FI88109C - Foerfarande foer framstaellning av loesligt fosforylerat glukan - Google Patents

Description

88109

Menetelmä liukoisen fosforyloidun glukaanin valmistamiseksi 1. Keksinnön ala

Keksintö koskee uutta liukoisten glukaanien joukkoa ja tarkemmin sanottuna liukoisia f os fory1oituja glukaaneja, joissa poly-[beeta-(1-3)glukopyranoosi1-ketjut ovat eriasteisesti fosforyloituneita, sekä menetelmiä näiden uusien liukoisten fosforyloituneiden glukaanien valmistamiseksi erilaisista mikro-organismeieta, joista mainittakoon Saccharomyces cere-visiae ja Coriolus versicolor. Keksinnön mukaiset uudet liukoiset fosforyloidut glukaanit ovat myrkkyvaikutuksettomia, ei-immunogeenisiä ja oleellisesti ottaen ei-pyrogeenisiä ja ne saavat aikaan voimakkaita immunologisia vasteita, kun niitä annetaan eläimille ja ihmisille in vivo, joista vasteista silmiinpistävin on makrofagiaktiivisuuden immunostlmuloitu-minen niin, että seurauksena on immunoreaktiivisten solujen aktivoituminen. Lisäksi näillä liukoisilla fosforyloidui1la glukaaneilla on sytostaattinen vaikutus rauhassyopälajeihin ja sarkoomiin in vivo sekä lymfosyyttisiin leukemiasoluihin in vitro.

2. Keksinnön tausta

Termi "glukaani" on yleisnimi erilaisille luonnossa esiintyville homopolysakkarideille tai polyglukooseille, joista mainittakoon mm. sellaiset polymeerit kuin selluloosa, amyloosi, glukogeeni, laminariaanit ja tärkkelys. Glukaani koostuu haarautuneista ja haarautumattomista glukoosiketjuista, joissa glukooslykslköt ovat liittyneet toisiinsa 1-3-, 1-4- ja 1-6-g lukos id i s 111 a sidoksilla, jotka voivat, olla joko aitaisi hosts t y y p i ’ is Tässä selostuksessa tarkoitetaan "hiukkasmaisella glukaanil-la" veteeniiukenematonta hiukkasmaieta (noin 1-3 ^u) poly-glukoosia, kuten sellaista, joka on saatu Saccharomyces ce-revisiae-hiivan solunseinästä. Hiukkasmainen glukaani on 2 88109 makromolekulaarista ja koostuu glukopyranoosiyksiköistä, jotka ovat liittyneet yhteen beeta-l-3-gl ukosidi Sten sidosten sarjalla niin, että muodostuu suljettu ketju (Hassid et ai., 1941, J. Amer. Chem. Soc. £3: 295-298; Di Luzio et ai., 1979, Int'l J. Cancer 24^ 773-779). Röntgendiffraktiotutki-mukset ovat osoittaneet, että hiukkasmaiset glukaanit esiintyvät koi misäikeiston heliksien muodossa (Sarko et ai.. 1983, Biochem. Soc. Trans. H_: 139-142 ).

2.1. Hiukkasmaisten glukaanien immunobioioginen aktiivisuus Hiukkasmainen glukaani aktivoi voimakkaasti makrofagi/mono-syyttisoiusarjaa, komplementtia sekä lymfosyyttisiä B-soluja. Näin ollen hiukkasmaisei 1 a glukaanilla on syvälle menevä vaikutus retikuloendoteliaaliseen järjestelmään ja immuunijärjestelmään.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hiukkasmaisen glu-kaanin antaminen erilaisille koe-eläimille in vivo indusoi syvälle meneviä immunobioiogisia tapahtumia, joista mainittakoon mm. seurauvat: (1) monosyyttion Ja rnakrofagien proliferation eli lisääntymisen kohoaminen (Deimann ja Fahimi, 1979, J. Exper. Med. 149: 883-897; Ashworth et ai., 1963, Exper. Molec. Pathol., Supp. 1_: 83-103); (2) rnakrofagien fagosy-toivan toiminnan kohoaminen (Riggi ja Di Luzio, 1961, Am. J. physiol. 200: 297-300); (3) rnakrofagien eritysaktiivisuu-den kohoaminen (Bärlin et ai., 1981, Heterogeneity of Mononuclear Phagocytes, Forster ja Landy, toim. Academic Press,

New York, s. 243-252); (4) rnakrofagien koon suureneminen (Patchen ja Lotzova, 1980, Exper. Hematol. 8 409-422); (5) rnakrofagien tarttumisen ja kemotaktisen aktiivisuuden lisääntyminen (Niskanen et ai., 1978, Cancer Res. 38^: 1406-141)9 ); Ja komplementin aktivoitumisen kokoaminen (Glovs-ky et ai., 1983, 0. Ket i cu 1 oendothe l . Soc. 33^: 401-413).

Kasvainsolui hi n kohdistuvan sytoiyyttisen aktiivisuuden lisääntyminen on osoitettu eläimiltä ja ihmisiltä otetuilla, hiukkasmaisei 1 a glukaanilla käsitellyillä makrofagei11 a sekä 3 88109 in vivo-tutkimuksissa (Mansell ja Di Luzio, 1976, teoksessa The Macrophage in Neoplasia, toim. Fink, Academic Press, New York, s. 227-243) ja in vitro-tutkimuksissa (Chririgos et al., 1978, Cancer Res. 38: 1085-1091).

Retikuloendoteliaalisen järjestelmän stimulointi antamalla hiukkasmaista glukaania in vivo johtaa allogeenisen tai kse-nogeenisen 1uuydinsiirrännäisen hyljintään letaalisesti säteily tetyi11ä eläimillä (ks. esim. Wooles ja Di Luzio, 1964, Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 115: 756-759). Tämä havainto viittaa siihen, että glukaani indusoi isännän puolustusmekanismeja jopa normaaleja soluja vastaan, jos ne eroavat isännän soluista geneettisesti.

Rotiku1oendote1iaa 1iseen vasteeseen ja immuunivasteeseen kohdistuvan vaikutuksen lisäksi on hiukkasmaisen glukaanin antamisen in vivo todettu kohottavan hemopoieettista aktiivisuutta, kuten granulopoieesia, monosytopoieesia ja erytropoieesia, mikä johtaa suurempaan toipumiseen koko kehoon kohdistuvasta letaalisesta säteilytysannoksesta (Patchen, 1983, Surv. Immunol . Res. 2: 237-242).

Lukuisat tutkimukset viittaavat siihen, että hiukkasmaisen glukaanin antaminen in vivo parantaa huomattavasti isännän vastustuskykyä erilaisille infektiosairauksille, kuten bakteerien, sienten, virusten ja loiseliöiden aiheuttamille.

Irity isosti on vastustuskyvyn paranemista havaittu eläimissä, jotka on infektioitu esim. jollakin seuraavista mikro-organismeista: Esherichia coli, Staphylococcus aureus, Francisel-la tularensis, Mycobacterium leprae, Streptococcus pneumoniae, Candica albicans, Sporotrichum schenckii tai jollakin seuraavista viruksista: venezuelai ainen hevosten aivoselkäydin-tulehdusvirus, Rift Yal1ey-kuumevirus, hiirten hepatiittivirus, sammakon virus III, Herpes simplex I ja II sekä loisilla, joista mainittakoon Leishmania donovani (ks. Di Luzion katsaus, 1983, Trends in Pharmacol. Sei. 4: 344-347 ja siinä mainitut viitteet).

4 88109

Laajoissa tutkimuksissa on voitu osoittaa, että hiukkasmai-sella glukaanilla on voimakas kasvainlääkevaikutus. Hiukkas-maisen glukaanin on esimerkiksi osoitettu estävän kasvaimen kasvua ja pidentävän elinaikaa neljässä syngeenisessä hiiren kasvainmal1issa, joihin kuului rauhassyöpä BW 10232, takautuvaa solumuutosta edustava syöpä 15091A, melanooma B16 ja spontaani lymfosyyttinen leukemia BW5147 (Di Luzio et ai., 1979, teoksessa Advances in Experimental Medicine and Biology, Voi . 121A : 269-290 ).

Jotta voitaisiin arvioida hiukkasmaisen glukaanin kasvainlää-kevaikutusta soiupohjai ta, tutkittiin kontrol1ihiiri1tä ja hiukkasmaisei 1 a glukaanilla käsitellyiltä hiiriltä saatujen peritoneaaliSten makrofagien kasvaintenvastaista sytotoksis-ta aktiivisuutta (Mansell ja Di Luzio, 1976, teoksessa Macrophage in Neoplasia, toim. Fink., Academic Press, New York, s. 227-243). Nämä kokeet osoittivat, että glukaanilla käsiteltyjen hiirten peritoneaaliset makrofagit saivat aikaan huomat ta van sy t o tok s i sen vasteen verrattaessa norinaa 1 e i h i n makrota yelhin . lama havainto on varmistettu {k s - esim. Burl in et. ai., 1981, teoksessa Heterogenity of Mononuclear Phagocytes, Foster ja Landy, toim., Academic Press, New York, s. 243-252 ja Chirigos et ai., 1978, Cancer Res. 38: 1085-1091).

Lisäksi in vitro-tutkimukset inkuboimalla normaaleja ja kas-vainsoluja hiukkasmaisen glukaanin kanssa ovat osoittaneet, että glukaanilla on suora sytostaattinen vaikutus sarkooma-ja melanoomasolui hi n ja proliferatiivinen vaikutus normaaleihin perna- ja 1uuydinsolui hi n (Williams et ai., 1985, Hepatology, 5: 198-206). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että tutkittu ylukaani terapeuttisesti annettuna (1) inhiboi huomattavasti maksan metastaaseja; (2) inhiboi primäärisen kasvaimen kasvua; ja (3) pidentää elinaikaa mahdollisesti i 5 88109 siksi, että Kupffer-soiujen tumorisidinen vaikutus kohoaa, ja siksi, että glukaanilla on suora sytostaattinen vaikutus sar-koomasolui hi n.

Näistä biologisista ominaisuuksistaan huolimatta ovat hiuk-kasmaiset glukaanit haitallisten sivuvaikutustensa vuoksi lähes hyödyttömiä kliinisessä lääketieteessä.

2.2. Hiukkasmaisten glukaanien haitalliset sivuvaikutukset Kun hiukkasmaista glukaania on annettu eläimille in vivo, on ilmennyt vakavia sivuvaikutuksia, joista seuraavat ovat huomatta vi mpi a: (1) granulooman muodostuminen (sarkoidoosi ); (2) hepatosplenomegalian kehittyminen; (3) kohonnut alttius gram-negatiivisi 11 e infektioille ja endotoksi i neilie; (4) komplementin aktivoituminen (anafylatoksiini ); (5) keuhkojen granulomaattlnen vasculitis; (6) matalan verenpaineen kehittyminen suonensisäisen annon seurauksena; ja (7) mikroembolusten muodostuminen, kun anto tapahtuu suurina pitoisuuksina.

Lisäksi on havaittavissa suhteellisen paljon akuuttia toksisuutta, kun hiukkasmaista glukaania annetaan in vivo. Esimerkiksi 20 % ja 100 % kuolleisuus havaittiin hiirillä, jotka saivat vastaavasti hiukkasmaista glukaania 250 ja 500 mg painokiloa kohti vesisuspensiona yhtenä suonensisäisenä injektiona annettuna.

Lisäksi on glukaania sen hiukkasmaisen luonteen (1 - 3 u) vuoksi vaikea antaa suonensisäisesti. Esimerkiksi potilas, jolle annettiin hiukkasmaista glukaania, vaati jatkuvaa tarkkailua suonensisäisen (IV) annon aikana ja IV-tiputuspul1 on jatkuva ravistelu oli tarpeen, jotta hiukkasmainen glukaani pysyi suspensiona niin, että vältyttiin embolusten muodostumiselta potilaaseen.

6 88109

Vaikka vähäisessä määrin liukoisia neutraaleja glukaaneja on kaupallisesti saatavissa, nämä valmisteet eivät sovellu suonensisäiseen antoon, koska vesiliuosten viskositeetti on hyvin korkea ja, mikä tärkeintä, niihin on väistämättä liittynyt huomattava myrkkyvaikutus koe-eläimi11 e annettuina.

Lentinaania, joka on suurimolekyy1inen ja heikosti liukeneva beeta-1,3- ja beeta-1,6-glukaani, jota saadaan Lentinus edo-desista, on tutkittu suonensisäisesti koirille annettuna. Erilaisia haitallisia kliinisiä vaikutuksia havaittiin 1en-tinaanin (Ajinomoto Co. Inc., Tokio, Japani) antamisen jälkeen, kun annokset olivat 2,0, 8,0 tai 30 mg/kg/vrk 5 viikon ajan. Havaittuja haitallisia vaikutuksia olivat mm. oksentaminen, eryteema, silmän kovakalvon värinmuutos ja kasvojen turpoaminen. Yksittäisillä jäniskoiri11 a havaittiin myös verenkierron äkkiheikentymistä, epävakaista käyntiä, käyttäytymisen muutoksia ja ylenmääräistä sy1jenerittymistä. Ruumiin-vauksessa havaittiin verentungosta mahasuoli1imakalvossa eläimillä, joiden saama annos oli 2,0 tai 8,0 mg/kg/vrk. Maksassa havaitut morfologiset muutokset viittasivat siihen, että maksasolujen sytoplasman sisälle oli kertynyt materiaalia, mahdollisesti lentinaania. Yhdellä eläimellä ilmeni verenkierron heikkeneminen ensimmäisen injektion (8,0 my/ky) jälkeen. Vaikka eläin toipuikin, sillä ilmeni toistuvaa oksentelua niin, että oksennuksessa oli verta, joka osoitti verenvuotoa maha-suolikanavassa. Toisella eläimellä ilmeni huomattava allerginen vaste, joka oli havaittavissa eryteemana ja ihonalaisena turpoamisena (ödeema) kasvoissa. Ruumiinavauksessa havaittiin subkutaanin kudoksen laaja ödeema sekä verentungos maha-suolikanavassa verenvuodon kera. Makrofagiso-luissa havaittiin materiaalin kertymistä, joka materiaali mahdollisesti oli lentinaania (Chesterman et ai., 1981, Toxicol. Lett. 9: 87-90).

7 8 81 G 9

Lisäksi suoritettiin toksisuuskokeita antamalla 1entinaaniannoksia, joiden suuruus oli välillä 0,1 - 1,0 mg/kg/vrk rotille suonensisäisesti 9 viikon ajan. Tällöin voitiin havaita myrkkyvaikutus, joka ilmeni ihon haavoina ja värinmuutoksena korvissa, mikä viittasi tromboembolisiin tapahtumiin (Conzens et ai., 1981, Toxicol. Lett. £: 55-64 ).

2.3. Epäonnistuneet yritykset tehdä hiukkasmaisista glukaa- neista liukoisia__

Koska siis hiukkasmaisi 11 a beeta-1,3-glukaanei11 a on tällaisia haittavaikutuksia in vivo annettuina, on suoritettu laajoja tutkimuksia liukoisen beeta-1,3-pol ygl ukoosin kehittämiseksi, joka ehkä ei olisi myrkyllistä eikä ehkä saisi aikaan patologisia muutoksia, mutta kuitenkin olisi säilyttänyt merkittävän immunobioiogisen aktiivisuutensa.

Pienimolekyylisellä liukoisella glukaanivai mi steel 1 a, jota glukaania ei ole fosfory1 oitu, ja joka on valmistettu hydrolysoimalla hiukkasmainen glukaani muurahaishapolla, on havaittu olevan 1ääkevaikutusta kasvaimiin ja stafy1okokkeihi n (Di Luzio et ai., 1979, Internat'l J. Cancer 24: 773-779). Ikävä kyllä, huono saanto ja tällä menetelmällä saatujen erien epätasaisuus tekivät tästä valmisteesta käyttökelvottoman ennaltaehkäiseviin ja terapeuttisiin tarkoituksiin (ks.

Di Luzio, 1983, Trends in Pharmocoligical Sciences 4: 344-347 ).

Samoin epäonnistuivat yritykset hiukkasmaisen glukaanin liukoiseksi tekemiseksi dimetyy1isulfoksidi a (DMSO) lisäämällä, joka on "molekyylirelaksentti". Ajateltiin, että DMSO höllentäisi" glukaanimolekyylin koi moishelikaalisen rakenteen.

Hiukkasmainen glukaani todellakin liukenee DMS0:n läsnäollessa. Kuitenkin kaikki yritykset eristää liukoista glukaania ovat epäonnistuneet. Kun DMSO-glukaani1iuos laimennettiin erilaisilla vesiliuoksilla, kuten glukoosi- tai NaCl-liuok-sella, glukaani palautui hiukkasmuotoon. Eläimet, joille an- 8 881G9 nettiin suolaliuoksella laimennettua DMS0:hon liukenevaa glu-kaania ruiskeina, kuolivat välittömästi injektion antamisen jälkeen johtuen suuresta DMSO-pitoisuudesta tai hiukkasmaisen glukaanin uudel1eenmuodostumisesta. Glukaani seostettiin DMSO-liuoksesta lisäämällä etanolia (100 %) ja sakka otettiin talteen ja kylmäkuivattiin . Kun tätä kylmäkuivattua glukaania lisättiin veteen, muodostui uudestaan hiukkasmaista glukaania.

Yritykset muuntaa hiukkasmaisesta glukaanista saatu neutraali glukaanivai miste polaariseksi, varatuksi valmisteeksi lisäämällä fosfaatti- tai sulfaattiryhmiä tai asety1 oimal1 a ovat myös epäonnistuneet. Kukin näistä menetelmistä toteutettiin sen jälkeen, kun glukaani oli tehty liukoiseksi DMS0:lla, ja jokaisessa tapauksessa hiukkasmaista glukaania muodostui uudestaan.

3. Keksinnön pääkohdat

Tutkittaessa perusteellisesti menetelmiä, joilla kolmisäikei-siä glukaaniheiiksejä voitaisiin "höllentää" riittävästi, jotta kukin ketju reagoisi, havaittiin, että liuotettaessa hiukkasmainen glukaani voimakkaasti polaariseen liuottimeen (kuten DMSOrhon) voimakkaan kaotrooppisen aineen (kuten urean) läsnäollessa glukaanin rakenne hajoaa riittävästi, jotta kunkin yksittäisen ketjun (tai säikeen) fosforyloituminen tulee mahdolliseksi siten, että saadulta fosforyloidulta glukaanil-ta puuttuu hiukkasmaisei 1 e glukaanille tunnusomainen kol-inoi shel i ksrakenne oleellisesti ottaen täysin. Talteen saatu fosforyloitu glukaani on vesiliukoinen, myrkky vaikutukseton, ei-immunogeeninen, oleellisesti ottaen ei-pyrogeeninen ja se kykenee saamaan aikaan syvälle meneviä immunobioiogisi a vasteita ihmiselle ja eläimille in vivo annettuna.

Näiden havaintojen perusteella keksintö tarjoaa joukon uusia liukoisia fosforyloituja glukaaneja, (a) joiden poly-/beeta-(1-3)glukopyranoosl7-ketjut ovat eriasteisesti fosfory1 oi tulleita; (b) jotka ovat myrkkyvaikutuksettomia, ei-immunogeeni- 9 88109 siä ja oleellisesti ottaen ei-pyrogeenisiä, ja (c) jotka kykenevät saamaan aikaan voimakkaita immunobioiogisia vasteita eläimille ja ihmisille in vivo annettuina. Nämä uudet liukoiset fosfory1 oidut glukaanit, joille on lisäksi tunnusomaista hiukkasmaiSten glukaanien kolmoisheliksrakenteen puuttuminen oleellisesti ottaen kokonaan, immunostimuloivat makrofagiak-tiivisuutta, josta on seurauksena muiden immunoaktiiviSten solujen aktivoituminen retikuloendoteliaalisessa järjestelmässä ja immuunijärjestelmässä. Lisäksi nämä liukoiset fosfo-ryloidut glukaanit kohottavat hemopoieettista aktiivisuutta, leukopoieesi mukaan luettuna, mutta ei 1eukopoieesiin rajoittuen. Näillä liukoisilla fosfory1 oidui11 a glukaaneilla on sy-tostaattinen vaikutus rauhassyöpälajeihi n in vivo ja lymfo-syyttisiin 1eukemiasolui hi n in vitro. Nämä liukoiset fosfory-1 oi dut glukaanit siis stimuloivat makrofagisoiuja in vivo, mutta tämän lisäksi niillä on voimakas stimuloiva vaikutus in vitro -viljeltyihin makrofagisoi ui hi n. Tällaiseen makrofagi-solujen immunostimuloitumiseen liittyy väistämättä makrofaa-gin sytotoksis-sytostaattisen tekijän (MCT) (proteiini tai proteiineja, joiden rakenne on tuntematon) tuottaminen, joka tekijä on selektiivisesti toksinen syöpäsoluille, erityisesti rauhassyöpä soluille.

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmän näiden liukoisten fosfo-ryloitujen glukaanien tuottamiseksi siten, että hiukkasmainen glukaani (valmistettu mielellään Saccharomyces cerevisiae-hiivasta, vaikka muitakin mikrobi1ähteitä voidaan käyttää) liuotetaan voimakkaasti polaariseen liuottimeen, joka sisältää voimakkaasti kaotrooppista ainetta, ja saatu glukaani saatetaan reagoimaan fosforihapon kanssa niin, että syntyy liukoinen fosforyloitu glukaani, ja saadut fosfory1 oidut glukaanit otetaan talteen reaktioseoksesta.

10 88 1 09

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmiä bakteerien, sienten, virusten tai loisten aiheuttamien sairauksien ennaltaehkäisemiseksi tai hoitamiseksi siten, että eläimel1 e tai ihmiselle annetaan liukoista fosfory1 oitua glukaania tai farmaseuttista seosta, joka koostuu liukoisesta fosfory1 oidusta glukaanista ja fysiologisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta. Lisäksi tarjotaan menetelmiä tällaisten organismien aiheuttamien infektioiden hoitamiseksi siten, että annetaan tehokas määrä liukoista fosforyloitua glukaania yhdessä mainittua infektiota vastaan kohdistuvan bioaktiivisen aineen kanssa.

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmiä ihmisten tai elä inten pahanlaatuisten kasvainsairauksien hoitamiseksi siten, että ihmisille tai eläimille annetaan terapeuttisesti tehokas määrä liukoista fosforyloitua glukaania yksin tai yhdessä syöpälääkkeen kanssa. Keksintö tarjoaa myös menetelmiä syöpälääkkeen aiheuttaman leukopenian estämiseksi siten, että eläimelle tai ihmiselle annetaan tehokas määrä liukoista fosforyloi-tua glukaania yhdessä mainitun syöpälääkkeen kanssa.

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmiä eläinten tai ihmisen makrofagisoiujen stimuloi mi seksi (in vivo tai in vitro) tuottamaan ja erittämään liukoista sytotoksis-sytostaattista tekijää (MCT) ja keksintö koskee myös näin tuotettua tuotetta. Tarkemmin sanottuna MCT:tä tuotetaan antamalla eläimelle tai ihmiselle liukoista fosforyloitua glukaania tai viljelemällä eläinten tai ihmisen makrofagisoiuja liukoista fosfory1 oitua glukaania sisältävässä kasvualustassa in vitro.

Tämän keksinnön mukaisten liukoisten fosfory1 oitujen glukaa-nien immunobioiogisia ominaisuuksia ovat mm. (1) kyky estää murtavista gram-negatiiviSten bakteerien aiheuttamista infektioista johtuvat kuolemantapaukset; (2) kyky estää gram-positiivisten bakteerien aiheuttamista infektioista aiheutuvat kuolemantapaukset; (3) kyky muuntaa kuolleisuutta spon-taaneihin infektioihin, joita esiintyy eläimillä ja ihmisillä, i 11 88109 jotka on immunosuppressoitu voimakkaasti; (4) kyky muuttaa immunosuppressoituneiden eläinten ja ihmisten kohonnutta alttiutta gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamille infektioille; (5) kyky muuntaa virusinfektioita merkittävästi; (6) kyky muuntaa sienten tai muiden 1 oisorganismien indusoimia spontaaneja infektioita; (7) kyky merkittävästi estää primaarisen kasvaimen kasvua yksin käytettyinä tai saada aikaan sy-nergistinen vaikutus primaarisen kasvaimen kasvua vastaan yhdessä syöpälääkkeen kanssa käytettyinä; ja (8) kyky toimia synergistisesti syöpälääkkeiden kanssa primaaristen pahanlaatuisten kasvainvaurioiden tai metastaattisten vaurioiden palautuessa sekä eläimissä että ihmisissä.

Näiden ainutlaatuisten omineisuuksiensa vuoksi ovat liukoiset fosfory1 oituneet glukaanit erityisen hyödyllisiä käytettäviksi ennaltaehkäisy- tai hoitotarkoituksessa erilaisia bakteerien, virusten, sienten tai loiseliöiden aiheuttamia sairauksia vastaan sekä lukuisia kasvainsairauksia vastaan. Liukoisia fosfory1 oituja glukaaneja on edullista käyttää fysiologisesti hyväksyttävän farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa joko yksin tai yhdessä muiden bioaktiivisten tai farmakologisten aineiden tai hoitomuotojen kanssa.

4. Kuvien selitys

Esillä olevan keksinnön ymmärtäminen helpottuu seuraavan selostuksen, keksinnön toteutustapaesimerkkien ja liitteenä olevien kuvien avulla.

Kuva 1 esittää liukoisen fosfory1 oidun glukaanin ydinmagneet-tista resonanssi spektriä pitoisuudessa 27 mg/ml.

Kuva 2 esittää kaupallisesti saatavissa olevan 1entinaanivai -misteen (Ajinomoto Co. Inc., Tokio, Japani) ydinmagneettis-ta resonanssi spektriä. Kuvan 2A spektri on saatu 1entinaanipi-toisuudessa 40 mg/ml. Kuvan 2B spektri on saatu 1entinaanipi-toisuudessa 3 mg/ml.

12 8 8 1 09

Kuvan 3 käyrä esittää vaikutusta kortikosteroidi 11 a immuno-suppressoitujen hiirten elossapysymiseen, kun hiiret ovat saaneet kahdesti viikossa liukoista fosfory1 oitua glukaania injektioina. Kuva 3 esittää myös liukoisen fosfory1 oidun glu-kaanin kroonisen antamisen vaikutusta normaalien hiirten elossapysymiseen.

Kuva 4 esittää ennalta in vivo -annetun liukoisen fosforyloi-dun glukaanin vaikutusta sekä normaalien että kortikosteroi-deilla immunosuppressoitujen hiirten vastustuskykyyn Escherichia coli -infektiolle.

Kuva 5 esittää ennalta suoritetun liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla tapahtuneen käsittelyn vaikutusta hiirille myöhemmin kokeellisesti aiheutetun Staphylococcus aureus -infektion letaalisiin vaikutuksiin.

Kuva ϋ esittää ennalta liukoisella fosfory1o1du 11 a glukaanll-la tapahtuneen käsittelyn vaikutusta hiirille myöhemmin kokeellisesti aiheutetun virushepatiiti n jälkeiseen elossapysymiseen.

Kuva 7 esittää ennalta suun kautta annetun liukoisen fosfory-loidun glukaanin vaikutusta hiirten elossapysymiseen, kun niille on kokeellisesti myöhemmin aiheutettu Candida albicans-infektio.

Kuva 8 esittää liukoisen fosfory1 oidun glukaanin vaikutusta i nterleuki ini-1:n tuotantoon.

Kuva 9 esittää käyrää, josta ilmenee, että liukoisella fosfo-ryloidulla glukaanilla aktivoitujen makrofagien viljelmistä saatu kasvainsolui hi n vaikuttava sytotoksis-sytostaattinen tekijä koostuu kahdesta pääjakeesta, joiden molekyy1ipainot ovat 38 500 ja 84 000 daltonia.

i 13 88 1 09 5. Keksinnön yksityiskohtainen selostus 5.1. Liukoisen fosforyloidun glukaanin valmistusmenetelmä Vesiliukoinen glukaani valmistetaan menetelmällä, jolla syntyy joukko ainutlaatuisia tuotteita, jotka eroavat kaikista ennestään tunnetuista glukaaneista.

Esillä olevan keksinnön edullisen toteutustavan mukaan liukoinen fosforyloitu glukaani valmistetaan seuraavalla tavalla:

Hiukkasmainen glukaani, joka on Saccharomyces cerevisiaesta johdettu neutraali polyglukoosi, suspendoidaan jatkuvasti sekoittaen liuokseen, jossa on voimakasta kaotrooppista ainetta aproottisessa 1iuottimessa, kuten dimetyylisulfoksidissa (DMSO). Voimakas kaotrooppinen aine "höllentää" polyglukoosi-ketjun pituudella sijaitsevat vetysidokset niin, että seurauksena on molekyylin avautuminen. On edullista käyttää suhteellisen korkeata voimakkaan kaotrooppisen aineen, kuten urean, konsentraatiota, kuten noin 4 - 12 M, jotta vetysidos- ten uudelleenmuodostus saadaan estetyksi. Sitten seos kuumen- o netaan noin 50 - 150 C:een, jossa sen lämpötila pidetään samalla, kun fosfori happoa lisätään hitaasti jatkuvaa sekoitusta käyttäen. Noin 1 tunnin kuluttua havaitaan sakka, joka koostuu liukoisesta fosforyloituneesta glukaanista. On edul- o lista pitää reaktioseosta noin 100 C:ssa noin 3-12 tuntia bioaktiivisen tuotteen saannon parantamiseksi. Käytännössä, o kun reaktio on jatkunut noin 6 tuntia noin 100 C:ssa, saanto on noin 70-90 %. Liukoisen tuotteen fosforyloitumisaste vaihtelee hieman reaktioajasta riippuen (esim. se on 1,48 % 3 tunnin kuluttua ja 2,23 % 6 tunnin kuluttua).

Bioaktiivinen liukoinen fosforyloitu glukaanituote eristetään reaktioseoksesta seuraavalla tavalla: Seos jäähdytetään fosforyl oi tumi sreakti on pysäyttämiseksi ja laimennetaan vesimäärällä, joka riittää uudelleensuspendoimaan sakan. Saatu liuos suodatetaan karkean, keskikarkean ja hienon sintterin läpi,

14 8 8 I G

jotta mahdollinen jäljellä oleva sakka saadaan poistetuksi. Sitten liuos seulotaan molekyy1iseulall a, jotta kaikki komponentit, joiden molekyy1ipaino on alle noin 10 000 daltonia, saadaan poistetuiksi. Näin DMSO, urea, glukoosi ja mahdollinen reagoimaton fosforihappo poistuvat liuoksesta. Molekyyli-seulonta voidaan suorittaa millä tahansa menetelmällä, joka poistaa molekyy1ipainoltaan pienet (so. alle noin 10 000 daltonia) komponentit. Liuos voidaan esimerkiksi seuloa käyttämällä Spectrapor-kalvodiälyysi putkea ja dialysoima 11 a juoksevaa tislattua vettä vasten noin 5 vuorokautta. Toinen seulon-tatapa voi esimerkiksi olla liuoksen seulonta Millipore-dialysaattori/konsentraattorin avulla käyttämällä 10 000 dal-tonin (molekyy1ipaino, MW) kaivosuodatinta ja suurta dialy-soivan liuoksen tilavuutta. Molekyy1iseulonnan jälkeen saatu liuos väkevöidään ja ky 1mäkuivataan niin, että lopputuotteeksi saadaan liukoinen fosforyloitu glukaani kuohkean jauheen muodossa. Kiderakenteita ei ole havaittavissa.

Tämän keksinnön mukaisen liukoisen fosfory1 oidun glukaanin valmistuksessa käytetty hiukkasmainen glukaani voidaan eristää S. cerevisiaen soiunseinästä ennestään tunnetuilla menetelmillä (ks. esim. Di Luzio et ai., 1979, Internat'l J. Cancer 24_: 773-779 ; Hassid et ai., 1941, J. Amer. Chem. Soc.

63: 295-298, jotka sisällytetään tähän viitteiksi). Lyhyesti sanottuna hiukkasmainen glukaani valmistetaan seuraavalla tavalla: kuiva hiiva hajotetaan natriumhydroksidi n vesiliuok- o sessa kuumentamalla noin 100 C:een 4 tunniksi ja antamalla seisoa yön yli. Emäliuos dekantoidaan ja toimenpide toistetaan vielä kolmeen kertaan. Jäännös tehdään happamaksi kloo- o rivetyhapol1 a, kuumennetaan 100 C:een ja pidetään tässä lämpötilassa noin 4 tuntia ja jäähdytetään yön aikana. Emä-liuos dekantoidaan ja happohajotus toistetaan vielä kahdesti. Sen jälkeen jäännös pestään tislatulla vedellä useaan kertaan ja uutetaan etanolilla vähintään 24 tuntia. Tämän jälkeen punaruskea emäliuos imetään ja heitetään pois. Etanoliuutto toistetaan niin moneen kertaan, että emäliuos on oleellisesti 15 88 1 09 ottaen väritöntä. Etanoli poistetaan pesemällä jäännös tislatulla vedellä useaan kertaan. Hiukkasmainen glukaani otetaan talteen sentrifugoimal1 a tai suodattamalla.

Paitsi ureaa, tutkittiin myös lukuisten muiden yhdisteiden, joiden tiedetään toimivan "molekyylien h ö11 entäjinä ", kyky estää vetysidosten uudel1eenmuodostuminen sen jälkeen, kun oli käytetty DMSOrta "höllentämään” hiukkasmaisen glukaanin koi moishelikskonfiguraatio. Näitä yhdisteitä olivat mm. (1) etyleenidiamiinitetraetikkahappo, (2) hydratsiinisulfaatti, (3) monoetanoliamiini, (4) guanidiini, (5) guaniini ja (6) tiourea. Lisäksi käytettiin pinta-aktiivisi a aineita ja emul-gointi aineita, kuten Tween-20 ja emulgointi aineina toimivia fosfolipidejä, kuten Alcolecriä ja Centrolex f:aa (lesitiini), jotta hiukkasmainen glukaani saataisiin liuotetuksi ja fosfo-ryloiduksi. Missään näistä tapauksista ei saatu liukoista immunologi sesti aktiivista valmistetta.

Tämän keksinnön vaihtoehtoisten toteutustapojen mukaan voidaan liukoista fosfory1 oitua glukaania valmistaa neutraaleista polyglukoosituotteista tai polyglukoosi-proteiinituotteis-ta, jotka on saatu erilaisista muista mi krobi1ähteistä . Taulukossa 1 on esitetty luettelo tällaisista lähteistä, jota luetteloa ei ole tarkoitettu kaiken kattavaksi.

Taulukko 1

Esimerkkejä glukaanilähteistä, joita voidaan käyttää 1i ukoi-sen fosfory1 oidun glukaanin valmistuksessa___

Alcaligenes faecalis Auricularia auricula-judae Auricularia polytricha Candida utilis Cladosporium fulvum Claviceps purpurea 16 8 8 1 09

Cochi 1iobolus sativus Coriolus versicolor Corlinellus shiitake Corticium v a g u m Grifola umbrellata Lentinus edodes Pichia fermentans Poria cocos

Saccharomyces cerevisiae Sclerotium coffeicolum Sclerotium delphnii Sclerotium glucanium Sclerotium rolsfi Shizophyllum commune Streptococcus salvarius Stereum sanguinolentum Wingea robertsii 5.2. L i uk öisen to s foryloidun glukaanin karak ter is^ointi Keksinnön mukaisesti S. cerevisiaesta valmistetun liukoisen fosfory1 oidun glukaanin liukoisuus veteen on yli noin 50 mg/ml. Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin vesiliuokset eivät ole viskoosisia eivät ne maistu makealta.

5.2.1. AIkuainekoostumus

Taulukossa 2 on esitetty liukoisen glukaanivai misteen alkuai-nekoostumus Gailbraith Laboratories:n (Knoxville, TN) määrit-tämänä. Taulukon 2 tulosten perusteella voidaan valmisteen keskimääräinen empiirinen kaava kirjoittaa seuraavasti: C H PO 40 87 37 Näin ollen liukoisessa fosfory1 oidussa glukaanissa on keskimäärin yksi fosfaatti ryhmä jokaista 6,6 glukoositähdettä kohti .

17 88 1 09

Taulukko 2

Liukoisen fosforyloldun glukaanin aikuainekoostumus3

Alkuaine tai komponentti mooli-% hiili 34,66 vety 6,29 happi 42,83 typpi 0,64 rikki 0,11 fosfori 2,23 hydratoitumisvesi 11,78 a Määritetty 6 tunnin fosfory1 oinnin jälkeen 5.2.2. Konfiguraatio

Eri menetelmien avulla määritettiin liukoisen fosforyloidun glukaanin molekyy1ipaino (MW) ja rakenteelliset piirteet.

5.2.2.1. Molekyyliseulonta

Sepharose CL-6B-200:11a (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ ) suoritettu pyiväskromatografia osoitti, että 80 %:11 a liukoisesta glukaanista oli molekyylipainoalue välillä 10 000 - 100 000 daltonia ja 20 %:11 a välillä noin 100 000 - noin 500 000 daltonia.

5.2.2.2. Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia Tämän keksinnön mukaisesti S. cerevisiaesta valmistetusta liukoisesta fosforyloidusta glukaanista määritettiin useita rakenteellisia ominaisuuksia hii1i-13-ydinmagneettisei 1 a resonanssi spektroskopi ai 1 a ( C-NMR) käyttämällä Brucker WP-200 -spektrometriä (Brucker Instruments, Billerica, MA).

ie 88109 Näytteet NMR-tutkimuksia varten valmistettiin käyttämällä vettä, jossa oli 10 % deuteriumoksidi a (D^O). Näytteet ajettiin ensin ilman referenssimateriaalia ja sen jälkeen lisättiin pieni määrä 1,4-dioksaan ia. Kaikki näytteet sijoitettiin putkiin, joiden halkaisija oli 10 mm.

13

Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin C-NMR-spektritutkimukset osoittivat, ettei beeta-l-3-glukaanirakenteessa ollut lainkaan haaroittuneisuutta C-6-hiilessä (ks. kuva 1). NMR-spektristä ilmenee, että hiukkasmaiSten glukaanien kolmoishe-liksrakenne on oleellisesti ottaen poissa. Fosforyloitumisas-teen arvioitiin olevan 3,6 %, mikä vastaa oleellisesti ottaen analyysi tul oksia.

Toisin kuin tämän keksinnön mukaisesti S. cerevisiaesta valmistetun liukoisen fosforyloidun glukaanin spektreissä, ilmeni 1entinaanivai misteen (Ajinomoto Co. Inc., Tokio, Japani), joka on haaroittunut beeta-1-3- ja -1-6-D-glukaani, pitoisuuksissa 40 mg/ml (kuva 2A) ja 3 mg/ml (kuva 2B) spektreissä NMR-spektrin vaimeneminen. Tämä johtuu oletettavasti molekyylin geeliti 1asta, erityisesti pitoisuudessa 40 mg/ml. Mitään signaaleja ei havaittu 10-i:ssa D^O-1iuoksessa geeliytymät-tömässä pitoisuudessa 3 mg/ml.

Kuvia 1 ja 2 vertaamalla voidaan havaita täydellinen rakenteellinen ja konfirmationaalinen ero lentinaanin ja liukoisen fosforyloituneen glukaanin välillä. Lentinaanin beeta-l-6-si-doksissa on konformaatio epäjärjestyksessä (Saito et ai., 1977 , Carbohydrate Research, 58_: 293-305 ), kun taas tämän keksinnön mukaisen liukoisen fosforyloituneen glukaanin konformaatio osoittaa järjestäytyneisyyttä.

5.3. Liukoisen fos fory1 oidun glukaanin myrkky vaikutuksetto- muus, ei-pyrogeenisyys ja ei-immunogeenisyy s_____

Koska liukoinen fosforyloitu glukaani tarjoaa tärkeitä etuja hiukkasmaiseen glukaaniin verrattuna injektoitavana biologi- i 19 881 09 sen vasteen modulaattorina, seuraavassa selostetaan liukoisen glukaanin tunnusomaista myrkyllisyyttä, pyrogeenisyyttä ja immunogeenisyyttä erityisesti vertaamalla näitä ominaisuuksia hiukkasmaisen glukaanin vastaaviin ominaisuuksiin.

5.3.1. Myrkkyvaikutuksettomuus Välitön toksisuus arvioitiin antamalla normaaleille eläimille liukoista fosfory1 oitua glukaania yhtenä suonensisäisenä annoksena erisuuruisina annoksina. Käsiteltyjä eläimiä seurattiin 30 vuorokauden ajan injektion antamisen jälkeen.

Yhdessä koesarjassa 49 ICR/HsD-hiirtä jaettiin 3 ryhmään, joissa kussakin oli 15 hiirtä, ja 2 ryhmään, joissa molemmissa oli 2 hiirtä. Ryhmille 1-3 annettiin 0,5 ml fysiologista suolaliuosta, jotka sisälsivät vastaavasti liukoista fosfory-loitua glukaania 40, 200 ja 1000 mg/kg; ja ryhmille 4 ja 5 annetut liuokset sisälsivät tätä glukaania vastaavasti 1600 ja 2000 mg/kg. Missään ryhmässä ei havaittu kuolemantapauksia. Myöskään ei ilmennyt mitään fysiologisia tai käyttäytymiseen liittyviä muutoksia. Selvänä vastakohtana taas havaittiin, että vastaavasti hiukkasmaisei 1 a glukaanilla käsitellyillä hiirillä oli kuolleisuus 20 % annoksen ollessa 250 mg/kg ja 100 % annoksen ollessa 500 mg/kg.

Toisessa koesarjassa annettiin kahdelle 5 Sprague Oawley -rottaa sisältävälle ryhmälle liukoista fosforyloitua glukaania suonensisäisenä injektiona 250 tai 500 mg/kg rottaa kohti. Kummassakaan ryhmässä ei havaittu kuolleisuutta tai fysiologisten toimintojen tai käyttäymisen muutoksia. Sitä vastoin kuolleisuus oli vastaavasti 30 % ja 100 %, kun hiukkas-maista glukaania annettiin 75 tai 150 mg/kg.

Krooninen toksisuus arvioitiin antamalla suonensinäisinä injektioina kahdesti viikossa suolaliuosta, joka sisälsi liukoista fosfory1 oitua glukaania 0, 40, 200 tai 1000 mg/kg.

20 881 09

Seurannan kohteina olivat ruumiinpaino ja elinten painot, silmin havaittavissa ja mikroskooppisesti havaittavissa oleva patologia, seerumin sisältämät elektrolyytit ja liuenneet aineet sekä munuaisten ja maksan toimintoja edustavat seerumin entsyymi t.

Eräässä koesarjassa hiiret punnittiin 0, 8, 11, 15, 22 ja 30 vuorokauden kuluttua liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla suoritetun käsittelyn alkamisesta. Minkään annetuista liukoisen fosforyloidun glukaanin annoksista ei havaittu aiheuttavan merkitsevää eroa ruumiinpainossa. 30 vuorokautta kestäneen kroonisen käsittelyn jälkeen elä imet surmattiin. Maksan, keuhkojen tai munuaisten painossa ei havaittu mitään muutosta. Tilastollisesti merkitsevä kohoaminen pernan painossa havaittiin hiirillä, joille oli annettu 40 tai 100 mg/kg liukoista glukaania (0,01<p<0,001), mutta tätä ei havaittu hiirillä, joille annettu annos oli 200 mg/kg,.

Toisessa koesarjassa hiiret punnittiin 0, 15, 30, 49 ja 60 vuorokauden kuluttua liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla suoritetun käsittelyn (kahdesti viikossa) alkamisesta. Minkään liukoisen fosfory1 oidun glukaanin annoksen ei havaittu aiheuttavan merkitsevää eroa ruumiinpainoihin. Kun kroonista käsittelyä liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla oli jatkettu 60 vuorokautta, eläimet surmattiin. Maksan, keuhkojen tai munuaisten painossa ei havaittu merkitsevää eroa. Tilastollisesti merkitsevä kohoaminen pernan painossa havaittiin hiirillä, joille oli annettu liukoista fosfory1 oitua glukaania 100 mg/kg (p<0,001).

30 tai 60 vuorokautta kestäneen kroonisen käsittelyn jälkeen seuraavissa seerumin aineosissa ei havaittu merkitsevää muutosta: glukoosi, veren ureatyyppi (BUN), virtsahappo, kolesteroli, triglyseridit, kokonaisproteiini, albumiini, globu-liini, kreatiniini, kalsium, fosfori, natrium, kalium, kloridi, bikarbonaatti ja anioniväli. Mitään merkitsevää muutosta i 21 88109 ei myöskään havaittu seuraavissa entsyymeissä: emäsfosfataasi, maitohappodehydrogenaasi, seerumin glutamaatti-oksaaliase-taattitransaminaasi ja seerumin glutamaatti-pyruvaattitrans-aminaasi ja kreatiniinifosfokinaasi. Seerumin bi1irubiinissa ei havaittu mitään muutosta.

30 vuorokauden kroonisen käsittelyn jälkeen otetuissa hiirten kudosnäytteissä havaittiin histologisissa tutkimuksissa oleellisesti ottaen normaali maksan histologia, kun hiiret olivat saaneet 40 tai 200 mg/kg liukoista fosfory1 oitua glu-kaania injektiota kohti. Eläimillä, jotka olivat saaneet liukoista fosforyloitua glukaania 1000 mg/kg, ilmeni maksassa selvästi monosyyttistä 1äpitihkumista. Keuhko- ja munuaiskudokset olivat kaikilla hiirillä oleellisesti ottaen normaaleja.

60 vuorokauden kroonisen käsittelyn jälkeen otetuissa hiirten kudosnäytteissä havaittiin histologisissa tutkimuksissa muutamia luonteeltaan erillisiä maksagranuloomia eläimillä, jotka olivat saaneet injektioita 40 tai 200 mg/kg annoksina. Suurempi määrä monosyyttisiä 1äpitihkumiskohtia havaittiin hiirillä, jotka olivat saaneet injektioina 100 mg/kg. Kaikilla eläimillä, joille tehtiin ruumiinavaus, oli keuhkokudos oleellisesti ottaen normaali.

Krooninen toksisuus arvioitiin myös antamalla marsuille (Harlan Sprague Dawley, Houston, TX) 7 vuorokauden ajan ruiskeina vatsaonteloon 5 ml fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi liukoista fosfory1 oitua glukaania 250 mg/kg (FDA:n vaatima koe). Taulukossa 3 esitetyt tulokset osoittavat, että liukoisella glukaanilla käsiteltyjen hiirten kasvu heikkeni verrattaessa kontrolliryhmään, joka sai vastaavan määrän 0,9 %:sta suolaliuosta. Kuitenkin 7 vuorokauden kroonisen käsittelyn jälkeen oli käsiteltyjen eläinten ruumiinpaino kohonnut merkitsevästi kasvun ollessa 9 % lähtöpainoon verrattuna.

22 88 1 09

Taulukko 3

Liukoisen fosfory1 oi dun glukaanin kroonisen antamisen vaikutus ruumiinpainoon - , , . a Käsittely Ruumiinpainon keskiarvo (g) vrk 1 2 3 4 5 6 7

Fysiol. 213.8 225.2 227. 4 234.2 239.7 244. 2 253.8 suolat. ^4.0 +6.6 _+ 7.1 _+ 7.3 _+ 6.1 ^5.2 _+ 7 . 5

Spcb 208.9 202.3 203.9 207.4 214.3 215.6 227.3* + 2.9 + 5.0 + 5.3 + 5.3 + 6.0 + 6.6 + 6.6 a Arvot ovat ruumiinpainon keskiarvoja (g) +_ keskihajonta N = 5 eläintä b SPG tarkoittaa liukoista fosfory1 oitua glukaania * p<0,01

Krooninen toksisuus arvioitiin kahdella täysikasvuisella naa- raskoiralla antamalla niille 120 vuorokauden ajan kahdesti viikossa liukoista fosfory1 oitua glukaania suonensisäisesti (5 mg/kg). Koirille syötettiin Purina Chowrta ja vettä mielin

määrin ja täydennykseksi annettiin kaupallista koiranruokaa TM

(ALPO ) kahdesti viikossa. Ruumiinpaino ja seerumin sisältämät liuenneet aineet, elektrolyytit ja entsyymit analysoitiin vuorokausina 0, 17, 24, 38, 80 ja 120. 120 vuorokauden käsittelyn käsittelyn jälkeisessä mittauksessa havaittiin keskimääräisen painonlisäyksen olevan 2,8 kg eli noin 22 %.

Mitään merkityksellistä eroa ei havaittu seuraavissa seerumin sisältämissä liuenneissa aineissa: glukoosi, BUN, virtsahappo, kolesteroli ja kreatiniini. Seuraavissa seerumin sisältämissä eletrolyyteissä ei havaittu merkityksellistä eroa: kalsium, fosfori, natrium, kalium, kloridi, bikarbonaatti ja anioni-

23 8 8 1 C Q

väli. Seuraavissa seerumin sisältämissä entsyymeissä ei havaittu merkityksellistä eroa: emäsfosfataasi, maitohappode-hydrogenaasi, seerumin glutamaatti-oksaaliasetaattitransami-naasi, seerumin glutamaatti-pyruvaattitransaminaasi ja krea-tiniinifosfokinaasi.

Myöskään mitään merkityksellistä muutosta ei havaittu sellaisen potilaan seerumin biokemiassa, joka sai 3 kuukauden ajan kolmesti viikossa liukoista fosfory1 oitua glukaania 50 mg/ml.

5.3.2. Ei-pyrogeeni syys

Liukoisen fosforyloidun glukaanin pyrogeeni syy s arvioitiin antamalla valveilla oleville koirille yhtenä suonensisäisenä injektiona annos, joka oli 7,5 mg/kg tai 30 mg/kg. Ruumiin-lämpötilaa seurattiin 14 vuorokauden ajan injektion antamisen jäi keen.

Taulukon 4 tuloksista voidaan havaita, ettei tässä kroonisessa eläinmallissa ilmennyt pyrogeenistä reaktiota.

Taulukko 4 Välittömän tai kroonisen pyrogeenisen vasteen puuttuminen koiria käytettäessä______________________ a o

Annos Ruumiinlämpöti1 an keskiarvo ( C) (mg/kg) aika (h) 0 1 6 24 144 336 7,5 38,3 37,4 38,3 38,3 38,3 38,4 30,0 38,6 37,0 38,0 38,5 38,4 38,6 a N = 3 koiraa/ryhmä

Pyrogeenisyy s arvioitiin myös käyttämällä kolmea Nembutaalil-la (30 mg/kg) nukutettua koiraa ja antamalla niille 3 tunnin

24 8 8 1 O S

kuluessa useita injektioita kohoavina annoksina, joiden suuruudet olivat 1, 5, 10, 15, 25 ja 50 mg/kg liukoista fosfory-loitua glukaania. Ruumiinlämpö mitattiin 15 minuutin kuluttua bol us-i rijekti on antamisesta. Millään annoksella ei havaittu olevan pyrogeenistä vaikutusta.

Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin pyrogeenisyy s arvioitiin myös kaneilla. Seitsemästä kanista muodostettiin kaksi ryhmää, joista toisessa oli 2 eläintä ja toisessa 5. Ryhmän 1 eläimet saivat vastaavan tilavuuden fysiologista suolaliuosta ja ryhmän 2 eläimet saivat suonensisäisinä injektioina 5 mg/kg liukoista fosforyloitua glukaania fysiologiseen suolaliuokseen liuotettuna. Ruumiin sisäosan lämpötila mitattiin 15 minuutin välein 100 minuutin ajan sen jälkeen, kun oli annettu yksi ho 1us -i nj ek t i o. K o n t r o 11i oiä i m i s s ä havaittiin vähäinen r u u m i i n I a m pi) lilan lasku (0,2 0). Liukoisella i os lory I n i du I - la glukdunillu käsitellyissä kaneissa havaittiin lämpötilan o nousu, jonka keskiarvo oli 0,44 C. Näin ollen kaneissa ilmeni vähäistä pyrogeeni syyttä.

5.3.3. Ei-immunogeenisyys

Rajapinnan rengastestiä, joka on suunniteltu IgG-vasta-aineiden läsnäolon havaitsemiseen, käytettiin liukoisen fos-foryloidun glukaanin immunogeenisyyden arviointiin, kun anto tapahtui koirille kroonisesti 120 vuorokauden ajan.

Täysikasvuisilta naaraskoi riita otettiin seeruminäytteet sen jälkeen, kun niille oli annettu kahdesti viikossa 120 vuorokauden ajan suonensisäisinä injektioina 5 mg/kg steriiliä, pyrogeenitöntä liukoista fosforyloitua glukaania. Rajapinnan rengastesti suoritettiin seuraavasti: Koeputkiin pipetoitiin 0,1 ml 1 aimentamatonta vastaseerumia. Antigeeni eli fosfory-loitu glukaani sijoitettiin laimennussuhteissa 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ja 1:32 antiseerumin päälle kerrokseksi niin, että muodostui rajapinta. Valkoisen rengasmaisen saostuman muodostu- 25 8 8 1 09 minen rajapintaan osoittaa, että läsnä on glukaanille spesifistä vasta-ainetta. Saostumarengasta ei havaittu millään anti geenila ime nnoksella.

5.4. Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin käyttötarkoitukset 5.4.1, Infekti osairauksien ennaltaehkäisy ja hoito Koska liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla on voimakas immuunivastetta ja reti kuloendoteli aali sta järjestelmää stimuloiva vaikutus, sitä voidaan menestyksellä käyttää ennaltaehkäisevässä ja hoitotarkoituksessa erilaisten mikro-organismien indusoimiin sairauksiin. Koska liukoinen fosforyloitu glukaani vaikuttaa isännän perustavaa laatua oleviin puolustusjärjestelmiin, jotka säätelevät makrofagien, T- ja B-lymfosyyttien, leukosyyttien ja luonnollisten tappajasolujen sekä kehon nesteissä olevien ja erittyvien komponenttien lukumäärää, toiminta-aktiivisuutta ja vuorovaikutusta, sillä on kyky vaikuttaa mitä erilaisimpiin infektiosairauksiin ei-spesifisesti.

Liukoista fosfory1 oitua glukaania voidaan käyttää joko yksin tai ennestään tunnettujen antimikrobiaineiden kanssa yhdessä haluttaessa estää tai hoitaa gram-positiiviSten bakteerien aiheuttamia sairauksia, joista bakteereista mainittakoon mm. Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae ja Diplococcus pneumoniae; gram-negatiiviSten bakteerien aiheuttamia sairauksia, joista bakteereista mainittakoon mm. Escherichia co-1i, Bacterium enteritis ja Francisella tularensis; haponkes-tävien bakteerien aiheuttamia sairauksia, joista bakteereista mainittakoon mm. Mycobacterium leprae; virussairauksia, joista viruksista mainittakoon mm. Hepatitis, Herpes simplex I ja II jne.; sienten aiheuttamia sairauksia, joista sienistä mainittakoon mm. Candica albicans ja Sporotrichum schenkii; ja alkueläinten aiheuttamia sairauksia, joista alkueläimistä mainittakoon mm. Leishmania donovani, Schistosoma mansoni jne.

26 8 8 1 G 9

Lisäksi voidaan liukoisia fosfory1 oituja glukaaneja käyttää infektioiden estämi seen ja hoitoon eläimillä ja ihmisillä, joilla on tapahtunut immunosupressio joko synnynnäisen tai saadun immuunivajavuuden seurauksena tai kemoterapeuttisen hoidon sivuvaikutuksena.

Liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla on lukuisia ominaisuuksia, jotka tekevät siitä erityisen edullisen infektioiden hoidossa käytettäviksi, joita ominaisuuksia ovat mm. seuraa-vat: (1) Liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla on laaja vaikutusalue. Se tehoaa mm. bakteerien, sienten, virusten ja loisten ai heuttamii n i nfekti oi hi n.

(2) Liukoisella fosfory1 oi dull a glukaanilla on lisä- tai sy-nergistinen vaikutus, kun sitä käytetään yhdessä sellaisen bioaktiivisten aineiden kanssa, joita tavallisesti käytetään infektioiden hoidossa, joista bioaktiivisista aineista mainittakoon mm. aminoglykosidiantibioootit jne.

(3) Liukoinen fosforyloitu glukaani ei aiheuta vastustuskyvyn kehittymistä aiheuttavissa organismeissa, koska sen vaikutukset ovat isännän välittämiä.

(4) Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin toksisuus on hyvin vähäistä.

(5) Liukoinen fosforyloitu glukaani estää ja korjaa leukopenia n kehittymisen.

(6) Liukoinen fosforyloitu glukaani voimistaa mitä erilaisimpia soluihin ja kehon nesteisiin liittyviä immuunivasteita isännässä.

(7) Liukoinen fosforyloitu glukaani estää tai kääntää immunosuppression kehittymisen isännässä.

5,4.2. Kasvainten hoito

Koska liukoinen fosforyloitu glukaani stimuloi makrofagien fagosytoivaa aktiivisuutta ja erityisaktiivisuutta ja lisää makrofagien prol iferaatiota, voidaan sitä käyttää menestyksekkäästi joko yksin tai yhdessä muiden hoitomuotojen, kuten i 27 8 81 G 9 leikkausten ja kemoterapian kanssa, kasvainsairauksien hoitoon, joista mainittakoon mm. rauhassyövät, reticulumsolu-sarkooma jne.

Lisäksi, koska liukoinen fosforyloitu glukaani inhiboi kas-vainsolujen, kuten mm. lymfosyytti Sten 1eukemiasolujen , lisääntymistä, voidaan sitä menestyksellä käyttää kasvainten kasvun ja metastaasien inhibointiin.

Viimein, liukoisen fosfory1 oidun glukaanin on osoitettu (ks. kohta 7) stimuloivan liukoisen sytotoksis-sytostaattisen tekijän tuotantoa ja erittymistä makrofagien toimesta (tästä lähtien käytetään lyhennettä "MCT", macrophage cytotoxic factor). MCT on rakenteeltaan tuntematon liukoinen proteiini-fraktio, joka voidaan eristää makrofagisoiujen viljelmän emä-liuoksesta, ja joka on toksinen syöpäsoluille, joista tässä yhteydessä mainittakoon mm. rauhassyövät jne. Näin ollen liukoista fos fory1 oitua glukaania voidaan menestyksellä käyttää MCT:n tuotannon stimulointiin in vivo. Lisäksi liukoista fos-foryloitua glukaania voidaan käyttää makrofagisolujen MCT-tuotannon stimulointiin in vitro.

5.5. Antotavat Tämän keksinnön mukaisia fosforyloituja glukaaneja voidaan antaa ennalta ehkäisevässä ja hoitotarkoituksessa erilaisiin tavoin, joista mainittakoon seuraavat, joita ei kuitenkaan ole tarkoitettu rajoittaviksi: suun kautta, injektioina, kuten suonensisäisesti, intraperitoneaalisesti, subkutaanisti, intramuskulaarisesti jne., paikallisesti nenän ja nenänielun limakalvoille ja sisäänhengittämäl1ä aerosolien avulla tai levittämällä hengitystien limakalvoille jne.

Eläimille tai ihmisille annettuina voidaan liukoinen fosforyloitu glukaani sekoittaa veteen, vesiliuokseen tai mihin tahansa fysiologisesti hyväksyttävään farmaseuttiseen kantaja-aineeseen tai apuaineeseen.

28 8 8 I G >'

Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavilla esimerkeillä.

6. Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin valmistus Hiukkasmainen glukaani valmistettiin Saccharomyces cerevi-siaesta menetelmällä Di Luzio et ai. (1979, Int'l J. Cancer 24: 773-779). Lyhyesti sanottuna, 6 litran pullossa suspen-doitiin 540 g kuivahiivaa (Universal Foods Corp., Milwaukee, WI) 3 litraan natriumhydroksidi n 3-%:sta vesiliuosta. Saatu suspensio sijoitettiin kiehuvalle vesihauteelle 4 tunniksi, annettiin jäähtyä yön aikana ja emäliuos dekantoitiin. Toimenpiteet toistettiin vielä kolme kertaa. Sen jälkeen jäännös tehtiin happamaksi lisäämällä liuos, jossa oli 800 ml väkevää suolahappoa ja 2 litraa 3-%:sta suolahappoa, ja sijoitettiin kiehuvalle vesihauteelle 4 tunniksi. Suspension annettiin seisoa yön yli ja emäliuos dekantoitiin. Jäännöstä hajotettiin edelleen 3 litralla 3-%:sta suolahappoa 4 tuntia o 100 C:ssa, annettiin jäähtyä yön ajan ja dekantoitiin. Hajottaminen 3-%:lla suolahapolla toistettiin vielä kahdesti. Sitten jäännös lämmitettiin tislatulla vedellä kolmeen kertaan (20°C) ja tislatulla vedellä kahteen kertaan (100 ° C). Jäännökseen lisättiin 1 litra etyylialkoholia, sekoitettiin perusteellisesti ja annettiin seisoa vähintään 24 tuntia, jotta uuttuminen tapahtui maksimaalisesti. Tumma, punaruskea aikoholiemäliuos imettiin pois jäännöksestä ja heitettiin menemään. Uutto alkoholilla toistettiin niin moneen kertaan, että emäliuos oli viimein oleellisesti ottaen väritöntä. Alkoholi poistettiin pesemällä jäännös neljään kertaan kuumalla vedellä ja sen jälkeen hiukkasmainen glukaanivai miste otettiin talteen sentrifugoima 11 a, jäädytettiin ja kylmäkuivattiin.

Liukoinen fosforyloitu glukaani valmistettiin keksinnön mukaisesti liuottamalla ja fosfory1 oimal1 a hiukkasmainen glukaani seuraa vai la tavalla: i 29 88109 18 g ureaa (8 M) liuotettiin kolviin, jossa oli 50 ml dime-tyy1isulfoksidia (DMSO) ja sekoitusta pidettiin yllä jatkuvasti. Lisättiin 1 g hiukkasmaista glukaania niin, että muodostui hienojakoinen suspensio. Kolvi kuumennettiin o 100 C:een ja sen jälkeen lisättiin hitaasti tipoittain 10 ml fosfori happoa (85 %). Seosta pidettiin 3-12 tuntia o 100 C:ssa kiehuvaan vesihauteeseen upotettuna. On edullista antaa reaktion edetä noin 6 tunnin ajan.

Kuumennusvaiheen aikana muodostui sakka, joka muuttui näkyväksi 1 tunnin kuluttua ja lisääntyi määrältään sen jälkeen. Noin 6 tunnin kuluttua seos jäähdytettiin ja laimennettiin 200 ml :11a tislattua vettä, jotta sakka saatiin uudelleen-suspendoiduksi. Sen jälkeen seos suodatettiin karkean, keski-karkean ja hienon sintterisuppi1 on läpi sakan poistamiseksi.

Sitten näin saatu liuos seulottiin molekyy1iseulai 1 a, jotta pienimolekyyliset jakeet, kuten glukoosi, DMSO ja urea, saatiin poistetuiksi.

Eräässä koesarjassa molekyyliseulonta suoritettiin dialysoi-malla 5 vuorokautta juoksevaa tislattua vettä vasten Spectra-por-kalvodiälyysi putkessa (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA). Tämän putken huokosten koko vastaa molekyy1ipainoa noin 12 000 daltonia. Toisessa koesarjassa molekyy1iseulonta suoritettiin Mi 11ipore-d1alysaattori/konsentraattori11 a (Milli-pore Corp., Bedford, MA), jonka suodattimen erotuskyky oli molekyy1ipainon 10 000 kohdalla. Pienimolekyy1iSten yhdisteiden poistamiseen käytettiin noin 70 litraa dialysointi 1iuosta. Kummassakaan tapauksessa ei lopullisesta valmisteesta löydetty glukoosia. Lopullisesta valmisteesta ei myöskään löydetty DMS0:ta, kun suoritettiin korkeapainekaasu-nestekromatografia.

Molekyy1iseulonnan jälkeen liuos, joka sisälsi kyseisen liukoisen fosfory1 oidun glukaanin, väkevöitiin ja kylmäkuivatuin. Tämä fosforyloitu glukaani on stabiili kylmäkuivatussa 30 881 09 tilassa vähintään 2 vuotta ja vähintään 15 kuukautta liuokse- o na, kun liuosta säilytetään -20 C:ssa.

7. Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin immunobioiogiset omi nai suudet__

Kaikkia seuraavissa kokeissa käytettyjä eläimiä pidettiin Purina Laboratory Chow -ravinnolla ad libitum ilmastoiduissa huoneissa, joissa oli 12 tunnin vaio-pimeä-syk1i .

7.1. Muutokset immunosuppressoitujen eläinten suuremmassa i nfekti oaltti udessa__

Eläimet, joiden kyky vastustaa injektioita on heikentynyt ke-moterapian tai synnynnäisen tai hankitun immuunikadon (esim. hankittu immuunikato-oireyhtymä eli AIDS) seurauksena, ovat hyvin ai ti i ta erilaisten organismien aiheuttamille infektioille. Esimerkiksi hyvin suuren määrän kuolemantapauksia AIDS-potilailla aiheuttaa Pneumocystis carinii (ks. e.g., Jaffee et ai., 1983, J. Infect. Dis. 148: 339-345; Gottlieb et ai., 1981, New Eng. J. Med. 305: 1425-1431).

Aiemmissa Walzer et al:n suorittamissa kokeissa (1983, J.

Reti cul oendothel . Soc. .33: 1-9; 1979; Infec. Immunol.

24: 939-947) on havaittu, että immunosuppressoitaessa C3H/HeJ-kannan hiiret antamalla kortikosteroidia kroonisesti näistä tulee alttiimpia P. carniin aiheuttamalle keuhkotaudille kuin muiden hiirikantojen hiiristä. Näissä eläimissä, kuten ihmisessä, Pneumocystis-keuhkotaudin kehittyminen edustaa latentin infektion aktivoitumista infektioidenvastustuskyvyn heikkenemisen eli immunosuppression seurauksena.

Seuraavat esimerkit osoittavat, että liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen kroonisesti immunosuppressoidui11 e C3H/-HeJ-hiirille paransi näiden eläinten elossapysymistä ja vähensi niiden alttiutta infektiosairauksille merkitsevästi.

3i 88109 7.1.1. Parempi elossapysyminen

Eräässä koesarjassa 100 C3H/HeJ-hi 1rtä (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) jaettiin neljään 25 hiiren ryhmään. Ryhmä 1 sai 0,5 ml 5-%:sta glukoosi1iuosta suonensisäisesti; ryhmä 2 sai 5 mg liukoista fosforyloitua glukaania suonensisäisesti; ryhmä 3 sai 1,5 mg kortisoniasetaattia (Upjohn, Kalamazoo, MI) subkutaanisti; ja ryhmä 4 sai sekä 5 mg liukoista fosforyloi-tua glukaania suonensisäisesti että 1,5 mg kortisoniasetaat-tia subkutaanisti. Kaikille hiirille suoritettiin käsittely kahdesti viikossa 5 viikon ajan ja elossapysymistä seurattiin 60 vuorokauden ajan. Huomattakoon, että kortisoniasetaati11 a käsitellyissä eläimissä oli tapahtunut erittäin voimakas im-munosuppressoituminen, koska annettu steroidi annos oli reilusti suurempi kuin se, jonka Walzer (supra) on osoittanut tarpeel1i seksi.

Saadut tulokset on esitetty kuvassa 3. Kuten kuvasta 3 ilmenee, ei pelkällä glukoosilla (ryhmä 1) eikä pelkällä liukoisella fosforyloidul1 a glukaanilla (ryhmä 3) käsitellyillä hiirillä esiintynyt lainkaan kuolemantapauksia. Vuorokauteen 24 mennessä oli pelkällä kortikosteroidi 11 a käsiteltyjen hiirten eloonjäämisprosentti 12 % (ryhmä 3). Histopatologiset tutkimukset osoittivat, että bakteeri- ja sieni-infektiot, joita esiintyi mm. aivoissa, olivat osaltaan kuolemanaiheut-tajia. Sitä vastoin oli kortikosteroidi 11 a ja liukoisella fosforyloidul1 a glukaanilla käsiteltyjen eläinten eloonjää-misprosenssi noin 68 % vuorokauteen 24 mennessä. Näiden eläinten pitkäaikainen eloonjäämisprosentti oli 66 %, mikä on erittäin suuressa määrin tilastollisesti merkitsevää verrattuna kortikosteroidi 11 a käsiteltyihin hiiriin (p<0,001).

7.1.2. Immunosuppressoitujen hiirten vastustuskyvyn kohenemi-nen, kun kyseessä on Eschericia colilla aiheutettu infektio Seuraava koe osoittaa, että liukoisen fosforyloidun glukaanin antaminen kohensi sekä normaalien että kroonisesti immunosuppressoi tu jen hiirten vastustuskykyä E. colin aiheuttamalle infektiolle.

32 88109 60 C3H/HeJ-hiirtä jaettiin 4 ryhmään, joissa kussakin oli 15 hiirtä. Ryhmä 1 sai kolme suonensisäistä injektiota 5-%:sta glukoosia (0,5 ml); ryhmä 2 sai kolme suonensisäistä injektiota, joissa kussakin oli 4 mg liukoista fosfory1 oitua glu-kaania per eläin; ryhmä 3 sai subkutaanisti kolme injektiota, joissa kussakin oli 1,5 mg kortisoniasetaattia per eläin; ja ryhmä 4 sai kolme injektiota yhdistettyinä siten, että kulloinkin annettiin 4 mg liukoista fosfory1 oitua glukaania suonensisäisesti ja 1,5 mg kortisoniasetaattia subkutaanisti per eläin. Kolmen vuorokauden kuluttua viimeisen injektion antamisesta hiiret saivat 2,5 x 10 E. coli -bakteeria vatsaonteloon. Elossapysymistä seurattiin 15 vuorokauden ajan E. coli11a suoritetusta infektoinnista lukien.

Kuvasta 4 ilmenee, että E. colilla infektoiduista, normaaleista, glukoosilla käsitellyistä hiiristä jäi eloon 65 % (ryhmä 1). Tässä ryhmässä ei ilmennyt lainkaan kuolemantapauksia sen jälkeen, kun E. colilla suoritetusta infektoinnista oli kulunut 7 vuorokautta. Sitä vastoin normaaleissa, liukoisella fosforyloidul1 a glukaanilla käsitellyillä hiirillä oli kuol1 eisuusprosentti 0 % (ryhmä 2). Näin ollen liukoisella fosforyloidul1 a glukaanilla suoritettu esikäsittely kohensi normaalien eläinten vastustuskykyä E. colilla aiheutetulla infektiolla merkitsevästi.

Kuvan 4 tuloksista ilmenee myös sellaisten eläinten huomattava kuolleisuus, jotka on kroonisesti immunosuppressoitu antamalla kortikosteroidi a. Glukoosilla käsitellyillä immunosupp-ressoiduilla hiirillä (ryhmä 3) oli kuolleisuus 50 % 40 tunnin kuluessa ja 75 % 5 vuorokauden kuluessa. Sitä vastoin immunosuppressoi dui 1 1 a hiirillä, jotka oli käsitelty liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla (ryhmä 4), oli kuolleisuus 0 %. Näin ollen sekä kontrol1ihiiri11ä että kortisonilla käsitellyillä hiirillä kykeni liukoinen glukaani kohentamaan isännän 33 88 1 09 vastustuskykyä niin, että että seurauksena oli sekä normaalien että kortisonilla immunosuppressoitujen hiirten täydellinen suoja gram-negatiivisei 1 a bakteerilla aiheutetulle infektiolle.

Nämä tutkimukset osoittavat, että liukoisen glukaanin antaminen hiirille, jotka saavat kortisonia immunosuppressiivisina annoksina, johtaa muutoksiin kortisonilla indusoidussa infek-tioalttiudessa. Näin ollen glukaani kykenee muuntamaan kortisonin kroonisesta antamisesta aiheutuvia immunosuppressiivi -siä vaikutuksia niin, että spontaanien infektoiden aiheuttama kuolleisuus pienenee, ja lisäksi kortisonin suhteellisen äkilliset immunosuppressiiviset vaikutukset vähenevät samalla.

7.2. Bakteeri sairauksien kulun muuttaminen eläimissä antamal-la niille liukoista fosforyloitua glukaania in vivo_ 7.2.1. Staphylococcus aureuksella aiheutetun sepsiksen kulun : · muuttami nen_________

Seuraava koe osoittaa liukoisen fosfory1 oidun glukaanin in vivo -annon muuntovaikutusta Staphylococcus aureuksella aiheutetun sepsiksen 1etaalisuuteen.

20 ICR/TEX-hiirtä jaettiin kahteen ryhmään ja käsiteltiin seuraavalla tavalla: 3, 2 ja 1 vuorokautta ennen sepsiksen indusointia ryhmälle 1 annettiin suonensisäisinä injektioina fosforyloitua glukaania 200 mg/kg; ryhmälle 2, joka oli kontrolliryhmä, annettiin suonensisäisinä injektioina vastaava tilavuus isotoonista glukoosia. Polysakkaridin kolmannen annon jälkeisenä päivänä kummallekin ryhmälle annettiin suonensisäisenä injektiona 1,0 x 10 S. aureus -solua. Koehiir-ten ja vertai 1uhiirten elossapysymistä seurattiin 130 vuorokauden ajan.

34 881 09

Saadut tulokset on esitetty kuvassa 5. Kuvasta ilmenee, että 2 vuorokauden kuluttua S. aureus-infektoinnista oli glukoosilla käsiteltyjen hiirten (ryhmä 2) kuolleisuus 60 %. Samana ajankohtana oli ennen infektointia liukoisella fosfory1 oidul-la glukaanilla käsiteltyjen hiirten kuolleisuus 0 Ϊ. 8 vuorokauden kuluttua infektoinnista oli kontrol1iryhmästä jäljellä 27 %. Sitä vastoin liukoisella glukaanilla käsiteltyjen eläinten elossasäilyminen oli 100 % samana ajankohtana. Kummassakaan ryhmässä ei ilmennyt lisää kuolemantapauksia 130 vuorokauden kuluessa. Näin ollen esikäsittely liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla vähensi merkitsevästi myöhemmin aiheutetun S. aureus -infektion letaalista vaikutusta.

7.2.2. Escherichia colilla aiheutetun vatsakalvontulehduksen kulun muuttaminen__________ 7.2.2.1. Suojaavaan vaikutukseen tarvittava aika Seuraavat kokeet osoittavat liukoisen fosfory1 oidun glukaanin vatsaontelonsisäisen annon tehoa E. colilla kokeellisesti aiheutettuun sepsikseen.

79 täysikasvuista valkoista hiirtä jaettiin 8 ryhmään, joissa kussakin oli 8-13 eläintä. Ryhmä 1, joka oli kontrolliryhmä, sai 1 ml glukoosi1iuosta (5 %); ryhmä 2, joka oli positiivinen kontrolliryhmä sai 3 mg hiukkasmaista glukaania; ja ryhmä 3 sai 12,5 mg liukoista fosfory1 oitua glukaania 24 tuntia ennen E. colilla tapahtunutta infektointia. Ryhmät 4, 5, 6 ja 7 saivat 12,5 mg liukoista fosfory1 oitua glukaania vastaavasti 6, 2, 1 ja 0 tuntia ennen E. colilla tapahtunutta infektointia. Ryhmä 8 sai 12,5 mg liukoista fosfory1 oitua glukaania 2 ja 4 tunnin kuluttua E. colilla tapahtuneesta infek-toinnista. Kaikki annot tapahtuivat vatsaontelonsisäisinä injektioina. E. coli (1,0 x 10 solua injektoitiin myös vatsaonteloon. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 5.

35 88 1 09

Taulukko 5

Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antoajankohdan vaikutus E. coli -sepsiksen aiheuttamaan kuolleisuuteen_

Eloonjäämi s-%

Ryhmän Aika Aika (tunteja) infek- a b c numero Käsittely tuntia toinnista lukien 12 16 24 48d 1 Glukoosi 24 40 0 0 0 2 PG - 24 100 100 88 88 3 SPG - 24 80 80 70 70 4 SPG 6 100 100 100 88 5 SPG 2 20 20 20 20 6 SPG 1 20 20 20 20 7 SPG 0 30 0 0 0 8 SPG +2,+4 80 0 0 0 a

Ryhmän numero tarkoittaa tekstissä selostettua käsittelytapaa. Kussakin ryhmässä oli 8-13 eläintä.

b PG tarkoittaa hiukkasmaista glukaania; SPG tarkoittaa liukoista fosforyloitua glukaania.

c

Eläinten käsittelyajankohta.

d .....

Missään ryhmässä ei esiintynyt lisää kuolemantapauksia 48 tunnin jälkeisenä aikana.

Kuten taulukon 5 tuloksista ilmenee, liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen vatsaonteloon paransi merkitsevästi sellaisten hiirten eloonjääneisyyttä, joille oli kokeellisesti aiheutettu E. coli -vatsakalvontulehdus (ryhmät 3 ja 4). Kuten voidaan havaita, liukoisen fosfory loidun glukaanin antaminen vielä 6 tuntia ennen E. co1 il la tapahtunutta tartutusta oli tehokasta.

36 88 1 09

Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen joko samanaikaisesti E. coli antamisen kanssa tai sen jälkeen ei pystynyt kääntämään E. coli -vatsakalvontulehduksen letaalista vaikutusta (ryhmät 7 ja 8) infektion nopeasta etenemisestä johtuen.

7.2.2.2. Annosvaste

Vielä erään koesarjan avulla määritettiin erikokoisten liukoisen fosfory1 oidun glukaanin annosten vaikutus E. colilla indusoituun vatsakalvon tulehdukseen ja sen aiheuttamaan kuolleisuuteen.

106 valkoista hiirtä jaettiin 9-30 hiirtä sisältäviin ryhmiin.

Ryhmät 1-2, jotka olivat kontrolliryhmiä, saivat glukoosia vastaavana tilavuutena. Ryhmät 2-7 saivat liukoista fosfory- loitua glukaania vastaavasti 1, 1, 2, 4, 8, 10, 20, 120, 200 ja 260 mg/kg. Kaikki injektiot annettiin vatsaonteloon 24 tuntia ennen vatsakalvontulehduksen indusoi nti a, joka tapah- 3 tui antamalla E. colia (1 x 10 solua) vatsaonteloon. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 6.

Taulukko 6

Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin (SPG) annoksen suuruuden a vaikutus vatsaonteloon annetun E. colin 1etaalisuuteen

Ryhmän Hiirten Annos no Käsittely lukumäärä (mg/kg) Eloonjaämis-% 1 Glukoosi 30 - 13 2 SPG 22 1 78 3 SPG 12 2 83 4 SPG 12 4 83 5 SPG 12 8 83 6 SPG 9 10 100 7 SPG 9 20 89 37 881 09 a

Joko glukoosia tai liukoista fosfory1 oitua glukaania annettiin yhtenä injektiona vatsaonteloon 24 tuntia ennen E. colilla suoritettua infektointi a. Eloonjääneisyy s todettiin 24 tunnin kuluttua infektoinnin suorittamisesta.

Taulukon 6 tuloksista voidaan havaita, että kaikki liukoisen fosfory1 oidun glukaanin annokset, joiden suuruus oli välillä 1-20 mg/kg, olivat suunnilleen yhtä tehokkaita suojaamaan eläimiä vatsaontelonsisäisenä injektiona annetun E. colin vai kutuk si 1 ta .

7.3. Liukoisen fosforyloidun glukaanin vaikutus viruksella aikaansaatuun maksatulehdukseen_

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hiukkasmainen glukaani kykenee lisäämään eloonjäämistä, estämään maksanek-roosin ja pitämään yllä fagosytoivan aktiivisuuden aktivoinutta tilaa hiirissä, jotka on infektoitu hiiren hepatiitti-viruksen (MHV) kannalla A59 (Williams and Di Luzio, 1980, Science 208: 67-69).

Seuraava koe osoittaa, että etukäteen annettu liukoinen fos-foryloitu glukaani paransi sellaisten hiirten eloonjäämistä, joille oli aiheutettu virusperäinen hepatiitti kokeellisesti.

20 koiraspuolista C57BL/6 Tex-hiirtä (Timco, Houston, TX) jaettiin kahteen ryhmään. Ryhmä 1, joka oli kontrolliryhmä, sai glukoosia suonensisäisenä injektiona (0,5 ml/hiiri) ja ryhmä 2 sai suonensisäisenä injektiona liukoista fosforyloi-tua glukaania (5 mg/hiiri) 3, 2 ja 1 vuorokautta ennen akuutin virushepatiiti n aiheuttamista. Hepatiitti aiheutettiin injektoimalla vatsaonteloon 16 kömpiementinsitoutumisyksikköä (CFU) MHV A59-kantaa.

38 8 8 1 09

Hiirten elossapysymistä seurattiin 30 vuorokauden ajan viruksen antamisesta lukien. Saadut tulokset on esitetty kuvassa 6.

Kuten kuvasta 6 voidaan havaita, liukoisen fosforyloidun glu-kaanin suonensisäinen antaminen paransi akuuttia virushepa-tiittia sairastavien hiirten elossapysymistä. 6 vuorokauden kuluttua hepatiitin aiheuttamisesta oli kontrol1iryhmän eloonjääneisyy s 50 %. Sitä vastoin oli liukoisella fosfory-loidulla glukaanilla esi käsi teltyjen hiirten eloonjääneisyys 100 % tuona samana ajankohtana. Myöhemmin (vuorokausina 7-30) ei kummassakaan ryhmässä havaittu enää kuolemantapauksia.

7.4. Suun kautta annetun liukoisen fosfory1 oidun glukaanin vaikutus Candida albicansilla aiheutettuun sepsikseen_

Seuraava koe osoittaa, että suun kautta annettu liukoinen fosforyloitu glukaani kykenee muuttamaan Candica albicans -hiivalla aikaansaadun sepsiksen letaalista vaikutusta.

25 koiraspuolista ICR/Tex-hiirtä jaettiin kahteen ryhmään. Ryhmälle 1 (13 hiirtä) annettiin 7 vuorokauden ajan ennen infektointia juomavettä, joka sisälsi liukoista fosforyloitua glukaania 5,0 mg/ml. Hiiret juovat noin 1,2-1,5 ml vuorokaudessa, joten käsitellyt eläimet saivat liukoista fosforyloi-tua glukaania noin 7 mg vuorokaudessa. Ryhmä 2, joka oli kontrolliryhmä (12 hiirtä), sai koko koejakson ajan ravinnokseen vesijohtovettä. Vuorokautena 0 kaikkiin eläimiin injek-. . ... ,6 toitiin suonensisäisesti Candida albicansia (3,0 x 10 so- lua/hiiri). Ryhmälle 1 annettiin vielä 5 vuorokauden ajan in-fektoinnin jälkeen suun kautta juomavedessä liukoista fosfo-ryloitua glukaania ja sen jälkeen vesijohtovettä. Kummankin ryhmän hiirten painoa seurattiin. Sekä ryhmän 1 että ryhmän 2 hiirten paino nousi samalla nopeudella. Kummankin ryhmän elossapysymistä seurattiin myös. Saadut tulokset on esitetty käyrinä kuvassa 7.

i 39 881 09

Kuten kuvasta 7 voidaan havaita, liukoisen glukaanin antaminen ennen C. albicansilla suoritettua infektointia ja 5 vuorokautta sen jälkeen paransi hiirten elossapysymistä merkitsevästi, mutta vain väliaikaisesti. Vuorokausina 25 ja 30 in-fektoinnin jälkeen oli liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanil-la käsiteltyjen hiirten eloonjääminen merkitsevästi parempi (tasolla p < 0,0 5 ) kuin vertailuryhmän hiirten. (K h i n neliökoe χ<0,05<0,01). Keskimääräinen elossapysymisaika kontrol1iryh-mässä oli 18 vuorokautta, kun taas vastaava aika liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla käsitellyssä ryhmässä oli 30 vuorokautta. Pitkän ajan eloonjäämistä tarkasteltaessa ei lopputulos kummassakaan ryhmässä poikennut toisistaan merkitsevästi. Näin ollen tämä koe viittaa siihen, että liukoisen fosfo-ryloidun glukaanin annoksen ehkä pitää suun kautta annettaessa olla suurempi.

7.5. Makrofagien fagosytoivan aktiivisuuden kohentaminen Seuraava koe osoittaa, että liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen kohensi makrofagien fagosytoivaa toimintaa merkitsevästi.

20 koiraspuolista ICR-hiirtä jaettiin kahteen ryhmään, joissa kummassakin oli 10 hiirtä. Vuorokausina 3, 2 ja 1 ennen fagosytoivan aktiivisuuden määrittämistä ryhmälle 1, joka oli kontrolliryhmä, annettiin injektioina vastaava tilavuus fysiologista suolaliuosta, ja ryhmälle 2 annettiin liukoista fosfory1 oitua glukaania (200 mg/kg). Kaikki injektiot annettiin vatsaonteloon.

Fagosytoiva toiminta arvioitiin mittaamalla kolloidisen hiilen (Cll/143 (a), Gunther Wagner, Hannover, Germany) suonensisäinen poistumisnopeus menetelmällä Wooles et ai. (1962, Rad. Res. Ij5: 546-554 ). Kolloidinen hiili (640 mg/kg) annettiin suonensisäisesti ja veri näytesarjat otettiin häntäleskimosta. Näytteet hemolysoitiin 4,0 ml:ssa 0,5 %:sta natriumkarbonaat-tiliuosta ja kolloidisen hiilen pitoisuudet määritettiin 40 88 1 09 spektrofotometri sesti . Puol i intiimi sajaksi (t/2) katsottiin se aika, jona optinen tiheys tai pitoisuus oli puolet nolla-ajan arvosta, joka määritettiin ekstrapoloimalla poistumakäy-rät nol1a-aikaan. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7

Liukoisen fosfory1 oi dun glukaanin (SPG) vaikutus makrofagien fagosytoi vaan toimintaan______

Suonensisäinen a

Hoito Ruumiin Maksan poistuma t/2 paino (g) paino (g) (minuuttia)

Fysi oio-ginen suolaliuos 24,8 + 0,82 1,94 + 0,05 7,6 + 0,73 SPG 25,2 + 1,03 1,82 + 1,03 3,5 + 0,58* a N = 10 per ryhmä *p<0,001

Kuten taulukon 7 tuloksista ilmenee, kohensi liukoisen fosfo-ryloidun glukaanin antaminen fagosytoivaa vaikutusta merkitsevästi, mitä 55 %:n nopeutuminen poistumassa heijastaa (taulukko 7). Kuten jo aiemmin mainittiin, maksan painossa ei havaittu kohoamista (taulukko 7).

7.6. Makrofagien erittävän aktiivisuuden koheneminen Makrofagien eritystoiminnan päätuote, erityisesti niiden ollessa aktivoituneessa tilassa, on välittäjämolekyyli nimeltään interleukiini-1. Interleukiini-1 on polypeptidi, joka indusoi sekä koe-eläimissä että ihmisissä akuutin vaiheen proteiinivasteen. Tähän vasteeseen sisältyvät mm. erytrosyyt-tien sedimentaationopeuksien kasvu, leukosytoosi , akuutin vaiheen proteiinien määrän kohoaminen ja endogeenisestä pyro- 4i 88109 geenistä johtuva kuumeen kehittyminen. Lisäksi interleukiini-1 kykenee syvälle menevästi stimuloimaan T-solujen aktivoitumista ja proliferaatiota. Näin ollen interleukiini-1 on lymfosyyttejä aktivoiva tekijä, joka kykenee solutasolla valjastamaan torjuntajärjestelmän toimintaan ja tehostamaan sen toimi ntaa.

Seuraava koe osoittaa, että liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen stimuloimakrofagien erittävää aktiivisuutta, kun määritys suoritetaan interleukiini-1: n erittymisenä.

Rotille (16 kpl) annettiin injektoimalla suonensisäisesti liukoista fosfory1 oitua glukaania (200 mg/kg). Kahdeksalle konrol1ieläimel1 e annettiin vastaava tilavuus glukoosi1iuosta . P1asmanäytteet otettiin 1, 3, 5, 8, 24, 48, 72 ja 168 tunnin kuluttua injektion antamisesta.

Interleukiini-1-tuotanto arvioitiin käyttämällä C-57 BL/6J- 6 tymosyyttejä. Tymosyyttivi1jelmiä (1 x 10 solua) inkuboi-tiin pelkässä väliaineessa, tai 0,1 ml:ssa plasmaa, joka oli otettu kontrol1iroti1 ta tai liukoisella fosfory1 oidul1 a glu-kaanilla käsitellyiltä rotilta. Kaikkia soluviljelmiä pidettiin yllä 24 tuntia, jossa vaiheessa lisättiin l^uCi -H-tymidiiniä, ja sen jälkeen inkubointia jatkettiin vielä 24 tuntia. Tässä vaiheessa mitattiin tyrni diininkulutus. Saadut tulokset on esitetty kuvassa 8.

Kuvasta 8 ilmenee, että liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaa-nilla käsiteltyjen rottien seerumin interleukiini-l-aktiivi-suus oli kohonnut, mitä heijastaa tymosyyttien tyrni diininku-lutuksen kohonneisuus ajankohtina 1, 24, 48 ja 72 tuntia verrattuna glukoosilla käsiteltyjen hiirten seerumiin. Näin ollen liukoinen fosforyloitu glukaani aktivoi makrofageja nopeasti ja lisää niiden erittävää aktiivisuutta, mikä heijastuu plasman kohonneina interleukiinipitoisuuksina. 24-72 tunnin pilkin luonnetta e1 tähän mennessä ole saatu tarkoin sel-vi tetyksi.

42 8 8 1 09 7.7. Makrofagien tuottaman kasvaintenvastaisen sytotoksiinin tuotannon kohoaminen in vitro_

Seuraavien kokeiden avulla arvioitiin liukoisella fosforyloi-dulla glukaanilla stimuloitujen makrofagien kykyä tuottaa makrofagien sytotoksis-sytostaattista tekijää (MCT).

Pernan makrofageja, jotka oli saatu C57BL/6J-hiiristä (5 x 6 10 solua), inkuboitiin RPMI 1640 -alustassa, joka sisälsi 7,5 % vasikan sikiön seerumia, 50 kansainvälistä yksikköä/ml penisilliini G:tä, 50^ug/ml streptomysiiniä, 50^ug/ml gentamysiiniä, 10^ug/ml Amphotericin B:tä ja 2 mg/ml NaHC0:a. Vertai 1usoluja inkuboitiin pelkässä alustassa. Koe-soluja inkuboitiin alustassa, joka sisälsi liukoista fosfo- ryloitua glukaania (5 mg/ml). Kaikkia soluja inkuboitiin 20 o tuntia 37 C:ssa ilmakehässä, jossa oli 5 % C0^:a ja 95 % ilmaa, Falcon 2013 -viljelypulloissa. Inkuboinnin loputtua viljelmän emäliuos sentrifugoitiin talteen ja solut poistettiin täydellisesti laskemalla 0,22^u:n suodattimen läpi.

MCT:n läsnäolon määritystä varten rauhassyöpäsolut (BW10232) leimattiin H-tyrni diini11ä ja pestiin kolmeen kertaan mahdollisen rakenteeseen sijoittumattoman radioaktiivisuuden 4 poistamiseksi. Leimatut kasvainsolut (2 x 10 solua/0,1 ml) lisättiin sen jälkeen kololevyn koloihin emäliuosta, josta 011 tarkoitus tutkia MCT, lisättiin koloon 0,1 ml ja soluja inkuboitiin 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen kololevyt sentri-fugoitiin ja 0,1 ml:n eristä määritettiin radioaktiivisuus. Vapautunut radioaktiivisuus, joka edustaa kasvainsolujen lyy-sin seurauksena tapahtunutta hajoamista, vaihteli suoraan läsnäolevan MCT-määrän suhteessa. Lisäksi sytolyysi ja syto-staasi arvioitiin kvalitatiivisesti kiinnittämällä kasvainsolut etanolilla ja suorittamalla värjäys geimsalla. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 8.

43 8 810 s'

Vertai 1umakrofagelsta tai levossa olevista makrofageista, so. sellaisista, joita ei ole käsitelty liukoisella fosfory-loidulla glukaanilla, saadut emäli^okset sisältävät sytotok-sista tekijää (MCT), joka edistää H-tymidiinin vapautumista adenokarsinoomasoluista pelkkään alustaan verrattaessa (taulukko 8). Glukaanilla stimuloitujen makrofagien emäliuos sisältää kuitenkin olennaisesti enemmän MCT:tä. Sytotoksisuu-den kohoaminen on erittäin selvästi havaittavissa (taulukko 8).

Taulukko 8

Liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla aktivoitujen makrofagien emäliuoksen kohonnut sytotoksisuus rauhassyövän BW10232 suhteen._ a 3H-tyrni diinin vapautuminen (¾)

Levossa olevien

Alusta makrofagien SPG:11ä aktivoitujen (vertailu) emäliuos maksofagien emäliuos 27,2 + 2,8 53,4 + 6,6* 88,9 + 3,7** aArvot edustavat 6 toisinnosta ryhmää kohti laskettuja keskiarvoja +_ keskihajonta *p<0,01 **p<0,001

Jotta saataisiin osoitetuksi, ettei emäliuosfraktion kohonnut 3 sytolyyttinen vaikutus johtunut glukaanista, H-tyrni diim 1 -lä leimattuja kas vainsoluja inkuboitiin liukoisen fosforyloi-dun glukaanin (0,5 mg) läsnäollessa 24 tuntia. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 9.

44 8 8 1 09

Taulukko 9

Osoitus siitä, ettei liukoisella fosfory1 oidul 1 a glukaanilla ole suoraa sytotoksista vaikutusta rauhassyöpään BW10232 in vitro______ 3 d H-tyrni diinin vapautuminen

Alusta (vertailu) Liukoinen fosforyloitu glukaani 27,2 + 2,8 22,4 + 1,8 a

Arvot edustavat 6 toisinnosta ryhmää kohti laskettuja keskiarvoja + keskihajonta

Kuten taulukon 9 tuloksista voidaan havaita, ei liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla ole mitään merkitsevää vaikutusta tymidiinin vapautumiseen esi 1eimatuista kasvainsoluista. Näin ollen voidaan vetää se johtopäätös, että tymidiinin suurempi vapautuminen kasvainsoluista johtui makrofagien tuottamasta tuotteesta, jota liukoisen fosfory1 oidun glukaanin läsnäollessa viljeltyjen solujen emäliuos sisälsi.

Emäliuosjakeen sytotoksis-sytostaattinen vaikutus varmistettiin viljelmien histologisei 1 a arvioinnilla. Rauhassyöpäsolut (BW10232), joita viljeltiin pelkässä kasvualustassa, kasvoi-vat erinomaisesti. Edellä selostettujen havaintojen perusteella, jotka koskivat H-tymidiinin vapautumista, ilmeni normaali kasvu myös sellaisissa kasvainsol uissa, joita viljeltiin 24 tuntia liukoista fosfory1 oitua glukaania sisältävässä alustassa. Tämä varmistaa sen, ettei liukoisella fosfo-ryloidulla glukaanilla ole suoraa sytotoksista vaikutusta kasvainsoluiinjaan . Sitä vastoin selvänä vastakohtana oli merkitsevä solujen vahingoittuminen ja lyysi havaittavissa kasvainsoluissa , joita oli inkuboitu liukoista fosfory1 oitua glukaania sisältävässä kasvualustassa kasvatettujen makrofa- i 45 881 09 gien emäliuoksessa. Solujen vahlngoittumisaste ja lyysi havaittiin paljon suuremmiksi näillä soluviljelmillä kuin silloin, kun kasvualustaan lisättiin normaalien tai kontrolli-makrofagien emäliuosta. Näin ollen liukoinen fosforyloitu glukaani indusoi levossa olevat makrofagit lisäämään kasvaimiin vaikuttavan sytolyyttisen tekijän tuotantoaan.

Koska sytotoksis-sytolyyttisen (MCT) tekijän havaittiin olevan proteiini, haluttiin sen ominaisuudet, kuten molekyyli-paino(t), määrittää. 50 mg makrofagisoiujen viljelmien kuivattua emäliuosta liuotettiin 1 ml:aan steriiliä vettä ja saatu liuos sijoitettiin lasipylvääseen (1,5 x 90 cm; LKB Instruments), joka oli pakattu Sephacryl S-300 superfine -matriisilla (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ).

Pylväs ajettiin virtausnopeudella 0,2 ml/min käyttämällä eluenttina fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta. Jakeet kerättiin 1 ml:n välein ja niiden sytostaattinen aktiivisuus testattiin. Saadut tulokset on esitetty käyränä kuvassa 9.

Kuten kuvasta 9 ilmenee, antoi liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla aktivoidun makrofagifΐ1jelmän emäliuoksen py1 -väskromatografia 2 piikkiä, joilla oli sytotoksinen aktiivisuus rauhassyöpäsoluihin. Piikit eluoituvat tilavuuksissa, jotka vastasivat molekyy1ipainoja 38 500 ja 84 000 daltonia.

7.8 . Muuntava vaikutus metastaattiseen maksasairauteen Seuraava koe osoittaa, että liukoisen fosfory1 oidun glukaanin joko yksin tai yhdessä kasvainlääkkeen, esim. syki ofosfamidi n, kanssa vähensi primaarisen kasvaimen kasvua ja reticulumsolu-sarkooman metastaasia hiirillä.

120 C57BL/6J-hiirtä (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) jaettiin neljään 30 hiiren ryhmään. Kaikki hiiret saivat sub- 4 kutaanina injektiona 1,0 x 10 reticulumsolusarkooma M5076 -solua. 20 vuorokauden kuluttua injektion antamisesta valittiin mielivaltaisesti 5 hiirtä ja ne surmattiin, jotta saa- 46 881 09 tiin määritetyksi primaaristen kasvainten kasvu ja varmistetuksi metastaattisten vammojen läsnäolo. Primaaristen kasvainten painon keskiarvo oli 1,86 g eli 6,4 % ruumiinpainosta ja kaikilla tutkituilla eläimillä oli elinspesifisiä mikrome-tastaaseja maksassa. Primaarisen kasvaimen painon muutos laskettiin prosentteina käyttämällä 20 vuorokauden kohdalla saatua kasvaimen painoa vertai 1uarvona.

Vuorokautena 20 kasvaimen siirrostamisesta lukien ja siitä eteenpäin joka kolmas päivä vuorokauteen 50 asti ryhmälle 1, joka oli kontrolliryhmä, annettiin suonensisäisesti glukoosi-liuosta (0,5 ml), ryhmälle 2 annettiin suonensisäisesti liukoista fosfory1 oitua glukaania (200 mg ruumiinpainon kiloa kohti), ryhmälle 3 annettiin sykiofosfamidi a (Cytoxan, Mead Johnson, Evansville, IN) (45 mg ruumiinpainon kiloa kohti) ja ryhmälle 4 annettiin liukoista fosfory1 oitua glukaania suonensisäisesti (200 mg ruumiinpainon kiloa kohti) ja vatsaonteloon sykiofosfamidi a (45 mg ruumiinpainon kiloa kohti).

Eri käsittelyjen vaikutus primaarisen kasvaimen kasvuun on esitetty taulukossa 10. Vaikutus eloonjäämiseen on esitetty taulukossa 11.

Taulukko 10

Kemoimmunoterapia liukoista fosforyloitua glukaania yhdessä syk 1 ofosfami di n kanssa käyttäen _________________ Käsitelty Kasvaimen paino ryhmä (% ruumiinpainosta) no vrk 30 vrk 36 1 12,6 15,5 2 8,3 11,8 3 8,5 8,7 4 4,4 2,3 47 88 1 09 a

Kaikille C57BL/6J-hiiriryhmil1 e annettiin subkutaanisti 4 injektoimalla 1,0 x 10 reticul umendoteel isoi ua vuorokautena 0. Vuorokautena 20 oli primaaristen kasvainten painojen keskiarvo 1,86 g eli 6,4 % ruumiinpainosta. Vuorokautena 20 ja joka kolmas päivä siitä eteenpäin hiirelle suoritettiin lää-kekäsittely. Tämän yksityiskohdat on esitetty tekstissä.

Taulukossa 10 esitetyistä tuloksista voidaan havaita, että vuorokautena 30 reticulumsarkoomasolujen injektoinnista lukien oli liukoisella glukaanilla ja syki ofosfamidi 11 a suunnilleen yhtä suuret primaaristen kasvainten kasvua hillitsevät vaikutukset eli painot olivat 8,3 % ja 8,5 % verrattuna vertai 1 uhi i ri 1 1 e (ryhmä 1) saatuun 12,6 %:iin ruumiinpainosta. Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin ja syki ofosfamidi n yhdistelmällä käsitellyissä hiirissä (ryhmä 4) ilmeni vielä suurempi primaaristen kasvainten koon pieneneminen, nyt paino oli 4,4 % ruumiinpainosta verrattuna kontrol1ihiirten (ryhmä 1) 12,6 %:iin.

Tulokset olivat vielä selvempiä vuorokautena 36 (taulukko 0). Kun kasvainten painon keskiarvo kasvoi 142 % 16 vuorokaudessa (vuorokausina 20 - 36) kontrolliryhmässä (ryhmä 1) kasvoi kasvainten paino liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla käsitellyssä ryhmässä (ryhmä 2) vain 84 % ja sykiofosfamidi 11 a käsitellyssä ryhmässä (ryhmä 3) vain 36 %. Ensimmäistä kertaa tutkimuksissamme havaittiin todellinen taantuminen primaarisissa kasvaimissa, kun käytettiin kemoterapiaa yhdistettynä liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla suoritettuun immuno-terapiaan. Yhdistelmähoidolla havaittiin -64 %:n kasvu, mikä merkitsi primaaristen kasvainten kasvun taantumista.

Taulukossa 11 esitetyistä tuloksista voidaan havaita, että pelkästään liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla (ryhmä 2) tai pelkällä syk1ofosfamidi 11 a (ryhmä 3) käsitellyillä ryhmillä eloonjääminen kasvoi merkitsevästi (p<0,01) kontrolli- 48 381 09 ryhmään (ryhmä 1) verrattuna. Lisäksi tilastollisesti erittäin merkitsevä (p<0,001) eloonjäämisajän piteneminen havaittiin eläimillä, jotka oli käsitelty liukoisen fosfory1 oidun glukaanin ja syki ofosfamidi n yhdistelmällä.

Nämä tutkimukset osoittavat selvästi sen tehokkuuden, joka kemoterapian ja liukoisella fosforyloidul1 a glukaanilla suoritetun immunoterapian yhdistämisei 1ä on. Paitsi primaaristen kasvainten kasvua, voitiin myös metastaattisessa sairaudessa havaita kehitystä parempaan suuntaan histopatologisten havaintojen perusteella. Maksassa sijaitsevat metastaasit, jotka olivat hyvin selviä kontrol1iryhmässä, puuttuivat oleellisesti ottaen kokonaan liukoisen fosfory1 oidun glukaanin ja syki ofosfamidi n yhdistelmällä käsitellyltä ryhmältä. Lisäksi näin käsitellyssä ryhmässä havaittiin merkitsevä elossapysymisen piteneminen (taulukko 11) sekä koheneminen siinä aikavälissä, joka kului ensimmäisen kuolemantapauksen esiintymiseen käsitellyssä ryhmässä.

Taulukko 11

Kemoimmunoterapia liukoista fosfory1 oitua glukaania yhdessä syk1 ofosfamidi n kanssa käyttäen. Vaikutus hiirten elossapysy-miseen, kun niillä oli etenevä reticulumsolusyöpä M5076_ Käsittely- Ensimmäinen Elossapysymis- Ajankohta (vrk), ryhmä kuoleman- ajan keskiarvo jolloin kuolleisuus a b no tapaus (vrk) oli 100-X:nen 1 27 34 52 2 32 41* 67 3 43 51* 65 4 52 64** 102 i 49 8 8 1 09 a

Menetelmät olivat samat kuin taulukossa 10 esitettyjen tulosten hankkimisessa käytetyt. Kaikki käsittelyt lopetettiin vuorokautena 50.

b

Kuolleisuus liukoisella fosfory1 oi dull a glukaanilla ja syk-1 ofosamidi 11 a käsitellyssä ryhmässä oletettavasti johtui jäljelle jääneistä pernakasvainsoluista, jotka muodostivat haja-pesäkkeitä hoidon lopettamisen jälkeen.

*p<0,01 **p<0,001 7.9. Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin kyky estää syklofosf-amidin indusoi ma 1eukopeni a _

Melkein kaikkien syöpälääkkeiden käyttöön liittyy haittavaikutuksina mm. myelosuppression ja leukopenian indusoituminen ja alttiuden kokoaminen Infektiosairauksille (ks. yleisesti Klastersky, toim. Infection in Cancer Patients, Raven Press, NY, 1982, s. 1-12).

Kuten kohdassa 7.8. on yksityiskohtaisesti selostettu, on liukoista fosfory1 oitua glukaania ja sykiofosfamidi a yhdessä käyttämällä mahdollista saada primaarisiin kasvaimiin kohdistuvat synergistinon vaikutus. Eräs syklofosfamidin käyttöön syöpäpotilailla liittyvä haitta on leukopenian kehittyminen. Koska aiemmin on osoitettu, että erilaiset hiukkasmaiset ja liukoiset polyglukaanit kykenevät edesauttamaan sellaisten hiirten hemopoieettista toipumista, joille oli annettu joko tuntia aiemmin tai tuntia myöhemmin 650 radia kobolttisätei-lytystä (ks. Patchen, 1983, Surv. Immunol. Res. 2: 237-242; Patchen et ai., 1984, J. Biol . Response Modifiers, 627-733), suoritettiin kokeita, jotta saataisiin selville kykeneekö liukoinen fosforyloitu glukaani pitämään yllä leuko-syyttitasoa eläimissä, jotka saavat sykiofosfamidi a hoitavina ja immunosuppressiivisina annoksina.

50 881 09 40 hiirtä jaettiin neljään ryhmään. Ryhmä 1, joka oli kontrolliryhmä, sai suonensisäisesti isotoonista glukoosia, ryhmä 2 sai liukoista fosfory1 oitua glukaania (5 mg per hiiri), ryhmä 3 sai vatsaonteloon syki ofosfamidi a (Cytoxan) (0,6 mg per hiiri) ja ryhmä 4 sai yhdistelmähoitona syki ofosfamidia plus liukoista fosfory1 oitua glukaania. Kaikki injektiot annettiin kolmen vuorokauden välein ja kukin eläin sai kaikkiaan neljä injektiota. Perifeerisestä verestä laskettiin ko-konaisleukosyyttimäärä vuorokautena 14. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 12.

Taulukko 12

Syki ofosfamidi n indusoiman leukopenian estäminen liukoisella fosforyloi dull a glukaanilla__ Käsittely Kokonai s leukosyytti määrä (x 1000 per mm verta)

Kontrolliryhmä 13,8 + 1,6 SPG 10,0 + 1,8

Sykiofosfamidi 6,0 + 0,81 SPG < syk 1 ofosfamidi 12,2 + 1,62 a

Liukoista fosforyloitua glukaania (SPG) annettiin 5 mg hiirtä kohti suonensisäisesti joka kolmas päivä. Syklofosfa-midia (0,6 mg/hiiri) annettiin vatsaonteloon joka kolmas päivä. Kokonaisleukosyyttimäärä laskettiin 14. koepäivänä.

i p<0,01 - verrattaessa kontrolliryhmää syki ofosfamidi 11 a käsiteltyihin 2 * 1 p < ϋ, 01 - SPG + syk1 ofosfamidi verrattuna pelkkään syklo-f o s f a m i di 1 n si 88109

Taulukon tuloksista voidaan havaita, että sykiofosfamidi n antaminen sai aikaan tunnusomaisen 47 %:n laskun peri feerisessä kokonaisleukosyyttimäärässä (p<0,01). Liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen yhdessä sykiofosfamidi n kanssa sai aikaan 103 %:n kohoamisen kokonaisleukosyyttimäärässä syki ofosfami-di 11 a käsiteltyyn ryhmään verrattuna (p<0,01).

Tämä tutkimus osoittaa selvästi, että liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antaminen yhdessä sykiofosfamidi n kanssa kykeni estämään sykiofosfamidi n antoa tunnusomaisesti seuraavan leuko-penian kehittymisen. Tämän pitäisi pitää yllä vastustuskykyä infektiosairauksia vastaan myrkyllisten kemoterapeuttiSten aineiden läsnäollessa samalla, kun ne saavat aikaan synergis-tisen, kasvainten kehittymistä taannuttavan vaikutuksen, kuten edellä kohdassa 7.8. on esitetty.

7.10. Sytostaattinen vaikutus lymfosyytti Sten 1eukemiasolujen proliferaatioon in vitro_ Tämä tutkimus osoittaa, että liukoinen fosforyloitu glukaani kykenee alentamaan hiiren lymfosyytti Sten 1eukemiasolujen proliferaationopeutta in vitro.

Viljelmänä ylläpidettyjä lymfosyyttisiä L-1210-1eukemiasoluja 5 kasvatettiin kololevyn koloissa pitoisuudessa 2 x 10 so- lua/kolo. Lisättiin liukoista fosfory1 oitua glukaania (500 ^ug/kolo) tai hiukkasmalsta glukaania (100^ug/kolo) ja soluja i nkuboi ti i n 24 tuntia. Kon trolli vi1j e1 mi i n lisättiin sama tilavuus kasvualustaa (RPMI-1640, jota oli täydennetty 7,5 %:11 a vasikan sikiön seerumia). Sitten kaikkiin viljel-3 miin lisättiin H-tymidiiniä (0,5^uCi/kolo) ja inkubointia jatkettiin vielä 24 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin sen mukaan, kuinka paljon H-tymidiiniä oli sijoittunut rakenteeseen. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 13.

52 88 1 09

Taulukko 13

Liukoisen fosforyloidun glukaam'n (SPG) ja hiukkasma i sen glu-kaanin (PG) vaikutusten vertailu in vitro, kun kohteena on hiiren lymfosyytti Sten 1eukemiasolujen proliferaatio__ 3 Käsittely- H-tymidiinin Kasvainsolujen proliferaation a

ryhmä otto (opin) i nhi hoi tum1 s-X

Kontrolliryhmä 3547 +_ 310 0 SPG 407 + 38 88,5 + 9,3 PG 2269 + 293 36,0 + 4,6 a 5 L-1210-soiuja (2 x 10 /kolo) inkuboitiin liukoisen fosforyloidun glukaanin (0,5 mg/kolo) tai hiukkasmaisen glukaanin (0,1 mg/kolo) läsnäollessa 24 tuntia. H-tymidiiniä lisättiin (0,5^uCi/koi o), jotta kasvainsolujen proliferaatio saatiin mitatuksi. N = 24 koloa/ryhmä.

Kuten taulukon 13 tuloksista ilmenee, hiukkasmainen glukaani esti kasvainsolujen proliferaatiota noin 36 %. Selvänä vastakohtana tälle liukoinen fosforyloitu glukaani esti kasvainso-lujen proliferaatiota noin 88,5 %. Näin ollen eräs niistä mekanismeista, joilla liukoinen fosforyloitu glukaani estää kasvainten ja metastaasien kasvua, on sen kyky, jonka luonnetta ei tällä hetkellä tarkemmin tunneta, estää kasvainsolu-jen proliferaatiota suoraan.

8. Liukoisen fosforyloidun glukaanin valmistaminen Coriolus varsicolorista ja näin saadun valmisteen tehokkuus_

Seuraavat kokeet osoittavat, että itiökantaisiin sieniin kuuluvasta Coriolus versicol or-sienosta (Fr. Quel.) saadulla liukoisella fosfory1 oidul1 a glukaanilla on myös immunobiolo-gista aktiivisuutta.

53 881 09

Kaupallisesti saatavissa olevaa polysakkaridi-proteiinivalmistetta ("Krestin" tai "PSK", toimittaja Sanyko Corporation, Tokio, Japani) käytettiin lähtöaineena liukoisen fosforyloi-dun glukaanin valmistamiseen C. versicolorista. Tämä kaupallinen valmiste on suhteellisen epäpuhdas valmiste, joka sisältää beeta-1,4-, beeta-1,3- ja beeta-1,6-glukaani-proteii-nikompleksia. Pääasiallinen kemiallinen polyglukoosirakenne on päägl ukoosiyk si kköket j u, jonka yksiköt ovat liittyneet, toisiinsa I , (>-g 1 uk os 1 d 1 s 111 a sidoksilla, ja Johon on liittynyt gI ukoos iyksi kkösi vuketj uja beeta-1,3- ja -1,6-gI ukos 1 <1 i -silla sidoksilla. Proteiinipitoisuus on välillä 15 - 38 % (Ehrke et ai., 1983, Internat'l J. Immunopharm. 5_: 34-42; Yamamura ja Azuma, 1982, Adv. Immunopharm. 2: 501-507).

Koska kaupallisesti saatavissa oleva PSK-valmiste on suhteellisen epäpuhdasta ja sen proteiinipitoisuus on suhteellisen korkea, ei sen anto suonensisäisesti ole mahdollista. Sitä pitää antaa suun kautta.

8.1. Valmistus C. versicolorln PSK-polysakkar1di-prote11n1kompleks1sta valmistettiin liukoinen fosforyloltu glukaanl (käytetään tästedes nimeä "liukoinen fosforyloitu PSK") esillä olevan keksinnön mukaisesti kohdassa 5 kuvatulla tavalla. Eristetty liukoinen fosforyloitu PSK kylmäkuivattiin.

8.2. Vaikutus Escherichia colilla aiheutettuun vastakalvon- tulehdukseen_

Seuraava koe osoittaa, että vatsaonteloon etukäteen annettu liukoinen fosforyloitu PSK tehoaa myöhemmin aiheutettuun E. coli -vatsakalvontulehdukseen.

48 täysi -1 k ä1stä valkoista hiirtä Jaettiin kolmeen 16 hiiren ryhmään. Ryhmä 1, joka oli kontrolliryhmä, sai suonensisäisesti U,5 ml isotoonlsta, fysiologista suolaliuosta, ryhmä 2 sai suonensisäisesti 5 mg kaupallisesti saatavissa olevaa 54 8 8 1 09 P S K:ta (Sankyo Corporation, Tokio, Japani) ja ryhmä 3 sai suonensisäisesti 5 mg liukoista fosfory1 oitua PSK:ta. Molemmat glukaanit annettiin 24 tuntia^ennen E. colilla suoritettua in fek toi nti a. E. coli (1 x 10 bakteeria) injektoitiin vatsaonteloon. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 14.

Taulukko 14 C. versicolorista saadun liukoisen fosfory1 oidun glukaanin antamisen vaikutus E. colilla aikaansaadun sepsiksen ai heut-tamaan kuolleisuuteen_____ a

Ryhmä Käsittely Eloonjäämis-%

Aika (h) injektoinnista 24 48 72 1 Fysiologinen b suolaliuos 6 6 6 2 PSKC 63 25 19 3 Liukoinen fosfo- b ryloitu PSK 100 100 100 a N = 16 hiirtä/ryhmä b 24 tuntia ennen E. colilla vatsaonteloon suoritettua infek-tointia annettiin hiirille yhtenä injektiona joko fysiologista suolaliuosta tai liukoista fosfory1 oitua glukaania (5 mg/hi i ri).

c

Kaupallisesti saatavissa oleva PSK (Sankyo Corporation, Tokio, Japani) annettiin suonensisäisesti (5 mg/eläin) 24 tuntia ennen E. colilla suoritettua infektoi nti a.

55 88 1 09

Kuten taulukon 4 tuloksista ilmenee, oli kaupallisesti saatavissa olevalla PSK:11 a ja liukoisella fosfory1 oidul1 a PSK-glukaanilla merkitsevä suojaava vaikutus E. coli-sepsistä vastaan 24 tunnin ajan infektoinnista lukien (so. eloonjää-neisyys oli 63 % ja 100 % vastaavasti verrattuna fysiologista suolaliuosta saaneen kontrolliryhmän hiirten 6 %:iin). PSK-valmisteeseen verrattuna oli keksinnön mukaisesti valmistetulla liukoista fos fory1 oitua PSK-glukaania sisältävällä valmisteella paljon parempi vaikutus eloonjäämiseen infektion jälkeen pitemmän ajan kuluessa. 72 tunnin kuluessa infektoin-nista lukien ei liukoisella fosfory1 oidul1 a PSK:11 a käsitellyssä ryhmässä havaittu yhtään kuolemantapausta (ryhmä 3). Samanaikaisesti havaittiin PSK :11a käsitellyssä ryhmässä (ryhmä 2) 81 %:n kuolleisuus.

Claims (11)

56 881 09

1. Menetelmä liukoisen fosforyloidun glukaanin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (a) liuotetaan hiukkasmainen glukaani tai glukaani-proteiinikompleksi voimakkaasti polaariseen liuottimeen, joka sisältää voimakkaasti kaotrooppista ainetta; (b) näin liuotettu glukaani saatetaan reagoimaan fosfori-hapon kanssa niin, että syntyy liukoinen fosforyloitu glukaani; ja (c) otetaan reaktioseoksesta talteen saatu liukoinen fosforyloitu glukaani, joka käsittää fosforyloidun poly-/beta- (1>3)-glukopyranoosi/-ketjun jolle on luonteenomaista: (i) kyky liueta veteen tai vesiliuokseen; (ii) myrkyttömyys, ei-immunigeeninen ja oleellisesti ei-pyrogeeninen luonne; ja (iii) kyky tuottaa selvä immunobiologinen vaste annosteltaessa in vivo eläimelle tai ihmiselle.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että voimakkaasti polaarinen liuotin on di-metyylisulfoksidi.

3· Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että voimakkaasti kaotrooppinen aine on urea.

4- Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että hiukkasmainen glukaani tai glukaani-proteiinikompleksi liuotetaan menetelmällä, joka koostuu seu-rnavista peräkkäisistä vaiheista: (n) hiukknsmainon glukaani tai glukaani-proteiinikomplek si suspendoidaan voimakkaasti polaariseen liuottimeen, joka sisältää voimakkaasti kaotrooppista ainetta niin, että saadaan aikaan seos; 57 881 09 . . O (b) saatu seos kuumennetaan noin 50 - 150 C:een, (c) seokseen lisätään fosforihappoa, (d) seoksen annetaan reagoida noin 1-12 tuntia 50 -o

150 C:ssa.

5· Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n - o n e t t u siitä, että seos kuumennetaan noin 100 C:een.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n - n o t t u siitä, että seo3 sisältää noin 4 - 12 moolia ureaa dimetyylisulfoksidilitraa kohti.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukaanin annetaan reagoida fosforiha-pon kanssa niin pitkään, että fosforyloituminen, jonka lopputuote liukoinen fosforyloitu glukaani on, tapahtuu oleellisesti ottaen täydellisesti.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukoinen fosforyloitu glukaani otetaan talteen siten, että (a) liukoisen fosforyloidun glukaanin annetaan saostua; (b) lisätään riittävä määrä vettä, jotta saostunut liukoinen fosforyloitu glukaani saadaan uudelleensuspendoiduksi; ja (c) poistetaan kaikki komponentit, joiden molekyylipaino on alle noin 10 000 daltonia.

9· Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun ne t t u siitä, että hiukkasmainen glukaani saadaan Saccha-romyces cerevisiaesta.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukaani-proteiinikompleksi saadaan Co- riolus versioolorista. 58 881 09

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että hiukkasinainen glukaani saadaan menetelmällä, joka koostuu seuraavista vaiheista: (a) eienisolut suspendoidaan hydroksidin vesiliuokseen niin, että syntyy seos; o <b) seos kuumennetaan noin 50 - 150 C:een; (c) saadusta jäännöksestä poistetaan emäliuos; (d) jäännös suspendoidaan hydroksidin vesiliuokseen; (e) vaiheet h .ja c toistetaan 2 tai 3 kertaa; (f) vaiheen e jäännökseen lisätään suolahappoa niin, että syntyy hapan seos; o (g> hapan seos kuumennetaan noin 100 C:een; <h) poistetaan emäliuos; <i> toistetaan vaiheet f ja g kahdesti; <j) pestään jäännös vedellä; (k) uutetaan jäännös toistuvasti etanolilla, kunnes emä-liuos on oleellisesti ottaen väritön; ja (l) eristetään näin saatu liukenematon polyglukoosιseos. 59 88 1 09 Pa tentk ra v