된다. 상기 발견은, 간 내에서 제 1 형 반응 또는 적절한 시토카인의 국소 생산 부양을 목적으로 하는 전략이 만성 HBV 감염을 위한 치료로서 유용할 수 있음을 제시한다 [M. J. Koziel,Sem. Liver Disease,19(2), 157-161 (1999)]. PAGC 는 전통적 중국 의약 식물인 아스트라갈루스 멤브라나세우스 var. 몬골리쿠스 (AM) 로부터 제조되며, 상기 식물은 역사적으로 면역계 및 조혈계를 촉진하기 위해 사용되어 왔다. 이것은 화학치료- 또는 방사선치료-유도 골수억제의 증상 (호중구감소증에 덧붙여 혈소판감소증 및 빈혈) 과 유사한 다양한 병을 갖는 환자를 치료하는데 널리 사용된다. 추가적으로, AM 은 시험관 내에서 용량 의존적 방식으로 마우스 비장 세포의 증식을 촉진하고, S-180 육종 종양 세포가 접종된 동물의 비장 세포에서 자연살세포 (NK cell) 활성을 증가시키며, 또한 세포독성 T 임파구 (CTL) 의 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다. CTL 에 의해 생산되는 시토카인은 생체 내 바이러스 감염의 조절을 매개할 수 있고, 바이러스 특이적 CTL 에 의한 IFN-γ및 TNF-α의 생산은 CTL 이 바이러스 감염을 제거할 수 있는 능력을 증폭시킬 수 있다 [L. G. Guidotti 등, "Cytotoxic T lymphocytes inhibit hepatitis B virus gene expression by a noncytolytic mechanism in transgenic mice",Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91, 764-3768 (1994)]. 또한, 상기에 나타낸 바와 같이, AMC 는 PHA 로의 활성화 후 인간 PBMC 로부터 G-CSF 의 생산을 촉진하였다. 상기 결과는, AMC 가 시토카인 생산의 조절을 통해 간접적으로 면역 기능에 영향을 미칠 수 있음을 제시한다. AM 으로부터 제조되는 미정제 추출물은 만성 간염 환자들에서 상승된 IgG 의 감소, ALT 값의 저하, 및 환자의 면역 및 간 기능 개선을 위해 사용되어 왔다 [Y. Liu, "Therapeutic effect of oral solution from Astragalus in the treatment of 70 chronic hepatitis B patients",Jiang Su Chung Yao,15(12), 38 (1994)]. 또한, 분획화된 AM 은 앞서 논의된 바와 같이 면역증강 활성을 갖는 것으로 나타났다. 상기는AMC 가 B 형 간염 보균자의 생물학적 반응 조절제로서 및 간 세포를 보호하기 위해 사용될 수 있음을 제시한다.
B 형 간염 환자를 위한 백신 보강제
폴리포러스 움벨라투스 (Polyporus umbellatus) 로부터 제조되는 다당류는 만성 B 형 간염 환자의 치료에서 B 형 간염 백신에 대한 보강제로서 사용되었다. 상기물은 통계적으로 유의미한 B 형 간염 e 항원 (HBeAg) 의 혈청반응음성으로의 전환 및 B 형 간염 바이러스 DNA (HBV-DNA) 의 손실을 일으키는 것으로 나타났다 [S. M. Wu 등, "The therapeutic observation on the combined Polyporus polysaccharide with hepatitis B vaccine in the treatment of chronic hepatitis B".J. Chin. Infectious Disease,13(3), 187-189 (1995); H. Z. Shu 등, "The therapeutic observation on the Polyporus polysaccharide with large dose of hepatitis B vaccine in the treatment of 64 cases of chronic hepatitis B patients",Med. J. NDFSC,6(4), 211-212 (1996)]. AM 으로부터의 추출물은 또한 B 형 간염 환자에서 HBeAg 의 혈청반응음성으로의 전환 및 항 B 형 간염 코어 항원 (항 HBc), 및 HBV DNA 손실을 일으키는 것으로 보고되었다 [C. K. Liu 등, "Clinical and experimental studies on effects of chronic hepatitis B treated with Astragali composita",Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih,16(7), 394-397 (1996); P. L. Chen 등, "Polysaccharide from Astragalus in treating 33 cases of chronic active hepatitis patients",New Drugs Clin. Remedies,11(2), 75-76 (1991)]. 상기 연구 및 위에서 논의된 결과들은 AMC 가 B 형 간염 환자를위한 B 형 간염 백신 보강제로서 유용할 수 있음을 제시한다.
마약성 약물 갱생을 위한 금단 증상의 치료
환자들로부터 마약을 제거하면, 이들은 중독 금단 증상을 겪는다. 전통 중국 의약 (TCM) 용어에서 금단의 특성은 기 (에너지) 결핍의 표시이다. 기가 강화되면 갱생이 빨라질 것이라는 중국 의사의 관찰에 근거하여, 인간 암 화학치료 시험에서 PAGC 의 한 적응증은 화학치료 후 암 환자의 삶의 질을 개선시키는 것이다. 삶의 질은 화학치료와 관련된 증상의 개선으로 평가되었다: 여기에는 권태 및 피로, 무기력, 발한, 숨가쁨 및 식욕 감퇴가 포함된다. TCM 의사에 따르면 마약성 금단에도 연관되는 상기 증상은 "기 부족 증상" 에 해당된다. 이는 PAGC 가 환자의 기를 강화시킬 수 있고, 마약으로부터의 중독 금단의 치료를 위한 약학적 가능성을 가지고 있음을 제시한다. 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 는 동일한 이득을 제공할 것으로 기대된다.
화학치료 또는 방사선 치료에 있어서 암 환자 구토의 예방 및 치료
오심 및 구토는 화학치료 및/또는 방사선 치료의 일반적인 부작용이다. 화학치료 또는 방사선 치료에 많은 개선이 있어 왔지만, 상당수의 환자는 여전히 구토를 경험하여, 치료의 상기 부작용을 감소시키기 위한 노력이 계속되어야 한다. 상기 부작용을 예방하기 위해 사용가능한 다수의 항구토제 (예컨대 세로토닌 수용체 길항제, 코르티코스테로이드, 및 도파민 수용체 길항제) 가 있지만, 이들은 이들 고유의 부작용을 갖는다. 상기 약물과 관련된 증상에는 가벼운 두통, 변비, 수면 장애, 불안, 근육 및 혀의 비자발적 운동 및 진정작용이 있다. 구토의 신경약리적 근거는 여전히 불완전하게 이해되고 있지만, 구토의 완전한 조절에 관련되는 목표에는 환자에게 편리한 케어 제공, 입원 및 보형 장치에서의 시간을 감소시키는 치료, 및 환자의 삶의 질을 증강시키는 치료가 포함된다. PAGC 시도에서는 PAGC 가 화학치료 후, 특히 환자의 삶의 질 개선에 유익한 것으로 나타났다. 조사자 및 환자의 관찰은 모두, PAGC 가 실제로 환자의 전체 복지를 개선시킬 수 있음을 지지하며, 이는 PAGC 가 화학치료 후 구토의 예방 및 치료에 역할을 담당할 수 있음을 제시한다. 상기 결과 및 PAGC 와의 비교에 근거하여, AMC 가 동일한 이득을 제공할 것으로 기대된다.
신장 투석 환자를 위한 에리트로포이에틴의 사용 감소 또는 대체
EPOGEN (에포틴 알파, 에리트로포이에틴) 은 투석을 받는 환자의 만성 신부전에 관련된 빈혈 치료를 위해 1989 년에 허가되었다. 상기물은 이들 환자에게 보다 활동적이고 생산적인 삶을 살 수 있도록 하는 수단을 제공한다. EPOGEN 의 사용 이전에는, 모든 투석 환자의 90% 가 피로 및 체력소모를 일으키고 이들의 작업능을 손상시키는 빈혈을 겪었다. 오늘날, 투석을 받는 대부분의 환자들은 적혈구 수준을 상승시키고 유지하기 위한 이들의 치료 요법의 일부로서 EPOGEN 을 받는다. 임상 시험에서, EPOGEN 와 관련된 부작용으로 가장 빈번하게 보고된 것은 고혈압, 두통, 발작, 오심/구토 및 응고 혈관 입구이며; 상기 부작용이 나타나는 경우, EPOGEN 의 용량을 줄일 것이 추천된다. AMC 의 연구는, 이것이 실시예 7 에 나타낸 바와 같이 준치사 조사된 마우스에서 말초 적혈구 수의 회복을 촉진할 수 있을을 시사하며; PAGC 는 동일한 이득을 나타내었다. 또한, PAGC 는 정상 마우스에서순환 BFU-E 의 수를 증가시키기 위해 단일제로서 및 G-CSF 와 협동하여 투여되는 경우 순환 BFU-E 의 수를 증가시키고, 정상 및 시클로포스파미드 처리 마우스 둘 다의 말초 혈액에서 TER-119+세포의 수를 증가시키는 것으로 나타났다. TER-119 항원은 초기 적아세포 (erythroblast) 에서 성숙한 적혈구 단계까지 적혈구성 세포 상에서 발현된다. TER-119+세포 수의 증가는 PAGC 가 골수에서 적혈구 계통의 분화, 증식 및 성숙, 그리고 상기 세포의 말초 혈액으로의 가동화를 촉진할 수 있음을 시사한다. 상기 모든 발견은, PAGC 가 마우스 연구에서 적혈구의 생산 및 성숙을 촉진할 수 있음을 제시한다. 또한, PAGC 는 인간 임상 시험에서 임상적으로 유의미한 부작용이 보고되지 않고 안전한 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과 및 PAGC 와의 비교를 근거로, AMC 가 신장 투석 환자의 빈혈 치료를 위한 EPOGEN 의 사용을 감소시키거나 대체할 수 있음이 제시된다.
결과적으로, PAGC 와 유사한 방식으로 투여되는 AMC 는 조사된 마우스에 있어서 대조군에 비해 개선된 백혈구, 적혈구 및 혈소판 회복을 촉진시키며; PAGC 에 주어진 것과 동일한 상기 모델에 있어서, 동일한 이득이 나타나고; 본 명세서에 논의된 다른 PAGC 데이타와 함께 AMC 가 PAGC 와 동일한 이득을 가지므로, PAGC 와 동일한 효용성 및 약학 적응증에 적합함이 제시된다.
약학 제형물 및 투여
일반적으로, 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 치료제, 특히 조혈을 촉진할 수 있는치료제와 함께 정맥내 주사에 의해 치료적 유효량이 투여될 것이다. 치료적 유효량은 질환, 그 중증도, 치료할 동물의 연령 및 상대적 건강, 및 기타 요인에 근거하여 매우 다양할 수 있다. 조혈의 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-lβ, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 또는 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증의 치료, 또는 세포독성제 또는 방사선으로의 노출 (예컨대 치료적 노출 뿐만 아니라 우연하거나 비치료적인 노출) 로부터의 회복 가속화를 위해, 본 발명의 제 1 요지의 정제 아라비노갈락탄 조성물의 치료 유효량은 평균 체중의 인간에 대해 약 10 내지 1000 mg/일, 특히 약 50 내지 500 mg/일, 특히 약 100 내지 250 mg/일 범위이다. 악액질, 구토 또는 약물 금단 증상의 치료 또는 B 형 간염에서 생물학적 반응의 조절 또는 간세포의 보호를 위해, 유사량이 치료적으로 유효할 것이다. 당업자는 실험 없이도 기술과 본 명세서를 고려하여, 주어진 질환을 위한 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 주사에 의해 약학 제형물로서 투여될 것이다. 제형물은 수성의 주사가능한 부형제와 함꼐, 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 함유할 것이다. 적합한 수성의 주사가능한 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이들과 제형물의 제형화 방법은 [Alfonso AR: Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 17 판, Mack Publishing Company, Easton PA, 1985] 와 같은 표준 참고문헌에서 찾을 수 있을 것이다. 적합한 수성의 주사가능한 부형제에는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 위한 용해 증강제, 예컨대 3-10% 만니톨 또는 기타 당, 3-10% 글리신 또는 기타 아미노산을 임의로 포함하는, 물, 식염수 수용액, 덱스트로오스 수용액 등이 포함된다.
전형적으로 조혈제로서 투여되는 경우, 본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 또는 본 발명의 제 2 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물은 주사에 의해 (피하, 근육내, 복강내, 정맥내 등, 특히 정맥내), 특히 수분 내지 1 시간 이상에 걸쳐, 예컨대 15 분 가량에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여될 것이다. 제형물 내에서 본 발명의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 양은 제형물의 유형, 단위 투여량의 크기, 부형제의 종류 및 당업자에게 널리 알려진 기타 요인에 따라 크게 다양할 수 있다. 일반적으로, 최종 제형물에는 0.001 중량% (%w) 내지 10 %w, 바람직하게는 0.01 %w 내지 1 %w 의 본 발명의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물과 나머지 부형제(들) 이 함유될 수 있을 것이다.
본 발명의 제 1 요지의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 치료될 질환 상태를 위한 하나 이상의 치료제, 특히 조혈을 촉진할 수 있는 또다른 약제, 예를 들어 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), IL-3 등과 함께 임의로 투여될 수 있다.
하기의 비제한적 예로 본 발명을 예시한다. 모든 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 크기 배제 크로마토그래피로 특징분석되었다.
크기 배제 크로마토그래피 방법은 하기와 같았다:
SCL-10A 시스템 컨트롤러, LC-lOAD 펌프, DGU-4A 가스제거기, RID-6A 굴절 지수 검출기, 및 SPD-10AV UV 검출기가 장착된 Shimadzu HPLC 시스템, 및 0.2 N 염화나트륨으로 평형화된 GS-701 및 GS-620 칼럼 (Shodex Asahipak, 7.6 ×500 mm) 을 이용. 로딩된 시료량은 80 ㎍ 이었고 (수중 2 mg/mL 인 시료 용액 40 ㎕), 시료는 1 mL/분으로 용출되었다. 상이한 평균 분자량을 갖는 풀루란 표준물을 사용하여 보정 곡선을 제조하였고; 보정 곡선으로부터 분자량을 결정하였다. 시료의 중량 평균 분자량 (Mw = ∑(A i M i )/∑A i ), 수평균 분자량 (Mn = ∑A i /∑(A i /M i )), 및 다중다공성 (Mw/Mn) 을 Shimadzu SEC 소프트웨어, Version 2.4 를 이용하여 통계적 계산으로 결정하였다.
본 발명의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 당 함량 및 조성은 트리메틸실릴 메틸 글리코시드 유도체의 GLC 분석에 의해 결정되었다. 상기 방법에서, 시료를 일차로 메탄올계 HCl 중에서 메탄올화시킨 후 트리메틸실릴 (TMS) 유도체화시켜, 휘발성 단당류 유도체를 생성하였다. 정화 후, 유도체를 Flame Ionization Detector (FID) 로 DB-1 칼럼을 이용하여 기체 액체 크로마토그래피 (GLC) 로 분석하였다. 내부 표준물질인미오-이노시톨을 유도체화시키고 조성물 시료와 함께 분석하여, 당 함량 및 조성을 정량하였다.
히드록시프로린 함량은 발색 분석으로 결정하였다. 시료를 먼저 염산으로 가수분해한 후, 소듐 히포브로마이트 (수산화나트륨 중 브롬 용액), 염산 및 디메틸아미노벤즈알데히드로 처리하였다. 최종 용액의 광학 밀도를 비색계 상에서 측정하고, 동일한 방식으로 제조된 다양한 농도의 히드록시프롤린으로부터 만들어진 보정 곡선으로부터 히드록시프롤린 함량을 결정하였다.
실시예 1. 산 처리를 최종 단계로 하는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 조성물의 제조
단계 A. "드링크 칩" 가공
건조 아스트라갈루스 멤브라나세우스의 뿌리 300 Kg 을 모든 오염 부분을 제거하고, 멸균 세척 및 초여과수로 문질러, 70% 에탄올 중에 하룻밤 동안 담그고, 3-5 mm 두께의 칩으로 절단하여 60-70℃ 에서 멸균 오븐 건조함으로써, 드링크 칩으로 가공하였다. 상기 "드링크 칩" 은 건조 시 <15% 가 손실되었다.
단계 B. 미정제 아라비노갈락탄 조성물 추출
단계 A 에서 제조된 "드링크 칩" 2 Kg 을 100℃ 근처의 온도에서 30 분 동안 10 L 의 0.5 M KH2P04(25℃ 에서 pH 4.5) 로 세척하고, 세척 용액을 버렸다. 이어서, 이들을 20 L 의 0.5 M KH2PO4(25℃ 에서 pH 4.5) 로 1 회 및 20 L 의 내독소가 없는 물 (10K MWCO UF 시스템을 통해 초여과된 탈이온수) 로 2 회 100℃ 에서 각각 3 시간 동안 추출하였다. 수합한 수성 추출액을 약 30 분 동안 대략 7500 ×g 에서 원심분리 또는 여과하여 맑게 만든 후, 고온의 알칼리로 탈발열화된 (depyrogenated) 100K MWCO 폴리에테르술폰 멤브레인을 이용하여 초여과에 의해 약 12 배 농축하였다. 95% 에탄올을 실온에서 15 분 동안 교반하면서 최종 에탄올 농도가 35% 가 되도록 농축액에 첨가하여, 약간만 가용성인 물질을 침전시켰다. 침전물을 여과 또는 원심분리에 의해 제거하여 상청액을 다음 단계로 옮기고, 충분량의 95% 에탄올을 에탄올 농도가 70% 가 되도록 첨가하여 아라비노갈락탄 단백질을 침전시키고, 대략 7500 ×g 에서 원심분리 또는 여과에 의해 회수하였다. 침전물은 70% 에탄올 중에서 안정하며, 필요하다면 상기 형태로 유지될 수 있다. 침전물을 UP 물 중에 약 20 g/L 의 농도로 재용해시키고, 건조하여 (분무건조, 트레이건조 또는 동결건조하여) 미정제 아라비노갈락탄 조성물을 생성하였다.
미정제 아라비노갈락탄 조성물은 200 mg/mL 에서 수용성인 담황색 분말이며, 건조 시에 < 15% 의 손실을 가졌다. 내독소 함량은 < 0.3 EU/mg 이었다.
단계 C. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
단계 B 로부터의 미정제 아라비노갈락탄 조성물을 약 40 g/L 로, pH 5.2 에서 20 mM NaOAc 완충액 농도 중에 용해시켰다. 용액을 SP Sepharose 양이온 교환 칼럼 (미정제 AGC 1 g 당, 동일 완충액으로 평형화된 약 20 mL 의 수지) 상에 로딩하여 20 mM NaOAc 로 용출시키고, 용출액의 2.5-3.0 층 부피를 수합하였다. 수합한 용출액을 SP 칼럼에서와 동일한 수지 부피인 Q Sepharose 음이온 교환 칼럼 상에 로딩하여 20 mM NaOAc 로 용출하고, 용출액의 3-3.5 층 부피를 수합하였다. 수합한 용출액을 100K MWCO UF 시스템으로 초여과하여 탈염시키고 약 40 g/L 로 농축하였다. 보유액에 무수 에탄올을 최종 에탄올 농도가 80-90% 가 되도록 첨가하여 침전시키거나, 후속 단계에 직접 사용할 수 있다.
아라비노갈락탄 단백질 조성물은 20 mg/mL 에서 물, 식염수 및 pH 4 내지 7에서 수용액인 5% 글루코오스 중에 가용성인 백색 분말이었다. 조성물은 ≤0.5 EU/mg 의 내독소 및 ≤10 ppm 의 중금속을 함유하였다. 상기물은 ≥3.0:1, 전형적으로 ≥4.0:1 의 Ara : Gal 비를 가졌다. 조성물의 중량 평균 분자량은 ≥100 킬로달톤이었다.
단계 D. 산 개질 및 단리
단계 C 로부터의 아라비노갈락탄 단백질 조성물 보유액을 동일 부피의 1 M HCl 과 혼합하였다. 0.5 M HCl 중의 생성 용액을 30℃ 에서 6 시간 동안 인큐베이션한 후, 1 M NaOH 로 중화시켰다. 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 함유하는 중화 용액을 내독소가 없는 물로 100K MWCO Biomax 100 멤브레인을 통해 초여과시켜 탈염시키고, 약 20 g/L 로 재농축하였다.
생성 용액을 직접, 또는 단일 용량 바이알로 분배한 후, 특히 용해 증강 부형제, 예컨대 만니톨 또는 기타 당, 글리신 또는 기타 아미노산 또는 염화나트륨을 첨가한 후 동결건조시킬 수 있다.
산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 3.5:1 이하의 Ara: Gal 비; 약 2 중량% 이하의 회 함량, 약 20 중량ppm 이하의 중금속 함량을 가지며; 실질적으로 내독소가 없고; 120 내지 260 킬로달톤의 중량 평균 분자량을 갖고; 200 mg/mL 이상에서 수용성인 회백색-백색 분말이었다.
실시예 2. 순차적 이온 교환 크로마토그래피를 최종 단계로 하는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 조성물의 제조
단계 B. 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 추출
실시예 1 의 단계 A 에서 제조된 "드링크 칩" 150 g 을 100℃ 에서 3 시간 동안 환류시키면서, 1.5 L 의 내독소가 없는 pH 4.5 의 0.5 M KH2P04로 3 회 추출하였다. 합한 추출액을 ~ 200 mL 로 농축하고, 동시에 100K MWCO Biomax 100 폴리에테르술폰 UF 멤브레인 (Millipore Corp.) 을 통해 초여과하여 내독소가 없는 물 중으로 교환하였다. 농축액에 95% 에탄올을 최종 에탄올 농도가 35% v/v 가 되도록 교반하면서 첨가하여, 목적하지 않는 물질을 침전시켰다. 에탄올 현탁액을 8000 ×g 에서 원심분리하고 침전물을 버렸다. 상청액을 95% 에탄올로 최종 에탄올 농도 70% v/v 로 교반하면서 더욱 희석하여, 제 2 침전물을 형성시켰다. 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 함유하는 상기 제 2 침전물을 8000 ×g 에서 고속 원심분리하여 회수하고, 멸균 오븐 중에서 60-70℃ 에서 건조하였다 [필요하다면 중간 건조 없이 여기의 침전물을 단계 c 로 가져갈 수 있음을 주목할 것].
단계 C. 산 개질
단계 B 로부터의 건조된 미정제 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 40 mg/mL 의 농도로 내독소가 없는 물 중에 용해시킨 후, 동일 부피의 1 M 염산과 혼합하였다. 0.5 M HCl 중의 생성 용액을 30℃ 에서 6 시간 동안 인큐베이션한 후, 1 M NaOH 로 중화시켰다. 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 함유하는 중화 용액을 내독소가 없는 물로 100K MWCO Biomax 100 멤브레인을 통해 초여과시켜 탈염시키고 저분자량 물질을 제거하였다.
단계 D. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 및 단리
단계 C 로부터의 보유액을 pH 5.2 인 NaOAc 완충액 중에 20 mM 로 만든 후, 연속적으로 SP-Sepharose 가 채워진 양이온 교환 칼럼 (1.5 cm ×25 cm), 및 Q-Sepharose 가 채워진 음이온 교환 칼럼 (1.5 cm ×25 cm) 을 통해 통과시켰다. 음이온 교환 칼럼으로부터의 용출액에는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물이 함유되었다. 용출액을 100K MWCO Biomax 100 멤브레인을 통해 초여과하여 탈염시키고, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 동결건조에 의해 회수하였다.
실시예 3. 회분식 이온 교환을 최종 단계로 하는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 조성물의 제조
실시예 2 의 단계 B 및 C 의 공정을 이용하여, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 함유하는 탈염 용액을 제조하였다.
단계 D. 회분식 이온 교환에 의한 정제 및 단리.
단계 C 로부터의 보유액을 실온에서 1 시간 동안 1 g 의 IONAC NM-60 혼합층 이온 교환 수지와 함께 교반하였다. 수지를 여과에 의해 제거하고, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 함유하는 여과액을 100K MWCO Biomax 100 멤브레인을 통해 초여과하여 탈염시킨 후 건조하도록 동결건조하였다.
혼합층 수지를 사용하는 대신에, 양이온- 및 음이온-교환 수지로 단계 D 로부터의 보유액을 순차적 회분 교반하여서도 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 4. 산 처리를 최종 단계로, 회분식 이온 교환을 끝에서 두번째 단계로 하는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 조성물의 제조
실시예 3 의 단계 D 에 기재된 회분식 이온 교환으로 실시예 1 의 단계 C 의 이온 교환 크로마토그래피를 대체하여, 실시예 1 의 공정을 반복하였다.
실시예 5. 활성화된 인간 말초 혈액 단구 세포로부터의 시토카인 생산
인간 말초 혈액 단구 세포 (PBMC) 를 Boyum 의 방법 [A. Boyum, "Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood....",Scan. J. Lab. Invest.,97, 77-89 (1968)] 을 이용하여 제조하였다. 대략 25 mL/공여체의 인간 혈액 연막 (buffy coat) 시료는 스탠포드 대학 의약 센터 혈액 은행 (Stanford University Medical Center Blood Bank) 에서 입수하였다. 멸균 기법을 이용하여, 각각의 연막 시료를 실온에서 칼슘 및 마그네슘이 없는 행크의 균형 염 용액 (HBSS, Gibco) 에 첨가하면서 전체 부피 100 mL 중에 부드럽게 재현탁시켰다. 이어서, 25 mL 부피의 세포 현탁액을 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브 중 15 mL 의 Ficoll-Paque (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) 상에 깔고, 튜브를 15℃ 에서 30 분 동안 400 ×g 에서 Beckman GPR 테이블탑 원심분리기 (GH-3.7 로터) 중에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 중간층의 PBMC 현탁액을 새로운 50 mL 튜브로 옮겨, 전체 부피 45 mL 의 HBSS 중에 재현탁시키고, 15℃ 에서 10 분 동안 354 ×g 에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 전체 45 mL 의 HBSS 에 재현탁시키고, 다시 15℃ 에서 10 분 동안 265 ×g 에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10 ml 의 X-Vivo 조직 배양 배지 (Bio Whittaker, MD) 중에 재현탁시키고 혈구계산기를 이용하여 계수하였다. 폴리스티렌 튜브 (Falcon #2057, Becton Dickinson)를 하기 실험에서 사용하였다. PBMC 현탁액을 4 ×106/mL 로 희석하고; 다양한 농도의 0.5 mL 의 본 발명의 조성물 용액과 함께 1 mL 을 최종 농도 3 ㎍/mL 로 0.5 mL 의 피토헤마글루티닌 P (PHA-P, Pharmacia 27-3707-01) 의 존재 하에 인큐베이션하였다. 비교측정기 용액에는 (1) "드링크 칩" 의 추출, 에탄올 침전, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제, 및 추가적 에탄올 침전에 의해 제조된 정제 아라비노갈락탄 조성물 (PAGC); 또는 (2) "드링크 칩" 의 추출, 에탄올 침전, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제, 100K MWCO UF 멤브레인으로의 이온 교환 용출액의 초여과 (보유액 유지), 및 추가적 에탄올 침전에 의해 제조된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 (AGPC) 이 함유되었다. 튜브 당 총 부피는 2 mL 이었다. 7% CO2로 인큐베이터 내 37℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션 후, 튜브를 15℃ 에서 1600 ×g 로 Beckman GPR 테이블탑 원심분리기 (GH-3.7 로터) 중에서 원심분리하여, 상청액을 수합하고 분석 전까지 -70℃ 에서 보관하였다. 제조자의 프로토콜에 따라, 인간 G-CSF 용의 상업적으로 시판되는 ELISA 분석 키트 (R & D Systems, MN, 또는 Pharmingen) 를 이용하여 시토카인 측정을 수행하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Thermo max, Molecular Devices, CA) 를 이용하여 광학 밀도를 결정하였다. 마이크로플레이트 탐독기에 제공되는 소프트웨어를 이용하여 결과를 계산하고, 상청액 중에 생산되는 G-CSF 의 pg/mL 로 나타내었다. 하기 표는, AMC 가 활성화된 인간 PBMC 에 의한 G-CSF 생산을 증가시키고, PAGC 및 AGPC 둘 다에 비해 우수함을 나타낸다. 결과의 스튜덴트 t-시험은, AMC 가 10 내지 300 ㎍/mL 의 농도에서 PAGC 에비해 우수함을, 10 내지 1000 ㎍/mL 의 농도에서 AGPC 에 비해 우수함을 나타내었다 (p < 0.02). 최대 편차 (AMC 로 유도된 G-CSF 대 PAGC 로 유도된 G-CSF 의 비) 는 10 ㎍/mL 에서 나타났으며 (4.5:1), 농도가 더 높아질수록 편차가 더 작아졌지만, 100 ㎍/mL 에 이르기까지 뚜렷이 나타났다 (2.5:1).
실시예 6. 준치사 조사된 마우스에서 말초 혈액의 회복
평균 체중 20 그램, 9-14 주령의 자성 BALB/c 마우스를 연구에 사용하였다. 실험 5 일 전, 40 mg/L 의 Neomycin (Sigma, St. Louis, MO) 을 비산성화된 마시는 물에 첨가하였다. 마우스를 군 당 6 마리 마우스씩, 무작위로 대조군 또는 처리군으로 지정하여, 0 일째에 5 Gy 의 X-선 (250 KVP, 1.6 mm Al 필터, Philips) 로 조사하였다. 상기 선량의 조사 후, 말초 혈액 백혈구 및 혈소판 수는 정상 마우스에서보다 현저히 더 낮아졌고, 적혈구 수는 약간 더 낮아졌다. 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 250, 100, 및 50 mg/Kg 피하 주사하였다. 처리는 최초 5 일간 (0 일부터 4 일째까지) 매일, 이어서 후속 3 주간 (7-10, 14-16 및 21-23 일간) 매주 3 회씩, 조사 4-5 시간 후 최초 투여량을 주었다. 총 14 개 투여량의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 투여하였다. 대조군에는 0.1 mL 의 식염수를 피하 주입하였다. 실험 도중, 9, 13, 16 및 20 일째에 눈확 정맥 (orbital vein) 을 통해 마우스를 채혈하고; 혈액 시료를 EDTA-코팅 튜브 (Sarstedt, Germany) 중에 수집하여; 말초 혈액 혈소판 및 적혈구를 Serono 9010+ 세포 계수기 (Serono Baker Diagnostics Inc., Allentown, PA) 로 분석하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 모든 조사 후 시점의 조사된 마우스에서, 250, 100, 및 50 mg/Kg 의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 대조군에 비해 개선된 적혈구 및 혈소판 회복을 촉진하였다.
상기 분석에서, 100 및 300 mg/Kg 투여량의 PAGC 는 식염수보다 통계적으로유의미하게 더 우수하였고, 100 및 250 mg/Kg 의 AGPC 는 식염수보다 더 우수하였다 (통계적 유의성은 결정되지 않음).
유사한 실험에서, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물은 식염수 단독에서와 비교하여, 회복 속도를 극적으로 증가시키는 것으로 나타났으며 (백혈구 수가 8 ×106/mL 이상으로 회복됨): AMC-처리군에서는 회복하는데 평균 21 일이 걸린 반면, 식염수 군에서는 7 마리 중 1 마리의 마우스만이 30 일째에 회복되었고; AGPC 에서 보인 것과 유사한 속도로, PAGC 에 비해 회속 속도가 증가되었다.
본 발명을 구체적 구현예 및 실시예와 연결시켜 기재하였지만, 본 명세서에 관해 당업자에게는 구체적으로 개시된 물질 및 기법의 동등물도 또한 본 발명에 적용가능할 것임이 자명할 것이며; 상기 동등물도 하기 청구범위 내에 포함시키고자 한다.

Claims (30)

  1. 아스트라갈루스 멤브라나세우스 (A. membranaceus), 특히 아스트라갈루스 멤브라나세우스의 뿌리로부터 제조된, 산 개질 이전 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만 또는 80% 미만의 아라비노오스/갈락토오스 비를 갖는, 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 아스트라갈루스 멤브라나세우스가 아스트라갈루스 멤브라나세우스 Bge. var. 몬골리쿠스 (mongholicus) (Bge.) 히샤오 (Hsiao) 또는 아스트라갈루스 멤브라나세우스 (Fisch.) Bge 인 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 중화민국의 산서성 또는 내몽고에서 재배된 아스트라갈루스 멤브라나세우스로부터 단리된 산으로 개질된 아라비노갈락탄 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 아스트라갈루스 멤브라나세우스 식물이 2 년생 아스트라갈루스 멤브라나세우스 식물인 산으로 개질된 아라비노갈락탄 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 100 킬로달톤 이상의 중량 평균 분자량을 갖는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 80%w/w 이상의 탄수화물 및 2%w/w 이하의 단백질을 함유하는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 3.0:1 미만의 아라비노오스:갈락토오스 비를 갖는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, Endospecy 분석으로 1.0 EU/mg 이하의 내독소 함량을 갖는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 재구성되는 경우 4 내지 7 의 pH 를 갖는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물.
  10. 하기를 함유하는 수성의 주사가능한 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물:
    (a) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 치료적 유효량; 및
    (b) 수성의 주사가능한 부형제.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 또는 제 10 항의 수성의 주사가능한 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물의 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 투여하여 치료할 수 있는 포유류의 질환 상태의 치료 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 그 방법이 조혈 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 또는 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증의 치료, 세포독성제 또는 방사선으로의 노출 (예컨대 치료적 노출 뿐만 아니라 우연하거나 비치료적인 노출) 로부터의 회복 가속화, 악액질, 구토 또는 약물 금단 증상의 치료, 바이러스성, 박테리아성, 진균성 및 기타 감염, 및 기타 면역억제 상태에서 면역 반응의 복구 또는 촉진 또는 B 형 간염에서 간세포의 보호 방법인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 그 방법이 조혈 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 또는 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증의 치료 방법인 방법.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 포유류가 골수 억제를 겪고 있는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 골수 억제가 암 화학치료 또는 방사선 치료의 결과인 방법.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 하나 이상의 다른 치료제가 조혈을 촉진할 수 있는 치료제인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 하나 이상의 다른 치료제가 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 과립구 집락 자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 또는 인터류킨-3 으로부터 선택되는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 또는 제 10 항의 수성의 주사가능한 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물의, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물 또는 제 10 항의 수성의 주사가능한 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 제형물의 투여에 의해 치료가능한 포유류 질환의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 있어서의 용도.
  21. 제 20 항에 있어서, 그 치료가 조혈 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 또는 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증의 치료, 세포독성제 또는 방사선으로의 노출로부터의 회복 가속화, 악액질, 구토 또는 약물 금단 증상의 치료, 바이러스성, 박테리아성, 진균성 및 기타 감염, 및 기타 면역억제 상태에서 면역 반응의 복구 또는 촉진, 또는 B 형 간염에서 간세포의 보호인 용도.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 그 치료가 조혈 촉진, 거핵세포의 증식 또는 성숙 유도, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, 또는 G-CSF 의 생산 촉진, 호중구의 생산 또는 작용 촉진, 호중구감소증, 빈혈 또는 혈소판감소증의 치료인 용도.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 질환에 골수 억제가 포함되는 용도.
  24. 제 23 항에 있어서, 골수 억제가 암 화학치료 또는 방사선 치료의 결과인 용도.
  25. 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물이 하나 이상의 다른 치료제와의 공동 투여를 위한 것인 용도.
  26. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 다른 치료제가 조혈을 촉진할 수 있는 치료제인 용도.
  27. 제 26 항에 있어서, 하나 이상의 다른 치료제가 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 과립구 집락 자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 또는 인터류킨-3 으로부터 선택되는 용도.
  28. 하기를 포함하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 제조 방법:
    (a) 아스트라갈루스 멤브라나세우스로부터 추출된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 수성 산으로 처리하여 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노갈락탄 분지를 줄이고, 아라비노오스:갈락토오스 비를 처리 전의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만 또는 80% 미만으로 감소시킴; 및
    (b) 단계 (a) 로부터의 산물을 정제하여 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 단리.
  29. 하기를 포함하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 제조 방법:
    (a) 아스트라갈루스 멤브라나세우스로부터 추출된 아라비노갈락탄 단백질 조성물의 정제; 및
    (b) 단계 (a) 로부터의 산물을 수성 산으로 처리하여 조성물의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노갈락탄 분지를 줄이고, 아라비노오스:갈락토오스 비를 처리 전의 아라비노갈락탄 단백질 성분의 아라비노오스:갈락토오스 비의 3.5:1 미만 또는 80% 미만으로 감소시켜, 생성되는 산으로 개질된 아라비노갈락탄 단백질 조성물을 단리.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 수성 산이 염산인 방법.
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