JP6961020B2 - ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、アクテイン、デオキシアクテインの使用 - Google Patents
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Description
ショウマは同仁堂前門本社から購入される。参考文献(潘瑞楽、陳迪華、斯建勇、趙暁宏、沈連鋼、『ショウマ地上部のサポニン類成分についての研究(升麻地上部分○○類成分研究)』、薬学学報、2002年、37(2):117−120)の方法に従ってトリテルペノイドサポニンの抽出を行う(訳注:丸括弧で示した前述の参考文献の正式名称は本来は簡体字表記、「○○」はサポニンを意味する二文字の中国語、一文字目は「白」の下に「七」、二文字目はくさかんむりの下に「甘」である。)。
試験材料:ConAはSigma社から購入される。アクテインとデオキシアクテインは米国ChromaDex社から購入される。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
割り当て:C57BL/6マウス40匹、雄、18−20g、1日間順応飼育してから、以下の4群にランダムに割り当てる(各群10匹):ConAモデル群、トリテルペノイドサポニン群、アクテイン群、デオキシアクテイン群。
モデル動物の作製および投与処置:ConA粉末150mgを秤量し、滅菌PBS40mLを加えて溶解し、室温下で時々軽く振盪しながら1〜2時間放置し、低温超音波によって溶解を促進し(毎回5分以下)、過度の発泡を避けるように注意する。完全に溶解してから、正確に50mLとし、濃度が3mg/mLになるように調製し、0.45μmのフィルタで加圧濾過する。25mg/kgに従ってマウスに単回静脈内注射し、各マウスに100μL注射する。アクテインとデオキシアクテインを4mgずつ取り、滅菌二段蒸留水10mLを加えて溶解し、濃度が0.4mg/mLになるように調製する。ConAモデル群は、蒸留水250μLを強制経口投与し、トリテルペノイドサポニン群は、調製例1のショウマトリテルペノイドサポニン抽出物250μLを強制経口投与し、投与量は15mg/kgであり、アクテイン群は、アクテイン溶液250μLを強制経口投与し、投与量は5mg/kgであり、デオキシアクテイン群は、デオキシアクテイン溶液250μLを強制経口投与し、投与量は5mg/kgであり、動物の96時間以内の死亡率を観察する。
試験材料および動物は実験例1と同様である。
割り当て:C57BL/6マウス、雄、18−20g、1日間順応飼育してから、以下の5群にランダムに割り当てる:正常対照群、ConAモデル群、トリテルペノイドサポニン群、アクテイン群、およびデオキシアクテイン群。
モデル動物の作製および投与処置:正常対照群を除き、ConA 15mg/kgの投与量に応じてマウスに単回静脈内注射する。各投与群の投与量は実験例1と同様である。
(1)各投与群の薬物によるConAモデルマウス血清中のALT、ASTへの作用を調べる。各群8匹ずつをConA注射10時間後麻酔下で屠殺し、末梢血を採取して血清を分離し、ALT、ASTを測定する。
(2)各投与群の薬物によるConAモデルマウス肝臓の病理的損傷への作用を調べる。各群3匹ずつをConA注射10時間後麻酔下で屠殺し、肝臓左葉を摘出し、約5mm3のサイズで切り、10%ホルマリン溶液に浸し、脱水、透徹・パラフィン浸透、包埋、薄切、伸展、染色を行ってから観察する。
(3)各投与群の薬物によるConAモデルマウスの血清サイトカインの分泌への作用を調べる。各群6匹ずつをConA注射3時間後末梢血を採取し且つ血清を分離し、サイトカインTNF−α、IL−12、IL−6、およびMCP−1の分泌能を測定する。ConA注射10時間後血清を分離し、サイトカインIFN−γの分泌能を測定する。
結果を表1に示す。ConAモデル群は正常群に比べALT、ASTが顕著に上昇する(**、p<0.01;***、p<0.001)。各投与群のALT、ASTはいずれも顕著に低下し、ConAモデル群に比べ統計的有意差が認められる(#、p<0.05;##、p<0.01;###、p<0.001)。ショウマトリテルペノイドサポニン抽出物、アクテイン、およびデオキシアクテインはいずれもConAマウスの肝損傷を軽減できると考えられる。
結果を図2示す。ConAモデル群マウスの肝細胞が広範囲な変性を呈し、肝小葉の構造に乱れが認められ、肝細胞の中心静脈が著しく拡張し、中心静脈および肝類洞が著しく充血し、ひいては肝細胞の大きなシート状壊死巣、大量の免疫細胞浸潤が認められる。ショウマトリテルペノイドサポニン群は、ConA群に比べ、肝細胞のシート状壊死巣が著しく軽減し、白血球のやや浸潤が認められる。アクテイン群、デオキシアクテイン群は、ConA群に比べ、肝細胞のシート状壊死巣が著しく軽減し、白血球の浸潤が減少する。
結果を表2に示す。ConAモデル群は、正常群に比べ、TNF−α、IL−12、MCP−1、IL−6およびIFN−γの分泌能が顕著に上昇し、統計学的有意差が認められる(***、p<0.001)。トリテルペノイドサポニン抽出物とアクテインはいずれも血清炎症性サイトカインIL−12、TNF−α、MCP−1、IL−6およびIFN−γの分泌能を著しく低下させることができ、デオキシアクテインはIL−12、MCP−1、IL−6とIFN−γの分泌能を著しく低下させることができると考えられる(#、p<0.05;##、p<0.01;###、p<0.001)。
試験材料:ウシII型コラーゲン酢酸溶液、完全フロイントアジュバントはChondrex社から購入される。イソフェルラ酸は天津一方科技有限公司から購入される。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
割り当て:C57BL/6マウス24匹、雄、18−20g、1日間順応飼育してから、以下の3群にランダムに割り当てる:正常群とCIAモデル群、n=5;アクテイン併用デオキシアクテイン群(以下、アクテインデオキシアクテイン群という)、n=7。
モデル動物の作製および投与処置:2mg/mLウシII型コラーゲン酢酸溶液を調製し、1晩放置してからウシII型コラーゲン酢酸溶液2mLを取り、完全フロイントアジュバント2mLとよく混ぜ乳化させ(氷上操作)、調製されるウシII型コラーゲン乳剤の最終濃度はlmg/mLである。各マウスに0.1mLを皮内注射する。アクテインとデオキシアクテインを4mgずつとり、滅菌二段蒸留水10mLを加えて溶解し、0.4mg/mLアクテインと0.4mg/mLデオキシアクテインとを含有する混合溶液が調製され、アクテインデオキシアクテイン群の投与治療の用に供する。マウス初回免疫21日目から、2回目の免疫を行い、2回目の免疫の0日目から、CIAモデル群は、蒸留水250μLを強制経口投与し、アクテインデオキシアクテイン群は、アクテインとデオキシアクテインの混合溶液250μLを強制経口投与し、投与量は5g/kgであり、1日ごとに強制経口投与し、21日間連続飼育する。
2回目の免疫の0日目から、3日ごとに関節評価を行う。関節評価法によって動物を評価し(0−4段階)、評価の根拠は関節の赤みや腫れの程度および関節の腫脹と変形の状況である。0点:赤みや腫れがない。1点:赤みがあるが腫れがない。2点:関節に軽度の赤みや腫れがある。3点:関節に中程度の赤みや腫れがある。4点:関節に重度の赤みや腫れがあり且つ機能障害を伴う。四肢は別々にスコア付けされ、四肢のスコアの合計が当該マウスの関節炎指数である。最高点は16点である。点数が高ければ高いほど、関節症状が深刻になる。
試験材料と動物は実験例3と同様である。
モデル動物の作製および投与処置:実験例3と同様である。マウスの2回目の免疫の21日目、体重を測る。
試験材料と動物は実験例3と同様である。
モデル動物の作製および投与処置:実験例3と同様である。マウスの2回目の免疫の21日目、麻酔下で屠殺し、脳、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、精巣を摘出し、体重を迅速に測り、臓器指数を評価する。
試験材料と動物:実験例3と同様である。抗II型コラーゲン抗体ELISAキットはChondrex社から購入され、Cytokine&Chemokine 36−Plex Mouse ProcartaPlex(商標)Panel 1A サイトカインおよびケモカイン検出キットはThermoFisher社から購入される。
モデル動物の作製および投与処置:各投与群の投与量は実験例3と同様である。2回目の免疫の21日目、マウスに麻酔をかけ、血清を採取し四肢を切断する。
(1)Micro−CT技術を用いて各投与群の薬物によるCIAモデルマウスの関節構造への作用を調べる。各群からマウスを3匹ずつ取って首の骨を折って処置してから、直ちに右後肢を切り、4%中性ホルマリンで固定する。2−3日間固定してから、生体動物画像診断システムでMicro−CTスキャンを行う。採集部位:マウス右後肢脛骨骨端プレートの上の区域のデータを採集する。3群のデータを採集する。サイズ選択:脛骨骨端プレートの上の部位(0.25*0.25*0.25);骨測定指標のデータを採集する:骨密度、骨体積、骨体積分率および骨梁の数。
(2)各投与群薬物によるCIAモデルマウスの血清抗II型コラーゲン抗体の含有量への作用を調べる。各群7匹、末梢血を採取し且つ血清を分離し、Elisaで抗II型コラーゲン抗体を測定する。
(3)各投与群薬物によるCIAモデルマウスの血清と関節組織のサイトカインの分泌への作用を調べる。各群7匹、末梢血を採取し且つ血清を分離し、多因子により血清サイトカイン:IFN−γ、IL−6、IL−9、IL−12、IL−17A、IP−10、MCP−1、MCP−3、MIP−1α、MIP−1β、Eotaxin、G−CSFの分泌能を測定する;右後肢膝を採取し、関節と足趾などを液体窒素内で急速凍結し、均質化後にタンパク質を抽出し、多因子により組織サイトカインIL−9、IL−18およびMIP−2の分泌能を測定する。
結果を図4に示す。CIAモデルマウス足首の関節構造がぼやけ、骨粗鬆が認められ延いてはひどく破壊し、アクテインデオキシアクテイン群の関節構造がほぼ無傷であり、特に骨の破壊程度がモデル群より著しく軽い。表6に示すように、CIA群マウスは、正常群に比べ、骨密度、骨体積、骨体積分率および骨梁の数はいずれも低下し、アクテインデオキシアクテイン群は、CIAモデル群に比べ、骨測定指標が著しく上昇する。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用は関節破壊を効果的に緩和できると考えられる。
結果を表7に示す。CIA群は、正常群に比べ、抗II型コラーゲン抗体の分泌能が顕著に上昇し、統計学的有意差が認められる(****、p<0.0001)。アクテインデオキシアクテインは血清抗II型コラーゲン抗体の分泌能を顕著に低下させる。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用は自己抗体の分泌能を低下させることができると考えられる。
結果を表8に示す。アクテインデオキシアクテイン群は、CIA群に比べ、血清サイトカインIFN−γ、IL−12、IL−17A、IL−6、IL−9、IL−18、ケモカインMCP−1およびコロニー刺激因子G−CSFの分泌能が顕著に低下し、統計学的有意差が認められる。それと同時に、関節組織中のIL−18とMIP−2の分泌能が顕著に低下し、統計学的有意差が認められる。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用は血清と関節組織中の複数のサイトカイン、ケモカイン、コロニー刺激因子の分泌能を顕著に低下させことができ、広範な抗炎症作用を有すると考えられる。
試験材料と動物:CD3−PerCP、NK1.1−APC抗体、Ki67−PE抗体、細胞内染色キットIntracellular Fixation&Permeabilization Buffer SetはeBioscience社から購入される。B220−FITC抗体はBD Pharmingen社から購入される;その他の試薬はいずれも実験例3と同様である。
モデル動物の作製および投与処置:各投与群の投与量は実験例3と同様である。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
脾臓単細胞懸濁液の調製:C57BL/6マウス麻酔後、マウスの脾臓を分離し、脾臓をPBEB 4mLの入った小さな皿に置き、スライドガラスの粗い面で脾臓を研磨し、400メッシュの濾過用網で脾臓細胞をフローチューブに濾過し、遠心分離して上澄液を除去し、RBC Lysis Buffer 2mLを加え、室温下で15分溶解してから、遠心分離して上澄液を除去し、脾臓細胞が得られる。そしてPBS 1mLを加えて再懸濁し、ピペットで繰り返し吸引・排出して均一になるように混合し、100μLを吸引してフローチューブに入れる。抗CD3、B220、NK1.1抗体を加えて表面染色を行い、4℃下で15分インキュベートしてから、PBEB 2mLを加え、遠心分離して上澄液を除去する。細胞内染色を行う。
細胞内染色:1)細胞固定透過処理液Fixation Buffer 100μLを加え、室温遮光下で、40分固定透過処理する。2)Permeabilization Buffer 1mLを加えて2回洗浄し、上澄液を除去する。3)Ki−67−PE抗体1μLを加えて室温遮光下で40分放置する。4)ステップは2)のステップと同様である。5)フローサイトメーターBD CalibarでCD3−NK1.1+B220−NK細胞におけるKi−67の発現率を測定する。
試験材料:LPSはSigma社から購入される。アクテインとデオキシアクテインは米国ChromaDex社から購入される。FBSは米国PAA社から購入される。DMEM高グルコース培地、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)はPeproTech社から購入される。ELISAキットは米国BD社から購入される。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)の分離と培養:C57BL/6マウス麻酔後、無菌環境下でマウスの両側大腿骨と脛骨を分離し、2mLシリンジを使用して滅菌PBSを吸引し骨髄細胞をフローチューブに流し込み、ピペットで繰り返し吸引・排出し、骨髓単細胞懸濁液とする。遠心分離後、骨髓細胞が得られ、10%FBS、1%グルタミン、1%二重抗体(抗ペニシリン、ストレプトマイシン)を含有する完全培地10mL、および10ng/mL M−CSFを加え、100mm細胞培養用皿に接種し培養し、37度で培養する。4日後上記新鮮な培地に交換し、培養7日目、顕微鏡により大きな体積、付着増殖、分化成熟のマクロファージが観察されることができる。細胞スクレーパーで細胞を掻き落とし、ピペットで繰り返し吸引・排出し均一になるように混合し、単細胞懸濁液としてから、1×105個/ウェルに従って96ウェルプレートに入れる。
BMDM細胞の誘導活性化と投与処置:投与量の異なるアクテインとデオキシアクテインでBMDM細胞を処置し、1時間後100ng/mL LPSで細胞を刺激し、細菌感染によるマクロファージの活性化をシミュレートする。4時間後細胞上澄液を収集し、ELISAでサイトカイン分泌能を測定する。
試験材料:CD45−PE、CD3−FITC、NK1.1−APC抗体、細胞内染色キットIntracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set、細胞刺激剤Cell Stimulation CocktailはいずれもeBioscience社から購入される。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
骨髄単細胞懸濁液の調製:C57BL/6マウス麻酔後、無菌環境下でマウスの両側大腿骨と脛骨を分離し、2mLシリンジを使用して滅菌PBSを吸引して骨髄細胞をフローチューブに流し込み、ピペットで繰り返し吸引・排出し、骨髓単細胞懸濁液とする。遠心分離後、骨髓細胞が得られ、10%FBS、1%グルタミン、1%二重抗体(抗ペニシリン、ストレプトマイシン)を含有する完全培地1.5mLを加える。
投与処置およびNK細胞誘導活性化後の細胞内染色:中濃度の62.5ng/mLアクテインと250ng/mLデオキシアクテインで細胞を処置し、1時間後Cell Stimulation Cocktail(PMA、イオノマイシンとタンパク質輸送阻害剤を含有する)で細胞を5時間刺激し、CD45−PE、CD3−FITC、NK1.1−APC抗体を用いて表面染色を行い、IL−12−APC抗体を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメーターによりCD45+CD3−NK1.1+のNK細胞においてIFN−γを発現する陽性細胞の割合を測定する。
試験材料:実験例9と同様である。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
骨髄単細胞懸濁液の調製:実験例9と同様である。
投与処置およびNK細胞誘導活性化後の細胞内染色:実験例9と同様である。フローサイトメーターによりCD45+CD3−NK1.1+のNK細胞においてIFN−γを発現する陽性細胞の割合を測定する。
試験材料:CD3−PE抗体は米国BD社から購入され、CD4−FITC、CD8−PerCP抗体はeBioscience社から購入される。その他の試薬はいずれも実験例9と同様である。
動物:C57BL/6マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
脾臓単細胞懸濁液の調製:C57BL/6マウス麻酔後、マウスの脾臓を分離し、脾臓をPBEB 4mLの入った小さな皿に置き、スライドガラスの粗い面で脾臓を研磨し、400メッシュの濾過用網で脾臓細胞をフローチューブに濾過し、遠心分離して上澄液を除去し、RBC Lysis Buffer 2mLを加えて室温下で15分溶解してから、遠心分離して上澄液を除去し、脾臓細胞が得られる。そして10%FBS、1%グルタミン、1%二重抗体(抗ペニシリン、ストレプトマイシン)を含有する完全培地1.5mLを加え、ピペットで繰り返し吸引・排出して均一になるように混合する。
投与処置およびNK細胞誘導活性化後の細胞内染色:中濃度の62.5ng/mLアクテインと250ng/mLデオキシアクテインで細胞を処置し、1時間後Cell Stimulation Cocktail(PMA、イオノマイシンおよびタンパク質輸送阻害剤を含有する)で細胞を5時間刺激し、フローサイトメーターによりCD3+CD4+T細胞においてIFN−γを発現する陽性細胞の割合、CD3+CD8+T細胞においてIFN−γを発現する陽性細胞の割合を測定する。
[付記1]
自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用。
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記1に記載の使用。
炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製における、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用。
前記炎症性サイトカインは、TNF−α、IFN−γ、IL−6、IL−9、IL−12、IL−17A、IL−18、IP−10、MCP−1、MCP−3、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、Eotaxin、G−CSFの中の1種または複数種を含む、付記3に記載の使用。
前記アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物において、アクテインとデオキシアクテインの質量比は、1〜5:5〜1、好もしくは、1〜3:3〜1、より好もしくは、1:1である、付記1〜4のいずれか1つに記載の使用。
ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物を活性成分とする自己免疫疾患を治療するための薬物組成物。
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記6に記載の薬物組成物。
ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物を活性成分とする炎症性サイトカインを抑制するための薬物組成物。
前記炎症性サイトカインは、TNF−α、IFN−γ、IL−6、IL−9、IL−12、IL−17A、IL−18、IP−10、MCP−1、MCP−3、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、Eotaxin、G−CSFの中の1種または複数種を含む、付記8に記載の薬物組成物。
前記アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物において、アクテインとデオキシアクテインの質量比は、1〜5:5〜1、好もしくは、1〜3:3〜1、より好もしくは、1:1である、付記6〜9のいずれか1つに記載の薬物組成物。
Claims (7)
- 任意で含まれる医薬上許容される担体の他は、活性成分とするアクテインとデオキシアクテインのみからなる薬物組成物であって、アクテインとデオキシアクテインの質量比が1:5〜5:1である、自己免疫疾患を治療するための薬物組成物。
- 前記アクテインとデオキシアクテインの質量比は1:3〜3:1である、請求項1に記載の薬物組成物。
- 前記アクテインとデオキシアクテインの質量比は1:1である、請求項2に記載の薬物組成物。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の薬物組成物の自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における使用。
- 前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、請求項4に記載の使用。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の薬物組成物の炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製における使用。
- 前記炎症性サイトカインは、TNF−α、IFN−γ、IL−6、IL−9、IL−12、IL−17A、IL−18、IP−10、MCP−1、MCP−3、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、Eotaxin、G−CSFの中の1種または複数種を含む、請求項6に記載の使用。
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