CN102300576B - 用包含黄芪提取物的组合物治疗特发性血小板减少性紫癜 - Google Patents

用包含黄芪提取物的组合物治疗特发性血小板减少性紫癜 Download PDF

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Abstract

本文所提供的教导大体上涉及制备和使用包含黄芪提取物的组合物。所述提取物从黄芪中制备，并可包括例如酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物，其带有约3.5∶1至约5.0∶1的阿拉伯糖∶半乳糖的比例，约5％至约10％的鼠李糖，约15％至约20％的半乳糖以及约10％至约15％的葡萄糖。所述组合物可被用在特发性血小板减少性紫癜的治疗以及这种治疗的药物制剂中。

Description

用包含黄芪提取物的组合物治疗特发性血小板减少性紫癜
相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年12月15日申请的第61/122,586号美国临时专利的权利，所述专利申请的全文以引用的方式并入本文中。
技术领域
本文所提供的教导涉及制备和使用包含黄芪提取物的组合物。
背景技术
血小板或巨核细胞的数量减少是被称为血小板减少症(thrombocytopenia)的病症，一种在许多疾病以及在抑制骨髓功能、抑制造血或者致使血小板数目或巨核细胞减少的治疗中所经受的病症。例如，癌症患者经常使用化疗或放疗进行治疗而经受血小板减少症，增加了其出血的风险并有可能限制了化疗剂的剂量。至少有两种机制引起血小板减少症-(1)减少巨核细胞或血小板的产生的机制；以及(2)分解血小板或将其从循环中去除的机制。
运用第二种机制的疾病的例子是特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenic purpura)(ITP)。ITP是自身免疫性血液病，其特点是经由免疫系统的攻击去破坏血液中的血小板，导致血小板数目异常地低。血小板的破坏是由于存在抗血小板自身抗体，该抗体是针对患者自己的血小板的抗体。该低血小板数目可能造成容易瘀青、牙龈出血以及不大常见的严重内出血。也可发生鼻、牙龈、胃肠道或尿道出血，而脑内出血是少见但可怕的并发症。
目前，ITP在美国影响着大约200,000人，并且还无治疗其的方法。所有病例中约一半被归类为“特发性”，意指病因未知。术语“血小板减少性”指血小板的减少，术语“紫癜”指在皮肤和粘膜，例如口内膜，中的紫色区域，在这些区域由于血小板减少而发生出血。术语“免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombytopenic purpura)”说明了该疾病的免疫性质并包括病因已知的病例和成因未知的病例，因此常用该术语来描述这种病症。
ITP可能由药物引发，或与感染、怀孕或免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮，相关。急性ITP最常见于幼儿。该病症对男孩和女孩的影响相同，常在病毒感染后出现症状。约85％的儿童在1年内康复，并不再复发。当ITP持续超过6个月时，其被认为是慢性的，慢性ITP可在任何年龄发病。ITP在成年期达到高峰，所影响的女性比男性多两到三倍。不幸的是，为防止由于受伤而引起出血，常需要改变生活方式。
在一些实施例中，标准的ITP治疗使用高剂量的皮质类固醇(corticosteroids)。患者对高剂量的皮质类固醇反应良好，但这些反应不会持久，而且患者对该治疗耐受性差，兼且有明显的副作用。并且，失效或不耐受皮质类固醇能够造成选择了脾切除术，这是因为脾是血小板的破坏的主要部位，其当然造成另外的并发症。在一些实施例中，治疗可包括给予泼尼松和/或IV免疫球蛋白。还可使用其他药物，例如长春新碱、硫唑嘌呤(依木兰(IMURAN))、丹那唑(DANAZOL)、环磷酰胺和环孢素。
本领域技术人员应理解使用化疗药物或放疗进行治疗会导致血小板数目异常地低是已知的。这些治疗提供了上述第一机制，其抑制骨髓功能，减少巨核细胞的产生，继而减少血小板数目。相反，ITP的异常低的血小板数目由通过产生与血小板结合的抗体来将血小板从循环中去除的第二机制造成。因此，本领域技术人员应理解一种能够治疗血小板减少症的组合物，不管该症是由于产生在循环中的巨核细胞或血小板的生物过程受损，或是由于ITP的抗体介导机制，都能够用该组合物来治疗该症。
发明内容
本文所提供的教导大体上涉及制备和使用包含黄芪提取物的组合物。在一些实施例中，组合物包含黄芪的高收率提取物，其中所述提取物包括大于约3.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例；约5％至约10％的鼠李糖；约15％至约20％的半乳糖；约10％至约20％的半乳糖醛酸；以及约10％至约15％的葡萄糖。在这些实施例中，使用第一过程制备所述高收率提取物，所述第一过程包括从黄芪中分离出粗提取物以及将该粗提取物用酸温和地处理，所述温和地处理包括把浓度约0.05M至约0.5M的酸在温度约15℃至25℃下用于该粗提取物，时间约1小时至约24小时。需选择该酸的使用温度和时间以获得所述的阿拉伯糖∶半乳糖比例、所述的半乳糖含量、所述的葡萄糖含量以及高收率。该高收率比使用第二过程所产生的黄芪提取物的收率高得多，所述第二过程包括把酸用于所述粗提取物，所选择的温度和时间是为求获得小于3.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例、20％-35％的半乳糖以及小于约10％的葡萄糖的温度和时间。在一些实施例中，该酸处理中所使用的酸是三氯乙酸或盐酸。
在一些实施例中，所述提取物是从黄芪的根中分离出来。在这些实施例中，该黄芪可能是蒙古黄芪(A.membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜荚黄芪(A.membranaceus(Fisch.)Bge.)。在一些实施例中，该黄芪生长在中国的内蒙古或山西省。此外，在一些实施例中，所述根可来自生长了约两年的黄芪属植物。
所述提取物的组分可能各有不同。在一些实施例中，所述提取物带有至少100千道尔顿的重均分子量、以重量计至少80％的碳水化合物和以重量计不多于2％的蛋白、约4.0∶1至约4.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例、pH值约4.5至约6.5的水溶液或其相互之间的任何组合。
包含所述提取物的组合物可进一步包含刺激造血或与刺激造血的药剂联合给予的药剂。在一些实施例中，所述药剂可选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。在一些实施例中，所述组合物可在含水的注射用制剂中，该制剂包含有效治疗分量的所述组合物和含水的注射用辅料。
在一些实施例中，所述提取物包括约1.5∶1至约3∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例；约5％至约15％的阿拉伯糖；少于约1.5％的鼠李糖；约3％至约7％的半乳糖；少于约4％的半乳糖醛酸；以及约70％至约90％的葡萄糖。在这些实施例中，所述提取物可带有约20千道尔顿至约60千道尔顿的重均分子量、pH值约4.5至约6.5的水溶液或其组合。
本文所提供的教导还包括刺激哺乳类动物的造血系统的方法。所述方法包括对哺乳类动物给予有效分量的包含本文所教导的提取物的组合物。在一些实施例中，所述刺激包括增加血小板数目、增加白细胞数目、增加淋巴细胞数目或其组合。
在一些实施例中，所述方法进一步包括同时给予第二活性剂。在这些实施例中，第二活性剂可为造血剂。第二活性剂可选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。
所述哺乳类动物可为不管是为试验目的还是为治疗的目的而给予其所述组合物的任何哺乳类动物。在一些实施例中，该哺乳类动物为人类，并且在一些实施例中，该人患有骨髓抑制。骨髓抑制可能是化疗或放疗的后果。
所述教导还提供了制备所述提取物的方法。所述方法包括从黄芪中分离出粗提取物以及将该粗提取物用酸温和地处理。所述温和地处理包括把浓度约0.05M至约0.5M的酸在温度约15℃至25℃下用于该粗提取物，时间约1小时至约24小时。需选择该酸的使用温度和时间以获得大于约3.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例；约5％至约10％的鼠李糖；约15％至约20％的半乳糖；约10％至约20％的半乳糖醛酸；约10％至约15％的葡萄糖；以及高收率。该高收率比使用第二过程所生产的黄芪提取物的收率高得多，所述第二过程包括将酸用于所述粗提取物，所选择的温度和时间是为求获得小于3.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例、20％-35％的半乳糖以及少于约10％的葡萄糖的温度和时间。在一些实施例中，可将阿拉伯糖∶半乳糖比例减至约4.0∶1至约4.5∶1、约3.75∶1至约4.5∶1、约3.8∶1至约4.25∶1或其中的任何范围。
本教导还提供了治疗特发性血小板减少性紫癜的方法，其中所述方法包括给予患有特发性血小板减少性紫癜的对象有效分量的本文所教导的提取物。在一些实施例中，与第二活性剂联合给予酸改性阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)蛋白组合物。在一些实施例中，第二活性剂可选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。并且，在一些实施例中，所述组合物可被用于生产治疗哺乳类动物的特发性血小板减少性紫癜的药剂，通过给予有效治疗分量的该药剂来进行该症的治疗。
读到以下教导的技术人员应理解所述概念可扩展到超出权利要求的字面意思、权利要求所列举的发明以及权利要求中所列举的术语的另外的实施例。
附图说明
图1显示了根据一些实施例在给予亚致死剂量的放射之后，BALB/c小鼠的血小板水平对所述高收率提取物的反应。
图2显示了根据一些实施例在给BALB/c小鼠注射后7天，丝裂霉素诱发了血小板减少症。
图3显示了根据一些实施例在给予所述高收率提取物之后，受放射的BALB/c小鼠的白细胞的恢复。
图4显示了根据一些实施例在同时注射所述高收率提取物和G-CSF(粒细胞集落刺激因子)时，受放射的BALB/c小鼠的血小板数目的恢复速度。
图5显示了根据一些实施例在同时注射所述高收率提取物和G-CSF时，受放射的BALB/c小鼠的白细胞数目的恢复速度。
图6显示了在台湾临床试验的流程表，其中根据美国血液学协会(ASH)的准则将患者诊断为患有慢性特发性血小板减少症。
具体实施方式
本文所提供的教导大体上涉及制备和使用包含黄芪提取物的组合物。在一些实施例中，所述提取物可被用于刺激骨髓抑制中的造血；刺激IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF或G-CSF的产生；刺激白细胞的产生或作用；刺激患有嗜中性白血球减少症(neutropenia)、白细胞减少症、单核细胞减少症、贫血症或血小板减少症的哺乳类动物的免疫和/或造血系统。所述提取物可被用于例如治疗因暴露于细胞毒性剂或者事故性或作为治疗方案的一部分的放射而产生的病症，这里所述的病症包括但不受限于骨髓抑制或免疫反应所致的造血细胞的损伤、抑制或去除。使用本文所提供的治疗能缓解症状，这里所述的症状可包括例如恶病质、呕吐以及停药症状。这种提取物的例子可在例如第6,991,817号美国专利和第WO200100682号专利中找到，所述两个专利申请的全文都以引用的方式并入本文中。
所述提取物刺激造血活动，从而增加血细胞的产生。例如，所述提取物可增加血小板数目，并对治疗血小板减少症有效，该病症最常见于经受癌症治疗的患者。然而，血小板减少症还有很多其他的病因，例如免疫性疾病和病毒性疾病。免疫性疾病的例子是ITP，病毒性疾病的例子是HIV或慢性肝炎。给予药物也可能引起血小板减少症，在这里可将血小板数目减少看作为对该药物的不良反应，或抑制骨髓功能的药物的结果。消炎药、心脏病药、抗生素已被确认为是血小板减少症的病因。身体状况，例如脾的变大，能够引起血小板减少症，这是因为增大的脾困住并破坏血小板。免疫系统疾病，例如狼疮病和类风湿病，也能够引起血小板减少症。
就其本身而论，所述提取物可被用于治疗血小板减少症，例如由免疫性疾病或骨髓抑制所引起的血小板减少症。所述提取物也可被用来刺激白细胞的产生。本文所述的组合物和方法刺激造血，诱使巨核细胞或其他白细胞的增殖或成熟。本文所述的组合物和方法刺激血小板、巨核细胞和其他白细胞的产生、增殖和成熟，而且在病症或其他治疗抑制其产生或者将其破坏或从循环中去除之后加快其恢复。技术人员在看过已提供的教导之后会更好地理解权利要求的范围。
本文所提供的提取物能有助于恢复对感染或在免疫抑制病症中的免疫反应，以及保护乙型肝炎中的肝细胞。而且，可有理由地预期所述提取物刺激较成熟的造血细胞的原始造血祖细胞的生长和活动。此外，通过刺激患者的造血以及阻止可能会延迟给药治疗或减轻治疗强度的感染来增强患者对感染的抵抗力，所述提取物能有助于提高正在进行的治疗计划，例如化疗，的功效。
制备Ara∶Gal(阿拉伯糖∶半乳糖比例)为约1.5∶1至约3∶1、平均分子量为约20千道 尔顿至约60千道尔顿的黄芪提取物(“纯化的提取物”)
本教导描述了如何从黄芪中分离出提取物并将其纯化。在一些实施例中，生长了两年的黄芪属植物的根提供了所述组合物的良好来源。在很多实施例中，所述根能来自例如蒙古黄芪；膜荚黄芪；或生长在中国的内蒙古或山西省的黄芪。
所述黄芪的提取物通常来源于无菌的已加工的已被切削或分段的干燥的根。所述制备包括修剪干燥的根，用超滤(UF)水擦洗，以及用消毒液，例如70％的乙醇，清洁。将根切成小片并在无菌条件下干燥以生成“饮片(drink chips)”，在本文中还被称作“干净的薄片(clean chips)”。所述提取物包括阿拉伯半乳聚糖蛋白和相关的多糖，利用包括使用温度至少为80-100℃的含水的提取溶剂的过程将其从饮片分离出来。
所述提取溶剂可为水，并能可选地包括共提取剂，例如碱金属盐。碱金属盐可包括例如磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。共提取剂可例如为pH值为约4.5、浓度为0.5M的KH2PO4。
以从根中分离出所述提取物所需的时间、温度以及提取循环将提取溶剂使用在饮片上。典型的过程包括三个提取循环，各循环持续约3个小时，使用温度约100℃的提取溶剂。在一些实施例中，初时用诸如pH值为4.5、温度为100℃、浓度为0.5M的KH2PO4的热盐水冲洗约30分钟来提取所述饮片。在一些实施例中，制备饮片随后的所有步骤都在无菌条件下进行，包括使用无菌的设备和试剂。
然后，将所述提取溶剂浓缩，这能在温度约为60℃至约70℃的真空下完成，以达到每1kg饮片约1L的浓度。使用超滤，例如用截留分子量为100千道尔顿的过滤器超滤，也能达到所述浓度。
然后，使用低醇将所述提取物从所述浓缩的提取溶剂中沉淀出来。所述低醇可为例如乙醇。在一些实施例中，可将乙醇加入所述溶剂至乙醇在约室温下的浓度为约70％，从而产生沉淀物。在一些实施例中，首先在第一沉淀步骤中使用约35％的低浓度乙醇，然后在第二沉淀步骤中使用约70％的高浓度乙醇来进行沉淀。用于沉淀的低醇的浓度可例如为20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或其中的任何浓度。
可重复地以烷醇冲洗以进行进一步的纯化。例如，可用更多的所述低醇来冲洗沉淀物，这里典型的冲洗可包括例如用95％的乙醇冲洗三次。然后，使沉淀物悬浮在浓度适合进一步处理的例如约18-20％的重量/体积的水中。可再次将低醇加入水中进行重新沉淀，以去除不溶于水的其他物质。可用高浓度的低醇来沉淀上清液。所述高浓度的低醇可为例如40-80％的乙醇，在一些实施例中为60-70％的乙醇，以产生包含阿拉伯半乳聚糖蛋白和相关的多糖的粗提取物沉淀物。
将所述粗提取物重新溶解在水中并进行干燥。合适的干燥过程可包括已为技术人员所知的避免过度加热的任何过程，并可包括例如喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥、临界点干燥、溶剂交换及其类似过程。也可将所述粗提取物重新溶解在水或水溶液中，其中使所述粗提取物达到合适的浓度以进行超滤。在一些实施例中，适合超滤的浓度为约2％。然后，可将所述粗提取物超滤以进一步去除低分子量的物质并减小该溶液的体积，其中超滤系统的截留分子量例如可为5千道尔顿。
在一些实施例中，所述粗提取物可为白色至灰白或黄白色粉末或淡黄色粉末，并可在水中溶解至至少约100mg/mL。在一些实施例中，所述粉末可在水中溶解至至少约200mg/mL。干燥后粉末的重量减轻了少于约15％，内毒素含量少于约0.5EU/mg，在一些实施例中内毒素含量少于约0.3EU/mg。
可用离子交换层析进一步纯化所述粗提取物。将所述组合物在水溶液中重新溶解，使其达到合适的浓度以进行超滤，通常浓度为约2％。然后，将所述重新溶解的组合物超滤以进一步去除低分子量的物质并减小该溶液的体积。可使用如上所述的截留分子量为5千道尔顿的超滤系统。将该超滤的滞留物通过阳离子交换柱，例如以pH值为5.20的20mM的NaOAc缓冲液平衡的SP Sepharose阳离子交换柱，进行洗脱。将来自阳离子交换柱的洗脱物通过阴离子交换柱，例如以相同的NaOAc缓冲液平衡的QSepharose阴离子交换柱，进行洗脱。
来自阴离子交换柱的洗脱物可被(1)直接用于制备如本文所教导的其他形式的提取物；(2)浓缩和干燥以形成所述粗提取物，可将其保存为适合制备所述纯化提取物的中间体；或者(3)直接用于制备所述纯化提取物。
在所述纯化提取物的制备中，可将所述粗提取物通过合适的抑菌过滤器，例如0.1μm的过滤器，进行微滤，并且进行超滤以使该溶液脱盐而再次减小其体积。在一些实施例中，可使用截留分子量为8千道尔顿的超滤。将来自该超滤的滞留物浓缩，并可使用折射仪来测定百分比浓度。在一些实施例中，把该滞留物浓缩至浓度在50-60℃下为约20-26％。然后，用低醇将浓缩后的滞留物沉淀。在一些实施例中，所述低醇可为浓度增加到约80-90％的乙醇。可进一步冲洗该沉淀物，在这里典型的冲洗可包括使用无水乙醇将该沉淀物冲洗三次。然后，将该沉淀物干燥以得到所述纯化提取物。在一些实施例中，可通过使用真空烘箱在约60-70℃的温度下将该沉淀物干燥。
为了减少从该过程得到的提取物的批次差异，可在提取过程的一个或多个阶段将所述材料混合。在一些实施例中，所述过程包括混合原材料、混合“饮片”、混合该过程中的其他中间体或其相互之间的组合。
可使用已为技术人员所知的标准的分析技术通过甲醇化的组合提取物的三甲基硅衍生物的气液层析法来测定所述纯化提取物的组分。在一些实施例中，所述纯化提取物包括Ara，其量少于约5％至约15％、约5％至约12％、约5％至约10％、约10％至约15％或其中的任何范围；Rha，其量少于约1％至1.5％；GalA，其量少于约4％；Gal，其量为约3％至约7％、约3％至约5％、约4％至约6％或其中的任何范围；Glc，其量为约70％至约90％、约70％至约85％、约75％至约80％、约85％至约90％或其中的任何范围。所有百分比以摩尔％(mol％)表示。
所述纯化提取物的Ara∶Gal比例为约1.5∶1至约3∶1。在一些实施例中，Ara∶Gal比例在约1.5∶1至约1.75∶1、约1.75∶1至约3∶1或其中的任何范围。
所述纯化提取物的重均分子量为约20千道尔顿至约60千道尔顿。在一些实施例中，所述分子量在约25千道尔顿至约40千道尔顿、约27千道尔顿至约35千道尔顿或其中的任何范围。
而且，所述纯化提取物的灰分含量以重量计少于约2％，重金属含量以重量计少于约10ppm，羟脯氨酸含量少于约0.1％。在一些实施例中，羟脯氨酸含量少于约0.05％、少于约0.03％或其中的任何范围。
所述纯化提取物大体上不含内毒素，用Endospecy(内毒素检测试剂盒)[SeikagakuCorporation，东京，日本]测定其内毒素含量少于1.0EU/mg。在一些实施例中，该内毒素含量为少于0.5EU/mg、少于0.3EU/mg或其中的任何范围。并且，所述纯化提取物可在水中溶解至至少20mg/ml，水溶液的pH值为约4.5至约6.5。
在一些实施例中，所述提取物包括约1.5∶1至约3∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例；约5％至约15％的阿拉伯糖；少于约1.5％的鼠李糖；约3％至约7％的半乳糖；少于约4％的半乳糖醛酸；以及约70％至约90％的葡萄糖。在这些实施例中，所述提取物的均重分子量可为约20千道尔顿至约60千道尔顿，水溶液的pH值为约4.5至约6.5或其组合。
制备Ara∶Gal为约2∶1至约4∶1、平均分子量大于约100千道尔顿的黄芪提取物(“高 MW(分子量)提取物”)
一般而言，本例子中的提取物是高分子量形式的所述纯化提取物，其中所述提取物的均重分子量为至少100千道尔顿。除其他优点外，这些提取物的体积较小。通常使用制备所述纯化提取物的步骤来制备这些高分子量提取物，其中可直接使用来自所述阴离子交换柱的洗脱物、所述粗提取物或所述纯化提取物(“纯化提取物或其中间体”)。
使用100K截留分子量的超滤系统来制备源自所述纯化提取物或其中间体的高MW提取物。例如，可把来自阴离子交换柱的洗脱物直接用于100K截留分子量的超滤系统，将该洗脱物浓缩、沉淀、可选地进一步将其冲洗，以及干燥，并且可使用上述在制备所述纯化提取物中的方法来完成每个步骤。
在一些实施例中，所述高MW提取物包括Ara，其量为约45％至约75％、约50％至约65％、约55％至约60％或其中的任何范围；Rha，其量为约2％至约4％、约2％至约3％或其中的任何范围；GalA，其量为约4％至约6％、约4％至约5％或其中的任何范围；Gal，其量为约8％至约25％、约10％至约20％、约12％至约18％或其中的任何范围；Glc，其量为约5％至约25％、约7％至约20％、约10％至约15％或其中的任何范围。所有百分比以摩尔％表示。
所述高MW提取物的Ara∶Gal比例为约2∶1至约4∶1。在一些实施例中，Ara∶Gal比例为约2∶1至约3.75∶1、约2.5∶1至约3.5∶1、约2.5∶1至约3∶1、约3∶1至约4∶1或其中的任何范围。
所述高MW提取物的重均分子量大于100千道尔顿。在一些实施例中，所述高MW提取物的重均分子量为约100千道尔顿至约350千道尔顿。在一些实施例中，所述分子量为约100千道尔顿至约300千道尔顿、约125千道尔顿至约275千道尔顿、约150千道尔顿至约250千道尔顿、约200千道尔顿至约275千道尔顿或其中的任何范围。
此外，所述高MW提取物的灰分含量以重量计少于约2％，重金属含量以重量计少于约20ppm，羟脯氨酸含量大于约0.2％，其在一些实施例中为约0.2％至约0.3％。
所述高MW提取物大体上不含内毒素，用Endospecy[Seikagaku Corporation，东京，日本]测定其内毒素含量少于1.0EU/mg。在一些实施例中，该内毒素含量为少于0.5EU/mg、少于0.3EU/mg或其中的任何范围。并且，所述纯化提取物可在水中溶解至至少10mg/ml，水溶液的pH值为约4.5至约6.5。
所述高MW提取物包含约95％的碳水化合物，其包括使阿拉伯半乳聚糖蛋白的蛋白核心糖基化的碳水化合物和约5％的蛋白，在这里羟脯氨酸占总氨基酸含量的约20％。
制备Ara∶Gal为约3.5∶1至约5.0∶1、平均分子量为大于约100千道尔顿的黄芪提取 物(“高收率提取物”)
第6,991,817号美国专利教导了酸改性的提取物。一般而言，由于至少以下原因，本例子的提取物是改进的：其提供了多种收率高得多的形式的活性提取物。在一些实施例中，通常能使用制备所述高MW提取物的步骤和包括本例中所述的温和的酸处理来制备该高收率提取物。
所述过程包括分离出所述粗提取物并用酸温和地处理该粗提取物，所述温和地处理包括把酸用于该粗提取物，该酸的浓度为约0.05M至约0.5M、约0.01M至约1.0M、约0.05M至约0.1M或其中的任何范围。所述过程使用的处理温度为约15℃至25℃，处理时间为约1小时至约24小时。可将处理时间加长至超过24小时，在一些实施例中，加长至能达到优选的水解技术所需的时长。可选择酸的使用温度和时间，以使阿拉伯糖∶半乳糖比例大于3.5∶1，并得到其他的组合特征，例如半乳糖含量为约15％至约20％、葡萄糖含量为约10％至约15％以及所述高收率。
所述收率大大高于使用不同的过程所生产的黄芪提取物的收率，该过程包括把酸用于所述粗提取物，所挑选的温度和时间是为求获得小于3.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例，20％-35％的半乳糖以及少于约10％的葡萄糖。所述高收率提取物的收率可为较高3％-30％、5％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-20％、20％-30％或其中的任何范围。所述高收率提取过程产生的阿拉伯糖∶半乳糖比例为约3.5∶1至约5.0∶1，得到的收率高于使用本文教导的其他提取物制备过程所得到的收率，该过程产生的提取物的阿拉伯糖∶半乳糖比例为3.5∶1或更小。
在确保充分水解以达到理想的纯化和高收率时，选择温和的酸处理来保存例如多糖链。在一些实施例中，所述酸可包括无机酸、有机酸或其组合。在一些实施例中，所述有机酸是弱有机酸。在一些实施例中，所述酸包括三氯乙酸、盐酸或其组合。在一些实施例中，所述酸包括甲酸、乙酸、柠檬酸或其组合。在一些实施例中，所述酸包括硼酸、磷酸、氢氟酸或其组合。
在一些实施例中，所述温和的酸处理可包括约0.01M至约0.5M的盐酸。在一些实施例中，盐酸可被高氯酸、氢碘酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或其组合代替，或与高氯酸、氢碘酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或其组合联合使用。在一些实施例中，所述酸可包括有机酸，其选自二氯乙酸、马来酸、草酸、水杨酸、三氯乙酸、甲磺酸、三氟乙酸、苯磺酸或其组合。技术人员可轻易地选择合适的浓度和状态。
在一些实施例中，酸的浓度可为约1.0M或更低、约0.5M或更低、约0.3M或更低、约0.2M或更低、约0.1M或更低、约0.05M或更低、约0.01M或更低或其中的任何范围。在一些实施例中，酸的浓度可为约0.1M至约0.5M、约0.2M至约0.4M、约0.2M至约0.3M或其中的任何范围。在一些实施例中，反应时间可为0.5小时至约10小时、约1小时至约8小时、约2小时至约7小时、约2小时至约5小时、约2小时至约3小时或其中的任何范围。
然后，可使用上述的超滤和离子交换步骤将所述高收率提取物进一步纯化。所述进一步纯化去除了更多的盐和低分子量物质，并且减小了该溶液的体积。
在一些实施例中，所述高收率提取物包含Ara，其量为约35％至约65％、约50％至约65％、约50％至约60％、约40％至约60％或其中的任何范围；Rha，其量为约5％至约10％、约5％至约8％、约6％至约9％或其中的任何范围；GalA，其量为约10％至约20％、约10％至约18％、约12％至约16％或其中的任何范围；Gal，其量为约15％至约25％、约15％至约20％、约18％至约21％或其中的任何范围；Glc，其量少于约10％、为约1％至约8％、约2％至约6％或其中的任何范围。全部百分比以摩尔％表示。
所述高收率提取物的Ara∶Gal比例大于约3.5∶1。在一些实施例中，Ara∶Gal比例为约3.5∶1至约4.5∶1、约4.0∶1至约4.5∶1、约3.5∶1至约4∶1、约3.75∶1至约4.5∶1或其中的任何范围。
所述高收率提取物的均重分子量大于100千道尔顿。在一些实施例中，所述分子量为约100千道尔顿至约350千道尔顿。在一些实施例中，所述分子量为约100千道尔顿至约300千道尔顿、约125千道尔顿至约275千道尔顿、约150千道尔顿至约250千道尔顿、约200千道尔顿至约275千道尔顿或其中的任何范围。
此外，所述高收率提取物的灰分含量以重量计少于约2％，重金属含量以重量计少于约20ppm，羟脯氨酸含量少于约0.1％。
所述高收率提取物大体上不含内毒素，用Endospecy[Seikagaku Corporation，东京，日本]测定其内毒素含量少于1.0EU/mg。在一些实施例中，该内毒素含量为少于0.5EU/mg、少于0.3EU/mg或其中的任何范围。而且，所述纯化提取物可在水中溶解至至少10mg/ml，水溶液的pH值为约4.5至约6.5。
聚糖可包含约80％的提取物，剩余物中有蛋白，并可能有微量的脂质。在一些实施例中，峰值分子量为约350千道尔顿(相对于支链淀粉尺寸)的那部分提取物代表较大的分子量，而峰值分子量大约为75千道尔顿的那部分提取物代表较小的分子量。所述带有较大分子量的那部分的均重分子量可为260千道尔顿，带有较小分子量的那部分的均重分子量可为约120千道尔顿。多分散度可例如为约1至约5、约1.5至约3.5或其中的任何范围。
在一些实施例，所述提取物包含大于约3.5∶1的阿拉伯糖∶半乳糖比例；约5％至约10％的鼠李糖；约15％至约20％的半乳糖；约10％至约20％的半乳糖醛酸；以及约10％至约15％的葡萄糖。
技术人员应理解可改变以上所提供的制备所述提取物的步骤的次序来得到相同或相似的结果。在一些实施例中，可使用依次序的离子交换层析步骤。在一些实施例中，可使用相同或相似的离子交换树脂以批量的方式进行离子交换层析。可使用带有阴离子和阳离子交换功能的混床树脂来代替分离的阴阳离子树脂。在一些实施例中，离子交换纯化可发生在所述过程的不同时点，包括在所述温和的酸处理之前或之后，并且对超滤膜的截留分子量尺寸的选择可有所不同。
包含任何本文所教导的提取物的组合物可进一步包含刺激造血或与刺激造血的药剂联合给予的药剂。在一些实施例中，所述药剂可选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。在一些实施例中，所述组合物可在含水的注射用制剂中，该制剂包括有效治疗分量的该组合物和含水的注射用辅料。
使用和给药方法
所述组合物可在治疗疾病中提供治疗和/或预防效果或改善对象的疾病的一个或多个症状。术语“对象”和“患者”能交换使用，指动物，例如哺乳类动物，包括但不受限于非灵长类动物，例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠；以及灵长类动物，例如猴或人。
可针对本文所述的各种不同的治疗给予本文所提供的组合物，所述治疗包括例如刺激造血；诱导巨核细胞的增殖或成熟；刺激IL-1-β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF或G-CSF的产生；刺激白细胞、嗜中性白血球的产生或作用；治疗嗜中性白血球减少症、白细胞减少症、单核细胞减少症、贫血症或血小板减少症。所述组合物也可帮助促进从暴露于细胞毒性剂或放射(包括事故性或非治疗性的，以及治疗性的暴露)中的恢复。
本文所提供的教导还包括刺激哺乳类动物的造血系统的方法。所述方法包括给予哺乳类动物有效分量的包含本文所教导的提取物的组合物。在一些实施例中，所述刺激包括增加血小板数目、增加白细胞数目、增加淋巴细胞数目或其组合。
在一些实施例中，所述方法进一步包括同时给予第二活性剂。在这些实施例中，第二活性剂可为造血剂。第二活性剂可选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。
在很多实施例中，所述哺乳类动物可为不管是为试验目的还是为治疗的目的而给予其所述组合物的任何哺乳类动物。在一些实施例中，该哺乳类动物为人类，并且在一些实施例中，该人患有骨髓抑制。骨髓抑制可能是化疗或放疗的后果。
本教导还提供了治疗特发性血小板减少性紫癜的方法，其中所述方法包括给予患有特发性血小板减少性紫癜的对象有效分量的本文所教导的提取物。在一些实施例中，与第二活性剂联合给予酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物。在一些实施例中，第二活性剂可选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。
本教导还包括药物组合物，其包括在预防、治疗疾病中起治疗和/或预防作用和/或改善疾病症状的量的所述提取物。
所述组合物中所使用的提取物的量可根据多种因素例如对象的疾病类型、年龄、性别和体重而有所不同。可调整给药方案以使治疗反应为最佳。如已为本领域技术人员所知的治疗状况和因素的紧急情况所显示，在一些实施例中，可一次性给药，该药可为大丸剂；可随时间分多次给药；可按比例减少或增加剂量；或其相互之间的任何组合。要注意的是剂量值可随病症的严重程度所需的缓解而有所不同。可根据个人需要以及给予或指导给予所述组合物之人的专业判断而随时间调整剂量方案，本文所提出的剂量范围仅是示例性的，不对医疗从业人员可选择的剂量范围加以限制。
术语“给药”(“administration”)或“给予”(“administering”)指将组合物加入对象的细胞或组织(体内或体外)以诊断、预防、治疗或改善疾病症状的方法。在一个例子中，可将化合物以体内、胃肠外的方式给予对象。在另一例子中，可通过将化合物与对象的细胞组织以体外的方式相结合而将该化合物给予对象，其目的包括但不受限于用于确定组合物的效用和效力的检测。当将所述化合物与一个或多个活性剂联合加入对象时，术语“给药”或“给予”可包括先后或同时地加入带有其他药剂(例如上述的任何药剂)的化合物。本发明的药剂组合物被配制成与其预定的给药途径相配。给药途径的例子包括但不受限于胃肠外给药，例如静脉、皮内、肌内和皮下注射；口服；吸入；鼻内；经皮；经粘膜；以及直肠给药。
可使用本发明的化合物的“有效分量”来描述有效治疗分量或有效预防分量。有效分量也可为改善疾病症状的量。“有效治疗分量”指以获得理想的治疗结果所需的剂量和时段为有效的量，也可指研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的、在组织、系统或对象上引起任何生物或医疗反应的活性的化合物、药物前体或药剂，所述反应可为产生理想效果的治疗计划的一部分。在一些实施例中，所给予的有效治疗分量可能必须是足以改善疾病的一个或多个症状、预防疾病的发展或疾病的倒退的量。在一个例子中(以发炎为特征的炎性疾病或自身免疫疾病的治疗)，有效治疗分量优选地指治疗剂提供所述组合物的理想作用的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的可测反应的量。术语“治疗”指给予本文所教导的一种或多种治疗或预防剂。
“有效预防分量”指以得到理想的预防结果，例如预防或抑制血小板或白细胞数目下降的严重程度或减少所述下降的最低点所需的剂量和时段为有效的量。通常，在疾病发作之前或疾病发作的早期阶段向对象使用预防剂量，以预防或抑制该疾病的发作或该疾病的症状。有效预防分量可少于、大于或等于有效治疗分量。
在一些实施例中，可口服给药。在其他实施例中，可皮下注射给药。在其他实施例中，可使用无菌的等渗的含水的缓冲液静脉注射给药。在另一实施例中，给药可包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocaine)，以减轻注射部位的不适感。在其他实施例中，可胃肠外给药，以使给药例如轻松和均匀。
可用剂量单位的形式给予所述化合物。术语“剂量单位”指能以统一剂量的形式给予对象的个别预定数量的化合物。可选择预定数量的活性化合物以产生理想的治疗效果，并可将其与药学上可接受的载体一起给予。各单位剂量的预定数量可取决于一些因素，其包括但不受限于(a)所述活性化合物的独特特性和所获得的特定的治疗效果，以及(b)产生和给予这种剂量单位的技术所固有的限制。
“药学上可接受的载体”为稀释剂、辅助剂、辅料或与所述组合物一起给予的媒剂。经州或联邦管理机构批准用于对象或其列在美国食品化学法典或其他公认的来源上之后，载体为药学上可接受的。
所述药物载体包括任何或全部的生理相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及其类似物。药物载体的例子包括但不受限于无菌液体，例如水、油和脂类(例如磷脂和糖脂)。这些无菌液体包括但不受限于来源于石油、动物、蔬菜或合成的诸如花生油、豆油、矿物油、芝麻油的无菌液体。水可为静脉给药的优选载体。生理盐水溶液、含水的右旋葡萄糖和甘油溶液也可为液态载体，尤其是作为注射用溶液的液态载体。
合适的药物辅料包括但不受限于淀粉、糖、惰性聚合物、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、硬脂酸甘油单脂、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇以及其类似物。所述组合物也可包含少量的湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂或其组合。所述组合物的形式可为溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂以及其类似物。口服制剂可包括标准的载体诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁以及其类似物。见马丁E.W.雷明顿(Martin，E.W.Remington)的药物学。也可将补充性活性化合物加入所述组合物。
在一些实施例中，所述载体适于胃肠外给药。在其他实施例中，所述载体可适于静脉、腹腔内、肌内、舌下或口服给药。在其他实施例中，所述药学上可接受的载体可包括药学上可接受的盐。
用于胃肠外给药的药物制剂可包括脂质体。脂质体和乳剂是对疏水性药物特别有用的给药媒剂或载体。根据治疗试剂的生物稳定性，可采用另外的稳定蛋白的策略。此外，可在靶向给药系统中，例如在包裹有靶目标抗体的脂质体中给予该药。所述脂质体会与靶蛋白结合并选择性地被表达该靶蛋白的细胞接收。
在生产和储存状态下，治疗性组合物通常必须是无菌而稳定的。可将所述组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。在一些实施例中，所述载体可为溶剂或分散介质，其包括但不受限于水；乙醇；多元醇诸如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇以及其类似物；以及其组合。可用各种不同的方法例如使用涂层(例如卵磷脂)、保持分散体内需要的颗粒大小以及使用界面活性剂来保持适当的流动性。
在一些实施例中，可使用等渗剂例如糖；多元醇，包括但不受限于甘露醇、山梨糖醇、甘油和其相互之间的多种组合；以及氯化钠。通过包括延迟吸收的药剂，例如硬脂酸盐、明胶和缓释聚合物，可将持续吸收的特征引入所述组合物。可使用载体来防止活性化合物迅速释放，这些载体包括但不受限于植入物和微囊给药系统中的控释制剂。可使用生物可降解和生物适合的聚合物诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸共聚物(PLG)及其类似物。通常可使用已为本领域技术人员所知的方法制备这些制剂。
可用悬浮液，例如用于注射的油性悬浮液，的形式给予所述化合物。亲脂性溶剂或媒剂包括但不受限于脂肪油，例如芝麻油；合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯；以及脂质体。可用于注射的悬浮液还可包含增强该悬浮液的粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐(dextran)。可选地，悬浮液可包含稳定剂或增强所述化合物的溶解性并允许制备高浓度溶液的药剂。
在一个实施例中，可通过以下制备无菌和注射用溶液：将有效分量的活性化合物加入带有上述任何一种需要的附加成分或其组合的溶剂，过滤，然后将该溶液消毒。在另一实施例中，可通过将活性化合物加入包含分散介质和上述任何一种需要的附加成分或其组合的无菌媒剂来制备分散体。可通过真空干燥、冷冻干燥或其组合来制备用于无菌和注射用溶液的无菌粉末，从而产生可包括所述活性成分和任何需要的附加成分的粉末。而且，所述附加成分可来自分别制备的无菌和滤过的溶液。在另一实施例中，可与一种和多种增强所述提取物的溶解性的另外的化合物联合来制备所述提取物。
在一些实施例中，可通过气雾喷雾器或雾化器吸入药剂来给予所述化合物，所述气雾喷雾器或雾化器可包括合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其组合物。在一个例子中，可通过计量阀给予加压气溶胶剂量单位。在另一实施例中，可把例如明胶胶囊和药包用在吸入器中并可将其配制成包含带有合适的粉基，例如淀粉或乳糖的化合物的粉状混合物。
在一些实施例中，有效治疗或有效预防分量的组合物的浓度可为约0.001nM至约0.10M；约0.001nM至约0.5M；约0.01nM至约150μM；约0.01nM至约500μM；约0.01nM至约1000μM或其中的任何范围。在一些实施例中，可给予以下量的所述组合物：约0.001mg/kg至约500mg/kg；约0.005mg/kg至约400mg/kg；约0.01mg/kg至约300mg/kg；约0.01mg/kg至约250mg/kg；约0.1mg/kg至约200mg/kg；约0.2mg/kg至约150mg/kg；约0.4mg/kg至约120mg/kg；约0.15mg/kg至约100mg/kg、约0.15mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg或其中的任何范围，其中被认为对象为人的平均值为约70kg。
本发明包括用来给予一种或多种药剂的缓释制剂。在一些实施例中，所述缓释制剂可减少将该剂给予对象的剂量和/或次数。
在一些实施例中，对于普通体重的人来说，有效分量的本发明的提取物可例如为约10mg/天至约1000mg/天、约50mg/天至约500mg/天、约100mg/天至约250mg/天或其中的任何范围。为治疗恶病质、呕吐或停药症状，或者更改生物反应或保护乙型肝炎中的肝细胞，相似的量在治疗上是有效的。本领域的普通技术人员能够为确定用于特定的疾病的本发明的组合物的有效治疗分量而不需要过度进行与所述技能和本文所公开的内容有关的实验。
可将所述组合物以药物制剂的形式注射给药。在一些实施例中，所述制剂可包括与含水注射用辅料结合的所述提取物。合适的含水的注射用辅料的例子已为本领域的普通技术人员所知，这些例子和配制这些制剂的方法可在标准的参考书如Alfonso AR：Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton Pa.，1985中找到。合适的含水注射用辅料包括水、生理盐水溶液、葡萄糖水溶液以及其类似物，可选地包含为酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物而设的溶解促进剂，例如310％的甘露醇或其他糖类、310％的甘氨酸或其他氨基酸。
通常，在将所述提取物作为造血剂给予时，可通过皮下、肌内、腹腔内或静脉注射给药。在一些实施例中，使用静脉给药，并且可持续进行静脉注射几分钟至一小时或更长时间，例如十五分钟左右。给药量可依制剂类型、单位剂量大小、辅料种类和本领域普通技术人员所熟知的其他因素而变化。所述制剂可包括例如约0.001％至约10％(w/w)、约0.01％至约1％、约0.1％至约0.8％或其中的任何范围，剩余物包括所述一种或多种辅料。
在一些实施例中，可与用于所治疗的疾病状态的至少一种其他的治疗剂联合给予所述提取物，所述治疗剂指特别是能够刺激造血的另一药剂，诸如红细胞生成素、血小板生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、IL-3以及其类似物。在一些实施例中，所给予的有效治疗或有效预防分量的提取物的量可为约0.001mg/kg至约500mg/kg；约0.005mg/kg至约400mg/kg；约0.01mg/kg至约300mg/kg；约0.01mg/kg至约250mg/kg；约0.1mg/kg至约200mg/kg；约0.2mg/kg至约150mg/kg；约0.4mg/kg至约120mg/kg；约0.15mg/kg至约100mg/kg、约0.25mg/kg至约75mg/kg、约0.5mg/kg至约50mg/kg或其中的任何范围，其中被认为对象为人的平均值为约70kg。
可将所述提取物彼此联合或与其他药剂联合给予。在一些实施例中，可以于每隔15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时、48小时或1周的不同时段给予所述药剂。在一些实施例中，所述药剂中至少之一为刺激造血系统的药剂。在其他实施例中，所述药剂可包括抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗有丝分裂剂、抗炎剂、抗血小板剂、抗凝血剂、抗纤维蛋白剂、抗凝血酶剂、抗生素、抗过敏剂、抗氧化剂以及任何的药物前体、相互作用的药物(codrug)、代谢物、类似物、同系物、同族物、衍生物、盐及其相互之间的组合。
可例如与以有效治疗分量给予的造血剂联合给予本文中所教导的提取物。造血剂是刺激造血的分子。造血剂的例子包括但不受限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3和其衍生物。G-CSF的例子包括但不受限于非格司亭(filgrastim)(优保津(NEUPOGEN))和其衍生物，例如乙二醇化非格司亭(PEGFILGRASTIM)。GM-CSF的例子包括沙格莫丁(Sagramostim)(瘤肯(LEUKINE))。红细胞生成素的例子是阿法依泊汀(epoetin alfa)(宜保利血(EPREX))。红细胞生成刺激蛋白的例子是阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)(耐血比(NESP)，使血红升(ARANESP))。
可与本文所教导的提取物联合给予所述造血剂，并且该给予可长达例如30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、3周、4周、6周、3个月、6个月、1年或其任何的组合，或者可使用技术人员认为需要的任何时间。可将所述药剂同时、先后或循环地给予对象。循环治疗涉及给予第一药剂一段预定的时间、给予第二药剂一段预定的时间，以及为任何需要的目的例如增强疗效而重复这一循环。也可同时地给予所述药剂。术语“同时地”(“concurrently”)不受限于在完全相同的时间给予药剂，而是指可按先后和时间间隔给予所述药剂，以便所述药剂可一起起作用来提供额外的好处。可使用任何合适的给予所述一种或多种药剂的方式以任何合适的形式分开或一起给予所述药剂。
在一些实施例中，使用已为本领域技术人员所知的有效的给药量、时段和方法将G-CSF与本文所教导的提取物联合给予。G-CSF可为NEUPOGEN，其例如以约0.1μg/kg至约1mg/kg、约0.5μg/kg至约500μg/kg、约1μg/kg至约250μg/kg、约1μg/kg至约100μg/kg、约1μg/kg至约50μg/kg或其中的任何范围的量给予。
制品
本发明提供了制品，其包括完成、已被包装和贴上标签的医药产品。所述制品包括在合适的器皿或容器，例如玻璃小瓶或其他密封的容器内的合适的单位剂量形式。对适合胃肠外给药的剂量形式而言，所述活性成分，例如包括本文所教导的提取物的一种或多种药剂，为无菌的并适合将其作为去除微粒溶液给药。换言之，本发明包括注射液和冻干的粉末，其各自是无菌的，并且后者适合在注射前再加水使其复原。或者，所述单位剂量形式可为适合口服、经皮、局部或粘膜给药的固体。
在一些实施例中，所述单位剂量形式适合静脉、肌内、局部或皮下给药。因此，本发明包括溶液，其优选是无菌的，并适合各种给药途径。本发明包括如本文所述的所给予的药剂的浓度和量。
与任何医药产品一样，可将包装材料和容器设计成在储存和运输过程中保护产品的稳定性。此外，制品可包括使用说明书或建议使用者，例如医生、技术人员或患者如何适当地将所述组合物作为对相关疾病的预防性、治疗性或改善性治疗而给予的其他知识资料。在一些实施例中，说明书可显示或建议包括但不受限于实际剂量和监测程序的给药方案。
在其他实施例中，所述说明书可包括显示了给予所述组合物可能产生的副作用的知识资料，所述副作用包括但不受限于过敏反应，例如过敏性休克(anaphylaxis)。所述知识资料可表明过敏反应可仅表现为轻度瘙痒的皮疹，或可能是严重的，包括红皮病、脉管炎、过敏性休克、斯-琼氏综合症及其类似的病症。所述知识资料应表明过敏性休克能致命，并可在将任何外源蛋白被引进入体内时发生。所述知识资料应表明这些过敏反应可能表现为风疹、皮疹并发展成致命的系统反应，并且其可能在暴露诸如不超出10分钟之后很快发生。所述知识资料可进一步表明过敏反应可致使对象经受感觉异常、低血压、喉水肿、精神状态变化、面部或咽部血管性水肿、气道阻塞、支气管痉挛、风疹和瘙痒、血清病、关节炎、过敏性肾炎、肾小球肾炎、颞动脉炎、嗜酸性粒细胞增多症或其组合。
在一些实施例中，制品可包括一种或多种包装材料，诸如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉输液(I.V.)袋、包膜(envelope)以及类似物；以及在所述包装材料内的至少一种单位剂量形式的包含本文所教导的提取物的药剂。在其他实施例中，所述制品还可包括将所述组合物用作相关疾病的预防性、治疗性或改善性治疗的说明。
在其他实施例中，所述制品可包含一种或多种包装材料，诸如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉输液(I.V.)袋、包膜以及其类似物；以及在所述包装材料内的第一组合物，该组合物包含至少一个单位剂量形式的包含本文所教导的提取物的药剂，以及第二组合物，该第二组合物包含第二药剂，例如粘多糖、磷脂、(聚)亚烃基二醇或其他本文所教导的生物活性剂，或者任何药物前体、相互作用的药物、代谢物、类似物、同系物、同族物、衍生物、盐及其相互之间的组合。在其他实施例中，制品也可包括将所述组合物用作相关疾病的诊断性、预防性、治疗性或改善性治疗的说明。
本发明不意指受限于任何理论或作用机制，提供了以下例子以进一步说明本文所展示的教导。应该理解的是预期得到在本领域的技术内有多个变体，并且不打算将所述例子理解为其限制了权利要求。
例1制备Ara∶Gal为约1.5∶1至约3∶1、平均分子量为约20千道尔顿至约60千道尔 顿的黄芪提取物(“纯化提取物”或EP011)
所述纯化提取物的分子量为20-60千道尔顿，带有70-90％的葡萄糖组分。
所述纯化提取物由内蒙古的黄芪根的薄片制备而成。先用去离子水，然后用超滤水清洁干燥的根(300kg)，将其加工成薄片。去除被污染的表面部分，把根切成2-5mm厚的薄片。然后将所述薄片消毒并干燥。
在3吨的水提取物中将所述薄片(200kg)在100℃用三个小时提取3次。将所得的水提取物混合，然后在减低的压力下在60-70℃将其浓缩30-40倍。将所得的水提取物用70％的乙醇沉淀两次，用35％的乙醇沉淀一次。将乙醇沉淀物溶解在水中并进行喷雾干燥以产生多糖中间体。
将所述多糖中间体(3.0kg)溶解在水中，微滤，超滤，接着先用阳离子交换柱，然后用阴离子交换柱将其纯化。将需要的洗脱液微滤和超滤，之后进行最后的浓缩。最终将浓缩物大量地冻干以在混合之后产生所述纯化提取物。
所述纯化提取物包括葡聚糖的多糖、鼠李半乳醛酸聚糖(rhamnogalacturonans)(RGs)的多糖、阿拉伯半乳聚糖(AGs)的多糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白的糖蛋白，其均重分子量为20,000-60,000道尔顿。该原料药是无味、似是白色的、非晶态粉末。其易溶于pH值为4.5-6.5的水和生理盐水，微溶于低浓度的乙醇，不溶于有机溶剂如丙酮。
存在于所述纯化提取物中的聚糖和糖蛋白的结构是以以下的组合为特征和说明的：利用TMS-GLC(三甲基硅烷化)得出的糖残基组分、利用GLC-MS(气相层析-质谱联合法)，核磁共振氢谱(1H-NMR spectroscopy)得出的甲基化合糖基连接组分、利用AA分析器得出的的氨基酸组分以及利用尺寸排阻HPLC(高压液相层析法)得出的MW分布。通过糖组分分析，测定主要的糖残基为葡萄糖基(60-85摩尔％)、阿拉伯糖基(5-20摩尔％)和半乳糖苷基(5-15摩尔％)的残基。在该制品中还存在少量(2-5摩尔％)的半乳糖醛酸和鼠李糖。糖基连接分析显示了葡萄糖残基的主要糖基连接在末端，是4-、6-和4，6-位连接的；阿拉伯糖残基的糖基连接在末端，是5-、3-和3，5-位连接的；半乳糖残基的糖基连接在末端，是3-、6-和3，6-位连接的；半乳糖醛酸是4-位连接的；以及鼠李糖残基是2-位连接的。氨基酸组分分析显示了存在于该制品中的糖蛋白富含Hyp、Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Val和Lsy残基。
分析纯化提取物
糖残基组分分析如表1所示。所述纯化提取物中的多糖主要包含葡萄糖基、阿拉伯糖基和半乳糖基的残基。在所述纯化提取物中仅有少量的鼠李糖和半乳糖醛酸。所述纯化提取物的糖残基组分通过利用GLC分析全-O-三甲基硅化的甲基葡糖苷(per-O-trimethylsilylated methyl glycosides)来测定。使用HP-5890气相层析在J&WScientific DB-1柱(0.25mm x 30m)中分离衍生物。
表1纯化提取物中的糖残基组分
Figure BDA0000079803070000221
基于表2中提供的糖基连接组分和核磁共振氢谱分析，所述制品中主要的多糖为1，4-位连接的葡聚糖，其在主链残基的6位有特定的支化度。存在于所述纯化提取物中的其他多糖是彼此交联的阿拉伯半乳聚糖和鼠李半乳醛酸聚糖。利用甲基化分析测定糖基连接。用丁基锂和碘甲烷将在Me2SO中的样本甲基化。使用SepPak C18柱将甲基化的样本纯化，用三乙基硼化锂还原uronosyl残基的羧甲基团。然后，制备和利用HP 5971MSD-5890GLC(联合GLC-MS)分析部分甲基化的醛醇。
表2纯化提取物中的糖基连接组分
Figure BDA0000079803070000222
以下表3中所示的氨基酸组分表明了Hyp、Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala以及Lys是所述纯化提取物中的蛋白的主要氨基酸残基。使用Beckman 6300氨基酸分析仪以胶原水解物分析方法来分析所述纯化提取物的氨基酸组分。利用6N HCL在110℃将样本水解24小时，稀释，然后注射进HPLC系统。
表3纯化提取物中的氨基酸组合物
  氨基酸残基   摩尔％   氨基酸残基   摩尔％
  Hyp   9.7   Val   4.5
  Asp   14.4   Met   0.4
  Thr   8.9   lle   2.1
  Ser   8.9   Leu   3.1
  Glu   11.0   Tyr   1.0
  Pro   4.2   Phe   1.0
  Gly   9.7   His   2.1
  Ala   9.0   Lys   8.1
  Cys   0.3   Arg   2.0
由于所述制品的给药途径是通过注射，所以去除内毒素对于所述纯化提取物的制作是至关重要的。所述制品中的一些多糖在结构上与内毒素LPS相近。因而重要的是一开始就将内毒素拒之门外而不是在生产过程中再将其去除。
例2制备高收率的、Ara∶Gal在约3.5∶1至约5.0∶1、平均分子量大于约100千道尔 顿的黄芪提取物(“高收率提取物”或EP011AM)
利用较温和的酸性条件使得Ara∶Gal比例＞3.5和提取物的收率比本文所教导的纯化提取物或高分子量提取物的收率要高得多。在一些实施例中，在该高收率时Ara∶Gal比例低于5.0。
用内蒙古的黄芪的根的薄片制备所述高收率提取物。先用去离子水，接着用超滤水清洁干燥的根，将其加工成薄片。去除被污染的表面部分，把根切成2-5mm厚的薄片。然后，将所述薄片消毒并干燥。
首先用0.5M的KH2PO4在100℃将所述薄片提取3小时，然后用水在100℃将所述薄片提取3个小时，重复所述提取过程。将混合后的提取物离心分离并进行超滤。将所得的溶液浓缩，先用35％的乙醇，后用80％的乙醇进行沉淀。将80％的乙醇沉淀物溶于水中并进行喷雾干燥，以得到粗提取物。
将所述粗提取物首先通过SP阳离子交换层析柱，然后通过Q阴离子交换层析柱。将洗脱物超滤。
在浓缩之后，将所得的洗脱物用盐酸(浓度为0.3M)在22℃水解3小时。在进行中和、超滤和冻干之后，基于所述粗提取物得到了收率为3.3％的高收率提取物。
分析高收率提取物
利用TMS-甲基糖苷衍生物的GLC来测定所述糖残基组分。Ara、Gal、GalA和Glc是原料药中主要的糖残基。以下表4显示了所述糖残基组分的结果。
表4高收率提取物中的糖基连接组分
  糖残基   摩尔％
  Ara   57.0
  Rha   8.2
  Xyl   2.7
  GalA   13.8
  Gal   13.1
  Glc   4.7
  4-0-Me-GlcA   0.4
请注意Ara∶Gal比例是4.35。利用BCA蛋白微量分析法来测定蛋白含量。以下表5显示了所述高收率提取物的蛋白含量。
表5高收率提取物中的蛋白含量
  样本   蛋白含量(％)
  AGP-P-05   0.67
利用比色法来测定所述高收率提取物的羟脯氨酸含量，其显示在以下表6中。
表6高收率提取物的羟脯氨酸含量
  样本   Hyp(％)
  AGP-P-05   0.34
例3通过利用较温和的酸性条件进行提取来提高收率
本例子显示了可使用较温和的酸性条件来提高所述有用的提取物的收率。利用0.5M HCl、6小时的水解时间和22℃的条件生产第一提取物；将第一提取物的收率与利用0.3M HCl、3小时的水解时间和22℃的较温和的酸性条件所生产的第二提取物和第三提取物的收率进行比较。表7显示了在利用较温和的条件时收率被大幅地提高。
表7利用较温和的条件所提高的提取物的收率
Figure BDA0000079803070000251
例4通过将所述纯化提取物给予接受亚致死性放射的哺乳类动物来提高血小板水平
本例子显示了所述纯化提取物刺激接受了亚致死剂量的x射线的哺乳类动物的血小板水平。本实验中使用了BALB/c小鼠，一部分小鼠在第0天接受了500cGy亚致死剂量的x-射线，其引起血小板水平的降低和血小板减少症。测量以下小鼠的血小板水平：(a)正常组小鼠，未经受放射或给予所述纯化提取物；(b)对照组小鼠，接受X射线，仅伴有腹腔内注射生理盐水；(c)实验组小鼠，接受X射线，伴有注射10次250mg/kg的所述纯化提取物的生理盐水，该注射始于放射的第0天，持续至实验的第14天，每周5次；以及(d)实验组小鼠，接受x射线，伴有100mg/kg/天的所述纯化提取物而其始于放射的第0天，持续每天进行至实验的第25天。
在接受10次皮下注射250mg/kg的所述纯化提取物的生理盐水，每周5次，始于放射的第0天，持续至实验的第14天的小鼠中，所述亚致死剂量的x射线降低了在第10天首次测量的血小板水平。在对比对照组和接受100mg/kg/天的纯化提取物而其始于放射的第0天并持续至实验的第25天的实验组小鼠时，所述纯化提取物在第14天显示了血液中的血小板水平上升，而且，用EP011治疗的小鼠的血液中所发现的低血小板水平与对照组之间的差异在第14天后增大并且该差异一直到第25天都依然明显。因此，所述纯化提取物提高了受到亚致死放射的小鼠的血液中的血小板水平并促进了放射治疗后血小板水平的恢复。
例5通过将所述高收率提取物给予(仅给予所述高收率提取物，与仅给予造血剂对比) 接受过亚致死放射的哺乳类动物来提高血小板水平
本例子显示了所述高收率提取物刺激了接受过500cGy亚致死剂量的x射线的哺乳类动物的血小板水平。本实验中使用了BALB/c小鼠，一部分小鼠在第0天接受了500cGy亚致死剂量的x射线。测定以下小鼠的血小板水平：(a)正常组小鼠，未经受放射或给予所述高收率提取物；(b)对照组小鼠，接受x射线，仅伴有腹腔内注射生理盐水；(c)实验组小鼠，接受x射线，伴有250mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水；(d)实验组小鼠，接受x射线，伴有100mg/kg/天的所述高收率提取物；(e)实验组小鼠，接受x射线，伴有50mg/kg/天的所述高收率提取物；以及(f)实验组小鼠，接受x射线，伴有G-CSF治疗。第0-4天每天都以皮下注射给予所述高收率提取物，然后3次/周，注射三周，在第7-9、14-16和21-23天给予所述高收率提取物。
图1显示了在根据一些实施例给予亚致死剂量的放射之后，BALB/c小鼠的血小板水平对所述高收率提取物的反应。从图1可见，x射线导致血小板水平降低，从而导致在放射后约10天血小板水平降低和出现血小板减少症。用250mg/kg的所述高收率提取物的生理盐水进行治疗，始于第0天，每周5次，注射10次。所述高收率提取物是有效的，其比所述生理盐水对照组早3-5天恢复了正常的血小板数目的50％，因此该治疗增加了受过亚致死放射的小鼠的血液中的血小板的量并促进了放疗后血小板的恢复。为进行对比，图1显示了G-CSF(NEUPOGEN)的功效。
例6通过将所述高收率提取物给予(仅给予所述高收率提取物和与造血剂联合给予)接 受过化疗的哺乳类动物来提高血小板水平
本例子显示了给予所述高收率提取物通过刺激血小板水平而加快从化疗中恢复，从而对化疗引起的血小板减少症进行治疗。
测定以下小鼠的血小板水平：(a)正常组小鼠，未接受化疗或给予所述高收率提取物；(b)对照组小鼠，接受静脉注射化疗，仅伴有腹腔内注射生理盐水；(c)实验组小鼠，接受化疗，伴有皮下注射200mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水；(d)实验组小鼠，接受化疗，伴有皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水；(e)实验组小鼠，接受化疗，伴有皮下注射400mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水；(d)实验组小鼠，接受化疗，伴有200μg的G-CSF的生理盐水；以及(e)实验组小鼠，接受化疗，伴有皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水和200μg的G-CSF的生理盐水。
使用的小鼠为BALB/c小鼠，用4mg/kg的丝裂霉素C(MMC)给小鼠静脉注射两次，一次在第“-1”天，一次在第0天。所述小鼠还接受7次250mg/kg/天的所述高收率提取物的皮下注射，从第0天至第6天，每天一次。
图2显示了根据一些实施例在向BALB/c小鼠注射丝裂霉素7天之后丝裂霉素诱发了血小板减少症。至第26天实验结束时，仅使用生理盐水治疗的对照组小鼠恢复到正常的血小板数目的60％，或约300×103/μL，而使用所述高收率提取物治疗的实验组小鼠在大约第10天达到了正常血小板数目的60％，并且在大约第19天达到了正常血小板数目的100％，这里指的正常的血小板数目为约500×103/μL。因此，所述高收率提取物使得化疗所引起的血小板减少症中的血小板恢复。
所述高收率提取物加快了经受化疗后的血小板或巨核细胞的恢复。尽管图2强调了使用化疗和上述提取物的量所得的相似结果，但未显示的数据说明了MMC治疗通常在第3天导致血小板数目减少，并在第10天前后到达为基础血小板数目水平的25％的最低点。用生理盐水治疗的对照组小鼠在第24天仅恢复到基础血小板数目水平的50％，而用200-400mg/kg/天的所述高收率提取物治疗的实验组小鼠在第10天恢复到基础血小板数目水平的约40-50％，并且此后继续恢复血小板数目。在用400mg/kg/天的所述高收率提取物治疗的小鼠中，血小板数目在第21天达到基础血小板数目水平的100％，而仅接受生理盐水的对照组小鼠仍处于基础血小板数目水平的约50％。所述高收率提取物将血小板减少症的持续时间从仅接受生理盐水的对照组小鼠的6天减至接受所述高收率提取物的实验组小鼠的0天。
在图2中，接受G-CSF(NEUPOGEN)的小鼠或始于第0天注射了7次200μg的NEUPOGEN的生理盐水，或始于第0天皮下注射了7次250mg/kg的200μg的所述高收率提取物和NEUPOGEN的生理盐水。结果显示，当与仅接受其中一种治疗的小鼠相比，将所述高收率提取物和NEUPOGEN联合起来使用加快了血小板的恢复，并且该联合治疗使得快速地在第10天就得到正常的对照血小板水平。一个尤其有趣的发现是所述高收率提取物和联合治疗的表现都胜过仅G-CSF给药，其未能在第26天后实验结束时达到正常的血小板水平。然而，将G-CSF与所述高收率提取物联合起来使用要比仅给予所述高收率提取物来得到正常的血小板数目早约9天。
因此，将所述高收率提取物给予患有化疗引起的血小板减少症的哺乳类动物至少(1)消除了严重的血小板减少症，其被定义为血小板数目＜200×10-9/L；(2)大体上降低血小板减少病症的血小板最低点的严重程度；(3)缩短血小板减少病症的持续时间；(4)以剂量依赖方式加快血小板的恢复；以及(5)通过同时给予G-CSF而使血小板显著地恢复。
例7通过将所述高收率提取物给予接受过亚致死放射的哺乳类动物来刺激白细胞的 产生
本例子显示了可使用所述高收率提取物来刺激经受放射的哺乳类动物的白细胞的恢复，所述哺乳类动物的骨髓功能或造血受到抑制。这样，所述提取物可在降低的白细胞水平上有帮助，否则该哺乳类动物可能易受感染。
本例子显示了所述高收率提取物刺激了接受过亚致死剂量的x射线的哺乳类动物的白细胞的恢复。本实验中使用了BALB/c小鼠，一部分小鼠在第0天接受了500cGy亚致死剂量的x射线。测量以下小鼠的细胞数目：(a)正常组小鼠，未经受放射或给予所述高收率提取物；(b)对照组小鼠，接受x射线，仅伴有腹腔内注射生理盐水；(c)实验组小鼠，接受x射线，伴有10次250mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水，每周5次，始于第0天，持续至实验的第14天；(d)实验组小鼠，接受x射线，伴有200μg的G-CSF的生理盐水，始于放射的第0天，持续至实验的第26天。
图3显示了在根据一些实施例给予所述高收率提取物之后，受到放射的BALB/c小鼠的白细胞的恢复。在放射后第7-10天小鼠经历严重的白细胞减少症，这时小鼠显示其白细胞数目为约600-1000/μl。所述高收率提取物使得白细胞在约21-25天后恢复，而仅用生理盐水治疗的对照组小鼠的白细胞数目在实验结束时还未恢复。分类计数表明了所述高收率提取物同样使得淋巴细胞恢复。
因此，对比图3和图2，可看到所述高收率提取物加快白细胞的恢复、缩短白细胞减少症的持续时间，并且增加经受亚致死剂量的x射线的BALB/c小鼠的血小板数目。
例8通过同时给予所述高收率提取物和刺激造血的药剂来加快经受放射诱发的血小 板减少症的哺乳类动物的血小板恢复
本例子显示同时给予所述高收率提取物和G-CSF可刺激受到亚致死放射的BALB/c小鼠的血小板的产生。
本实验中使用了BALB/c小鼠。一部分小鼠在第0天接受了500cGy亚致死剂量的x射线。测定以下小鼠的血小板水平：(a)正常组小鼠，未经受放射或给予所述高收率提取物；(b)对照组小鼠，接受x射线，仅伴有腹腔内注射生理盐水；(c)实验组小鼠，接受x射线，伴有皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水，始于放射的第0天，每天一次，注射7次；(d)实验组小鼠，接受x射线，伴有同时皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物和1μg/kg G-CSF的生理盐水，始于放射的第0天，每天一次，注射7次；(f)实验组小鼠，接受x射线，伴有同时皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物和100μg/kg G-CSF的生理盐水，始于放射的第0天，每天一次，注射7次。
图4显示了根据一些实施例，当同时注射所述高收率提取物和G-CSF时，经受放射的BALB/c小鼠的血小板数目的恢复速度。当用所述高收率提取物和1μg/kg的G-CSF或100μg/kg G-CSF同时注射时，恢复速度几乎是相同的。两组小鼠都在第15天恢复到正常的血小板数目的约50％，而仅接受所述高收率提取物的小鼠在第18天恢复到正常的血小板数目的约50％。相比之下，对照组小鼠到约第22天达到正常的血小板数目的50％。
例9通过同时给予所述高收率提取物和刺激造血的药剂来加快受到亚致死剂量的x射 线的哺乳类动物的白细胞恢复
本例子显示了同时给予所述高收率提取物和G-CSF可刺激受到亚致死放射的BALB/c小鼠的白细胞的产生。
本实验中使用了BALB/c小鼠。一部分小鼠在第0天接受了500cGy亚致死剂量的x射线。测定以下小鼠的血小板水平：(a)正常组小鼠，未经受放射或给予所述高收率提取物；(b)对照组小鼠，接受x射线，仅伴有腹腔内注射生理盐水；(c)实验组小鼠，接受x射线，伴有皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物的生理盐水，始于放射的第0天，持续至本实验的第14天，每周注射5次，注射10次；(d)实验组小鼠，接受x射线，伴有同时皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物和100μg/kg G-CSF的生理盐水，始于放射的第0天，持续至本实验的第14天，每周注射5次，注射10次；以及(e)实验组小鼠，接受x射线，伴有同时皮下注射250mg/kg/天的所述高收率提取物和1μg/kg G-CSF的生理盐水，始于放射的第0天，持续至本实验的第14天，每周注射5次，注射10次。
图5显示了根据一些实施例，当同时注射所述高收率提取物和G-CSF时，经受放射的BALB/c小鼠的白细胞数目的恢复速度。放射明显地减少了白细胞。仅注射所述高收率提取物引起缓慢的白细胞的恢复速度。并且，尽管图5并未显示，当用所述高收率提取物和1μg/kg G-CSF或100μg/kg G-CSF同时注射时，恢复速度亦几乎相同。该同时注射导致正常的白细胞数目在第15天产生了一个短暂的峰值，而仅注射所述高收率提取物使得恢复到正常数目的50％。从第18天直至本实验结束时，同时注射和仅给予所述高收率提取物没有造成多大差别。两种治疗都显示了正常数目的60％并在第29天达到正常数目而完全恢复了。仅接受生理盐水的对照组小鼠在第29天显示了正常的白细胞数目的40％。
例10治疗台湾的ITP患者
使用本文所教导的纯化提取物通过两个平行的研究群在持续进行的、开放式的、多中心的和剂量探索的试用中对人进行治疗。在患有慢性特发性血小板减少症的对象中评估使用所述提取物治疗的安全性和功效。在台湾两个首位的医疗中心进行所述试用。
图6显示了在台湾进行临床试用的流程图，在这里根据美国血液学协会(ASH)准则将患者诊断为患有慢性特发性血小板减少症。如图6所示，ASH准则包括使用纳入和排除标准筛检605至少六个月。而且，在六周的研究时间内，允许所有患者服用皮质类固醇或先于本研究制订的其它疗法。该研究进一步包括将患者随机指派610到四个研究组中的其中之一。
该研究进一步包括在首两周通过两种方案的其中之一给予615所述纯化提取物：(方案1)静脉注射500mg的所述提取物约3小时(2.5至3.5小时)，每周连续五天；或者(方案2)静脉注射500mg的所述提取物约3小时(2.5至3.5小时)，每周三天。下一步包括评估620其反应：(1)如果患者的血小板数目在第15天被提高到或高于75×109/L，但低于450×109/L，所述治疗包括停止620在接下来的两周给予所述提取物；以及(2)如果患者的血小板数目在第15天未能被提高到或高于75×109/L，但低于450×109/L，所述治疗包括再继续给予所述提取物两周。
在该研究的第五和第六周时，当不予625所述提取物时，对患者进行随访。在所述研究期间的任何时候，如果血小板数目升高到450×109/L或更高，患者停止再接受任何该提取物并接受监测直至完成630该研究。万一发生严重流血，则使用并记录下所指定的救援疗法，包括IVIG、类固醇、血小板输注。允许进行非ITP相关的疾病所需要的其它治疗。
基于本研究的结果，所述提取物在增加ITP患者的血小板数目上看起来是安全有效的。
例11治疗中国的ITP患者
在中国，所述纯化提取物被用于慢性和难治疗的IPT病例研究中。患者已被诊断为ITP患者多年，而没有进行有效的治疗，其包括脾切除术。用脱氢皮质或曲安西龙治疗患者多年以维持血小板数目，记录了多次出血事件。在治疗阶段结束时，用曲安西龙联合所述提取物(250mg/天)治疗患者两周，每天一次。如表8所示，经过两周的治疗后，患者的血小板数目从44×109/L恢复到110×109/L。
表8
Figure BDA0000079803070000311
Figure BDA0000079803070000312
Figure BDA0000079803070000321
本结果提供的恢复大大超过使用类固醇的传统疗法，并且还在服用所述提取物后三个月显示了持久效果。当血小板数目接近正常时，再给予额外剂量的所述提取物两周。在接下来的三个月中，由于所述提取物似乎运用了自反馈机制去限制血小板数目超射，所以血小板数目没有超射，这是非常重要的。
例11治疗ITP患者-个体研究
本研究的目的是评估所述纯化提取物对患有慢性特发性血小板减少症(ITP)的个别患者，包括患有ITP六个月或更久并一直用维持性ITP治疗的患者，的功效和安全。该研究是开放式的、随机的，有两个研究队列。主要终点是血小板数目反应。
女性患者(R01001)被诊断为患有ITP超过10年，并已使用脱氢皮质(10mg QD)进行治疗。该患者接受了所述纯化提取物5天/周，达4周，结果如表9所示。
表9
Figure BDA0000079803070000322
应该理解的是所述血小板数目为基线的两倍，并在用所述纯化提取物作为该治疗的反应物进行治疗之后恢复到23,000。未发生不良事件。
女性患者(R02001)，46岁，被诊断为患有ITP超过5年，并已使用脱氢皮质(20mgQD)进行治疗。该患者接受了所述纯化提取物5天/周，达3周，结果如表10所示。
表10
Figure BDA0000079803070000331
应该理解的是在用所述纯化提取物治疗之后所述血小板数目恢复到11,000。未发生不良事件。
男性患者(R01002)，61岁，被诊断为患有ITP超过10年，并已使用脱氢皮质(10mgQD)进行治疗。该患者接受了所述纯化提取物3天/周，达2周，结果如表11所示。
表11
  日期   研究进度   血小板数目(10^3/ul)
  2009-05-18   第1天   37,000(基线)
  2009-05-25   第8天   11，000
  2009-06-01   第15天   84,000
  2009-06-03   第17天   58，000
  2009-06-08   第22天   55，000
  2009-06-15   第29天   31，000
  2009-06-29   第43天   14，000
应该理解的是在用所述纯化提取物作为该治疗的反应物治疗之后，所述血小板数目从37,000恢复到84,000。未发生不良事件。
最后，女性患者(R02002)，60岁，被诊断为患有ITP约4年，并已使用脱氢皮质(15mg QD)进行治疗。该患者接受了所述纯化提取物3天/周，达3周(治疗持续进行)，结果如表12所示。
表12
  日期   研究进度   血小板数目
  (10^3/ul)
  2009-07-06   第1天   8,000(基线)
  2009-07-13   第8天   6，000
  2009-07-20   第15天   54,000
  不良事件
  2009-07-06   第1天   过敏反应
  2009-07-08   第3天   皮疹
应该理解的是在用所述纯化提取物作为该治疗的反应物治疗之后，所述血小板数目从8,000恢复到54,000。

Claims (23)

1.一种由黄芪的根中分离出来的提取物组成的组合物，其中所述提取物包含：
4.0：1至5.0：1的阿拉伯糖：半乳糖比例；
5%至10%的鼠李糖；
15%至20%的半乳糖；
10%至20%的半乳糖醛酸；
以重量计不多于2%的蛋白；以及
10%至15%的葡萄糖；
其中使用第一过程制备所述提取物，所述第一过程包括从黄芪中分离出粗提取物以及将该粗提取物用酸温和地处理，该温和地处理包括把浓度0.05M至0.5M的酸在温度15℃至25℃下用于该粗提取物，时间1小时至24小时，其中需选择该酸的使用温度和时间以得到所述的阿拉伯糖：半乳糖比例、所述的半乳糖含量以及所述的葡萄糖含量；
并且其中所述提取物的收率比使用第二过程所产生的黄芪提取物的收率高得多，所述第二过程包括把酸用于该粗提取物，所选择的温度和时间是为求得到小于3.5：1的阿拉伯糖：半乳糖比例、20%-35%的半乳糖以及小于10%的葡萄糖的温度和时间。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述黄芪为蒙古黄芪或膜荚黄芪。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述黄芪生长在中国的内蒙古或山西省。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述根来自生长了两年的黄芪属植物。
5.如权利要求1所述的组合物，其带有至少100千道尔顿的重均分子量。
6.如权利要求1所述的组合物，其带有以重量计至少80%的碳水化合物。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述酸是三氯乙酸或盐酸。
8.如权利要求1所述的组合物，其水溶液的pH值为4.5至6.5。
9.如权利要求1所述的组合物，进一步为刺激造血的药剂。
10.如权利要求1所述的组合物，进一步为选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物的药剂。
11.含水的注射用制剂，为有效治疗分量的权利要求1所述的组合物和含水的注射用辅料。
12.制备如权利要求1的提取物的方法，步骤为：
从黄芪中分离出粗提取物并将该粗提取物用酸温和地处理；
所述温和地处理包括把浓度0.05M至0.5M的酸在温度15℃至25℃下用于该粗提取物，时间1小时至24小时，其中需选择该酸的使用温度和时间，以得到4.0：1至5.0：1的阿拉伯糖：半乳糖比例；5%至10%的鼠李糖；15%至20%的半乳糖；10%至20%的半乳糖醛酸；10%至15%的葡萄糖；以及以重量计不多于2%的蛋白。
13.一种有效分量的从黄芪中提取的阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物，所述组合物如权利要求1所述的组合物作为制备治疗特发性血小板减少性紫癜的药物中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，可进一步給予一第二活性剂，其中与所述第二活性剂联合给予酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述第二活性剂选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物的药剂。
16.如权利要求14所述的应用，其中所述第二活性剂为粒细胞集落刺激因子。
17.如权利要求13所述的应用，其中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物的重均分子量为至少100千道尔顿。
18.如权利要求13所述的应用，其中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物被酸改性为包括
4.0：1至5.0：1的阿拉伯糖：半乳糖比例；
约5%至约10%的鼠李糖；
约15%至约20%的半乳糖；
约10%至约20%的半乳糖醛酸；
以重量計不多于2%的蛋白质以及
约10%至约15%的葡萄糖。
19.如权利要求18所述的应用，其中所述酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白的阿拉伯糖：半乳糖比例为4.0：1至4.5：1。
20.如权利要求18所述的应用，其中所述酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白的重均分子量大于100千道尔顿。
21.如权利要求18所述的应用，可进一步給予一第二活性剂，其中与所述第二活性剂联合给予所述酸改性阿拉伯半乳聚糖蛋白组合物。
22.如权利要求20所述的应用，其中所述第二活性剂选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和红细胞生成刺激蛋白、血小板生成素、白细胞介素-3以及其衍生物。
23.如权利要求20所述的应用，其中所述第二活性剂为粒细胞集落刺激因子。
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