DE69724156T2

DE69724156T2 - Aus mycobacterium tuberculosis extrahierter kohlenwasserstoffkomplex und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE69724156T2
Application number: DE69724156T
Authority: DE
Inventors: Tai Ho Jung-gu Chung; Chong Chan Suseong-gu Chung
Original assignee: Chung, Tai Ho; Chung, Chong Chan
Current assignee: HYOLIM BIO CO., LTD., GYEONGSAN, GYEONGSANGBUK, KR
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: ES2205226T3; US6274356B1; CA2293821A1; DE69724156D1; CA2293821C; WO1998056941A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kohlenwasserstoffkomplex, der aus Mycobacterium tuberculosis extrahiert ist, der eine anti-Krebsaktivität aufweist und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
Es ist allgemein bekannt, daß die anti-Krebsaktivität von Mycobacterium tuberculosis aktiven Inhaltsstoffen in der zytoplasmatischen Membran davon zuzuordnen ist, insbesondere den Polysaccharid- und Lipidderivaten.
Zum Beispiel waren Azuma et al. bei der Isolierung von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (MDP) erfolgreich, das eine aktive Komponente von M. tuberculosis ist [Azuma, L. et al., J. Bact., 96, 1885–1887 (1968)].
Barnes et al. berichteten auf der anderen Seite, daß Lipoarabinomannan die Produktion von Cytokin unterstützt [Barnes, P. F. et al., J. Immunol., 149, 541–547 (1992)]. Chung et al. isolierten aus M. tuberculosis eine Substanz, die eine anti-Krebsaktivität aufwies und verwendeten diese Substanz, die als Tubercin-3 bezeichnet wird, bei der Behandlung von terminalen-Krebs und leprösen Patienten sowie Labortieren, die an tumoralen Symptomen litten [Chung, T. H., J. Korean Med. Ass., 17, 427–431 (1974); Chung, T. H. et al., Yonsei Med J., 17, 131– 135 (1976)].
Es wurde auch berichtet, daß ein Polysaccharid, extrahiert aus Mycobacterium bovis BCG eine anti-Krebsaktivität aufweist (Patent Abstracts of Japan, vol. 18, No. 337, (C-1217), 1994; JP A 06 080 574, KICHIRO OZAKI). Auf der anderen Seite zeigt eine Person, die mit M. tuberculosis Bacilli infiziert ist, normalerweise eine granulomatöse Entzündung, und, falls die infizierte Stelle die Lunge ist, schreitet die Löcherbildung zusammen mit einer entzündlichen Reaktion fort, die durch Sekretion von Proteinen und Glycolipiden induziert wird, die ursprünglicherweise in der Zellwand von M. tuberculosis vorhanden sind. Dies läßt vermuten, daß für den Fall, daß Hoch-Molekulargewichts-Polysaccharide oder -Proteine in Krebsimmunotherapien verwendet werden es schwierig sein kann, solche nachteiligen Nebenwirkungen als unerwünschte Immunantworten und unkontrollierbare entzündliche Reaktionen zu unterdrücken.
Zusammenfassung der Erfindung
Demzufolge ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen Kohlenwasserstoffkomplex zur Verfügung zu stellen, der aus Mycobacterium tuberculosis extrahiert wurde, der eine hohe anti-Krebsaktivität aufweist und zur selben Zeit im wesentlichen keine der oben genannten unerwünschten Nebenwirkungen verursacht.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von diesem Kohlenwasserstoffkomplex zur Verfügung zu stellen.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt der Erfindung wird ein Kohlenwasserstoffkomplex zur Verfügung gestellt, der ein Gemisch von Polysacchariden ist, die aus Mycobacterium tuberculosis extrahiert wurden, dadurch gekennzeichnet, daß: die Polysaccharide ein Molekulargewicht von unterhalb von 7.000 aufweisen und von Monosacchariden abgeleitet sind, die im wesentlichen aus Mannose, Arabinose, Glucose und Galactose bestehen, wobei die Monosaccharide geradekettige und/oder Seitenketten-glycosidische Bindungen ausbilden.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Kohlenwasserstoffkomplexes zur Verfügung gestellt, das die Schritte umfaßt von:

(a) Kultivieren von Mycobacterium tuberculosis in einem Medium, Erhitzen der Kultur, die mit Wasser verdünnt wurde, auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 150°C unter einem Druck, der von 10 bis 30 psi reicht, und Entfernen von bakteriellen Reststoffen aus der erhitzten Kulturlösung;
(b) Hinzufügen einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Sulfosalicylsäure und Phosphowolframsäure zu der restlichen Lösung, um ein Präziptat zu bilden, und Entfernen des Präzipitats aus der erhaltenen Lösung;
(c) Dialysieren des restlichen Lösung, um eine Dialyse-Produkt zu erhalten;
(d) Hinzufügen eines Alkohols zu dem Dialyse-Produkt, um ein Präzipitat zu erhalten, Waschen des Präzipitats mit einem Alkohol-Ether-Gemisch und Extrahieren des gewaschenen Präzipitats mit einem organischen Lösungsmittel; und
(e) Reinigen des Extrakts, um das Kohlenwasserstoff-Gemisch zu erhalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die oben genannten und anderen Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung zusammengenommen, wenn in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich werden, worin:
1 den Bio-LC-Scan des Hydrolyseprodukts von Tubercin-5 der vorliegenden Erfindung zeigt (erhalten durch Verwendung eines gepulsten amperometrischen Detektors: Pad);
2 ¹H-NMR-Scans der Arabinomannan-Fraktionen 1, 2, 3 und 4 wiedergibt, die aus dem Hydrolyseprodukt von Tubercin-5 der vorliegenden Erfindung abgenommen sind;
3 ¹³C-NMR-Scans der Arabinomannan-Fraktionen 1 und 3 wiedergibt; und
4 das Ergebnis von FAB-MS-Analyse von Oligosaccharid-Alditolderivaten der Arabinomannan-Komponenten von Tubercin-5 verdeutlicht.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Der Kohlenwasserstoffkomplex der vorliegenden Erfindung, bezeichnet als Tubercin-5, wird aus M. tuberculosis extrahiert. Tubercin-5 ist eine Gemisch von Polysacchariden, das gerade kettige und Seitenketten-glycosidische Bindungen aufweist, die zwischen solchen essentiellen Monosacchariden wie Mannose, Arabinose, Glucose und Galactose ausgebildet sind. Das Molekulargewicht der Polysaccharide liegt unterhalb von 7.000, bevorzugt im Bereich von 2.500 bis 3.500 Dalton.
Tubercin-5 der vorliegenden Erfindung kann wie folgt hergestellt werden.
M. tuberculosis wird zuerst in einem geeigneten Medium kultiviert und die Kultur wird mit Wasser verdünnt. Die verdünnte Kultur wird auf einen Temperaturbereich von 50 bis 150°C, bevorzugt von 110 bis 130°C unter einem Druck erhitzt, der von 10 bis 30 psi, bevorzugterweise von 15 bis 20 psi reicht. Das für die Kultur geeignete Medium kann bevorzugterweise Sautons-Medium sein und das Wasser für die Verdünnung kann in einer Menge verwendet werden, die von 10- bis 30-fach reicht, bevorzugterweise ein 20-faches Volumen der Kultur. Der erhitzten Kultur wird es dann ermöglicht, daraus bakterielle Reste zu entfernen. Das Entfernen der bakteriellen Reste kann durch ein herkömmliches Verfahren durchgeführt werden, z. B. unter der Verwendung einer Zentrifuge und/oder einem Filter.
Zu der verbleibenden Kulturlösung wird ein anorganisches Salz hinzugefügt, um ein Proteinpräzipitat zu bilden. Das anorganische Salz, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Sulfosalicylsäure und Phosphowolf- ramsäure ein, während Sulfosalicylsäure und Phosphowolframsäure bevorzugt sind. Das anorganische Salz kann bis zu einer finalen Konzentration verwendet werden, die von 1 bis 15 Gew.%, bevorzugterweise von 8 bis 10 Gew.% reicht. Danach wird aus der sich ergebenden Lösung das darin erhaltene Präzipitat durch ein herkömmliches Verfahren, z. B. einer Zentrifugation, entfernt. Die verbleibende Lösung wird dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, um das anorganische Salz zu entfernen und ein Dialyseprodukt zu erhalten. Der Entfernungs-Verfahrensschritt kann zwei- oder mehrmals wiederholt werden.
Zu dem Dialyseprodukt wird dann ein Alkohol hinzugefügt, um ein Präzipitat zu erhalten, und das Präzipitat wird mit einem Alkohol-Ethergemisch gewaschen. Der Alkohol, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt Ethanol, Propanol und Butanol ein, während Ethanol bevorzugt ist. Der Ether kann bevorzugterweise Diethylether sein. Das gewaschene Präzipitat wird dann mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Phenol, Diethylether oder einem Alkohol extrahiert, um daraus Fettkomponenten zu entfernen. Die Extraktion kann in Anwesenheit einer Pufferlösung, z. B. einer gemischien Lösung von Tris-HCl-Pufferlösung-EDTA durchgeführt werden.
Zuletzt wird das erhaltene Präzipitat einem Reinigungsschritt unterzogen, um den Kohlenwasserstofflcomplex der vorliegenden Erfindung zu erhalten, der als Tubercin-5 bezeichnet wird. Die Reinigung kann zum Beispiel durch Verwendung einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie durchgeführt werden.
Das so erhaltene Tubercin-5 ist ein Gemisch von Polysacchariden, die eine Arabinomannanstruktur aufweisen, die aus solchen Monosacchariden wie Glucose (Glu), Arabinose (Ara), Galactose (Gal) und Mannose (Man) aufgebaut ist und wird aufgeklärt, wenn sie nacheinander Per-O-methylierung, Hydrolyse, Reduktion, Acetylierung und GLC-MS-Analyse unterzogen wird.
Die Struktur von Tubercin-5 wird weiter durch die Untersuchung der durch die Hydrolyse davon erhaltenen Fragmente untersucht. Es kann nämlich mittels High-Performance-Anionen-Austausch-Chromatographie (HPAEC) gezeigt werden, daß das Hydrolyseprodukt von Tubercin-5 aus einer Zahl von Monosacchariden und Oligosacchariden von veränderlichen Kettenlängen zusammengesetzt ist.
Vier Arabinomannanfraktionen, die aus der oben genannten chromatographischen Auftrennung des Tubercin-5-Hydrolyseprodukts erhalten wurden, wurden weiter durch NMR analysiert. Die ¹H-NMR-Ergebnisse zeigen die Anwesenheit von α- oder β-Furanosyl- und α-Pyranosylresten, während ¹³C-NMR Daten zeigen, daß Tubercin-5 folgendes besitzt: (1) eine 5-Verbindungstyp α-Araf-Einheit (Rest), (2) eine (35)-Verbindungstyp α-Araf-Einheit, substituiert mit einem 5-Verbindungstyp α-Araf-Rest an der Verzweigungsposition und (3) eine Disaccharideinheit, β-Araf-(12)-α-Araf-, sowie eine di-substituierte (35)-Verbindungstyp Araf-Einheit. Zur weiteren strukturellen Analyse wird Tubercin-5 aufeinanderfölgend Per-O-alkylierung, partieller Hydrolyse und Natriumbordeuterid (NaB[²H]₄) Reduktion unterzogen, und eine FAB-MS Analyse der Oligosaccharid-Alditolderivate, die so erhalten wurden, zeigt die Anwesenheit von einfachen (Man)₂-Einheiten sowie (Man)₆(Ara)₆(Glu)(Gal), (Man)₉(Ara)₆(Glu)(Gal) und andere Kombinationen von Man, Ala, Glu und Gal.
Die oben angegebenen Analysen zeigen, daß der Kohlenwasserstofflcomplex der vorliegenden Erfindung, Tubercin-5, aus Polysacchariden zusammengesetzt ist, die linear und verzweigte Ketten von Mannose, Arabinose, Glucose und Galactose aufweisen und ein Molekulargewicht von 7.000 oder weniger, bevorzugt von 2.500 bis 3.500 aufweisen. Wie oben angegeben, können Polysaccharide höheren Molekulargewichts, die zum Beispiel ein durchschnittliches Molekulargewicht von 12.000 oder höher aufweisen, unerwünschte Nebenwirkungen induzieren, z. B. eine Hypersensitivität.
Der Kohlenwasserstoffkomplex der vorliegenden Erfindung, Tubercin-5, ist bei der Behandlung von verschiedenen Krebspatienten bemerkenswert effektiv, insbesondere bei denjenigen, die an Lungen-, Magen- oder Gebärmutterhalskrebs leiden. Tubercin-5 weist einen LD₅₀-Wert auf, der mehrere Größenordnungen höher ist, als der empfohlene Dosierungsspiegel. Demzufolge ist es sicher und nicht toxisch, weist therapeutische Effekte auf kanzeröse Symptome auf, erhöht die Überlebensrate der Patienten und beseitigt oder verringert die Krebsgewebe, alles in der Abwesenheit von irgendwelchen erkennbaren nachteiligen Nebenwirkungen.
Daher kann Tubercin-5 allein oder in Kombination mit anderen Substanzen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe, Träger, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, befeuchtende Mittel und Aromastoffe in Kombination mit Tubercin-5 umfassen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann durch jedes der im Stand der Technik bekannte herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die Tubercin-5 umfaßt, kann über eine Vielzahl von Routen verabreicht werden, einschließlich oraler, transdermaler, subkutaner, intravenöser und intramuskulärer Einführung. Für den Fall, daß eine subkutane Injektionsformulierung verwendet wird, kann eine typische tägliche Dosis des aktiven Inhaltsstoffs von ungefähr 0,001 bis 1 μg/kg Körpergewicht, bevorzugterweise von 0,01 bis 0,5 μg/kg Körpergewicht reichen. Jedoch kann die Dosierung des aktiven Inhaltsstoffes in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren variieren, und eine geeignete Menge sollte nach Ermitteln des Verabreichungsverfahrens, dem Symptom sowie dem Alter und Gewicht des Patienten, unter anderem, bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die vorliegende Erfindung weiter zu verdeutlichen, ohne ihren Bereich zu begrenzen.
Beispiel 1: Herstellung von Tubercin-5
M. tuberculosis (H₃₇R_v:ATCC 25618) wurde in einem Sautons-Medium inokuliert [Sauton, B., Internat. Cong. Appl. Chem., 19, 267–269 (1912)] in einer 250 ml Flasche plaziert und für vier Wochen bei 37°C kultiviert. 300 g der Kultur wurden mit ungefähr 6.000 g Wasser verdünnt und die so erhaltene verdünnte Kultur wurde in einem Autoklaven unter einem Druck von 16 psi auf 120°C erhitzt.
Die erhitzte Kultur wurde für 30 Minuten bei 3.500 bis 4.500 U/min zentrifugiert, der Überstand wurde abgetrennt und mit einem Seilg-Filter filtriert, der eine Porengröße von 0,1 um aufwies. Die so erhaltene Lösung wurde nochmals unter der Verwendung eines Shämblan-Filters filtriert, um verbleibende bakterielle Reste zu entfernen.
Zu dem so erhaltenen Filtrat wurde Sulfosalicylsäure auf eine Konzentration von 10 Gew.% hinzugefügt und zentrifugiert, um gelbbraune Präzipitate (Proteine) zu entfernen. Der Überstand wurde in einen semipermeablen Membranbeutel (Thomas Co., U. S. A.) plaziert und gegen destilliertes Wasser für drei Tage dialysiert, um die Sulfosalicylsäure zu entfernen.
Die kolloidale Suspension in dem Membranbeutel wurde konzentriert, dazu wurde Phosphorwolframsäure auf eine Konzentration von 7 Gew.% hinzugefügt und das darin gebildete Proteinpräzipitat wurde durch Zentrifugation bei 3.500 U/min für 20 Minuten entfernt. Der so erhaltene Uberstand wurde in einen semipermeablen Membranbeutel plaziert und gegen destilliertes Wasser dialysiert, um die darin enthaltenen anorganischen Salz zu entfernen.
Die Dialyselösung wurde dann mit einem 5-fachen Volumen an Ethanol verdünnt und das sich ergebende Gemisch wurde bei 4°C für 24 Stunden stehen gelassen, um ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat wurde zweimal mit einem Ethanol-Wasser (1 : 3)-Gemisch gewaschen und zu dem gewaschenen Präzipitat wurde eine gemischte Lösung von 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)-5 mM EDTA hinzugefügt. Das sich ergebende Gemisch wurde nacheinander mit Phenol, Diethylether und Ethanol extrahiert, um in dem Präzipitat vorhandene Fette zu entfernen.
Zuletzt wurden Spuren anorganischer Verunreinigungen aus dem Präzipitat unter der Verwendung einer Bio-Gel-P4-Säule (1,2 × 65 cm; Bio-Rad Laboratories, USA) entfernt, um 100 mg des Kohlenwasserstoffkomplexes der vorliegenden Erfindung, bezeichnet als Tubercin-5, zu erhalten.
Beispiel 2: Strukturelle Analyse von Tubercin-5
Um die Monosaccharid-Bestandteile von in Beispiel 1 hergestelltem Tubercin-5 zu analysieren, wurde Tubercin-5 in Wasser auf eine Konzentration von 500 μg/ml gelöst und unter Verwendung des durch Oxford Glyco Systems in England entwickelten Verfahrens unter der Verwendung von verschiedenen Monosaccharid-Standardlösungen als Referenzenanalysiert.
Tubercin-5 wurde einer Serie von herkömmlichen Reaktionen unterzogen, d. h. Per-O-methylierung, Säure-katalysierter Hydrolyse, Reduktion und Acetylierung, um Per-O-trimethylsilyl(TMS)methylglycosid zu erhalten, und jede Komponente wurde mit GLC-MS identifiziert. Die quantitative Analyse jedes TMS-Methylglycosids wurde unter der Verwendung eines Flammen-ionisierenden Detektors (FID) durchgeführt und die Menge der in Tubercin-5 vorhandenen Glycosylreste wurde bestimmt, wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Wie in Tabellen 1 und 2 gezeigt, besitzt Tubercin-5, der Kohlenwasserstoffkomplex der vorliegenden Erfindung, eine Arabinomannanstruktur, ähnlich zu derjenigen, die in Kohlenwasserstoffkomplexen von anderen Tuberkulosebacilli gefunden werden. Weiter durch diese Untersuchung aufgeklärt sind die Tatsachen, daß der 4-Mannopyranose (4-Manp)-Rest in Tubercin-5 vorhanden ist und das die Arabinose- und Mannosegehalte viel höher sind, als die Glucose- und Galactosegehalte.
Im Anschluß an die oben genannte Analyse wurden 10 mg von Tubercin-5 in 6N HCl für 24 Stunden bei 70°C hydrolysiert, mit 6N NaOH neutralisiert und einer High-Performance-Anionen-Austauschchromatographie (HPAEC), unter der Verwendung einer CarboPac PA1-Säule (4–250 mm: Dionex) mit einer CarboPac PA-Guardsäule (3 × 25 mm) auf Bio-LC, ausgerüstet mit einem gepulsten amperometrischen Detektor (Dionex), der eine goldbeschichtete Elektrode verwendete, unter den folgenden Bedingungen unterzogen.
Probengröße = 26 ml
Pulspotential von Pad, E₁ = 0,05 V
t₁ = 480 ms
E₂ = 0,06 V
t₂ = 120 ms
E₃ = –80 V
t₃= 60 ms
Detektornachweiszeit = 1 Sek.
Eluent 1 = 1 M Natriumacetatlösung
Eluent 2 = 200 mM oder 375 mM Natriumhydroxidlösung
Eluent 3 = destilliertes Wasser
Verwendete Eluentengradientenprogramme:

(1) Programm A Eluent 1: 5% bei 0 Min., 50% bei 45 Min. Eluent 2 (200 mM NaOH): 50% bei 0 bis 45 Min.
(2) Programm B Eluent 1: 5% bei 0 Min., 15% bei 5 Min., 25% bei 20 Min., 35% bei 45 Min. und 45% bei 65 Min. Eluent 2 (375 mM NaOH): 40% bei 0–65 Min.

Die beobachteten Peak-Antworten wurden unter der Verwendung von Standardlösungen kalibriert, die bekannte Mengen von Referenzverbindungen enthielten.
Der Bio-LC-Scan der Hydrolyseprodukte von Tubercin-5; wie er durch den gepulsten amperometrischen Detektor definiert wurde, ist in 1 gezeigt. Tubercin-5 ist, wie der Scan in 1 vorschlägt, ein Gemisch von Polysacchariden, das verschiedene Monosaccharid-Bestandteile und verschiedene Kettenlängen aufweist. Dieses Hydrolysegemisch wurde in vier Fraktionen aufgeteilt und jede wurde wie folgt analysiert;
jede der vier Arabinomannanfraktionen wurde in 1 ml von ²H₂O gelöst, 1 μl von Aceton als einem internen Standard hinzugefügt und NMR-Analysen unterzogen (Broker ACE-300). Ein ¹³C-NMR-Scan zeigte einen Peak bei δ 31,4 relativ zu dem Acetonstandard, während ¹H-NMR einen Peak bei δ 2,04 relativ zu dem Aceton-Peak zeigte. Die ¹H-NMR-Scans der Arabinomannanfraktionen 1, 2, 3 und 4 von Tubercin-5 sind in 2 wiedergegeben, die die Anwesenheit von Saccharidkettenresten in Fraktionen 1 und 3 zeigt (die durch die Pfeile in den Scans markierten Peaks für Fraktionen 1 und 3 wurden als die H-1-Signale eines β-Glycosylrests identifiziert). Andere Protonen jedes dieser Polysaccharide zeigen Peaks bei δ 5,0–4,5 und diese entsprechen den α oder β-Furanosyl- sowie den α-Pyranosylresten.
Die ¹³C-NMR-Scans von Fraktionen 1 und 3 von Tubercin-5 der vorliegenden Erfindung sind in 3 wiedergegeben. Basierend auf den bekannten Ergebnissen für die in M. tuberculosis vorhandene lösliche Arabinomannankomponente [Daffe, M. et al., J. Biol. Chem., 265, 6734– 6743 (1990)] kann die chemische Verschiebung des nicht-reduzierbaren Terminus der Arabinankette abgeleitet werden. Es wurde daher gefunden, daß das terminale t-β-Araf(C-1, δ 101–102) an die 2-Position von α-Araf(C-1, δ 106–108) gebunden ist und das dieses Disaccharid seinerseits an die 3- und 5-Positionen eines α-Araf-Rests gebunden ist. Die verbleibenden Ara- und Man-Reste wurden als von der Furanoidart bestätigt, basierend auf den chemischen Verschiebungswerten (δ 107–109). Namentlich liegen die chemischen Verschiebungswerte für C-1 von t-β-Araf und der 2-Verbindungstyp α-Araf das C-2 des Arabinoserests und C-5 von t-β-Araf, die in der oben angegebenen Literatur berichtet wurden, sehr dicht an denjenigen, die in dieser Untersuchung beobachtet wurden. Im Fall des Furanosylrests beruhten die erhältlichen Daten für die 2-, 3- und 5-Verbindungstyp Araf-Reste und denjenigen für den 5-Galf-Rest auf der Untersuchung der Tatsache, daß der C-1 Peak, der bei δ 108–109 erscheint, meistens an den α-Araf/β-Galf-Einheiten liegt [Gorin, P. A. J. et al., Carbohydrate Res., 48, 171–186 (1976); Joseleau, J. P. et al., Carbohydrate Res., 58, 165–175 (1977); Mizutani, K. et al., Carbohydrate Res., 185, 27–38 (1989)]. Die in den ¹³C-NMR-Daten für die zwei löslichen Arabinomannankomponenten der Zellwand von M. tuberculosis beobachteten engen Ähnlichkeiten lassen vermuten, daß diese Komponenten ähnliche strukturelle Eigenschaften aufweisen. Es wurde gezeigt, daß diese struktwellen Eigenschaften wie folgt ausgedrückt werden können:

(a) 5-Verbindungstyp α-Araf-Rest;
(b) verzweigte (3 5) Verbindungstyp α-Araf-Einheit, substituiert mit 5-Verbindungstyp α-Araf-Rest an der Verzweigungsposition; und
(c) Disaccharid β-Araf(12)-α-Araf- und (35)Verbindungstyp α-Araf-Einheiten.

Um den Arabinomannangehalt genauer zu untersuchen, wurde eine Per-O-methylierte Arabinomannanfraktion mit 1M CF₃COOH bei 75°C für eine Stunde behandelt, um eine partielle Hydrolyse davon durchzuführen, und das sich ergebende Material wurde unter der Verwendung von NaB[²H]₄ reduziert, um Oligosaccharid-Alditolderivate zu erhalten, die dann zu Per-O-alkylierten Oligosaccharid-Alditolen überführt wurden; um einer FAB-MS Analyse unterzogen zu werden.
2 zeigt das Ergebnis der FAB-MS Analyse der positivien Ionen der Oligosaccharid-Alditole, die aus Tubercin-5 abgeleitet wurden, und man kann die intensiven Molekularionen-Peaks sehen, die [M + Na]⁺ und [M + NH₄]⁺ entsprechen, wobei die Peaks bei 408, 612, 932, 1862, 2270 und 2882 jeweils zu (Man)₂, (Man)₃, (Man)₃(Ara), (Man)₄(Ara)₆, (Man)₆(Ara)₆(Glu) (Gal) und (Man)₉(Ara)₉(Glu)(Gal), zugeordnet werden.
Die Strukturen der oben genannten Fragmente sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Ein Polysaccharid, das ein Molekulargewicht von mehr als 3.000 aufweist, weist die folgende Struktr auf:

worin l, m, n, o und p einzeln eine ganze Zahl sind und X eine Kette von Glucose- und Galactoseresten ist.
Polysaccharide, die ein Molekulargewicht von mehr als 3.500 aufweisen, stellen weniger als 10% der gesamten Polysaccharide.
Testbeispiel 1: Akute Toxizität von Tubercin-5 gegenüber Ratten und Mäusen
In Beispiel 1 hergestelltes Tubercin-5 wurde in physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 2 mg/ml gelöst, wovon verschiedene Mengen an 6-Wochen alte Mäusen (ICR-Mäuse: 20–35 g) und Ratten (SD-Ratte: 150 g) mittels intravenöser oder subkutaner Injektionen verabreicht wurden, um dessen Fatalität zu beobachten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß, unabhängig von dem verwendeten Testtier, der LD₅₀-Wert von Tubercin-5 höher als 20.000 μg/kg in Fällen von intravenösen Injektionen ist, während er oberhalb von 50.000 μg/kg liegt, wenn durch subkutane Injektionen verabreicht. Demzufolge ist unter der Berücksichtigung, daß eine effektive tägliche Dosis von Tubercin-5 für einen menschlichen Patienten von ungefähr 0,001 bis 1 μg/kg, bevorzugterweise von 0,01 bis 0,5 μg/kg des Körpergewichts reichen kann, Tubercin-5 im wesentlichen nicht toxisch.
Die in den oben genannten Behandlungen unterzogenen Testtiere wurden über eine Zeitdauer von 14 Tagen hinweg untersucht, um die Gewichtsveränderungen zu messen und wurden dann getötet, um die Leber, Niere, Milz, Magen, Lunge und Herzgewebe davon zu untersuchen. Auch wurde jede der Organproben in einer 10% Formaldehydlösung fixiert, um eine pathologische Probe herzustellen, die mit Hämotoxvlin-Eosin gefärbt wurde und mit einem Mikroskop untersucht wurde. Keine Abnormalitäten wurden in jeder der untersuchten Proben nachgewiesen.
Testbeispiel 2: Effekt der kombinierten Verwendung von Tubercin-5 und Cyclophosphamid
56 weiße männliche Mäuse, die jede ungefähr 22 g (ICR-Mäuse: 20–25 g) wog, wurden in 7 Gruppen eingeteilt und jede Maus wurde durch eine subkutane Injektion in ihren abdominalen Teil 0,2 ml von 10% Ehrlich Asciten-Tumorzellösung (1,4 × 10⁷ Zellen) verabreicht, in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Baillif [Baillif, R. N., Cancer Research, 15, 554–558 (1954)]. Anschließend wurde jede Maus einer der folgenden Behandlungen unterzogen:
Kontrollgruppe: abdominale Injektion von 0,2 ml von 0,9% physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 1: subkutane Injektion einer 1 μg/ml Tubercin-5 Lösung in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 2: subkutane Injektion einer 2 μg/ml Tubercin-5 Lösung in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 3: intraperitoneale Injektion von 0,55 mg (entsprechend zu 25 mg pro kg Körpergewicht) von Cyclophosphamid, gelöst in 0,2 ml Wasser;
Gruppe 4: intraperitoneale Injektion von 1,1 mg (entsprechend 50 mg/kg Körpergewicht) von Cyclophosphand, gelöst in 0,2 ml Wassesr;
Gruppe 5: intraperitoneale Injektion von 0,55 mg von Cyclophosphamid, gekoppelt mit sub- kutanter Injektion von 1 μg Tubercin-5;
Gruppe 6: intraperitoneale Injektion von 1,1 mg von Cyclophosphamid, gekoppelt mit subkutanter Injektion von 1 μg Tubercin-5.
Jede der oben genannten Injektionsbehandlungen wurde sechsmal über eine Zeitdauer von 6 Tagen hinweg wiederholt. 15 Tage nach der anfänglichen Inokulation von Krebszellen wurde jede der so behandelten Mäuse mit Diethylether betäubt und getötet. Der solide Tumor, der in dem abdominalen Teil wuchs, wurde sorgfältig von anderen Organgeweben isoliert, unter der Verwendung von Filterpapier gereinigt und gewogen. Für jede Gruppe wurde das durchschnittliche Gewicht von den Krebsgewebe tabuliert und durch den t-Test evaluiert, wobei die Ergebnisse davon in Tabelle 5 gezeigt sind.
Tabelle 5
Wie die Daten in Tabelle 5 vermuten lassen, produzierte die Verabreichung von Cyclophosphamid oder Tubercin-5 allein anti-Krebseffekte ähnlicher Größenordnung, während die kombinierte Verwendung von Cyciophosphamid und Tubercin-5 zu einer deutlichen Abnahme des Krebswachstums führte. Dieses Ergebnis zeigt die Brauchbarkeit von Tubercin-5 in Krebstherapien, insbesondere wenn es mit einem oder mehreren von anderen existierenden anti-Krebsmitteln kombiniert wird.
Wie in den oben genannten Beispielen ist Tubercin-5 der vorliegenden Erfindung ein außerordentlich effektives anti-Krebsmittel, das sicher zu verwenden ist, ohne jegliche nachteilige Nebenwirkungen.

Claims

1: Gemisch von Polysacchariden, bestehend im wesentlichen aus Mannose, Arabinose, Glukose und Galaktose als Bestandteilen davon, extrahiert aus Mycobacterium tuberculosis, wobei jedes der Polysaccharide ein Molekulargewicht von 7.000 oder weniger aufweist und eine oder mehrere der folgenden Strukturen umfaßt: Man-Man; Man-Man-Man; Man-Man-Man-Ara; Man-Man-Man-Ara-Ara; Man-Man-Man-Man-Ara-Ara-Ara-Ara; Man-Man-Man-Ara-Ara-Ara-Ara-Ara-Ara; Man-Man-Man-Man-Ara-Ara-Ara-Ara-Ara-Ara; Man-Man-Man-Man-Man-Ara-Ara-Ara-Ara-Ara-Ara;

worin 1, m, o und p einzeln eine ganze Zahl sind und x ist eine Kette aus Glukose- und Galaktoseresten.

Gemisch nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht der Polysaccharide von 2.500 bis 3.500 reicht.

Verfahren zur Herstellung des Gemischs wie definiert in Anspruch 1, umfassend die Schritte von: (a) Kultivieren von Mycobacterium tuberculosis in einem Medium, Erhitzen der Kultur, die mit Wasser verdünnt wurde, auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 150°C unter einem Druck, der von 10 bis 30 psi reicht, und Entfernen von bakteriellen Reststoffen aus der erhitzten Kulturlösung; (b) Hinzufügen einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amoniumsulfat, Natriumsulfat, Sulfosalicylsäure und Phospho-Wolframsäure zu der restlichen Lösung, um ein Präziptat zu bilden und Entfernen des Präzipitats aus der erhaltenen Lösung; (c) Dialysieren des restlichen Lösung, um eine Dialyse-Produkt zu erhalten; (d) Hinzufügen eines Alkohols zu dem Dialyse-Produkt, um ein Präzipitat zu erhalten, Waschen des Präzipitats mit einem Alkohol-Ether-Gemisch und Extrahieren des gewaschenen Präzipitats mit einem organischen Lösungsmittel; und (e) Reinigen des Extrakts, um das Kohlenwasserstoff-Gemisch zu erhalten.

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines krebsartigen Symptoms, umfassend eine therapeutisch effektive Menge des in Anspruch 1 definierten Gemisches und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.