JP2790447B2 - ミコバクテリウム・ツベルクロシスから抽出した複合多糖体およびその製造方法 - Google Patents
ミコバクテリウム・ツベルクロシスから抽出した複合多糖体およびその製造方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はミコバクテリウム・
ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）から抽出した抗癌作用を有する複合
多糖体およびその製造方法に関する。
ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）から抽出した抗癌作用を有する複合
多糖体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９７４年以降、ミコバクテリウム・ツ
ベルクロシス菌体抽出物に含まれる抗癌成分は主にその
菌体の細胞膜に存在するということとその主成分が多糖
体と脂質誘導体であることが明らかになり、アズマらは
該菌体から有効成分としてＮ−アセチルムラミル−Ｌ−
アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）を分離した
〔Ａｚｕｍａ，Ｌ.，ｅｔ ａｌ.，Ｆｒａｃｔｉｏｎａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ
ｗａｌｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｂｉｎｏｓ
ｅ ｍｙｃｏｌａｔｅ ａｎｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａ
ｃｔａｎ ｆｒｏｍｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ Ａｏｙａｍａ Ｂ.，Ｊ.Ｂａ
ｃｔ.，９６，１８８５−１８８７（１９６８）〕。な
お、１９９２年バーネスらはリポアラビノマンナンがサ
イトカイン生産を増進させると報告した〔Ｂａｒｎｅ
ｓ，Ｐ.Ｆ.，ｅｔ ａｌ.，Ｃｙｔｏｋｉｎ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｌｉｐｏａｒａｂ
ｉｎｏｍａｎｎａｎ，Ｔｈｅ Ｊ.ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ.，１４９，５４１−５４７（１９９２）〕。
ベルクロシス菌体抽出物に含まれる抗癌成分は主にその
菌体の細胞膜に存在するということとその主成分が多糖
体と脂質誘導体であることが明らかになり、アズマらは
該菌体から有効成分としてＮ−アセチルムラミル−Ｌ−
アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）を分離した
〔Ａｚｕｍａ，Ｌ.，ｅｔ ａｌ.，Ｆｒａｃｔｉｏｎａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ
ｗａｌｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｂｉｎｏｓ
ｅ ｍｙｃｏｌａｔｅ ａｎｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａ
ｃｔａｎ ｆｒｏｍｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎ Ａｏｙａｍａ Ｂ.，Ｊ.Ｂａ
ｃｔ.，９６，１８８５−１８８７（１９６８）〕。な
お、１９９２年バーネスらはリポアラビノマンナンがサ
イトカイン生産を増進させると報告した〔Ｂａｒｎｅ
ｓ，Ｐ.Ｆ.，ｅｔ ａｌ.，Ｃｙｔｏｋｉｎ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｌｉｐｏａｒａｂ
ｉｎｏｍａｎｎａｎ，Ｔｈｅ Ｊ.ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ.，１４９，５４１−５４７（１９９２）〕。
【０００３】１９７４年に鄭泰浩らはＭ.ツベルクロシ
スから遅延性過敏反応を起さず、かつ抗癌効果を持つ物
質を分離してツベルシン-３（Ｔｕｂｅｒｃｉｎ-３）と
命名し、ヒトの末期癌と癩病、そして実験動物の腫瘍に
使用したことがある〔Ｃｈｕｎｇ，Ｔ.Ｈ.，Ａｎｔｉ-
ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
-ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｔｕｂｅｒｃｉｎ-
３，ａｎｄ ｉｔｓ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉ
ｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊ.ｏｆ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅ
ｄ.Ａｓｓ.，１７，４２７−４３１（１９７４）；Ｃｈ
ｕｎｇ，Ｔ.Ｈ.，Ｓｏｎｇ，Ｊ.Ｙ.＆ Ｈｏｎｇ，Ｓ.
Ｓ.，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｔｕ
ｂｅｒｃｉｎ-３，ｏｎ ｔｈｒｅｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ
ｌｅｐｒｏｍａｔｏｕｓ ｌｅｐｒｏｓｙ，Ｙｏｎｓｅ
ｉ Ｍｅｄ.Ｊ.，１７，１３１−１３５（１９７
６）〕。
スから遅延性過敏反応を起さず、かつ抗癌効果を持つ物
質を分離してツベルシン-３（Ｔｕｂｅｒｃｉｎ-３）と
命名し、ヒトの末期癌と癩病、そして実験動物の腫瘍に
使用したことがある〔Ｃｈｕｎｇ，Ｔ.Ｈ.，Ａｎｔｉ-
ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
-ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｔｕｂｅｒｃｉｎ-
３，ａｎｄ ｉｔｓ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉ
ｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊ.ｏｆ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅ
ｄ.Ａｓｓ.，１７，４２７−４３１（１９７４）；Ｃｈ
ｕｎｇ，Ｔ.Ｈ.，Ｓｏｎｇ，Ｊ.Ｙ.＆ Ｈｏｎｇ，Ｓ.
Ｓ.，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｔｕ
ｂｅｒｃｉｎ-３，ｏｎ ｔｈｒｅｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ
ｌｅｐｒｏｍａｔｏｕｓ ｌｅｐｒｏｓｙ，Ｙｏｎｓｅ
ｉ Ｍｅｄ.Ｊ.，１７，１３１−１３５（１９７
６）〕。
【０００４】ヒトがＭ.ツベルクロシス菌に感染される
と肉芽腫性炎症性変化を起すが、特に肺が感染された場
合は、このような炎症性変化とともに空洞（ｃａｖｉｔ
ｙ）が形成される。このような炎症性変化と空洞形成は
前記菌体の細胞壁構成成分中に含有される蛋白と複合脂
質成分が分泌されることによって誘発され得る。即ち、
癌治療に免疫療法を用いる場合、免疫療法に使用される
薬物が高分子量の多糖体成分または蛋白成分を含むと、
抗癌効果とは関係のない免疫反応や直接的炎症反応を誘
発する可能性が高くなるという問題がある。
と肉芽腫性炎症性変化を起すが、特に肺が感染された場
合は、このような炎症性変化とともに空洞（ｃａｖｉｔ
ｙ）が形成される。このような炎症性変化と空洞形成は
前記菌体の細胞壁構成成分中に含有される蛋白と複合脂
質成分が分泌されることによって誘発され得る。即ち、
癌治療に免疫療法を用いる場合、免疫療法に使用される
薬物が高分子量の多糖体成分または蛋白成分を含むと、
抗癌効果とは関係のない免疫反応や直接的炎症反応を誘
発する可能性が高くなるという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は前記問題点を解決することにあり、ミコバクテリウム
・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から得られる成分のうち、副作
用が殆ど無く、かつ優れた抗癌効果を有する複合多糖体
とこれを含む抗癌剤組成物およびその製造方法を提供す
る。
は前記問題点を解決することにあり、ミコバクテリウム
・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から得られる成分のうち、副作
用が殆ど無く、かつ優れた抗癌効果を有する複合多糖体
とこれを含む抗癌剤組成物およびその製造方法を提供す
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ミコバクテリ
ウム・ツベルクロシスから分離した、マンノース、アラ
ビノース、グルコースおよびガラクトースが直鎖または
側鎖グリコシド結合して構成され、分子量が約７,００
０以下の複合多糖類に関する。
ウム・ツベルクロシスから分離した、マンノース、アラ
ビノース、グルコースおよびガラクトースが直鎖または
側鎖グリコシド結合して構成され、分子量が約７,００
０以下の複合多糖類に関する。
【０００７】本発明の複合多糖体の製造方法は、培養し
たミコバクテリウム・ツベルクロシス菌株を水浮遊液と
して得、この菌体液を加圧下加熱後濾過分離し、濾液に
スルホサリチル酸を加えて生成された沈殿を除去した後
透析し、透析液にリンタングステン酸を加えて生成され
た沈殿を除いた後更に透析し、透析液にエタノールを加
えることによって沈殿を得、この沈殿をエタノール−エ
ーテルで抽出する段階を含む。Ｍ.ツベルクロシスから
分離した本発明の複合多糖体はツベルシン-５（Ｔｕｂ
ｅｒｃｉｎ-５）と命名した。
たミコバクテリウム・ツベルクロシス菌株を水浮遊液と
して得、この菌体液を加圧下加熱後濾過分離し、濾液に
スルホサリチル酸を加えて生成された沈殿を除去した後
透析し、透析液にリンタングステン酸を加えて生成され
た沈殿を除いた後更に透析し、透析液にエタノールを加
えることによって沈殿を得、この沈殿をエタノール−エ
ーテルで抽出する段階を含む。Ｍ.ツベルクロシスから
分離した本発明の複合多糖体はツベルシン-５（Ｔｕｂ
ｅｒｃｉｎ-５）と命名した。
【０００８】本発明のツベルシン-５の更に詳しい製造
方法は下記の過程を含む。先ず、Ｍ.ツベルクロシス
（Ｍ.ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）培養菌体の水浮遊液
を高圧オートクレーブで加熱することによって菌体から
複合多糖体と蛋白との複合物質を抽出する。次いで、抽
出液にスルホサリチル酸およびリンタングステン酸を好
ましくはそれぞれ１〜１０％および１〜１５％の濃度と
なるように添加して蛋白を沈殿させ除去した後、使用さ
れた酸を透析によって除いて得られる溶液にエタノール
を加え生成した沈殿をエタノール−水（１：３）混液で
洗浄した後、トリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液−ＥＤＴ
Ａから成る混液にフェノール、エーテルおよびエタノー
ルで繰り返し抽出して残っている脂質または蛋白を除
き、次いでイオン交換樹脂カラムを通過させて抽出過程
中混入された無機物を除去して本発明の複合多糖体を分
離できる。
方法は下記の過程を含む。先ず、Ｍ.ツベルクロシス
（Ｍ.ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）培養菌体の水浮遊液
を高圧オートクレーブで加熱することによって菌体から
複合多糖体と蛋白との複合物質を抽出する。次いで、抽
出液にスルホサリチル酸およびリンタングステン酸を好
ましくはそれぞれ１〜１０％および１〜１５％の濃度と
なるように添加して蛋白を沈殿させ除去した後、使用さ
れた酸を透析によって除いて得られる溶液にエタノール
を加え生成した沈殿をエタノール−水（１：３）混液で
洗浄した後、トリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液−ＥＤＴ
Ａから成る混液にフェノール、エーテルおよびエタノー
ルで繰り返し抽出して残っている脂質または蛋白を除
き、次いでイオン交換樹脂カラムを通過させて抽出過程
中混入された無機物を除去して本発明の複合多糖体を分
離できる。
【０００９】前記のように分離した高純度のツベルシン
−５の構成単糖体の成分および結合方式を確認するため
に、ツベルシン-５をｐｅｒ-Ｏ-メチル化、酸加水分
解、還元およびアセチル化してＧＬＣ−ＭＳを用いて分
析した結果、ツベルシン-５はアラビノマンナン構造を
示し、グルコース、アラビノースおよびマンノースを多
量に含有することが分かった。次いで、ツベルシン-５
を酸加水分解および中和して高速陰イオン交換クロマト
グラフィー（ＨＰＡＥＣ）を実施した結果、単糖体およ
び多様な長さの多糖体が混合されていることを確認し、
これを４種類のアラビノマンナン分画として分取した。
−５の構成単糖体の成分および結合方式を確認するため
に、ツベルシン-５をｐｅｒ-Ｏ-メチル化、酸加水分
解、還元およびアセチル化してＧＬＣ−ＭＳを用いて分
析した結果、ツベルシン-５はアラビノマンナン構造を
示し、グルコース、アラビノースおよびマンノースを多
量に含有することが分かった。次いで、ツベルシン-５
を酸加水分解および中和して高速陰イオン交換クロマト
グラフィー（ＨＰＡＥＣ）を実施した結果、単糖体およ
び多様な長さの多糖体が混合されていることを確認し、
これを４種類のアラビノマンナン分画として分取した。
【００１０】前記４種類の可溶性アラビノマンナン分画
の1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った結果、α−またはβ−フラノ
シルとα−ピラノシル残基とを有することを確認した。
また、13Ｃ-ＮＭＲ分析の結果、５−結合形α−Ａｒ
ａｆ残基、分枝位置で５−結合形α−Ａｒａｆ残基で
置換された分枝された（３→５）−結合形α−Ａｒａｆ
単位および二糖類であるβ−Ａｒａｆ（１→２）−α
−Ａｒａｆと，二か所が同時置換された（３→５）結合
形α−Ａｒａｆ単位を有していることが確認された。
の1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った結果、α−またはβ−フラノ
シルとα−ピラノシル残基とを有することを確認した。
また、13Ｃ-ＮＭＲ分析の結果、５−結合形α−Ａｒ
ａｆ残基、分枝位置で５−結合形α−Ａｒａｆ残基で
置換された分枝された（３→５）−結合形α−Ａｒａｆ
単位および二糖類であるβ−Ａｒａｆ（１→２）−α
−Ａｒａｆと，二か所が同時置換された（３→５）結合
形α−Ａｒａｆ単位を有していることが確認された。
【００１１】更に詳細な構造分析を行うために、ツベル
シン-５をＯ−アルキル化した後、部分的に酸加水分解
し、重水素化硼素ナトリウム（ＮａＢ2Ｈ4）で還元して
Ｏ−アルキル化オリゴ糖アルジトールを得、これをＦＡ
Ｂ−ＭＳで分析した結果、簡単な構造の（Ｍａｎ）
2と、多量の（Ｍａｎ）6（Ａｒａ）6（Ｇｌｕ）（Ｇａ
ｌ）と（Ｍａｎ）9（Ａｒａ）6（Ｇｌｕ）（Ｇａｌ）を
含めてＭａｎ、Ａｒａ、ＧｌｕおよびＧａｌの多様な組
合体が存在することが明らかになった。
シン-５をＯ−アルキル化した後、部分的に酸加水分解
し、重水素化硼素ナトリウム（ＮａＢ2Ｈ4）で還元して
Ｏ−アルキル化オリゴ糖アルジトールを得、これをＦＡ
Ｂ−ＭＳで分析した結果、簡単な構造の（Ｍａｎ）
2と、多量の（Ｍａｎ）6（Ａｒａ）6（Ｇｌｕ）（Ｇａ
ｌ）と（Ｍａｎ）9（Ａｒａ）6（Ｇｌｕ）（Ｇａｌ）を
含めてＭａｎ、Ａｒａ、ＧｌｕおよびＧａｌの多様な組
合体が存在することが明らかになった。
【００１２】前記分析結果によれば、本発明の複合多糖
体ツベルシン-５はマンノース、アラビノース、グルコ
ースおよびガラクトースが直鎖または側鎖の形態でグリ
コシド結合された分子量約７,０００以下の複合多糖体
であることが分かる。前記ツベルシン−５は糖の重合度
によって多様な分子量の化合物として存在するが、過敏
反応などの副作用を防止するためには分子量が７,００
０以下でなければならない。本発明のツベルシン-５は
好ましくは２,５００ないし３,５００の分子量の多糖体
からなるが、５,０００ないし７,０００の分子量を有す
るものも含まれる。
体ツベルシン-５はマンノース、アラビノース、グルコ
ースおよびガラクトースが直鎖または側鎖の形態でグリ
コシド結合された分子量約７,０００以下の複合多糖体
であることが分かる。前記ツベルシン−５は糖の重合度
によって多様な分子量の化合物として存在するが、過敏
反応などの副作用を防止するためには分子量が７,００
０以下でなければならない。本発明のツベルシン-５は
好ましくは２,５００ないし３,５００の分子量の多糖体
からなるが、５,０００ないし７,０００の分子量を有す
るものも含まれる。
【００１３】前記のようにＭ.ツベルクロシス菌体から
分離精製された純粋多糖体であるツベルシン-５は、色
々な癌、特に肺癌、胃癌および子宮頸部癌などの癌患者
の臨床症状を改善し生存期間を延長するのみでなく癌組
織を縮小または消滅させるが、過敏反応などの副作用が
なく、ＬＤ50が有効量とは比較にならない程度に高いの
で毒性のない安全な抗癌剤である。
分離精製された純粋多糖体であるツベルシン-５は、色
々な癌、特に肺癌、胃癌および子宮頸部癌などの癌患者
の臨床症状を改善し生存期間を延長するのみでなく癌組
織を縮小または消滅させるが、過敏反応などの副作用が
なく、ＬＤ50が有効量とは比較にならない程度に高いの
で毒性のない安全な抗癌剤である。
【００１４】本発明のツベルシン-５を有効活性成分と
して含む抗癌剤組成物は担体、希釈剤、充填剤、凝集防
止剤、潤滑剤、香味剤など薬剤学的に許容可能な通常の
賦形剤を含む。この組成物は公知の方法によって皮下注
射剤、静脈注射剤などの薬剤学的製剤に製造することが
でき、必要によって非経口的に投与できる。一日投与量
は皮下注射の場合、体重ｋｇ当り０.００１ないし１μ
ｇ、好ましくは０.０１ないし０.５μｇの量で使用する
ことができるが、患者の症状、年齢、性別、体重など色
々な条件によって調節できる。
して含む抗癌剤組成物は担体、希釈剤、充填剤、凝集防
止剤、潤滑剤、香味剤など薬剤学的に許容可能な通常の
賦形剤を含む。この組成物は公知の方法によって皮下注
射剤、静脈注射剤などの薬剤学的製剤に製造することが
でき、必要によって非経口的に投与できる。一日投与量
は皮下注射の場合、体重ｋｇ当り０.００１ないし１μ
ｇ、好ましくは０.０１ないし０.５μｇの量で使用する
ことができるが、患者の症状、年齢、性別、体重など色
々な条件によって調節できる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明する。但し、下記実施例は例示的なもので、本発明
の範囲がこれらのみで限定されるものではない。 〔実施例１〕ツベルシン−５の製造 Ｍ.ツベルクロシス（Ｈ３７Ｒｖ：ＡＴＣＣ ２５６１
８）を２５０ｍｌフラスコ内でサウトン培地〔Ｓａｕｔ
ｏｎ，Ｂ.，Ｓｕｒ ｌａ ｎｕｔｏｉｔｉｏｎｍｉｎｔ
ｅｒａｌｅ ｄｕ ｔｕｂｅｒｃｕｌｕｘ，Ｒｅｓ.８，
Ｉｎｔｅｒｎ.Ｃｏｎｇ.Ａｐｐｌ.Ｃｈｅｍ.，１９，２
６７−２６９（１９１２）〕に接種して３７℃で４週間
培養した。培養菌体３００ｇを約６,０００ｇの水で希
釈し、得られた水浮遊液をオートクレーブ（１５ ｌ
ｂ，１２０℃）で３０分間加熱して多糖体と蛋白との複
合物質を抽出した後、３,５００〜４,５００ｒｐｍで３
０分間遠心分離して上澄液を分離した。上澄液をセイリ
（ｓｅｉｌｙ）装置で濾過し、ろ液を再びサンブラン
（ｓｈａｍｂｌａｎ）濾過器を通過させて細菌体を完全
に除いた。ろ液にスルホサリチル酸を１０％濃度で加え
て遠心分離して黄褐色沈殿物（蛋白成分）を除いた後、
上澄液を透析用半透膜袋に入れて純水中に２〜３日間漬
けてスルホサリチル酸を純水中へ溶出させた。半透膜内
の膠質溶液を濃縮した後、リンタングステン酸を７％濃
度で添加して２次除蛋白処理し、３,５００ｒｐｍで２
０分間遠心分離した。上澄液を透析用半透膜袋に入れて
純水中に３日間漬けて無機成分を除去した。透析液に、
エタノールを透析液量の５倍程度の量で加え、４℃で２
４時間静置して沈殿を得、これをエタノール−水（１：
３）混液で２回洗浄した。継続して洗浄された沈殿を、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８.０）−５ｍＭ
ＥＤＴＡの混液中でフェノール、エーテルおよびエタノ
ールの混液で３回抽出して混入された脂質を除いた後、
バイオ−ゲルＰ４（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ４：Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）カラム（１.
２×６５ｃｍを用いて無機物を蒸留水で除去して本発明
の複合多糖体１００ｍｇを得た。
説明する。但し、下記実施例は例示的なもので、本発明
の範囲がこれらのみで限定されるものではない。 〔実施例１〕ツベルシン−５の製造 Ｍ.ツベルクロシス（Ｈ３７Ｒｖ：ＡＴＣＣ ２５６１
８）を２５０ｍｌフラスコ内でサウトン培地〔Ｓａｕｔ
ｏｎ，Ｂ.，Ｓｕｒ ｌａ ｎｕｔｏｉｔｉｏｎｍｉｎｔ
ｅｒａｌｅ ｄｕ ｔｕｂｅｒｃｕｌｕｘ，Ｒｅｓ.８，
Ｉｎｔｅｒｎ.Ｃｏｎｇ.Ａｐｐｌ.Ｃｈｅｍ.，１９，２
６７−２６９（１９１２）〕に接種して３７℃で４週間
培養した。培養菌体３００ｇを約６,０００ｇの水で希
釈し、得られた水浮遊液をオートクレーブ（１５ ｌ
ｂ，１２０℃）で３０分間加熱して多糖体と蛋白との複
合物質を抽出した後、３,５００〜４,５００ｒｐｍで３
０分間遠心分離して上澄液を分離した。上澄液をセイリ
（ｓｅｉｌｙ）装置で濾過し、ろ液を再びサンブラン
（ｓｈａｍｂｌａｎ）濾過器を通過させて細菌体を完全
に除いた。ろ液にスルホサリチル酸を１０％濃度で加え
て遠心分離して黄褐色沈殿物（蛋白成分）を除いた後、
上澄液を透析用半透膜袋に入れて純水中に２〜３日間漬
けてスルホサリチル酸を純水中へ溶出させた。半透膜内
の膠質溶液を濃縮した後、リンタングステン酸を７％濃
度で添加して２次除蛋白処理し、３,５００ｒｐｍで２
０分間遠心分離した。上澄液を透析用半透膜袋に入れて
純水中に３日間漬けて無機成分を除去した。透析液に、
エタノールを透析液量の５倍程度の量で加え、４℃で２
４時間静置して沈殿を得、これをエタノール−水（１：
３）混液で２回洗浄した。継続して洗浄された沈殿を、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８.０）−５ｍＭ
ＥＤＴＡの混液中でフェノール、エーテルおよびエタノ
ールの混液で３回抽出して混入された脂質を除いた後、
バイオ−ゲルＰ４（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ４：Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）カラム（１.
２×６５ｃｍを用いて無機物を蒸留水で除去して本発明
の複合多糖体１００ｍｇを得た。
【００１６】〔実施例２〕ツベルシン-５の構造分析 実施例１で製造したツベルシン-５の構成単糖体の分析
のために、ツベルシン-５を水に溶かして５００μｇ／
ｍｌの濃度にし、これと、対照群としての各種単糖体の
標準品および空試験液（ｂｌａｎｋ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）とを、英国オックスフォードグリコシステムズ（Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社で開発した
方法を用いて構成単糖体を分析した。
のために、ツベルシン-５を水に溶かして５００μｇ／
ｍｌの濃度にし、これと、対照群としての各種単糖体の
標準品および空試験液（ｂｌａｎｋ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）とを、英国オックスフォードグリコシステムズ（Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社で開発した
方法を用いて構成単糖体を分析した。
【００１７】ツベルシン-５を通常の方法によってｐｅ
ｒ-Ｏ-メチル化、酸加水分解、還元およびアセチル化
し、ｐｅｒ-Ｏ-トリメチルシリル（ＴＭＳ）メチルグリ
コシドに変化させてＧＬＣ−ＭＳシステムでそれぞれの
単糖体を分離および確認した。それぞれのＴＭＳ−メチ
ルグリコシドの定量分析にはＦＩＤ（ｆｌａｍｅ ｉｏ
ｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用した。分
析の結果として、ツベルシン-５複合多糖体に存在する
グリコシル残基および比率と、該多糖体を構成する単糖
体の種類および相対比率は次の表１と表２にそれぞれ示
した。
ｒ-Ｏ-メチル化、酸加水分解、還元およびアセチル化
し、ｐｅｒ-Ｏ-トリメチルシリル（ＴＭＳ）メチルグリ
コシドに変化させてＧＬＣ−ＭＳシステムでそれぞれの
単糖体を分離および確認した。それぞれのＴＭＳ−メチ
ルグリコシドの定量分析にはＦＩＤ（ｆｌａｍｅ ｉｏ
ｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用した。分
析の結果として、ツベルシン-５複合多糖体に存在する
グリコシル残基および比率と、該多糖体を構成する単糖
体の種類および相対比率は次の表１と表２にそれぞれ示
した。
【００１８】
【表１】グリコシル残基 モル％ ｔ−Ａｒａｆ ９.４ ２−Ａｒａｆ ８.１ ５−Ａｒａｆ ４４.１ ３,５−Ａｒａｆ ６.２ ２,５−Ａｒａｆ ０.１ ｔ−Ｍａｎｐ ２.２ ４−Ｍａｎｐ １７.３ ６−Ｍａｎｐ ４.１ ２,６−Ｍａｎｐ ３.１ ｔ−Ｇａｌｆ ０.１ ６−Ｇａｌｆ ２.０ ２−Ｇａｌｆ ０.１ ６−Ｇｌｕｐ ３.２
【００１９】
【表２】単糖体 含量比（モル％） アラビノース ６７.９ マンノース ２６.７ グルコース ３.２ ガラクトース ２.２
【００２０】前記表１および表２に示したように、ツベ
ルシン-５多糖体はアラビノマンナン構造を示すが、こ
れは他の結核菌由来の多糖体構造と類似した傾向であ
る。また、４−結合マンノピラノース（Ｍａｎｐ）残基
が存在するという事実と共に、アラビノースおよびマン
ノースが多量に存在し、次いでグルコースとガラクトー
スが少量に存在することが明らかになった。
ルシン-５多糖体はアラビノマンナン構造を示すが、こ
れは他の結核菌由来の多糖体構造と類似した傾向であ
る。また、４−結合マンノピラノース（Ｍａｎｐ）残基
が存在するという事実と共に、アラビノースおよびマン
ノースが多量に存在し、次いでグルコースとガラクトー
スが少量に存在することが明らかになった。
【００２１】次いで、１０ｍｇのツベルシン-５を６Ｎ
塩酸に溶かし、７０℃で２４時間放置して加水分解した
後、６Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和して、パルス電流
検出機（ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ：ｐａｄ）が装着されたＢｉｏ−ＬＣを用
いて高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ
Ｃ）を実施した。この際、Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡガー
ドカラム（３×２５ｍｍ）が付着されたダイオネクス
（Ｄｉｏｎｅｘ）Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ１（４×２５
０ｍｍ）カラムを使用し、ダイオネクス社のパルス電流
検出機に金で被覆された電極を検出機として使用した。
試料注入ループの容量は２６μｌ，ｐａｄのパルス電圧
はＥ1＝０.０５Ｖ，ｔ1＝４８０ｍｓ，Ｅ2＝０.６０
Ｖ，ｔ2＝１２０ｍｓ，Ｅ3＝−８０Ｖ，ｔ3＝６０ｍｓ
にし、検出機の反応時間は１秒であった。溶出剤として
は１Ｍ酢酸ナトリウム（溶出剤１）、２００ｍＭまたは
３７５ｍＭの水酸化ナトリウム（溶出剤２）、そして蒸
留水（溶出剤３）を使用し、溶出剤の勾配プログラムは
次の通りであった： （１）プログラムＡ： 溶出剤１：０分で５％、４５分で５０％ 溶出剤２（２００ｍＭ ＮａＯＨ）：０分から４５分ま
で５０％ （２）プログラムＢ： 溶出剤１：０分で５％、５分で１５％、２０分で２５
％、４５分で３５％、６５分で４５％ 溶出剤２（３７５ｍＭ ＮａＯＨ）：０分から６５分ま
で４０％ 流速は１ｍｌ／分で一定に維持した。
塩酸に溶かし、７０℃で２４時間放置して加水分解した
後、６Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和して、パルス電流
検出機（ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ：ｐａｄ）が装着されたＢｉｏ−ＬＣを用
いて高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ
Ｃ）を実施した。この際、Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡガー
ドカラム（３×２５ｍｍ）が付着されたダイオネクス
（Ｄｉｏｎｅｘ）Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ１（４×２５
０ｍｍ）カラムを使用し、ダイオネクス社のパルス電流
検出機に金で被覆された電極を検出機として使用した。
試料注入ループの容量は２６μｌ，ｐａｄのパルス電圧
はＥ1＝０.０５Ｖ，ｔ1＝４８０ｍｓ，Ｅ2＝０.６０
Ｖ，ｔ2＝１２０ｍｓ，Ｅ3＝−８０Ｖ，ｔ3＝６０ｍｓ
にし、検出機の反応時間は１秒であった。溶出剤として
は１Ｍ酢酸ナトリウム（溶出剤１）、２００ｍＭまたは
３７５ｍＭの水酸化ナトリウム（溶出剤２）、そして蒸
留水（溶出剤３）を使用し、溶出剤の勾配プログラムは
次の通りであった： （１）プログラムＡ： 溶出剤１：０分で５％、４５分で５０％ 溶出剤２（２００ｍＭ ＮａＯＨ）：０分から４５分ま
で５０％ （２）プログラムＢ： 溶出剤１：０分で５％、５分で１５％、２０分で２５
％、４５分で３５％、６５分で４５％ 溶出剤２（３７５ｍＭ ＮａＯＨ）：０分から６５分ま
で４０％ 流速は１ｍｌ／分で一定に維持した。
【００２２】標準液として既知の各種の炭水化物標準品
の溶液を用い、得られたピーク面積をμｇまたはμｍｏ
ｌに分けて補正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）した。図１
は本発明のツベルシン-５を酸加水分解してパルス電流
検出機が装着されたＢｉｏ−ＬＣで分析した結果を示
す。図１からみるように、ツベルシン-５は単糖体およ
び多様な長さを有する多糖体の混合物であることを確認
し、溶出位置にしたがって炭水化物の重合度の同定が可
能であった。これを４種類の分画に分取して分析を継続
した。
の溶液を用い、得られたピーク面積をμｇまたはμｍｏ
ｌに分けて補正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）した。図１
は本発明のツベルシン-５を酸加水分解してパルス電流
検出機が装着されたＢｉｏ−ＬＣで分析した結果を示
す。図１からみるように、ツベルシン-５は単糖体およ
び多様な長さを有する多糖体の混合物であることを確認
し、溶出位置にしたがって炭水化物の重合度の同定が可
能であった。これを４種類の分画に分取して分析を継続
した。
【００２３】分取した各アラビノマンナン分画を１ｍｌ
の2Ｈ2Ｏに溶かした後、アセトン１μｌを内部標準物質
として添加してＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣＥ−３０
０）で分析した結果、アセトンのピークを基準として13
Ｃ-ＮＭＲではδ３１.４、1Ｈ-ＮＭＲではδ２.０４の
領域でピークを検出した。図２は本発明のツベルシン−
５中に含有されたアラビノマンナン分画１，２，３およ
び４の1Ｈ-ＮＭＲ分析結果で、分画１と３から糖鎖残基
の存在を確認することができた（分画１と３で、下側の
小さい矢印がβ−グルコシル残基のＨ−１と同定された
信号を意味する）。それぞれの多糖体に対応した他のア
ノマープロトンはδ５.０−４.５範囲内で信号を示す
が、これはα−またはβ−フラノシルおよびα−ピラノ
シル残基に該当するものである。
の2Ｈ2Ｏに溶かした後、アセトン１μｌを内部標準物質
として添加してＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣＥ−３０
０）で分析した結果、アセトンのピークを基準として13
Ｃ-ＮＭＲではδ３１.４、1Ｈ-ＮＭＲではδ２.０４の
領域でピークを検出した。図２は本発明のツベルシン−
５中に含有されたアラビノマンナン分画１，２，３およ
び４の1Ｈ-ＮＭＲ分析結果で、分画１と３から糖鎖残基
の存在を確認することができた（分画１と３で、下側の
小さい矢印がβ−グルコシル残基のＨ−１と同定された
信号を意味する）。それぞれの多糖体に対応した他のア
ノマープロトンはδ５.０−４.５範囲内で信号を示す
が、これはα−またはβ−フラノシルおよびα−ピラノ
シル残基に該当するものである。
【００２４】図３は本発明のツベルシン−５中に含有し
たアラビノマンナン分画１と３との13Ｃ-ＮＭＲ分析結
果で、既に公開されたＭ.ツベルクロシスの可溶性アラ
ビノマンナンの同定結果〔Ｄａｆｆｅ，Ｍ.，Ｂｒｅｎ
ｎａｎ，Ｐ.Ｊ.およびＭ.ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ.Ｂｉｏｌ.
Ｃｈｅｍ.，２６５，６７３４−６７４３（１９９
０）〕に基づいて、アラビナン鎖の非還元性末端に該当
する共鳴値を求めることができた。即ち、末端ｔ−β−
Ａｒａｆ（Ｃ−１，δ １０１−１０２）がα−Ａｒａ
ｆ（Ｃ−１，δ １０６−１０８）の２番位置に結合さ
れており、この二糖体は、またα−Ａｒａｆ残基の３と
５番位置に結合されていることが分かった。残っている
ＡｒａとＭａｎ残基のフラノイド特性もアノマー炭素共
鳴位置（δ−１０７−１０９）で確認された。即ち、ｔ
−β−Ａｒａｆと２−結合形α−ＡｒａｆのＣ−１、そ
の次にアラビノース残基とＣ−２、そしてｔ−β−Ａｒ
ａｆのＣ−５位置の核磁気共鳴資料は前記文献で既に発
表されたが、これと非常に類似であった。フラノシル残
基の場合、２−、３−および５−結合形Ａｒａｆ残基に
対する情報と５−結合形Ｇａｌｆ残基に対する情報は既
存の資料を用い、δ １０８と１０９との間に現れるＣ
−１共鳴の大部分がα−Ａｒａｆ／β−Ｇａｌｆ単位に
該当することが分かった。〔Ｇｏｒｉｎ，Ｐ.Ａ.Ｊ.お
よびＭ.Ｍａｚｕｌｅｋ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒ
ｅｓ.，４８，１７１−１８６（１９７６）；Ｊｏｓｅ
ｌｅａｕ，Ｊ.Ｐ.，Ｃｈａｍｂａｔ，Ｇ.，Ｖｉｇｎｏ
ｎ，Ｍ.およびＦ.Ｂａｒｎｏｕｄ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅ Ｒｅｓ.，５８，１６５−１７５（１９７７）；
およびＭｉｚｕｔａｎｉ，Ｋ.，Ｋａｓａｉ，Ｒ.，Ｎａ
ｋａｍｕｒａ，Ｍ.およびＯ.Ｔａｎａｋａ，Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ.，１８５，２７−３８（１９８
９）〕。Ｍ.ツベルクロシスの細胞壁成分中二つの可溶
性アラビノマンナン分画に対応した13Ｃ-ＮＭＲ結果が
相互類似したのは、それぞれの分画が相互同じ構造的モ
チブを有するのを示唆する。結果的にこれらアラビノマ
ンナン成分は少なくとも次の三つの構造を有することが
確認された： ５−結合形α−Ａｒａｆ残基、 分枝位置で５−結合形α−Ａｒａｆ残基で置換され
た、分枝された（３→５）−結合形α−Ａｒａｆ単位、
および 二糖類のβ−Ａｒａｆ（１→２）−α−Ａｒａｆと２
か所が同時に置換された（３→５）−結合形α−Ａｒａ
ｆ単位。
たアラビノマンナン分画１と３との13Ｃ-ＮＭＲ分析結
果で、既に公開されたＭ.ツベルクロシスの可溶性アラ
ビノマンナンの同定結果〔Ｄａｆｆｅ，Ｍ.，Ｂｒｅｎ
ｎａｎ，Ｐ.Ｊ.およびＭ.ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ.Ｂｉｏｌ.
Ｃｈｅｍ.，２６５，６７３４−６７４３（１９９
０）〕に基づいて、アラビナン鎖の非還元性末端に該当
する共鳴値を求めることができた。即ち、末端ｔ−β−
Ａｒａｆ（Ｃ−１，δ １０１−１０２）がα−Ａｒａ
ｆ（Ｃ−１，δ １０６−１０８）の２番位置に結合さ
れており、この二糖体は、またα−Ａｒａｆ残基の３と
５番位置に結合されていることが分かった。残っている
ＡｒａとＭａｎ残基のフラノイド特性もアノマー炭素共
鳴位置（δ−１０７−１０９）で確認された。即ち、ｔ
−β−Ａｒａｆと２−結合形α−ＡｒａｆのＣ−１、そ
の次にアラビノース残基とＣ−２、そしてｔ−β−Ａｒ
ａｆのＣ−５位置の核磁気共鳴資料は前記文献で既に発
表されたが、これと非常に類似であった。フラノシル残
基の場合、２−、３−および５−結合形Ａｒａｆ残基に
対する情報と５−結合形Ｇａｌｆ残基に対する情報は既
存の資料を用い、δ １０８と１０９との間に現れるＣ
−１共鳴の大部分がα−Ａｒａｆ／β−Ｇａｌｆ単位に
該当することが分かった。〔Ｇｏｒｉｎ，Ｐ.Ａ.Ｊ.お
よびＭ.Ｍａｚｕｌｅｋ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒ
ｅｓ.，４８，１７１−１８６（１９７６）；Ｊｏｓｅ
ｌｅａｕ，Ｊ.Ｐ.，Ｃｈａｍｂａｔ，Ｇ.，Ｖｉｇｎｏ
ｎ，Ｍ.およびＦ.Ｂａｒｎｏｕｄ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅ Ｒｅｓ.，５８，１６５−１７５（１９７７）；
およびＭｉｚｕｔａｎｉ，Ｋ.，Ｋａｓａｉ，Ｒ.，Ｎａ
ｋａｍｕｒａ，Ｍ.およびＯ.Ｔａｎａｋａ，Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ.，１８５，２７−３８（１９８
９）〕。Ｍ.ツベルクロシスの細胞壁成分中二つの可溶
性アラビノマンナン分画に対応した13Ｃ-ＮＭＲ結果が
相互類似したのは、それぞれの分画が相互同じ構造的モ
チブを有するのを示唆する。結果的にこれらアラビノマ
ンナン成分は少なくとも次の三つの構造を有することが
確認された： ５−結合形α−Ａｒａｆ残基、 分枝位置で５−結合形α−Ａｒａｆ残基で置換され
た、分枝された（３→５）−結合形α−Ａｒａｆ単位、
および 二糖類のβ−Ａｒａｆ（１→２）−α−Ａｒａｆと２
か所が同時に置換された（３→５）−結合形α−Ａｒａ
ｆ単位。
【００２５】ツベルシン-５のアラビノマンナン成分の
より正確な構造分析のために、ｐｅｒ-Ｏ-メチル化され
たアラビノマンナン成分を１Ｍ ＣＦ3ＣＯＯＨで７５℃
で１時間処理して部分的に酸加水分解させた後、ＮａＢ
2Ｈ4で還元させてオリゴ糖アルジトールを得、これから
ｐｅｒ-Ｏ-アルキル化されたオリゴ糖アルジトールを調
製してＦＡＢ−ＭＳで分析した。
より正確な構造分析のために、ｐｅｒ-Ｏ-メチル化され
たアラビノマンナン成分を１Ｍ ＣＦ3ＣＯＯＨで７５℃
で１時間処理して部分的に酸加水分解させた後、ＮａＢ
2Ｈ4で還元させてオリゴ糖アルジトールを得、これから
ｐｅｒ-Ｏ-アルキル化されたオリゴ糖アルジトールを調
製してＦＡＢ−ＭＳで分析した。
【００２６】図４はツベルシン-５中に含有したオリゴ
糖アルジトールの陽イオンＦＡＢ−ＭＳ分析結果で、Ｍ
＋Ｎａ＋またはＭ＋ＮＨ４＋の大きい分子イオンピーク
を多数示しているが、ここで４０８は（Ｍａｎ）2、６
１２は（Ｍａｎ）3、９３２は（Ｍａｎ）3（Ａｒａ）、
１８６２は（Ｍａｎ）4（Ａｒａ）6に該当し、多量存在
する２２７０は（Ｍａｎ）6（Ａｒａ）6（Ｇｌｕ）（Ｇ
ａｌ）、そして２８８２は（Ｍａｎ）9（Ａｒａ）9（Ｇ
ｌｕ）（Ｇａｌ）の構造を各々有するものに対応する。
糖アルジトールの陽イオンＦＡＢ−ＭＳ分析結果で、Ｍ
＋Ｎａ＋またはＭ＋ＮＨ４＋の大きい分子イオンピーク
を多数示しているが、ここで４０８は（Ｍａｎ）2、６
１２は（Ｍａｎ）3、９３２は（Ｍａｎ）3（Ａｒａ）、
１８６２は（Ｍａｎ）4（Ａｒａ）6に該当し、多量存在
する２２７０は（Ｍａｎ）6（Ａｒａ）6（Ｇｌｕ）（Ｇ
ａｌ）、そして２８８２は（Ｍａｎ）9（Ａｒａ）9（Ｇ
ｌｕ）（Ｇａｌ）の構造を各々有するものに対応する。
【００２７】以上の結果から得たツベルシン-５の構造
を次の表３に示した。下記表３でＸ部位にはグルカン、
即ちグルコース残基またはガラクトースを含有する糖鎖
がくることもできる。本発明のツベルシン-５中で最も
大きい分子量は７,０００であり、２,５００ないし３,
５００の間のものがもっとも多く、５,０００〜７,００
０の間のものも多少含まれる。
を次の表３に示した。下記表３でＸ部位にはグルカン、
即ちグルコース残基またはガラクトースを含有する糖鎖
がくることもできる。本発明のツベルシン-５中で最も
大きい分子量は７,０００であり、２,５００ないし３,
５００の間のものがもっとも多く、５,０００〜７,００
０の間のものも多少含まれる。
【００２８】
【表３】
【００２９】前記表３で、---は連続するアラビノース
残基を表し、Ｘは分子量が３,０００以上のポリサッカ
ライド中のグルコースおよびガラクトースの存在を意味
する。分子量が３,５００以上のポリサッカライドはポ
リサッカライド全体の１０％未満である。
残基を表し、Ｘは分子量が３,０００以上のポリサッカ
ライド中のグルコースおよびガラクトースの存在を意味
する。分子量が３,５００以上のポリサッカライドはポ
リサッカライド全体の１０％未満である。
【００３０】（毒性試験）マウスおよびラットに対する急性毒性試験 前記製造例で製造したツベルシン-５を０.９％生理食塩
水に２ｍｇ／ｍｌの量で溶解させ、６週齢のマウス（Ｉ
ＣＲ ｍｉｃｅ；２０〜２５ｇ）およびラット（ＳＤ ｒ
ａｔ；１５０ｇ）に色々な用量で静脈注射または皮下注
射（１回または連続投与）した後、生存可否を観察して
その結果を表４に示した。
水に２ｍｇ／ｍｌの量で溶解させ、６週齢のマウス（Ｉ
ＣＲ ｍｉｃｅ；２０〜２５ｇ）およびラット（ＳＤ ｒ
ａｔ；１５０ｇ）に色々な用量で静脈注射または皮下注
射（１回または連続投与）した後、生存可否を観察して
その結果を表４に示した。
【００３１】
【表４】
【００３２】前記表４から、ツベルシン−５のＬＤ
50は、マウスとラットの全ての場合において静脈注射し
た際は２０,０００μｇ／ｋｇ以上、皮下注射した際は
５０,０００μｇ／ｋｇ以上であることが分かる。従っ
て、ヒトに治療的に有効な１日投与量が体重ｋｇ当り
０.００１ないし１μｇ、好ましくは０.０１ないし０.
５μｇである点を考慮する際、ツベルシン−５は急性毒
性の側面においては安全なものとみなされる。
50は、マウスとラットの全ての場合において静脈注射し
た際は２０,０００μｇ／ｋｇ以上、皮下注射した際は
５０,０００μｇ／ｋｇ以上であることが分かる。従っ
て、ヒトに治療的に有効な１日投与量が体重ｋｇ当り
０.００１ないし１μｇ、好ましくは０.０１ないし０.
５μｇである点を考慮する際、ツベルシン−５は急性毒
性の側面においては安全なものとみなされる。
【００３３】また、前記のようにツベルシン−５をマウ
スとラットとに投与し１４日間一般状態を観察して体重
の変化を測定し、１５日目に全動物を犠牲・剖検して、
肝臓、腎臓、脾臓、胃、肺および心臓を肉眼で観察し、
１０％ホルマリンに固定させ病理学的標本を作成し、ヘ
マトキシリン−エオシン染色を行い顕微鏡で観察した。
その結果、いづれの場合においても異常は発見されなか
った。
スとラットとに投与し１４日間一般状態を観察して体重
の変化を測定し、１５日目に全動物を犠牲・剖検して、
肝臓、腎臓、脾臓、胃、肺および心臓を肉眼で観察し、
１０％ホルマリンに固定させ病理学的標本を作成し、ヘ
マトキシリン−エオシン染色を行い顕微鏡で観察した。
その結果、いづれの場合においても異常は発見されなか
った。
【００３４】（効果試験）ツベルシン-５単独およびツベルシン-５とシクロホスフ
ァミド（シトキサン）との併用効果 平均体重２２ｇの白色雄性マウス（ＩＣＲ ｍｉｃｅ；
２０〜２５ｇ）５６匹を８匹づつ７個群に分けて分離収
容し、各動物に対してベイリッフの方法〔Ｂａｉｌｌｉ
ｆ，Ｒ.Ｎ.，Ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｉｎ
ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５，５
５４−５５８（１９５４）〕によって１０％エルリヒ
（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腹水癌細胞液０.２ｍｌ（１.４×１
０７細胞含有）を背面皮下に接種した。
ァミド（シトキサン）との併用効果 平均体重２２ｇの白色雄性マウス（ＩＣＲ ｍｉｃｅ；
２０〜２５ｇ）５６匹を８匹づつ７個群に分けて分離収
容し、各動物に対してベイリッフの方法〔Ｂａｉｌｌｉ
ｆ，Ｒ.Ｎ.，Ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｉｎ
ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５，５
５４−５５８（１９５４）〕によって１０％エルリヒ
（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腹水癌細胞液０.２ｍｌ（１.４×１
０７細胞含有）を背面皮下に接種した。
【００３５】接種後３日目に、７個群の各動物を下記の
試験液で処理した。０.２ｍｌの０.９％生理食塩水を腹
腔に注射した対照群、ツベルシン-５を０.９％生理食塩
水に１μｇ／ｍｌの量で溶解させ皮下に注射したツベル
シン-５単独投与群（１）、ツベルシン-５を０.９％生
理食塩水に２μｇ／ｍｌの量で溶解させ皮下に注射した
ツベルシン-５単独投与群（２）、体重ｋｇ当り２５ｍ
ｇの市販抗癌剤シトキサンを０.２ｍｌの水に溶解させ
腹腔に注射したシトキサン単独投与群（３）、体重ｋｇ
当り５０ｍｇのシトキサンを０.２ｍｌの水に溶解させ
腹腔に注射したシトキサン単独投与群（４）、体重ｋｇ
当り２５ｍｇのシトキサン腹腔注射と１μｇのツベルシ
ン-５皮下注射とを併行した投与群（５）、そして体重
ｋｇ当り５０ｍｇのシトキサン腹腔注射と１μｇのツベ
ルシン-５皮下注射とを併行した投与群（６）の７ヶ群
を処理するにあたり、ツベルシン-５は動物の背面皮下
に、シトキサンは腹腔内に各々６回づつ注射した。
試験液で処理した。０.２ｍｌの０.９％生理食塩水を腹
腔に注射した対照群、ツベルシン-５を０.９％生理食塩
水に１μｇ／ｍｌの量で溶解させ皮下に注射したツベル
シン-５単独投与群（１）、ツベルシン-５を０.９％生
理食塩水に２μｇ／ｍｌの量で溶解させ皮下に注射した
ツベルシン-５単独投与群（２）、体重ｋｇ当り２５ｍ
ｇの市販抗癌剤シトキサンを０.２ｍｌの水に溶解させ
腹腔に注射したシトキサン単独投与群（３）、体重ｋｇ
当り５０ｍｇのシトキサンを０.２ｍｌの水に溶解させ
腹腔に注射したシトキサン単独投与群（４）、体重ｋｇ
当り２５ｍｇのシトキサン腹腔注射と１μｇのツベルシ
ン-５皮下注射とを併行した投与群（５）、そして体重
ｋｇ当り５０ｍｇのシトキサン腹腔注射と１μｇのツベ
ルシン-５皮下注射とを併行した投与群（６）の７ヶ群
を処理するにあたり、ツベルシン-５は動物の背面皮下
に、シトキサンは腹腔内に各々６回づつ注射した。
【００３６】前記のように処理した動物を接種後１５日
目にエーテル麻酔下に断頭して、背部に発生した固形癌
種を注意深く周囲組織と区別して切取した後、癌組織の
みを分離して測量した。各動物群の癌組織の重量は平均
値と誤差を計算して平均値の差はｔ−テストで検証し
た。その結果は下記表５に示した。
目にエーテル麻酔下に断頭して、背部に発生した固形癌
種を注意深く周囲組織と区別して切取した後、癌組織の
みを分離して測量した。各動物群の癌組織の重量は平均
値と誤差を計算して平均値の差はｔ−テストで検証し
た。その結果は下記表５に示した。
【００３７】
【表５】 実験動物群 動物数 癌組織重さの平均値 相対重量＊ （平均重さ±標準偏差） 対照群 ８ ３.２５±０.１２ １００ １ ８ ２.３５±０.０６ ７２.３ ２ ８ ２.２５±０.０５ ６９.２ ３ ８ ２.３２±０.０５ ７１.３ ４ ８ ２.１５±０.０４ ６６.１ ５ ８ １.５１±０.０３ ４６.４ ６ ８ １.１０±０.０２ ３３.８ ＊：対照群の癌組織重さを１００にしたときである。
【００３８】前記表５でみるように、ツベルシン-５単
独およびシトキサン単独投与群においては、ほぼ同じ程
度の癌組織減少を示したが、二つを併行投与した場合は
癌組織が著しく減少した。この結果から本発明のツベル
シン-５を既存の抗癌剤と併用すれば癌治療にもっとも
効果的であることが分かる。
独およびシトキサン単独投与群においては、ほぼ同じ程
度の癌組織減少を示したが、二つを併行投与した場合は
癌組織が著しく減少した。この結果から本発明のツベル
シン-５を既存の抗癌剤と併用すれば癌治療にもっとも
効果的であることが分かる。
【００３９】各種癌患者に対したツベルシン-５の効果
検索 前記製造例で製造したツベルシン-５を０.９％生理食塩
水に２μｇ／ｍｌの量で溶解させて各種の癌患者の皮下
に毎日注射し、患者の臨床症状と各種検査学的所見を継
続的に観察した。
検索 前記製造例で製造したツベルシン-５を０.９％生理食塩
水に２μｇ／ｍｌの量で溶解させて各種の癌患者の皮下
に毎日注射し、患者の臨床症状と各種検査学的所見を継
続的に観察した。
【００４０】その結果、ツベルシン-５は早ければ４０
日以後から有効性を示し、場合によっては数年内抗癌性
が持続した。１９８５年から１９９５年までの間に治療
した各種癌患者らの中追跡が可能であった１００名（男
６４名；女３６名）に対するツベルシン-５の効果を下
記表６に示す。
日以後から有効性を示し、場合によっては数年内抗癌性
が持続した。１９８５年から１９９５年までの間に治療
した各種癌患者らの中追跡が可能であった１００名（男
６４名；女３６名）に対するツベルシン-５の効果を下
記表６に示す。
【００４１】
【表６】 癌種類 性別 患者数 一部腫瘍の 臨床症状の 無反応 衰退 好転 肺癌 男 １４ ３ ７ ４ 女 ６ １ ３ ２ 胃癌 男 ２７ ３ １６ ８ 女 １１ ２ ６ ３ 肝癌 男 １６ ２ ９ ５ 女 ６ − ３ ３ 膽道癌 男 ２ １ １ ０ 女 ４ １ ２ １ 黒色腫 男 ５ ３ ２ ０ 女 ３ １ １ １ 子宮頸部癌 女 ６ ２ ３ １ 総 計 １００ １９ ５３ ２８ 前記表６でみるように、各種癌患者１００名の中１９名
が一部癌腫瘍の衰退の徴候を示し、５３名においては症
状が好転され、２８名は反応を示さなかった。
が一部癌腫瘍の衰退の徴候を示し、５３名においては症
状が好転され、２８名は反応を示さなかった。
【００４２】
【発明の効果】以上の試験結果から、本発明のツベルシ
ン-５は毒性または副作用が殆どない効果的な抗癌剤と
して使用でき得ることが分かる。
ン-５は毒性または副作用が殆どない効果的な抗癌剤と
して使用でき得ることが分かる。
【図１】 パルス電流検出機装着Ｂｉｏ−ＬＣで分析し
た本発明のツベルシン-５の酸加水分解物のクロマトグ
ラム
た本発明のツベルシン-５の酸加水分解物のクロマトグ
ラム
【図２】 本発明のツベルシン-５中に含有されたアラ
ビノマンナン分画１，２，３および４の1Ｈ-ＮＭＲ分析
チャート
ビノマンナン分画１，２，３および４の1Ｈ-ＮＭＲ分析
チャート
【図３】 本発明のツベルシン-５中に含有されたアラ
ビノマンナン分画１と３の13Ｃ-ＮＭＲ分析チャート
ビノマンナン分画１と３の13Ｃ-ＮＭＲ分析チャート
【図４】 本発明のツベルシン-５中に含有されたオリ
ゴ糖アルジトールの陽イオンＦＡＢ−ＭＳ分析チャート
ゴ糖アルジトールの陽イオンＦＡＢ−ＭＳ分析チャート
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鄭 鍾▲ちゃん▼ 大韓民国慶尚北道大邱廣域市壽城区泛魚 ４洞300番地ガードンハイツ１次101− 601 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C08B 37/00 A61K 31/715 ADU A61K 35/74 C12P 19/04 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 ミコバクテリウム・ツベルクロシスから
分離した、直鎖または側鎖の形態でグリコシド結合され
たマンノース、アラビノース、グルコースおよびガラク
トースを必須構成単糖体成分とする分子量約７,０００
以下の複合多糖体。 - 【請求項２】 分子量が２,５００ないし３,５００であ
ることを特徴とする請求項１に記載の複合多糖体。 - 【請求項３】 ミコバクテリウム・ツベルクロシス菌を
培養して得られる菌体の水浮遊液を加圧下加熱後濾過し
て濾液を得る過程と、前記濾液にスルホサリチル酸を加
えることによって生成される沈殿を除いた溶液を透析し
て第一透析液を得る過程と、前記第一透析液にリンタン
グステン酸を加えることによって生成される沈殿を除い
た溶液を透析して第二透析液を得る過程と、前記第二透
析液にエタノールを加えることによって得られる沈殿を
エタノールとエーテルの混合物で洗浄する過程とを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の複合多糖体の製造方
法。 - 【請求項４】 請求項１記載の複合多糖体および薬剤学
的に許容可能な賦形剤を含む抗癌剤組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950048616A KR0173362B1 (ko) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | 마이코박테리움 투버쿨로시스로 부터 추출한 복합다당체 및 이의 제조방법 |
| KR1995-48616 | 1995-12-12 | ||
| PCT/KR1997/000109 WO1998056941A1 (en) | 1995-12-12 | 1997-06-10 | Carbohydrate complex extracted from mycobacterium tuberculosis and process for the preparation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09176206A JPH09176206A (ja) | 1997-07-08 |
| JP2790447B2 true JP2790447B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=26631476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8167147A Expired - Fee Related JP2790447B2 (ja) | 1995-12-12 | 1996-06-27 | ミコバクテリウム・ツベルクロシスから抽出した複合多糖体およびその製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0991773B1 (ja) |
| JP (1) | JP2790447B2 (ja) |
| AU (1) | AU3049797A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2205226T3 (es) * | 1997-06-10 | 2004-05-01 | Tai Ho Chung | Complejo de carbohidratos extraido de mycobacterium tuberculosis y procedimiento para la preparacion del mismo. |
| JP4703574B2 (ja) * | 2005-01-19 | 2011-06-15 | 日本クリニック株式会社 | カキ肉エキスの製造方法 |
| JP4877045B2 (ja) | 2007-04-25 | 2012-02-15 | トヨタ自動車株式会社 | 植物系繊維材料の分解方法 |
| JP4240138B1 (ja) | 2007-09-05 | 2009-03-18 | トヨタ自動車株式会社 | 植物系繊維材料の糖化分離方法 |
| JP4609526B2 (ja) | 2008-06-03 | 2011-01-12 | トヨタ自動車株式会社 | 植物系繊維材料の糖化分離方法 |
| JP5114298B2 (ja) | 2008-06-03 | 2013-01-09 | トヨタ自動車株式会社 | 植物系繊維材料の糖化分離方法 |
-
1996
- 1996-06-27 JP JP8167147A patent/JP2790447B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-10 AU AU30497/97A patent/AU3049797A/en not_active Abandoned
- 1997-06-10 EP EP97925325A patent/EP0991773B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0991773A1 (en) | 2000-04-12 |
| AU3049797A (en) | 1998-12-30 |
| EP0991773B1 (en) | 2003-08-13 |
| JPH09176206A (ja) | 1997-07-08 |
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