JPS63500805A

JPS63500805A - 可溶性リン酸化グルカン

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Publication number: JPS63500805A
Application number: JP61504604A
Authority: JP
Inventors: ジ　ルジオ、ニコラス　アール
Original assignee: ジ　アドミニストレイタ−ズ　オブ　ザ　テユ−レン　エデユケイシヨナル　フアンド
Priority date: 1985-08-19
Filing date: 1986-08-13
Publication date: 1988-03-24
Anticipated expiration: 2011-11-06
Also published as: US4739046A; WO1987001037A1; US4833131A; KR900008442B1; EP0232405A4; AU6229686A; FI871718A0; NO871603L; EP0232405A1; NO871603D0; ATE71528T1; NO170586B; US4818752A; NO170586C; JP2550332B2; KR870700355A; FI88109C; EP0232405B1; DK198587A; US4761402A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性リン酸化グルカン１、技術分野本発明は、新規クラスの可溶性グルカン類に関する。更に詳しくは、本発明は、サツ力ロミケスセレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびコリオラスペルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）のような各種微生物から新規可溶性リン酸化グルカン類を調敷する方法のほかにポリ−［β−（１−３）グルコビラノース］鎖が種々の程度にリン酸化されている可溶性リン酸化グルカン類に関する。本発明の新規可溶性リン酸化グルカン類は、非毒性、非抗原性、実質的に非発熱性であり、動物およびヒトにインビボ（ｉｎｖｉｖＯ）投与される際は顕著な免疫バイオロジー的反応を示し、そしてその最も著しい活性が他の免疫活性細胞の活性化を生じさせるマクロファージ活性の免疫刺激でめる。さらに、これら可溶性リン酸化グルカン類は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でリンパ性白血病に対すると同様にインビボで腺癌類および肉腫類に対して細胞増殖抑制作用を示す。

２、背景技術「グルカン」と称する言葉は、セルロース、アミロース、グリコゲン、ラミテリアン類（ｌａｍｉｎａｒｉａｎｓ）、デンプン等のポリマー類を含有する、各種の天然に生ずるホモ多糖類またはポリグルコース類を一般に対象とする。グルカンは、αまたはβ型のいずれかである１−３，１−４、および１−６のグルコシド結合によりリンクされた分校または非分枝鎖のグルコース単位を含む。

ここで定ｉするように、「微粒子グルカン」は、イーストサッカロミケスセレビシエの細胞壁から誘導されたような非水溶性微粒子（約１〜３μ）ポリグルコースを示す。

微粒子グルカンは、巨大分子であり、かつ一連のβ−１−３グルコシド結合により単位化された閉鎖グルコビラノース単位から成っている。［ハッシド等、　、　１９４１、ジャーナルオブ　アメリカン　ケミカル　ソサイヤティ−６３：　２９５〜２９８頁ニジ　ルジオ等、、１９７９　、インターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサ−２４；　７７３〜７７９頁（Ｈａｓｓｉｄ７７３−７７９）　］。Ｘ線回第１研究においては、微粒子グルカン類が三重らせん鎖（ｔｒｉｐｌｅ−５ｔｒａｎｄｅｄ　ｈｅｌｉｃｅｓ）形態テ存在することが示された［サーフ等、　、　１９８３．バイオケミカルソサイヤテイー　トランスアクション　１１：　１３９〜１４２頁（Ｓａｒｋｏ　ｅｔ　ａｌ　、、　１９８３．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、　１１：１３９−１４２）］。

２．１．微粒子グルカン類の免疫バイオロジー的活性微粒子グルカンは、Ｂリンパ球細胞と同様にマクロファージ／単球細胞系、補体の有効な賦活物質である。

このように、微粒子グルカンは、細網内皮系および免疫系の両者に十分な効果を示した。

以前の研究においては、微粒子グルカンの各種実験動物へのインビボ投与が次のことを含む多くの十分な免疫バイオロジー的反応を誘導することを示した：（１）単球類およびマクロファージ類の増殖の高揚［デエイマンとファヒミ、１９７９．ジャーナル　オブ　イクスペリメンタル　メディシン１４９：　８８３〜８９３頁；アシュワース等、１９６３　、イクスペリメンタル　モレキュラー　パソロジー１．サブリメント　１　：　８３〜１０３（１０３（Ｄｅｉ　ａｎｄ　Ｆａｈｉｍｉ。

１９７９、　Ｊ、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、　１４五８８３−８９７；Ａｓｈｗｏｒｔｈ　ｅｔ、虹、。

１９６３、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｈｏ１ｅｃ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　Ｓｕｍｏ、　１：　８３−１０３）］　：（２）マクロファージ食作用機能の高揚［リギとジ　ルジオ、１９６１．アメリカン　ジャーナル　オブ　フイジオロジ−，２００：　２９７〜３００頁（Ｒｉｇｇｉ　ａｎｄ　Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ、１９６１．Ａｍ、Ｊ、Ｐｈ　ｙｓｉｏｌ、ｌＷ−：　２９７−３００）］　；（３）マイクロファージ分泌活性の高揚［ベーリン等、１９８１、イン　へテロジエニテイ　オブ　モノニュクリアーフ１ゴサイテス、フォースター　アンド　ライトイ、エツト０．アカデミツク　プレス、ニューヨーク、２４３〜２５２頁（Ｂｒｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．ｉｎ　Ｈｅｔｅｒｏｑｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　）Ｉｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ、　Ｆｏｒｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｙ、ｅｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、　２４３−２５２）］　；（４）マクロファージサイズの増大［パッチエンとロトゾ−バ、１９８０．イクスペリメンタル　へマトロジー　」：４０９〜４２２頁（Ｐａｔｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｌｏｔｚｏｖａ、　１９８０．Ｅｙ：ｐｅｒ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　８：　４０９〜４２２）］　；（５）マクロファージ付＠および走化性活性の高揚　二スカネン等、　、　１９７８．キャンサー　リサーチ　嬰：　１４０６〜１４０９（Ｎｉｓｋａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　３８：　１４０６−１４０９）］　；そして（６）補体活性化の高揚［グロブスキー等、　、　１９８３．ジャーナヤル　オプ　レテイキュロエンドセリアル　ソサイアテ対する細胞溶解活性の高揚は、インビボ［マンセルとジルジオ、１９７Ｂ、イン“′　ザ　マクロファージ　イン　ネオプラシア゛′、フインク等、、アカデミツク　プレス、ニューヨーク、２２７〜２４３頁（）ｌａｎｓｅｌｌ　ａｎｄ　Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ、１９７６　、　ｉｎ“Ｔｈｅ　Ｈａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ”、Ｆｉｎｋ、ｅｄ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、２２７−２４３）　］およびイン　ビトロ８５−１０９１　）　、　］の両者において微粒子グルカン処置された動物およびヒトからのマクロファージ類で示された。

微粒子グルカンのイン　ビボ投与による細網内皮系の刺激は、到死的に放射線照射された動物において異型的または異種間の骨髄移植片許容を抑制する［例えばウールスとジ　ルジオ、１９６４．プロシーディング　ソサイヤテイオブ　イクスペリメンタル　バイオロジカル　メデイシン１１５ニア５６〜７５９頁（Ｓｅｅ、　ｅ、ｇ、　Ｗｏｏｌｅｓ　ａｎｄ　Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ。

１９６４、　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、Ｅｘｐｅｒ、Ｂｉｏｌ、　）ｌｅｄ、　１１且７５６−７５９）参照のことコ。この発見は、正常細胞が遺伝的にホストと異なるならばグルカンが正常細胞に対してもホスト防衛機構を誘導するだろうということを示す。

細網内皮系および免疫反応の効果に加えて、微粒子グルカンのインビボ投与は、致死量の全身照射から回収されるより多い顆粒球形成、単球形成および赤血球形成を含む造血活性を高めることを示したしパッチエン、１９８３．サーベは、細菌、菌類、ウィルスおよび寄生体生物により誘導される各種の感染性疾病に対するホスト抵抗を著しく修飾することが示された。特に、感染に対してホスト抵抗の高揚は、動物がエシェリキア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｅｒｉａ　ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）。

フランジセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）。

マイコバクテリウム・レプレ（Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｊ　１ｅｐｒａｅ）。

ストレプトコッカス・ニューモニエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　。

スポロトリウム・ジエンキイ（ＳｐＯｒＯｔｒｉＣｈｕｍ　５ｃｈｅｎｃｋｉｉ）のような微小有機体、同様にベネズエラン　エキーネ　エンｔ？　’７７０ミエリテイス　ウィルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ　ｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、リフトバレー熱ウィルス、マウス肝炎ウィルス、フロッグ　ウィルスＩＩＩ　（ｆｒｏｇ　ｖｉｒｕｓＩＩＩ）、単純ヘルペスＩおよびＩＩのようなウィルス類、およヒレイシマニア　ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｄｏｎｏｖａｎｉ）　［ジルジオ、１９８３．トレントス　イン　ファーマコロジカルサイエンス、４：　３４４−３４７頁（Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ、１９８３．Ｔｒｅｎｄｓ　ｔ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｓｃｉ、　４：　３４４−３４７）およびそこに引用されている文献を参照のこと］のような寄生体類により対抗された場合に見られた。

広範な研究は、微粒子グルカンが有効な抗腫瘍活性を有することを示した。例えば、微粒子グルカンはアデノカルシノーマ（腺癌）　ＢＷ１０２３２．アナプラスチック　カルシノーマ（退化病）　１５０９１Ａ、メラノーマ（黒腫）Ｂ１６および自然按発生リンパ性白血病ＢＷ５１４７［ジ　ルジオ等、１９７９、インアトパンシス　イン　イクスペリメンタル　メデイシンｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１２１Ａ：　２６９−２９０）］を含む４つの相乗的ネズミ腫瘍モデルにおいて腫瘍成長および長びく生存率を抑制することを示した。

細胞基準の微粒子がグルカンの抗腫瘍活性評価のために、対照および微粒子グルカン処置マウスから誘導された腹腔マクロファージ類の抗腫瘍細胞溶解活性が研究された［マンセルとジ　ルジオ、　１９７６、イン　ザ　マクロファージイン　ネオブラシア、フィンク等、アカデミツクプレス。

ニューヨーク、２２７〜２４３頁（Ｈａｎｓｅｌｌ　ａｎｄ　Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ、１９７６　、　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｍａｃｈｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、　Ｆｉｎｋ、　ｅｄ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、　２２７−２４３）　］　、これらの研究により、グルガン処置マウスからの腹腔マクロファージ類は正常なマクロファージ類に比較して顕著なｌｌ１ｌ胞溶解反応を産生することが示された。この観察が確認された［例えば、ベーリン等、１９８１．、イン　へテロジェニティ　オブモノニュクリアー　ファゴサイテス、フォルスター　アンド　ランデイー、ニド　アカデミツク　プレス　、ニューヨーク、２４３〜２５２頁およびチリゴス等、１９７８、キャンサー　リサーチ　３８：１０８５〜１０９１頁（ｓｅｅ、ｅ、ｇ、、Ｂｉｒｌｉｎｅｔａｌ、　１９８１　、ｉｎ　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙ　ｏｆ　）Ｉｏｎｏｎｕｃｌｅ＠ａｒ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ、　Ｆｏｒｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｙ、　ｅｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ、　ｐｐ、　２４３−２５２）　ａｎｄ　Ｃｈｉｒｉｇｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７Ｂ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、嬰）　１０８５−１０９１）参照のこと］更に微粒子グルカンでインキュベートした正常、腫瘍細胞を使用するインビトロ研究は、グルカンが肉腫および黒（色）腫細胞に直接細胞増殖抑制効果を及ぼし、かつ、正常なｎ臓および骨髄細胞類に増殖効果を及ぼすことを示した［ウィリアムス等、　１９８５．ヘパトロジー、　５：１９８〜２０６（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｑｙ、　５：　１９８〜２０６）］。

これらの研究は、治療で投与された場合に研究されたグルカンが、恐らくは肉腫細胞に対するかかるグルカンの直接細胞増殖抑制効果と同様に増大したタッパ− 細胞の抗腫瘍活性により（１）肝転移を顕著に抑制し：（２）初期腫瘍成長を抑制しそして（３）生存率を高めるであろう。

これらのバイオロジー的特性にもかかわらず、微粒子グルカン類の反対である副作用がこれらの化合物をほとんど臨床医薬において無用となした。

２．２．微粒子グルカン類の反対の副作用微粒子グルカン類が動物にインビボ投与された場合に多くの反対の副作用が明らかとなり、その中でもつと注目すべきは次のようなものであった：（１）肉芽腫形成（サイコイド−シス）；（２）肝牌腫大症成長：（３）グラム陰性感染および（菌体）内毒素に対する感受性の増大；（４〉補体の活性化［アナフィラトキシン（ａｎａｐｈｙｌｙｏｔｏｘｉｎ）　］　；（５）肺内芽腫性脈管炎の成長；（６）静脈内投与後の低血圧化；（７）高濃度投与の場合の微小寒栓症の成長。

更に、微粒子グルカンがインビボ投与される際に相対的に高度の急性毒性が観察される。例えば、微粒子グルカンの水性懸濁液の単一静脈注射後に、２０％と１００％死亡率（ｍｏｒａｌｉｔｙ）は、２５０と５０（Ｃｇ１ｇ体重のグルカンをそれぞれ受容するマウスで観察された。

その上、グルカン製剤の微粒子持性（１−３μ）のために静脈ルート経由投与が困難である。例証によれば、微粒子グルカン類を受けるある患者は、静脈（ＩＶ）投与の間塞栓形成を避けるために微粒子グルカンを懸濁液として保持するために必須である静脈（ＩＶ）点滴ビンを連続的に振動とするという一定の管理を必要とした。

若干可溶性の中性グルカン類が市販されているけれども、これらの製剤は、水溶液が高粘度であり、そして更に重要なことに、実験動物に投与された時にその使用は必然的にかなりの毒性を伴うため、静脈投与に適していない。

レンチナン、即ち高分子量でおり、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓｅｄｏｄｅｓ）から得られた難溶性β−１，３およびβ−１，６グルカン、は犬への静脈投与について研究された。多くの逆の臨床結果は、レンチナン服１２．０，８．０および３０ｍ　（］　／ｋＶ日で５週間（味の素（株）、東京、日本国）の投与から観察された。逆の結果は、嘔吐、紅斑、強膜の変色および顔面はれを含んでいた。循環虚脱、不安定歩行、変更行動パターン余分の唾液が出ることも個々のピーグル大において観察された、。死体解剖において胃腸粘膜のうつ血が２．０または８．０ｍｙ／Ｋｇ／日処置動物で観察された。肝臓の形態の変化は、肝臓細胞中に蓄積された内部細胞形質物質、多分レンチナン、を示した。ある動物は、８゜Ｏｍｇ／　Ｋｇの最初の注射の際に循ｙＡ虚脱を示した。回復したが、経験動物は胃腸路の出血を示す血液の存在を有する嘔吐エピソードを繰り返した。他の動物は、顔面の紅斑および皮下のはれ（水腫）により示されるように著るしいアレルギー反応を示すように思われた。死体解剖において皮下組織の広範囲の水腫および出血を有する胃腸路のうつ血が見い出された。マクロファージ細胞は、物質の蓄積、多分レンチナン、を示した［チェスターマン等、１９８１．　トキシコロジカル　レター９：８７〜９０頁（Ｃｈｅｓｔｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｔ。

、１９８１．Ｔｏｘｉｃｏｌ、　Ｌ　ｅｔｔ　、９：８７〜９０）　］。

０．１〜１　、０ｍ３／に３／日範囲の各種服用量のレンチナンを静脈を通じてラットに９週間与えるさらなる毒性研究が実施された。毒性は、皮膚外傷の成長のおよび血栓塞栓症の事実を示唆する耳の変色により示された［コーゼンス等、、　１９８１．　トキシコロジカル　レター９　：　５５−６４　（Ｃｏｚｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１．　Ｔｏｘｉｃｏｌ、Ｌ　ｅｔｔ　、９：５５〜６４）　］。

２．３．可溶性微粒子グルカン類に対する試みの失敗微粒子β−１，３グルカン類のインビボ投与の不利益に鑑みて非毒性、何ら重要な病理学を誘導せず、さらに重要な免疫バイオロジー的活性を有する可溶性β−１，３ポリグルコ一ス開発の広範な研究が行なわれた。

微粒子グルカンのギ酸加水分解により製造された低分子量非リン酸化可溶性グルカン製剤は、抗腫瘍および坑スタフィロコッカス活性を示した［ジ　ルジオ等、、　１９７９．インターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサー晟−７７３〜７７９頁（Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏｅｔ　ａｌ、、１９７９．Ｉｒ１ｔｅｒｎａｔ’ ｌ　Ｊ　。

Ｃａｎｃｅｒ　２４：　７７３〜７７９）　］　。不幸な事に、この方法により得られたフラクションの低収量および多様性は、この製剤を予防および治療への適用を有効でないものとしたしジ　ルジオ、１９８３．　トレンズ　イン　ファーマコロジカル　サイエンス　−４，：　３４４〜３４７頁（Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ、　１９Ｂ３゜Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　４：　３４４−３４７）参照のことコ。

同様に、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）ｒ分子弛Ｍ薬」の添加による微粒子グルカンを可溶化する試みも不成功でおった。ＤＭＳＯはグルカン分子の三重らせん立体配置を弛めるだろうと考えられていた。事実、微粒子グルカンはＤＭＳＯの存在下で溶解する。ＤＭＳＯ溶液から可溶性グルカンを単離する試みの全ては、しかしながら、失敗した。ＤＭＳＯ−グルカン溶液をグルコースおよび塩化ナトリウム（ｓａｌｉｎｅ）溶液のような各種水性媒体で希釈すると微粒子タルカンが再形成された。ＤＭＳＯ−可溶性グルカン溶液を塩化ナトリウムで希釈した後、これら溶液の注射を受ける動物の全ては高濃度ＤＭＳＯまたは微粒子グルカンの再形成のため注射後直ちに死亡した。

エタノール（１００％）添加によりグルカンがＤＭＳＯ中に沈降すると、沈降物は集められ、凍結乾燥された。この凍結乾燥グルカンが水中に加えられると、微粒子グルカンが再形成した。

アセチル化と同様にホスフェートまたはサルフェート基の添加により微粒子グルカンの中性グルカン製剤を極性負荷製剤に変える試みも失敗した。これら工程の各々は微粒子グルカンの溶解（Ｕ　Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏにより制御され、各側において微粒子グルカンは再形成された。

３、発明の要約グルカンの三重らせん鎖が鎖の各々の反応を許容するよう十分に弛める方法の徹底的な研究の間に、微粒子グルカンが（尿素のような）強いカオトロピック剤の存在下において（ＤＭＳＯのような）高極性溶媒に溶解する際に、グルカンは構造的に十分に分裂させられて各単鎖（またはストランド）の各々のリン酸化反応を許容し、生じたリン酸化グルカンは微粒子グルカンの特性三重らせん構造が実質的に完全に存在しなことを示した。生じたリン酸化グルカンの除去は、水に溶解すること、非毒性、非免疫抗原性、実質的な非発熱性および動物およびヒトにインビボ投与される時に顕著な免疫バイオロジー的反応を行うことを示す。

これらの発見に基づいて本発明は、（ａ）ポリ［β−（１−３）−グルコビラノース］鎖がさまざまな程度にリン酸化され；（ｂ）非毒性、非免疫抗原性、実質的な非発熱性：および（Ｃ）動物およびヒトにインビボ投与された場合に顕著な免疫バイオロジー的反応をすることができる新規なりラスの可溶性リン酸化グルカン類を提供する。これら新規な可溶性リン酸化グルカン類は、ざらに微粒子グルカン類の三重らせん構造の実質的な不存在、細網内皮系および免疫系の他の免疫活性細胞の活性化を生じさせる免疫刺激マクロファージ活性により特徴づけられる。更にこれら可溶性リン酸化グルカン類は、それに限定されないが、白血球生成を含む造血活性を高める。これら可溶性リン酸化グルカン類は、インビボで腺癌および肉腫に対し、インビトロでリンパ性白血病に対して細胞増殖抑制効果を示す。これら可溶性リン酸化グルカン類はインビボでマクロファージ細胞を刺激するばかりでなく、インごトロ培養化マクロファージ細胞に顕著な刺激効果を働かせる。マクロファージ細胞のかかる免疫刺激は、マクロファージ細胞毒性／細胞増殖抑制性因子（ＭＣＴ）、選択的に癌細胞、特に腺癌に毒性である未知構造のタンパク質またはタンパク質類の生産を必然的に伴う。

加えて、本発明は（他の微生物源を使用しても良いが好ましくはサツ力ロミケスセレビシエから生産された）微粒子グルカンを強カオトロピック剤を含む高極性溶媒中に溶解し、生じたグルカンをリン酸と反応させて可溶性リン酸化グルカンを形成させ、そして反応混合物から生じたリン酸化グルカン類を回収するこれら可溶性リン酸化グルカン類を調製する方法を提供する。

更に、本発明は、細菌、菌類、ウィルス類および寄生体有機物により誘導された感染を可溶性リン酸化グルカンまたは動物またはヒトに生理学的に許容可能な担体と組合せた可溶性リン酸化グルカンから成る製剤組成物を投与することによる治療および予防に関する方法を提供する。その上、それらの方法はそれらの作因により誘導された感染の治療処置用にその感染に対して有効なバイオ活性剤と組合せた有効量の可溶性リン酸化グルカンを投与することにより提供される。

その上、本発明は治療上有効量の可溶性リン酸化グルカン単独または抗癌剤と組合せて動物またはヒトに投与することにより悪性新生疾病の処置方法を提供する。本発明は、同様に、抗癌剤と組合せて有効量の可溶性グルカン類を動物またはヒトに投与することにより、抗癌剤の投与により誘導された白血球減少症の予防方法を提供する。

更に、本発明は動物およびヒトマクロファージ細胞を刺激して可溶性細胞毒性／細胞増殖抑制因子（ＭＣＴ）を生産・分泌する方法およびそのように調製された生産物を提供する。特に、ＭＣＴは可溶性リン酸化グルカンを動物またはヒトに投与若しくは動物またはヒトマクロファージ細胞を可溶性リン酸化グルカン含有培養培地中でインビトロで培養することにより調製される。

本発明の可溶性リン酸化グルカン類の特性は、（１）グラム陽性細菌感染を圧倒し死亡率を加減させる効能；（２）グラム陽性細菌感染を圧倒し死亡率を加減させる効能；（３）顕著に免疫抑制された動物およびヒトにおトの感受性の高揚を加減する効能：（５）ウィルス感染を顕著に加減する効能：（６）菌類および他の寄生体有機物により誘導された自然発生感染を加減する効能；（７）単独で使用した場合に初期腫瘍成長を顕著に抑制し、抗癌剤と組合せて使用された場合に初期腫瘍成長に対し相乗効果を及ぼす効能；（８）動物およびヒトの転移外傷と同様に初期悪性外傷の退行に抗癌剤と相乗的に作用する効能を含む。

これらの独特の特性のため可溶性リン酸化グルカン類は、多くの新生条件と同様に、細菌、ウィルス、菌類および寄生体有機物により誘導された各種の疾病に対し予防および組成物は、生理学的に許容可能な製剤担体とともに、単独でまたは他のバイオ活性または薬学的に関する製剤および治療法と組合せて有効に使用してもよい。

４、図面の単な説明および添付の図を参照してざらに十分理解されるであろう。

第１図は、２７ｍ！ｊ／ｒｄにおける可溶性リン酸化グルカンの核磁気共鳴スペクトル図である。

第２区部、市販のレンチナン製剤（味の素（株）東京、日本国）の核磁気共鳴スペクトル図である。第２Ａ図は、４０ｍｇ／威濃度において得られたスペクトル図である。第２Ｂ図は、３ｍ３／ｍ！！レンチナン濃度において得られたスペクトル図で必る。

第３図は、週２回可溶性すン酸化グルカン注射を受けたコルチコステロイド免疫抑制マウスの生存効果を示す図である。同様に第３図は正常なマウスの生存率に対して可溶性グルカンの慢性投与結果を示ず。

第４図は、正常およびコルチコステロイド免疫抑制マウスのエシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｅｒｉａ　Ｃｏ１１）感染前の可溶性リン酸化グルカンのインビボ投与結果を示す図である。

第５図は、その後実験的に誘導されたスタフィロコッカス・アウレウス感染の致死効果に対する可溶性リン酸化グルカンの前処置結果を示す図である。

第６図は、その後実販的に誘導されたライスル性肝炎マウスの生存率に対する可溶性リン酸化グルカンを用いる前の処置結果を示す図である。

第７図は、実験的に誘導されたカンジダ・アルビカンス感染マウスの生存率に対する可溶性リン酸化グルカンの前の経口投与結果を示す図である。

第８図は、インターロイキン■産物に対する可溶性リン酸化グルカンの効果を示す図である。

第９図は、可溶性リン酸化グルカン活性化マクロファージ培養から得られた腫瘍細胞細胞毒性／細胞増殖抑制因子が分子ｆｉｌｔ３８，５００および８４．０００ダルトンの二つの主要なフラクションから成ることを示す図である。

水性可溶性リン酸化グルカンは、前記のいずれの他のグルカン類と異なる唯一のクラスを生ずる方法によって調製される。

本発明の好適な実ｔ′Ｍ態様に従って可溶性リン酸化グルカンは次のように調製される；サツ力ロミケスセレビシエから誘導された中性ポリグルコースである微粒子グルカンは、一定に撹拌しながらジメチルスルホキザイド（Ｄ　Ｍ、Ｓ　Ｏ）のような非プロトン性（ａｐｒｏｔｉｃ）溶媒中の強カオトロピック剤溶液中で懸濁させられる。強カオトロピック剤は、ポリグルコース鎖に沿って水素結合を弛め、そして分子を保持しない。水素結合の再形成防止のため約４〜１２Ｍの範囲の尿素のようなかなり高濃度の強カオトロピック剤を使用することが好ましい。その混合物を、その後、約５０〜１５０’Ｃで加熱し、保持し、一定に撹拌しながらリン酸を徐々に加えた。可溶性リン酸化グルカン生産物から成る沈降物は約１時間後明らかとなる。バイオ活性生産物の収量増加のため約１００’Ｃで約３〜１２時間反応混合物を保持すことが好ましい。実際に、約１　’ＯＯ’Ｃで約６時間の反応後、収量は約７０〜９０％でおる。可溶性生産物のリン酸化度は反応時間で若干変化する（例えば、３時間で１．４８％、６時間で２．２３％）。

バイオ活性可溶性リン酸化グルカン生産物は、次のように反応混合物から単離される：その混合物はリン酸化反応停止のために冷却され、沈降物を再懸濁するために十分量な蒸留水で希釈される。生じた溶液は、どのような残留沈降物除去のため粗、中間、微細な焼結ロートを通して濾過される。その溶液は、その後、約１０，０００ダルトン分子１（ＭＷ）より小さい成分の全てを除去するためにモレキュラーシーブにかけられた。このように、ＤＭＳＯ，［ｉ素、グルコースおよび未反応リン酸はその溶液から除去される。モレキュラーシービングは、これらのの低くすなわち、約１０，０００ダルトンより小さい）ＭＷ酸成分除去するいかなる方法によっても達成される。おる例証においてその溶液は、約５日間流れる蒸留水に対しスペクトル図。

−（５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ）メンプラン透析配管および透析を用いて篩われる。

他の例証においてその溶液は、１０，０００ダルトンＭＷメンブランフィルタ− および大容量透析４液を有するミリポアー（Ｈｉｌｌｉｐｏｒｅ）ダイアライザー／コンセントレータを使用して篩われる。モレキュラーシーブにかけた後、生じた溶液は綿毛のような粉末組成物形態の最終可溶性リン酸化グルカンを調製するために濃縮・凍結乾燥される。結晶構造は観察されない。

本発明従う可溶性リン酸化グルカンの調製方法において使用した微粒子グルカンは、既知の方法によりサツ力ロミケスセレビシエ細胞壁から単離されるであろう［例えば、ジ　ルジオ等、　、　１９７９．インターナショナル　ジーナル　オブ　キャンサ−２４：　７７３〜７７９頁；引例として含まれたハッシド等、、１９４１　、ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　、　］。簡単に、実際は微粒子グルカンは、次のように調製される：乾燥イーストは、水酸化す１〜リウム水溶液中で消化され、約１００℃で約４時間加熱され、そして−夜保持される。上７Ｍ液はデカントされ、その工程は３回繰り返される。

残留物はＨＣΩを使用して酸性化され、加熱され、１００’Ｃで約４時間保持され、そして１夜冷却される。上澄液はデカントされ、酸消化は２回繰り返される。その残留物は、その後、蒸留水で繰り返し洗浄され、エタノールで少なくとも２４時間抽出される。赤褐色上澄液はその後アスピレートされ、捨てられる。エタノール抽出は、上澄液が本質的に無色となるまで繰り返される。エタノールは、蒸留水で残留物を繰り返し洗浄することにより除去される。微粒子グルカンは遠心分離または濾過により集められる。

「分子弛緩薬」として作用することが知られている尿素以外の多くの化合物も、ＤＭＳＯが微粒子グルカンの三重らせん立体配置を弛めるために使用された後、水素結合の再形成防止のため除去される。これらの化合物は、（１）エチレンジアミン四酢酸、（２）ヒドラジンスルフェート、（３）モノエタノールアミン、く４）グアナジン、（５）グアニンおよび（６）チオ尿素を含む。加えて界面活性剤、トウィーン２　Ｑ　（丁ｗｅｅｎ−２０）のような乳化剤およびアルコレツク（Ａｌｃｏｌｅｃ）およびセントロレックスｆ　［（Ｃｅｎｔｒｏｌｅｘｆ（レシチン）］のようなリン脂質乳化剤も、微粒子グルカンを溶解し、リン酸化する試みに使用された。可溶性免疫バイオロジー的活性剤は決して得られなかった。

本発明の他の実１ｇ様に従えば、可溶性リン酸化グルカンは多くの他の微生物源から誘導された中性ポリグルコースまたはポリグルコースタンパク質生成物から調製し得る。。

かかる源の非徹底的なリストを第１表に示す。

（以下余白）珂１−でｉ−ｉ袈可溶性リン酸化グルカン調製用に使用され得るグルカン源の例タラビセブス・バーブレア　（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ　ｐｕｒｐｕｒｅａ）コルリネラス・シイタケ　（Ｑｏｒｌ　１ｎｅｌ　ｌｕｓ　ｓｈｉ　１ｔａｋｅ）レンチナス・ニド−デス　（Ｌ　ｅｎｔ　ｉ　ｎｕｓ　ｅｄｏｄｅｓ）スフレロチイウム・グルカニラム　（ＳＣｌｅｒＯｔｉＵｍ　ｇｌｕｃａｎｉｕｍ）スクレロティウムーｏルシフイ（３Ｃ１ｅｒＯｔｉｕｍ　ｒｏｌｓｆｉ）シゾロフィラム・コムネ　（ｓｈｉｚｏｐｈｙｌ　ｌｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ）ストレプトコッカス・サリバリウス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ａｌｖａｒｉｕｓ）ステレウム・サンギルシンタム　（３ｔｅｒｅｕｍ　ｓａｎｇｕ’＋ｎｏｌｅｎｔｕｍ）ウィンギア・ロベルトシ　（Ｗｉｎｇｅａ　ｒｏｂｅｒｔｓｉ　ｉ）５．２．可溶性リン酸化グルカンの特性本発明に従って、調製されたサツ力ロミケスセレビシエから得られた可溶性リン酸化グルカンの溶解性は、水中で約５０ｍｙ／ｒｄよりも大である。可溶性リン酸化グルカン水溶液は非粘性であり、甘い味ではない。

５．２．１．基本的な組成ガルプレース　ラボラトリーズ［テネシー州ノックスビル（Ｋｎｏｘｖｉ　Ｉ　Ｉｅ、　ＴＮ）］で測定された可溶性グルカン製剤の基本的な組成は、第２表に示される。第２表に示されるデータはＣ４０Ｈ８□Ｐ０３□と記載されるこの製剤の平均的な経験式を許容する。このように可溶性リン酸化グルカンにおいて各々の６．６グルコース残基に対し平均的な１つのホスフェート基がある。

（以下余白）週１」とｊ艮可溶性リン酸化グルカンの基本的組成８元素または成分　モ　ル　％Ｃ３４，６６水和水　１１．７８５、２．２．構造配置多くの方法は、可溶性リン酸化グルカンの分子量（ＭＷ）および構造配置の各種特色を決定するために使用された。

５．２．２．１．モレキュラーシービングｔ７１０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ−２００［ファーマシア　ファイン　ケミカルズ、ビス力タウエイ、ニューシャーシー州（Ｐｈａｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）］を使用するカラムクロマトグラフィーは、８０％の可溶性グルカンが１０，０００〜１００，０００ダルトン範囲の分子量、２０％のものが約１００，０００〜約５００，０００ダントン範囲の分子量であることを示した。

５．２．２−２．核磁気共鳴スベク１〜ロスジくニブルツカ−（Ｂｒｕｃｋｅｒ）Ｗ　Ｐ　−２００スペクトロメータ［プルツカ−インストルメンツ、ビレリカ、マサチューセッツ州（Ｂｒｕｃｋｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂ１１１ｅｒｉｃａ　ＨＡ）　］を使用するＣ−１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトロスコピーは、本発明に従って調製されたサツ力ロミケスセレビシエからの可溶性リン酸化グルカンの種々の構造特性を測定するために実施された。

ＮＭＲ研究用サンプルは、水中で１０％酸化デユーチリウム（Ｄ２０）を使用して調製された。サンプルは、最初対照物質なしで測定され、その後少アリ］−トの１，４−ジオキサン添加後に行なわれた。サンプルの全ては１０ｍ直径試験管に投入された。

可溶性リン酸化グルカンの１３０−ＮＭＲスペクトル研究は、Ｃ−６炭素位置に分岐を有しないβ−１−３グルカン３Ｓ造を示した（第１図参照）。ＮＭＲスペクトルは、微粒子グルカン類の三重らせん鎖の実質的な不存在を示ず。リン酸化度は、実質的に分析データに従う３，６％と評価された。

本発明に従って調製されたサツ力ロミケスセ１ノビシエからの可溶性リン酸化グルカンのスペク１〜ルに対して、分岐β−１−３と’１−６０グルカンであるレンチナン製剤（味の素（株）東京、日本国）は、４０ｍｇ／ｄ＜第２Ａ図）または３ｍｙ／ｍｐ、＜第２Ｂ図）の各々でＮＭＲスペクトルの減衰を示した。このことは、この分子、特に４０ｍ！ｊ／ｄ！の濃度においてゲル状態によると考えられる。非ゲル３ｍ９１／ｍ！！濃度の１０％Ｄ２０溶液においてシグナルは得られなかった。　第１図と第２図の比較は、レンチナンと可溶性リン酸化グルカンとの間の完全な構造および立体配座上の違いを示す。β−１−６結合にＪ５けるレンチナンの不規則立体配座しサイトウ等、　、　１９７７、カーボハイドレー１〜　リザーチ、　５８：２９３〜３０５　（Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９７７、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、５８：　２９３〜３０５）　］と対照して本発明に従う可溶性グルカンの規則立体配座は明らかとされる。

可溶性リン酸化グルカンが注入可能なバイオロジー的反応モデュレータとして微粒子グルカンより多くの利益をもたらすために、可溶性グルカン特有の毒性、発熱性および免疫抗原性は微粒子グルカン特性と比較し特定の比較例とともに記録される。

５、３．１．非毒性急性毒性は、各種服用量で可溶性リン酸化グルカンは正常動物への単一静脈注射後に評価された。処置動物は注射後３０時間観察された。

ある一連の実験において４９ＩＣＲ／Ｈ２Ｄマウスは３グループ（各々１５匹）と２グループ（各々２匹）に分けられた。１〜３グループは、それぞれ４０，２００および”１０１００Ｏ／Ｋｇの可溶性リン酸化グルカンを、第４および第５グループにはそれぞれ１，６００および２、Ｏ○Ｏｍｇ／に’ｊを含むＯ，！Ｍ塩化ナトナトリウムａｌｉｎｅ）溶液を受けた。いずれのグループにおいても死亡は観察されなかった。

ざらに、いずれの生理学または行動上の変調がないことは明らかであった。著しく異なり微粒子グルカンで同様に処置したマウスの場合、２５０ｍ’ｊ／　Ｋｇにおいて２０％死亡率が、そして５００ｍｇ／Ｋｆｆにおいて１００％死亡率が観察された。

他の一連の実験にａ５いて２グループ（各々５匹のスプラキュードーレイラット（Ｓｐｒａｑｕｅ　Ｄａｖｌｅｙ　ｒａｔｓ）は、静脈注射を通じてそれぞれ２５０および５００ｍ９／Ｋｇの可溶性リン酸化グルカンで処置された。死亡率および生理学または行動上の機能の変調のないことはいずれのグループにおいても明らかであった。これに対してそれぞれ７５および１５０ｍｙ／に！１７の微粒子グルカン静脈注射の後３０％および１００％死亡率が観察された。

可溶性リン酸化グルカンを０．４０，２００および１゜０００ｍｙ／Ｋｙ服用量含む塩化ナトリウム溶液を週２回静脈注射した後慢性毒性は評価された。体重、雌管重量、全体および顕微鏡的病理学、血清電解質、溶質、肝臓および肝機能の指示的血清酵素が監視された。

ある一連の実験においてマウスは、可溶性リン酸化グルカン処置後０，８，１１，１５，２２および３０日にそれぞれ計量された。顕著な差がないことは、投与された可溶性リン酸化グルカンのいかなる服用量のものの体重計量においても観察された。慢性処置３０日後動物は犠牲とされた。肝臓、肺および腎臓の重量の顕著な差は見られなかつｍｇ／　Ｋ’ｊ可溶性グルカン（０，０１＜ｌ）＜０．００１＞処置マウスにおいては注目され、２００ｍｇ／Ｎ９処置マウスにおいては注目されなかった。

他の一連の実験においてマウスは、可溶性リン酸化グルカン処置後（週２回）それぞれ０．１５，３０．４９および６０日に計量された。顕著な差がないことは、投与された可溶性リン酸化グルカンのいかなる服用量のものの体重計量においても観察された。可溶性リン酸化グルカンで慢性処置６０日後、動物は犠牲にされた。肝臓、肺および腎臓の重量の顕著な差は見られなかった。牌臓重醋の統計上の顕著な増加は、１０００ｍ３／Ｋｇの可溶性リン酸化グルカン（ｐ＜０．００１＞ｆｆｉ置マウマウスいて明らかであった。

慢性処置３０日または６０日後、顕著な変調がないことは次の血清組成において明らかであったニゲルコース、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、尿酸、コレステロール、１〜リグリセリド類、全タンパク質、アルブミン、グロブリン、クレアチニン、カルシウム、リン、ナトリウム、カリウム、塩素、重炭酸塩およびアニオンギャップ。その上顕著な変調のないことは次の酵素において明らかであった：アルカリ性フォスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、セラム　グルタミック　オキザル酢酸（ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ）　トランスアミナーゼ、セラム　グルタミック　ビルごツク　トランスアミナーゼおよびクレアチニン　ホスホキナーゼ。いかなる変化もセラム　ビリルビンにおいて検出されなかった。

３０日の慢性処置後マウスから得られた組織に関する組織研究は、１回の注射当り４０および２００ｍ’ｊ／に’ｊの可溶性リン酸化グルカンを受けたマウスにおいて実質的に正常な肝臓を示した。１０００ｍｙ／Ｋｇの可溶性リン酸化グルカンを受けた動物において単球浸潤が肝臓で急速に明らかとなった。マウスの肺および腎臓組織は実質的に正常であった。

６０日慢性処置後マウスから得られた組織に関する組織研究は、４０および２００〜／にり服用の注射を受けた動物において肝肉芽腫はほとんど示さなかった。

ざらに多くの単球浸潤は’ｌｏｏｏｍｙ／Ｎｙ注躬を受けたマウスで観察された。死体解剖動物の全てにおいて肺組織は実質的に正常であった。

慢性毒性は、２５０１ｇ／Ｎｇの可溶性リン酸化グルカンを含む塩化ナトリウム溶液の腹膜腔内注射５／ｄ！を７日間受けた（ＦＤＡ要求テスト）モルモット［バーラン　スプラキュー　ダーレイ、ヒユーストン　テキサス州（Ｈａｒｌａｎ　５ｐｒａｑＵｅ　Ｄａｗｌｅｙ、Ｈｏｕｓｔｏｎ　、ＴＸ）］を使ッテ更に評価された。第３表に現わされた結果は、同量の０．９％塩化ナトリウム溶液を受けた比較例に対し可溶性グルカン処置を受けたモルモットの成長障害があった事実を示す。７日間慢性処置後、処置動物の体重は、しかしながら、初期重量に比較し９％も増加した。

（以下余白）慢性毒性は、可溶性リン酸化グルカン＜５ｍｇ／に９＞を週２回静脈注射を受けた２匹の成人メス大について１２０日間評価された。その犬は、プリナ　チョＩＪ７（Ｐｕｒｉｎａ　Ｃｈｏｗ）および水をアト　リビタムに与えられ週２回カン入り市販ドッグフード［アルボ（Ａｌｐｏ）　］が補足された。体重および血清溶質、電解質および酵素が０．１７，２４，３８゜８０および１２０日間監視された。１２０日慢性処置後、２．８Ｋｇまたは約２２％の体重の平均重量増加が観察された。

顕著な差がないことは、次の血清溶質にいあて観察されされた：カルシウム、リン、ナトリウム、カリウム、塩素、重炭酸塩およびアニオンギャップ。顕著な差がないことは次の血清酵素にいあて観察された：アルカリ性ホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、セラム８グルタミック　オキザル酢酸（ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ）　トランスアミナーゼ、セラムグルタミツク　ピルビック　トランスアミナーゼおよびクレアチニン　ホスホキナーゼ。

更に顕著な差がないことは、可溶性リン酸化グルカンを５０ｍ９／ｒｄを週３回、３ケ月間投与治療後患者の血清バイオケミストリーにおいて観察された。

５、３．２．非発熱性可溶性リン酸化グルカンの発熱性は、７．５ｍ’Ｊ／に’Ｊａよび３０ｍ３／に３の服用間で圧気の大に静脈内への単−注射後評価された。体温は、注射後１４日間測られた。

第４表に現わされた結果は、この慢性動物モデルにおいて発熱反応を示さない。

急１／し５匁犬における急性または慢性発熱反応の不存在処置服用量　平均体温（”Ｃ）（ｌｎ’Ｊ　／　Ｋ’Ｊ　）　時間（時間）７．５　３８．３３７，４３８．３３８．３３８．３３Ｂ、７１３０．０　３Ｂ、６３７．０３８．０３８．５３８．４３８．６発熱性は、可溶性リン酸化グルカンの１．５，１０，１５．２５および５０ｙｔ／Ｋｓの服用量の多注射を受けた、ネンブタール（Ｎａｍｂｕｔａｌ、　３０ｍｙ／Ｋｇ＞麻酔剤を受りた３匹の大を使って３時間以上評価された ′。体温は、巨丸注人後１５分において測定された。発熱効果のないことはいずれの服用量においても観察された。

可溶性リン酸化グルカンの発熱性は、ラビットにおいても評価されたａ７匹のラビットは２グループ（２匹と５匹）に分けられた。グループ１は等容性塩化ナトリウム溶液、グループ２は５　ｍ５　／　Ｋ’Ｊの可溶性リン酸化グルカンを含む塩化ナトリウム溶液を静脈性用により受（プた。コア体温は、単一の巨丸注人後１００分間、１５分間間隔で監視された。

比較例ラビットは、０．２℃の温和な体温減少を示した。

可溶性リン酸化グルカン処置ラビツ１〜は、０．４４°Ｃの平均増加を示した。

このようにラビツ１〜において若干の発熱性が見られた。

５、３．３、非免疫抗原性ＩｇＧ抗体検出用に設計された界面リングテストは、犬への慢性的に投与された際に１２０日間の可溶性リン酸化グルカン免疫抗原性を評価するため使用された。

血清サンプルは、５　ｍ！Ｉ　／　Ｋ９の無菌、発熱物質のない可溶性リン酸化グルカン静脈処置を週２回の割合で１２０日間慢性処置した後の成人メス大から得られた。界面リング沈降素テストは次のように行なわれた：０．１ｄの未希釈抗血清は、ピペットで試験管に入れられた。抗原またはリン酸化可溶性グルカンは１　：２．１　：４．１　：８．１　：１６および１：３２の希釈でもって平界面を形成するように抗血清上に層を形成させられた。界面の白沈降素リング形成は、グルカンに対する抗体特異性の存在を示す。沈降素リングのないことは、いずれの抗原希釈液においても検出され１こ。

５．４．可溶性リン酸化グルカンの使用法５．４．１．ｐ染疾病の　５および治療免疫反応および細網内皮系刺激における可溶性リン酸化グルカンの有効活性のために、各種の微小有機体により誘導された疾病に対する予防および治療的適用に特に有効である。可溶性リン酸化グルカンが体液および分泌成分と同様にマクロファージの数、機能活性および相互作用、ＴおよびＢリンパ球、白血球および自然キラー細胞を調節する体の非常に基本的なホスト防衛システムに影響を与えるために、広範な配列の感染疾病の非特異的修飾に可能性を有する。

可溶性リン酸化グルカンは、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、マイコバクテリウム・チューバーコロシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ディプロコツカス・ニューモニエ（これらに限定されない）を含むダラム陽性菌；エシェリキア・コリ、バクテリウム−エンテリチス（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、フランジセラ・フランジセラ（これらに限定されない）を含むグラム陰性菌；マイコバクテリウム・レブレ（これに限定されない）を含む抗酸性菌；肝炎（これに限定されない）を含むライスル類；単純性庖疹■およびＴ１等；カンジダ・アルビカンス（これに限定されない〉を含む菌類ニスボロトリウム・ジエンキイ；およびレイシマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｄｏｎｏｖａｎｉ）、シストツマ・マン’）二（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ　）　（これに限定されない）を含む原生動物奇生体；等により誘導される疾病予防および治療のため単独か既知の抗微生物剤と組合せて使用し得る。

加えて可溶性リン酸化グルカンは、先天的または後天的免疫不全か化学治療処置の副作用の結果免疫抑制された動物およびヒト中の条件的感染の予防および処置に使用されるだろう。

可溶性リン酸化グルカンは、次の利益に限定されないが次の利益を含む感染！２！ｌ置に特に利益をもたらす多くの特徴を示す：（１）可溶性リン酸化グルカンは、広範な活性を有１゛る。

細菌、菌類、ウィルス類および奇生体有機体により誘導された感染に対して有効で必る；（２）可溶性リン酸化グルカンは、アミノグリコシド抗生物質（これに限定されない）等を含む感染Ｊ置に通常使用されるバイオ活性剤と組合−で付加的又は相乗的効果を有する；（３）可溶性リン酸化グルカンは、その効果がホスト（宿主）により仲介されるため、原因となる有機体において抵抗の発生を誘導しない：（４）可溶性リン酸化グルカンは、極めて低毒性を示す；（５）可溶性リン酸化グルカンは、白血球減少症の成長を防止し、修正する：（６）可溶性リン酸化グルカンは、ホストの細胞上および体液免疫反応の数多くの多様な概念を高揚する：そして（７）可溶性リン酸化グルカンは、ホストにおいて免疫抑制成長を防止しまたは逆にする。

５、４．２．新生細胞の治療マクロファージ食作用および分泌活性の刺激および可溶性リン酸化グルカンに起因するマクロファージ類増殖の高揚のため、この組成物は、腺癌、細網細胞肉腫（これに限定されない）等を含む悪性新生疾病処置のため、単独か外科または化学療法柔のような他の物理療法と組合せて有利に使用し得る。

加えて可溶性リン酸化グルカンがリンパ性白血病（これに限定されない）を含む腫瘍細胞増殖に対して直接抑制効果を及ぼすため、この組成物は腫瘍成長および転移を抑制するために有効に使用し得る。

結局、可溶性リン酸化グルカンは、マクロファージ細胞において可溶性細胞毒性／細胞増殖抑制因子（以後、マクロファージ細胞毒性因子ｒＭｃＴＪと称する。

）の生産および分泌を刺激することが示される（第７図参照）。ＭＣＴは、腺癌（これに限゛定されない）等を含む癌性細胞に毒性であるマクロファージ細胞の上澄培養地から単離された未知構造の可溶性タンパクフラクションである。このように、可溶性リン酸化グルカンは、インビボでＭＣＴ生産を刺激するめために有利に使用し得る。更に、可溶性リン酸化グルカンは、インビトロでマクロファージ細胞によりＭＣＴ生産を刺激するために使用し得る。

５．５．投与経路本発明の可溶性リン酸化グルカン類は、経口的；静脈、腹膜腔内、皮下、筋肉内（これらに限定されない）等の注射：鼻および鼻咽頭内部への局所適用：およびエアロゾール経由吸入および呼吸路内層への適用（これら限定されない）等の多くの経路により予防および治療用に投与し得る。

動物またはヒトに投与される際、可溶性リン酸化グルカンは水、水性溶液、いかなる生理学的に許容可能な製剤上担体またはベヒクルと組合せられる。

次の一連の実施例は、本発明の範囲について説明する目的であり、何ら限定するものではない。

６、可溶性リン酸化グルカンの調製法ジ　ルジオ等［１９７９，インターナショナル　ジャーナルオブ　キャンサー２４ニア７３〜７７９　夏Ｉｎｔ’ｌ　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２４ニア７３−７７９）　：の方法に従ってサツ力ロミケスセレビシエから微粒子グルカンは調製された。簡単に、６Ωフラスコを使用し、５４００ｍの乾燥イースト［ユニバーサルフーヅ　コーポレーション９．ミルウォーキー、ワイダボ州（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｆｏｏｄｓ　Ｃｏｒｐ、、　）ｌｉｌｗａｕｋｅｅ、　ＷＩ月を３９の３％水水酸化ナトトリウム水溶液中懸濁させた。その懸濁液は、沸騰しているウォーターバス中に４時間置かれ、−夜冷却されそして上澄液はデカントされた。この工程は３回繰り返された。残留物は、その後８００ｄの濃塩酸に２９の３％塩酸を加えたもので酸性化し、沸騰しているウォータバス中に４時間置かれた。その懸濁液は、−夜装置され、上澄液はデカントされた。残留物は、さらに、３Ωの３％塩酸を用いて１００℃で４時間消化され、−夜冷却され、デカントされた。

３％塩酸消化は２回繰り返された。残留物はその後蒸留水（２０℃）で３回、そして蒸溜水（１００’Ｃ）で２回洗浄された。１Ωのエチルアルコールは、残留物に加えられ、十分に混合され、最大抽出のため最少２４時間放置された。暗赤褐色アルコール上澄液は残留物からアスピレートされ、棄てられた。そのアルコール抽出工程は、アルコール上澄液が実質的に無色となるまで繰り返された。

そのアルコールは、熱水で残留物を４回洗浄することにより除去された：微粒子グルカン製剤は、その後、遠心分離により集められ、冷凍され、そして凍結乾燥された。

可溶性リン酸化グルカンは、本発明に従い、次のように微粒子グルカンの可溶化およびリン酸化により調製された：１８ａｍの尿素（８Ｍ）を５０ｄのジメチルスルホキサイ溶解した。Ｉｏｎの微粒子グルカンを加え微細懸濁液を形成させた。フラスコを１００’Ｃに加熱し、１０ｄのリン酸（８５％）を徐々に滴下した。その混合物を沸騰しているウォーターバスに入れて１００℃で３〜１２時間保持した。

約６時間反応させることが好ましい。

加熱工程において約１時間後沈降物が目視できるようになり、その後それが増加した。約６時間後、その混合物を冷却し、２００ｄの蒸留水で希釈し、沈降物を再懸濁させた。その混合物を粗、中間、微細な焼結ロートで口過し、沈降物を除去した。

生じた溶液を、その後、グルコース、ＤＭＳＯおよび尿素を含む低分子量（ＭＷ）フラクションを除去するために分子的篩にかけた。

ある一連の実験においてモレキュラーシービングは、スペクトラポアーメンプラン　ダイアリシス　チュービング［フィッシャー　サイエンティフィック　コーポレーション：ピッツバーグ、ペンシルバニア州（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）　］を使用し、流れる蒸留水に対し５日間透析することにより達成された。このチュービングの穴（ポア）のＭＷ範囲は、約１２，０００ダルトンである。

他の一連の実験においてモレキュラーシービングは、１０゜０００ＭＷモレキュモレキュラーターを有するミリポアダイアライザー／コンセントレータ−［ミリポア　コーポレーション、ベッドフォード　マサチューセッツ州（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＨＡ）］を用いて行なわれた。約７０１）の透析溶液を、低ＭＷ化合物用に使用した。他のケースにおいて最終製剤のグルコースの確認テストは否定的であった。その上、高速ガス−液クロマトグラフイーを使用したがＤＭＳＯは最終製剤中に検出できなかった。

モレキュラーシービング後、可溶性リン酸化グルカンを含む溶液を濃縮し、凍結乾燥した。このリン酸化グルカンは、凍結乾燥状態で少なくとも２年間、がっ、 −２０’Ｃで保持された溶液で少なくとも１５ケ月間安定である。

７、可溶性リン酸化グルカンの免疫バイオロジー的特性下記に報告される実験のすべてにおいて、動物はプリナラボラトリーカラ（Ｐｕｒｉｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｈｏｗ）で１２時間明／暗サイクルで空調付きの部屋でアドリビタムで扶養ざ高揚の修飾化学療法、先天的か後天的免疫不全（例えば、後天性免疫不全症候群またはエイズ（ＡＩＤＳ）’］のいずれかのために免疫抑制を受ける動物は、多様な条件的有機体感染に感受性がある。例えば、ＡＩＤＳ患者の死亡の主要な原因は、ペヌモシスティス・カリニイ（Ｐｅｎｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）によって起こされる肺炎である［例えば、シャツフィー等、　、　１９８３．ジャーナル　オブ　インフエクシャス　ディシース、１４８：３３９〜３４５；コツトリーブ等、、１９８１．ニューエンジニアリング　ジャーナル　オブ　メディシン３０５　；　１４２５〜１４３１頁参照のこと（Ｓｅｅ　ｅ、ｇ、、Ｊａｆｆｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３．　Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１４８；　３３９−３４５；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ｔＮｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｈｅｄ、　３０５：１４２５− １４３１月。

ウオルツヤー等［１９８３，ジャーナル　オブ　レティキュロエンドテリアル　ソサイヤティ　３３；１〜９頁：　１９７９；インフエクシャス　イミュノロジ −２４：　９３９〜９４７頁（１９８３、Ｊ、Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌ、Ｓｏｃ、３３：１−９；１９７９；　Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２４：９３９〜９４７）］による以前の研究は、コルチコステロイドの慢性投与により免疫抑制された際、マウスの０３１−４／　Ｈｅ　Ｊ菌株が他の菌株に対するよりペヌモシスティス・サリニイ（Ｐ、Ｃａｒｉｎｉｉ　）に誘導された肺炎により感受性であることを示した。ヒト類似動物においてペヌ玉システィス肺炎成長は、免疫抑制増加のため潜在的感染活性化を示す。

次の実験は、慢性的免疫抑制化Ｃ３１−１／　）−１ｅ　Ｊマウスに対する可溶性リン酸化グルカン投与が生存率を高め、かつ、動物に対する条件感染感受性を減少することを示ず。

７．１．１．１土Ω贋加ある一連の実験において１００匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス［ジャクソン　ラボラトリーズ、バーハーバ−、メイン州（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、）ｆＥ月を各々２５匹の４グループに分けた。グループ１は０．５ｄの５％グルコース溶液を静脈内に、グループ２は５ｍ５ｌの可溶性リン酸化グルカンを静脈内に、グループ３は１．５ｍ！Ｊのコルチゾン　アセテート［アブジョン、カラマズー、ミシガン州（Ｕｐｊｏｈｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、　）ＩＮ月を皮下に、グループ４は５ｍ！ｌの可溶性リン酸化グルカンを静脈内および１．５ｍ！ｉのコルチゾン　アセテートを皮下の両者を受けた。

マウスの全ては、週２回、５週間にわたり処置され、生存率は６０日間監視された。コルチゾン　アセテート処置動物は、投与ステロイド服用量がウォルツァー（Ｗａｌｚｅｒ、上記）により示された要求値よりも多かったために著しく免疫抑制されたことに注目すべてきである。

その結果は第３図に示される。第３図に示されるように、グルコース単独（グループ１）か可溶性リン酸化グルカン単独（グループ２）処置されたマウスの死亡はなかった。

２４日までにコルチコステロイド単独処置マウスの生存率は１２％であった（グループ３）。組織病理学的研究において死亡原因は、脳を含む細菌と菌類感染であることが示された。これに対し、２４日までにコルチコステロイドおよび可溶性リン酸化グルカン処置マウスの生存率は、約６８％であった（グループ４）。

かかるマウスの長期生存率は、コルチコステロイド処置マウスと比較すると高く、統計上重要である６６％であったｌｐ＜０．００１＞。

次の実施例は、可溶性リン酸化グルカンが正常および慢性的免疫抑制マウスのエシェリキア・コリ感染抵抗を高めたことを示す。

６０匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪｖウスは、４グループ（各々１５匹）に分けられた。グループ１は５％グルコース（０゜５ｄ）を静脈内へ３回注射、グループ２は４ｍ３／動物の可溶性リン酸化グルカンを静脈内へ３回注射、グループ３は１．５ｍｇ／動物のコルチゾン　アセテートを皮下へ３回注射、そしてグループ４は４ｍ３／動物の可溶性リン酸化グルカンを静脈内と１．５ｍ９／動物のコルチゾン　アセテートを皮下とを組合せて３回注射を、３目間隔で受けた。最終性！）！後３日間マウスは、２．５Ｘ１０７エシエリキア・コリ細菌を腹膜腔内に受けた。

生存率は、エシェリキア・コリ感染後１５日間監視された。

第４図に示された結果は、エシェリキア・コリ感染の正常なグルコース処置マウスにおいて６５％生存率を示す（グループ１）。エシェリキア・コリ感染７日後、このグループにおいて死亡はなかった。これと反対に、可溶性リン酸化グルカン処置正常マウスにおいて０％死亡率が観察された（グループ２）。このように、可溶性リン酸化グルカン予備処置は、正常動物にｄ３いてエシェリキア・］り感染抵抗を顕箸に高めた。

第４図に現された結果は、コルチコステロイド投与による慢性的に免疫抑制されたマウスの著しい死亡率をも示す。

グルコース処置された免疫抑制マウスにおいて（グループ３）、４０時間にお【プる５０％死亡率および５日における７５％死亡率は注目すべきであった。これと正反対に、可溶性リン酸化グルカン処置された免疫抑制マウスは（グループ４）、０％死亡率であった。このように比較例およびコルチソン処置マウスの両者において可溶性グルカンは、正常およびコルチソン抑制マウスの両者でグラム陰性感染に対する完全な保護を生ずるホスト抵抗を高めることができた。

これらの研究においては、コルチソン免疫抑制服用量を受けたマウスへの可溶性グルカン投与が感染に対するコルチソン誘導感受性を修飾することが示される。

それ故、グルカンは、自然感染からの死亡率を減少させるコルチソン慢性投与の免疫抑制効果ばかりでなくコルチソンの相対的急性免疫抑制効果を修飾し得る。

次の実験は、スタフィロコッカス・アラスレウスと関連した敗血症の致死効果の修飾における可溶性リン酸化グルカンインビボ投与の有効性を示す。

２０匹のＩＣＲ／ＴＥＸマウスは、二つのグループに分けられ、次のように処置された。敗血症誘導前３，２および１日において、グループ１は可溶性リン酸化グルカン（２００＃Ｉｇ／Ｋｇ）を静脈内注射、比較例と称するグループ２は同容量等張グルコースの静脈内注射を受けた。ポリサッカライドの第３投与後の１日、両グループは１．０Ｘ１０９細胞スタフイロコツカス・アウレウスの静脈注射を受けた。実験および比較例のマウス生存率は、１３０日間観察された。

結果を第５図に示す。そこに示されるように、スタフィロコッカス・アウレウス感染後２日においてグルコース処置マウスで６０％死亡率が観察された（グループ２）。同時に、しかしながら、感染前に可溶性リン酸化グルカン処置動物において０％死亡率が観察された。感染後８日で比較例グループの２７％が生存した。これに対し、可溶性リン酸化グルカン処置動物の生存率は、同時期に１００％であった。いずれのグループにおいてもの１３０日間、死亡は更に生じなかった。このように、可溶性リン酸化グルカン予備処置は、その後のスタフィロコッカス・アウレウス感染致死を著しく減少させた。

次の実験は、その後の実験的に誘導されたエシェリキア・コリ敗血症に対する可溶性リン酸化グルカン腹膜腔内投与の有効性を示す。

７９匹の成人ホワイトマウスは８グループ（各々８〜１３匹）に分けられた。比較例と称するグループ１は１ｄのグルコース（５％）、陽性比較例と称されるグループ２は３ｍｌの微粒子グルカン、グループ３はエシェリキア・コリに対抗前２４時間に１２．５ｍ９の可溶性リン酸化グルカンを受けた。グループ４，５．６および７は、エシェリキア・コリ対抗前それぞれ６．２．１，０時間に１２．５７Ｒｆｆの可溶性リン酸化グルカンを受けた。グループ８は、エシェリキア・コリ対抗後２および４時間に１２．５ｍｇの可溶性リン酸化グルカンを受けた。

処置の全ては、腹膜腔内注射投与であった。エシェリキア・コリ（１，０Ｘ１０８細胞）も、腹膜腔内経路で注射された。それらの結果を第５表に示す。

（以下余白）第５表エシェリキア・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）敗血症による死亡率に関する可溶性リン酸化グルカン投与時間の影響％生存率１　グルコース　−２４４００００２ＰＧ　−２４１００１００８８８８３ＳＰＧ　−２４８０８０７０７０４ＳＰＧ　、　−６１００１００１００８８５３ＰＧ　−２２０，２０２０２０７ＳＰＧ　Ｏ３００００ａグループナンバーは本明細書中で述べられた処置プロトコールを対象とする。

各グループの動物数は８〜１３であった。

ｂＰＧは微粒子グルカンを示す；ＳＰＧは可溶性リン酸化グルカンを示す。

Ｃ動物が処置された時間６４８時間後、いずれのグループにおいても死亡率はさらに観察されなかった。

第５表に示されるように可溶性リン酸化グルカンの腹膜腔内投与は、実験的誘導エシェリキア・コリ腹膜炎マウスの生存率を著しく高めたくグループ３と４）。

観察されたように可溶性リン酸化グルカンは、エシェリキア・コリで対抗する前６時間になってようやく有効に投与し得る。

エシェリキア・コリ投与と同時かその後の可溶性リン酸化グルカン投与は、感染の激痛特性のためにエシェリキア・コリ腹膜炎致死を逆にすることにおいて有効ではなかった（グループ７と８）。

７、２．２．２．服用反応他の一連の実験は、エシェリキア・コリ誘導腹膜炎および死亡率に関し各種服用量の可溶性リン酸化グルカン投与効果を測定するために行なわれた。

１０６匹のホワイトマウスは、それぞれ９〜３０匹のグループに分けられた。比較例と称するグループ１〜２は、等容性グルコースを受けた。グループ２〜７は、可溶性リン酸化グルカンをそれぞれ１，１，２，４，８，１０．２０．１２０，２００および２６０ｍ３７Ｋｇ受けた。注射の全部は、エシェリキア・コリ（ＩＸ１０Ｂ細胞）腹ｔｔａ腔内投与による腹膜炎誘導２４時間前に腹膜腔内投与された。結果は第６表に示される。

第６表エシェリキア・コリ腹膜腔内投与の死亡率に関する可溶性リン酸化グルカン（ＳＰＧ）の服用量の効果８１　グルコース　３０１３２　ＳＰＧ　２２　１　７８３　ＳＰＧ　１２　．２　８３４ＳＰＧ　１２　４’８３５　ＳＰＧ　１２　８　８３６　ＳＰＧ　９　１０　１００７　ＳＰＧ　９　２０　Ｂ９ａエシェリキア・コリ対抗２４時間前に腹膜腔内に与えられたグルコースか可溶性リン酸化グルカンの単一注射生存率は対抗２４時間後に測定された。

第６表に示されるように、”Ｉｍ３／Ｋｇ〜２０ｍ’ｉＪ　／　Ｋｇ範囲の可溶性リン酸化グルカン全服用量は、エシェリキア・コリの腹膜腔内感染により対抗された動物の生存率高揚において有効であった。

以前の研究では、微粒子グルカンがネズミ肝炎つイスル（ＭＨＶ）菌株Ａ５９［ウィリアム反およびジ　ルジコ、１９８０、サイエンス２０８：６７〜６９頁（Ｗｉｌｌａｍｓ　ａｎｄ　Ｄｉ　Ｌｕｚｉｏ、１９８０．５ｃｉｅｎｃｅ　２０８：６７〜６９）　３で対抗されたマウスの生存率を増加させ、肝壊死を抑利し、食作用活性を高揚状態に保持することが示された。

次の実験は、可溶性リン酸化グルカンの前投与が実験的に誘導されたウィルス肝炎を有するマウス生存率を高揚したことを示す。

２０匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｔｅｘ　マウス［ティムコ、ヒユーストン、テキサス州（Ｔｉｍｃｏ、　Ｈｏｕｓｔｏｎ、丁Ｘ）　］を２グループに分けた。比較例と称づ−るグループ１はグルコース（０，５ａ！／マウス）静脈内注射を受け、グループ２は急性ウィルス肝炎誘導の３，２および１日前に可溶性リン酸化グルカン＜５ｍｙ／マウス）静脈内注射を受けた。

肝炎は、ＭＨＶ菌株Ａ５９の１６の補体結合単位（ＣＦＵ）腹膜腔内注射により誘導された。

マウス生存率は、ウィルス投与後３０日間監視された。

結果を第６図に示す。

第６図に示されるように可溶性リン酸化グルカン投与は、急性ウィルス肝炎のマウス生存率を著しく高めた。肝炎誘導６日後、比較例グループにおいて５０％生存率が観察された。これに対ｌノ、その際に可溶性リン酸化グルカン予備処置グループにおいて１００％生存率が観察された。いずれのグループにあいでも死亡はその後観察されなかった投与可溶性リン酸化グルカンの効宋次の実験は、経口投与可溶、性リン酸化グルカンがイースト　カンシタ・アルビカンス誘導敗血症の致死効果の修飾において有効でめることを示ブ。

２５匹のオスＩＣＲ／Ｔｅｘマウスを２グループに分Ｇノだ。グループ１（１３匹）ｌよ、５．０ｍ’ｊ／厩の可溶性リン酸化グルカン含水飲料水を与え７日間扶養された。そのマウスは約１．２〜ＩＩ５巖／日の飲料水を飲み、このような処置動物は約７ｍｙ１日の可溶性リン酸化グルカンを経口で受【プた。比較グループと称するグループ２（１２匹）は、実験期間を通じて水道水で扶養された。

０日に動物の全ては、カンシタ・アルビカンス（３，０Ｘ１０６細胞／マウス）静脈注射を受けた。グループ１は、飲料水中の可溶性リン酸化グルカンを感染後５日間経口で受け、その後、これらの動物は水道水で扶養された。両グループのマウス体重を監視した。グループ１と２の両者のマウスは、同じ割合で体重が増加した。両グループの生存率も同様に監視された。その結果を第７図に示す。

第７図に示されるように、カンシタ・アルビカンス感染前および感染後５日間の可溶性リン酸化グルカン、経口投与は、一時的増加であるが、マウス生存率増加に重要となった。感染２５日および３０日後、可溶性リン酸化グルカン処置グループの生存率は、比較例グループにおけるより極めて大きくなった（ｐ＜０．０５レベルにおいて）　（カイ二乗テストλ＜０．５＜０．０１　＞。比較例グループのメディアン生存期間は１８日であったニ一方、可溶性リン酸化グルカン処置グループのメディアン生存期間は３０日であった。長期生存に関し、しかしながら、最終的結果は大きく変化しなかった。このように、この実験において可溶性リン酸化グルカン高服用が、経口投与される際に必要であろうということが示される。

７．５．マクロファージ食作用活性の高揚法の実験は、可溶性リン酸化グルカン投与がマクロファージ類の食機能を著しく高めたことを示す。

２０匹のオスＩＣＲマウスは、２グループ（各々１０匹）に分けられた。食作用測定の３，２および１日前に、比較Ｏｍ３　／　Ｋ９　）を受けた。注射は、すべて静脈内投与であった。

食機能は、ウールス等（ＷＯＯｌｅＳ　ａｔ　ａｔ）の方法［１９６２゜ラジエーション　リサーチ１６：５４６〜５５４頁（１９６２，Ｒａｄ、　ＲｅＳ、基：５４６−５５４）］に従ってコロイダルカーボン［Ｃ１１／１４３（ａ）、グンサーワグナー、ハノーバー、ジャーマニー（Ｃ１１／１４３（ａ）、　Ｇｕｎｔｈｅｒ　Ｗａｇｎｅｒ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）］の血管内浄化割合を測定することで評価された。コロイダルカーボンは静脈内投与され（６４０ｍｓ／Ｋｇ）　、連続血液サンプルはテール静脈から得られた。アリコートは、４．０ｒｎ１の０゜５％炭酸ナトリウム溶液中で溶血され、コロイダルカーボン濃度はスペクトロホトメトリー的に測定された。半減期（ｔ／２）は、零時間への浄化曲線の外挿により決定されるように光学密度または濃度が零時間の１７２である時間として採用された。結果は第７表に示される。

（以下余白）急Ｗ７！マクロファージ食作用に関する可溶性リン酸化グルカン（ＳＰＧ）の効果８体　重　肝　重量　血管内浄化処　置　’　（ｇｍ）　（ｇｍ）　ｔ／２（分）塩化　２４．８±０．８２１．９４±０．０５　７．６±０．７３ＳＰＧ　２５．２±　１．０３１．８２±　１．０３　３．５±　０．５８’ａＮ−グループ当り１０ｐ＜０．００１第７表に示されるように可溶性リン酸化グルカン投与は、浄化値において５５％増加で反映されるように食作用を著しく高めたく第７表）。以前観察したような肝臓重量増加特に活性化状態においてマクロファージの主要分泌産物はインターロイキンＩと称される仲介分子である。インターロイキンＩは、実験上の動物およびヒトの両者に急性相タンパク質反応を誘導するポリペプチドである。この反応は、赤血球沈降速度の増加、白赤球増多症、急性相タンパク質の高揚、および内因性発熱物質のため熱の発展を含む。

更にインターロイキンＩはＴ細胞活性化および増殖性を著しく刺激する能力を有する。このように、インターロイキンＩは、細胞漸増可能なリンパ球活性因子であり、それ故、ホスト防衛活性を高める。

次の実験は、インターロイキン１分泌により検定されるように可溶性リン酸化グルカン投与がマクロファージ分泌活性を刺激することを示す。

いくらかのラット（１６°）は、可溶性リン酸化グルカン＜２００ｍ３７に９＞静脈注射を受けた。８匹の比較例動物は等容性グルコースを受けた。血漿サンプルを、注射後１゜３．５．８，２４，４．８．７２および１６８時間後に得た。

インターロイキンＩ産物は、Ｃ−５７ＢＬ／６Ｊ胸腺細胞を使用して評価された。胸腺細胞（１Ｘ１０６細胞）培養は、培地単独または比較例若しくは可溶性リン酸化グルカン処置ラットからの０．１ｄ血漿を有する培地でインキュベートされた。細胞培養は２４時間保持され、その時ぐ１μＣｉの３Ｈ−チミジンが加えられ、その後、インキュベーションはざらに２４時間行なわれた。その時、チミジン摂取量が測定された。その結果を第８図に示す。

第８図に示されるように可溶性リン酸化グルカン処置ラットから得られた血清は、グルコース処置ラットから得られた血清と比較し１，２４．４８および７２時間における胸腺細胞によるチミジン摂取量の増加で反映されるようにインターロイキンＩ活性の増加を示した。このように、可溶性リン酸化グルカンは急速にマクロファージ類を活性化し、血漿インターロイキンレベルの高揚により反映されるように分泌活性を増加させる。２４〜７２時間ピーク特性はまだ確立されていない。

７．７．インビトロでマクロファージ類による抗腫瘍細胞毒素産物の高揚次の実験は、可溶性リン酸化グルカン刺激のもとてマクロファージ類によるマクロファージ細胞毒性／細胞増殖抑性因子（ＭＣＴ）産物評価用に導かれた。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（５Ｘ１０６細胞）から得られた牌性マクロファージ類は、７．５％のウシ胎児面清、５０ＩＵ／ｄのペニシリンＧ、５０μ９／ｄのストレプトマイシン、５０μ９／ｄのゲンタマイシンスルフェート、１０ｔｉ’；ｊ／ｍｌのアンホテリシンＢｉ！−３よび２ｍｙ／ｄＮ　ａ　ｌ−Ｉ　ＣＯ３を有するＲＰＭ１１６４０培地でインキュベートされた。

比較例細胞は培地単独でインキュベートされた。実験細胞（Ｆａｌｃｏｎ）　２０１３培養フラスコにおいて５％ＣＯ２、９５％空気のもとて３７℃、２０時間イス持された。インキュベーション後、培養土奢は遠心分離で集められ、細胞の全ては０．２２μフイルターを通すことにより除かれた。

ＭＣＴ検定において腺癌細胞（ＢＷ１０２３２＞は、３Ｈ−デミジンで標識化され、いかなる被結合化放射能をも除去のために３回洗浄された。標識化腫瘍細Ｉｍ＜０．１ｍｆｌ中に２×１０４．？ｌｌＩ胞）は、その後、微小力価ウェルに加えられ、ＭＣＴテス１へ用上澄液は０．１ｄ容積で加えられ、細胞は２４時間インキュベートされた。、インキコベ・−ジョン後、微小力価プレートは遠心分離にかけられ、０．１ｄアルコートは放射能を検定された。腫瘍細胞用菌指数を表わす放出された放射能は、存在するＭＣＴｉとともに直接変わる。加えて、細胞溶解および細胞性塞栓の程度の定性評価は、腫瘍細胞をエタノールで固定し、かつ、ギームザ染色することにより得られた。その結果は第８表に示される。

比較例または休止マクロファージ類、即ち、非可溶性り胞毒性因子（ＭＣ下）を含む（第８表）。

（以下余白）珂（ｆＬｊ５腺癌Ｂ旧０２３２に対する可溶性リン酸化グルカン活性化マクロフ？−ジ上澄液の細胞毒性の高揚％　目−チミジン放出８数値はグループ当り６個の複製に対する平均値上標準誤差”ｌ）＜０．００１上澄フラクションの細胞溶解性効果の高揚がグルカンの直接効果に帰因しないことを示す努力において、３日−デミシン標識化腫瘍細胞は、０．５ｍｇの可溶性リン酸化グルカン存在下２４時間インキュベートされた。その結果を第９表に示す。

第９表インビトロで腺癌Ｂ旧０２３２に対する可溶性リン酸化グルカンの直接細胞毒性効果の不存在％　３Ｈ−チミジン放出８２７．２±　２．８　２２．４±　１．８ａ数値はグループ当り６個の複製に対する平均値上標準誤差を示す。

第９表から観察し得るように、可溶性リン酸化グルカンは、予め標識化した腫瘍細胞からのチミジン放出に関して顕箸な効果を有しなかった。それ故に、腫瘍Ｊ胞によるチミジン放出の高揚は、可溶性リン酸化グルカン培養細胞からの上澄液産物から産出されたマクロファージに帰因すると結論づけられた。

上澄液フラクションの細胞毒性／細胞増殖抑制の確認は、培養の組織評価から得られた。申越した成長は、培地単独で培養した腺癌細胞（ＢΔ１０２３２）から明らかであった。３Ｉ」−チミジン放出に関する前記データと一致して、正常成長は、可溶性リン酸化グルカン含有培地で２４時間培養された腫瘍細胞においても明らかであった。このことは、腫瘍細胞系統に対する可溶性リン酸化グルカンの直接細胞毒性効果の不存在を確認する。これに対して、顕著な細胞傷害および溶菌は、可溶性リン酸化グリカン処置マクロファージ培養上澄液でインキュベートした腫瘍細胞において明らかであった。かかる腫瘍細胞培養において観察された細胞の傷害および溶菌の度合は、正常または比較例マクロファージ類からの上澄液が培養培地に加えられた際に観察されたものよりも大きかった。このように、可溶性リン酸化グルカンは、休止マクロファージ類の腫瘍細胞溶解因子生産の増加を誘導した。

細胞毒性／細胞増殖抑制因子ＭＣＴがタンパク質であることが見い出されたので、分子量のような特性を決定する研究が行なわれた。マクロファージ細胞培養からの５０ｍｙ乾燥上澄物を、１ｄの無菌水に溶解し、セファクリルＳ−３００スーパーフアイン　マトリックス（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００５ｕｐｅｒｆｉｎｅ　ｍａｔｒｉｘ）　［ファーマシア　ファイン　ケミカルズ、ビス力タウエイ　ニューシャーシー州（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａＦｉｎｅ　ＣｈｅｍｉＣａｌＳ、ＰｉＳＣａｔａＷａｙ、ＮＪ月をパックした１、５０ｍＸ９０ｃｍガラス　カラム（ＬＫＢ　インストルメンツ）に加えた。カラムを、溶離剤としてリン酸緩衝溶液を用いて流速０．２ｒｄ１分で操作した。フラクションを１ｄ間隔で集め、細胞増殖抑制活性をテストした。その結果を第９図に示す。

第９図に示されるように可溶性リン酸化グルカン活性化マクロファージ培養上澄液のカラムクロマトグラフィーは、腺癌細胞に対して細胞毒性活性の２ピークを生じた。そのピー゛りは、３８，５００および８４，０００ダルトンの分子量を示す溶積において溶離する。

７．８．転移肝臓疾病の修飾次の実験は、可溶性リン酸化グルカン単独か抗癌剤、例えばシクロホスファミド、との組合せ投与がマウスにおける粗細細胞肉腫の初期腫瘍および転移の成長を減することを示す。

１２０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス［ジャクソン　ラボラドリース、バーハーバ −、メイン州（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、ＨＥ）］を４グループ（各々３０匹）に分けた。マウスの全ては、１．０Ｘ’１０４細網細胞肉腫細胞Ｍ５０７６皮下注射を受けた。注射後２０日に５匹のマウスをランダムに選び、初期腫瘍成長測定および転移障害確認のため犠牲にした。平均初期腫瘍重量は、１．８６ｇｍまたは体重の６．４％であり、検査動物の全ては器官特異肝臓微少転移があった。初期腫瘍重量の割合変化は、参照として２０日にあける腫瘍重量を用いて計算した。

腫瘍移植後２０日およびその後５０日までの３日目毎に、比較例と称するグループ１はグルコース（０，５ｄ＞を静脈内に受け、グループ２は可溶性リン酸化グルカン（２０Ｏｍ！ｊ　／　Ｋ’ｊ体重）を静脈内に受け、グループ３はシクロホスファミド［シトキサン　ミード　ジョンソン、エバンスビレ、インジアナ州（Ｃｙｔｏｘａｎ、　Ｈｅａｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｅｖａｎｓｖｉ　ｌ　Ｉｅ、　ＩＮ）］　（４５ｍｌ／に３体重）を受け、グループ４は可溶性リン酸化グルカン（２００ｍｚ／Ｎ９体重）を静脈内とシクロホスファミド（４５ｍｇ／Ｋｇ体重）を腹膜腔内に組合せて受けた。

初期腫瘍成長に関する各種処置効果を第１０表に示す。

生存率への効果を第１１表に示す。

（以下余白）週１ニし０．８可溶性リン酸化グルカン−シクロホスファミド−化学免疫療法：初期腫瘍に対する相乗効果処置グループ　腫瘍重量１　１２．６　１５．５２　８．３　１１．８ａＣ５７ＢＬ／６’Ｊマウスのグループの全ては、０日に１゜０父１０４細網内皮細胞皮下注射を受けた。２０日に初期腫瘍の平均重量は１．８６ｙまたは体重の６．４％であった。２０日およびその後３日目ごとにマウスは適当な薬剤処置を受けた。詳細は本明細書参考のこと。

第１０表に示すように細細肉肝細胞注入後３０日に、可溶性リン酸化グルカンおよびシクロホスファミドは、比較例マウス体重の１２．６％（グループ１）に比べて初期腫瘍成長減少、即ち８．３％および８．５％とほぼ同等の効果を示した。可溶性リン酸化グルカンとシクロホスファミドとの組合せ処置マウスにおいて（グループ４）比較例の１２．６％に対しくグループ１）初期腫瘍サイズのさらに大ぎな減少、即ち４．４％を生じた。

３６日においてもさらに顕著な効果があった（第１０表）。比較例グループにおいて平均腫瘍重量が１６日（２０日〜３６日）で１４２％増加した（グループ１）が、可溶性リン酸化グルカン処置グループにおける腫瘍重量（グループ２）は８４％、シクロホスファミドのものくグループ３）は３６％であった。我々の研究において最初の間、初期腫瘍の急性退行は、化学療法および可溶性リン酸化グルカン免疫療法を組合せた影響のもとで示された。治療法を組合せると初期腫瘍成長を示す一６４％成長が観察された。

第１１表に示すように生存率の顕著な高揚（ｐ＜０．０１）は、比較例（グループ］）に比べ可溶性リン酸化グルカン（グループ２）がシクロホスファミド（グループ３）単独処置マウスにおいて観察された。さらに、生存時間の広範な統計上重要な（ｐ＜０．００１＞高揚は、可溶性リン酸化グルカンとシクロホスファミドを組合せて処置した動物くグループ４）におい−Ｃ観察された。

これらの研究は、化学〜および可溶性リン酸化グルカン−免疫療法の組合せの有効性を示す。初期腫瘍成長の退１１ばかゆでなく、粗織病理学上の観察に反映されるような転移疾病減少も注目された。比較例グループにおいて顕著な肝移転は、可溶性リン酸化グルカンーシクロボスノ１ミド処置グループにおいて実質的に存在しなかった。更に生存率の顕著な高揚（第１１表）は、処置グループにおいて生じた初期死亡的の期間増加と同様に観察された。

（以下余白）第１１表可溶性リン酸化グルカン−シクロホスファミド化学免疫療法：定着ｍ網細胞癌Ｍ５０７６を有するマウスの生存に対する効果１１１１１１叩−一―−ψ−１−１１１−一一−−−−１７、□ｏ１．１２１． −−圃閤一一−処置グループ　初期　メディアン　期間（臼）４　５２　６４” 　１０２ａ工程は、第１０表に示されたデータを得るために使用したものと同一であった。処置の全ては５０日で終了した。

ｂ可溶性リン酸化グルカンおよびシクロボスフッミドグループにおける死亡率は、治療終了の際に最終的に播種した残留牌臓腫瘍細胞によると考えられた。

ｐ＜０．０１ｐく０．００１７．９．シクロホスファミド誘導白血球減少症を防止する可溶性リン酸化グルカンの効能抗新生剤（ａｎｔｉｎｅｏＤＩａｓｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）のほぼ全ての投与で会合形成された有害効果に、骨髄抑制誘導、白血球減少症および感染疾病に対する感受性の増加がある［一般に、クラスタースキー等、イン　インフエクション　イン　キャンサー　ペイシャンッ、ラベン　プレス、ニューヨーク。

１９８２、　１〜１２頁　くに１ａｓｔｅｒｓｋｙ、ｅｄ、、ｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、１９８２．ｐｐ、１−１２）参照のこと］。

第７．８節で詳細に記載したように可溶性リン酸化グルカンをシクロホスファミド処置と組合せると、初期腫瘍に対する相乗効果の誘導が可能である。癌患者にお（ブるシクロホスファミド使用で会合形成された不利益の１つは、白血球減少症の発生である。６５０ラドのコバルト放射１時間前か１時間後に投与された時に、マウスにおける造血回復を高めるために種々の微粒子および可溶性ポリグルカン類の効能の開示に鑑みて［パッチエン、　１９８３．ザーバイバイ　イムノロジカル　リサーチ２　：　２３７〜２４２；パッチエン等　１９８４．ジャーナル　オブ　バイオロジカル　レスポンス　モディフンフイヤーズ、３　：　６２７−’　７３３　（Ｐａｔｅｈｅｎ、　１９８３，５ｕｒｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｓ、　２：　２３７−２４２；Ｐａｔｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、１９８４、　Ｊ、　Ｂｉ、ｏｌ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、　３；６２７−７３３）参照のことコシクロホスフＩミドの治療および免疫抑υｊ服最を受けた動物において、可溶性リン酸化グルカンが周辺のリンパ球レベルを保持する効能を有するかどうか決定する研究が行なわれた。

４０匹のマウスが４グループに分けられた。比較例マウスであるグループ１は静脈内に等張グルコースを受けた。

グループ２は可溶性リン酸化グルカン（マウス当り５　Ｉｎｇ）を、グループ３はシクロホスファミド（シトサン（Ｃｙｔｏｘａｎ））を腹膜腔内に、（マウス当り０．６ｍｆｆ）およびグループ４はシクロホスファミドに可溶性リン酸化グルカン組合せ治療を受けた。注射の全ては、動物当り合計４回の注射１４日に行なわれた。この研究結果を第１２表に示す。

（以下余白）第１２表可溶性リン酸化グルカンによるシクロホスファミド誘導白血球減少症防止白血球全数処　（１０００／ｍ！ｎ３血液）比較例　１３．８±１．６ＳＰＧ　１０．０±１．８シクロホスフアミド　６．０±０．８″ＳＰＧ＋　１２．２±１．６″６シクロホスフアミドａ可溶性リン酸化グルカン（ＳＰＧ　）　（５ｍｓ／マウス）は３日目ごとに静脈内投与された。シクロホスファミド（０゜６ｍｓ／マウス）は３日目ごとに腹膜腔内に投与された。

全白血球計数は実験の１４日に行なわれた。

’　Ｄ＜０．０１−シクロホスファミド処置と比較された比較例 ’ｐ＜０．０１−シクロホスファミド単独と比較されたＳＰＧ＋シクロホスファミド表に示されるようにシクロホスファミド投与は、周辺白血球の総数にいあて特性的に４７％凋つ・を生じさせた（ｐ＜０．０１＞。シクロホスファミドと組合せた可溶性グルカン投与は、シクロホスファミドグループに対し白血球総数を１０３％増加させた（ｐ＜０．０１＞。

この研究は、可溶性リン酸化グルカンとシクロホスファミドの同時投与がシクロホスファミド投与後の白血球減少症の特有発生防止をし得たことを示す。上記のとことは、上記第７，８節に示したように腫瘍退行に相乗効果を及ぼしながら毒性化学療法剤の存在下で感染疾病に対する抵抗を保有すべきである。

７．１０．インビトロリンパ性白血病細胞増殖に対する細胞増殖抑制効果この研究は、インビトロで可溶性リン酸化グルカンのマウスリンパ性白血病細胞の増殖速度抑制効能を示す。

培養で保持されたＬ−１２１０リンパ性白血病細胞を、２Ｘ１０５細胞／ウ工ル濃度で微小力価ウェル上に置いた。

可溶性リン酸化グルカン（５００μ９／ウエル）または微粒子グルカン（１００ μ９／ウエル）を加え、細胞を２４時間インキュベートした。同容積の培養培地［７，５％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０）を比較例培養に加えた。

３日−チミジン（０，５μＣｉ／ウエル）を培養の全てに加え、インキュベーションを更に２４時間続けた。、細胞増殖は、３日−チミジンの結合を測定することにより評価された。結果を第１３表に示す。

週１でし≦１８　− マウスリンパ性白血病細胞のインビトロ増殖に対する可溶性リン酸化グルカン（ＳＰＧ　）および微粒子グルカン（ＰＧ）の比較結果処　置　３日−チミジン　％腫瘍細胞比較例　３５４７±３１０　’　Ｏ・Ｓ　Ｐ　Ｇ　４０７±　３８　、８８．５±９．３Ｐ　Ｇ　２２６９±２９３　３６．０±４．６ａＬ−１２１０細胞＜２Ｘ１０５／ウエル）は、可溶性リン酸化グルカン（０，５＃Ｉ、９／ウエル）または微粒子グルカン（０，１ｍｆｆ／ウェル）の存在下で２４時間インキュベートされた。３Ｈ−チミジン（０，５μ Ｃｉ／ウエル）を腫瘍細胞増殖測定用に加えた。Ｎ＝２４ウェル／グループ第１３表に示されるように微粒子グルカンは腫瘍細胞増殖を約３６％抑制した。

これに対し、可溶性リン酸化グルカンは、腫瘍細胞増殖を約８８．５％抑制した。このように、可溶性リン酸化グルカンが腫瘍成長および転移を抑制する機構の一つは、いままでのところでは確定しＣない方法であるが、その効能により直接的に腫瘍細胞を抑制するからの可溶性リン酸化グルカンの調製および効熊次の実験は、担子菌網（ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）、　］リオラスベルシカラーから得られた可溶性リン酸化グルカンが有効な免疫バイオロジー活性を有づ−ることを示す。

日本国東京のサンキョウ　コーポレーションから得られた「クレスチン」またはｒＰｓＫＪと称する市販のポリザラカライドタンパク質製剤を、コリオラスペルシカラーからの可溶性リン酸化グルカン調製用原料物質として使用した。この製剤は、β−１，４，β−１，３，β−１，６，−グルカン−タンパク質複合体を含む相対的に粗ＨＩＪ剤である。ポリグルコースの主要化学構造は、β−１，３およびβ−１，６グルコシド結合によりリンクされたグルコース単位の付加分枝または側鎖を有する１−４グルコシド結合によりリンクされたグルコース単位が主鎖である。タンパク質含量は１５〜３８％である［ニーダ等、　、　１９８３．インターナショナル　ジャーナル　オブ　イムタフアーマコロジ−５１３４〜４２頁；ヤマムラおよびアズマ、１９８２．アトパンシス　インイムノファーマ］ロジー　２　：　５０１〜５０７　（Ｅｈｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ。

、　１９８３．　Ｉｎｔｅｒｎａｔ’ｌ　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏｐＨａｒｍ、　５：　３４−４２；Ｙａｍａｍｕｒａ　ａｎｄ　Ａｚｕｍａ、１９８２．Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、２：５０１−５０　ｔ）］　。

市販のＰＳＫ製剤が相対的に粗製製剤で“あり、相対的に高タンパク質を有するために、この物質の静脈内投与は不可能である。経口投与しなければないない。

８．１．調　製。

コリオラスペルシカラーからのＰＳＫボリポリツカライド−タンパク質複合体は、第５節に記載された本発明により可溶性リン酸化グルカン［今後、「可溶性リン酸化−ＰＳＫ］と称する）として調製された。単離可溶性リン酸化−ＰＳＫを凍結乾燥した。

８．２．エシェリキア・コリ誘導腹膜炎に対する効果法の実験は、その後誘合されたエシェリキア・コリ腹膜炎に対する可溶性リン酸化−ＰＳＫの腹膜腔投与結果を示す。

４８匹の成長ボワイ１へマウスを３グループ（各々１６匹）に分けた。比較例と称するグループ゛１は０．５戒の等張塩化ナトリウム（Ｓａｌｉｎｅ）溶液を静脈内に、グループ２は５ｍｇの市販のＰＳＫ　（日本国東京のザ′ンキョウ　コーポレーション）を静脈内に、グループ３は５ｍｇの可溶性リン酸化−ＰＳＫを静脈内に受けた。グルカンの全てを、エシェリキア・コリ対抗前２４時に投与した。エシェリキア・コリ（’１Ｘ１０８細菌）を腹膜腔内経由で注射した。その結果を第１４表に示す。

第１４表エシェリキア・コリ敗血症による死亡率に対するコリオラスペルシカラーからの可溶性リン酸化グルカン投与効果生存率感染後の期間（時間）１　塩化ナトリウムｂ　６　６　６２　ＰＳＫ’　６３　２５　１９３　可溶性リン酸化　１００　１００　１００ＰＳＫｂｂ塩化ナトリウムか可溶性リン酸化−ＰＳＫ（５ｍｙ／マウス）の単一注射をエシェリキア・コリ対抗前２４時間に腹膜腔内で与えた。

Ｃ市販のＰＳＫ　（サンキョウ　コーポレーション、日本国東京）をエシェリキア・コリ対抗前２４時間に静脈内投与＜５ｍ３／動物）した。

第１４表に示されるように市販のＰＳＫおよび可溶性リン酸化−ＰＳＫグルカン類の両者は、感染後２４時におるエシェリキア・コリ敗血症に対する顕著な保護活性を示したく即ち、グループ１の塩化ナトリウム比較動物にａ５ける６％に比ベロ３％および１００％生存であった）。ＰＳＫ製剤に対し、しかしながら、本発明に従って調製された可溶性リン酸化グルカン−ＰＳＫは、長期基準の感染に対し極めて高い有効性を示した。感染後７２時において可溶性リン酸化−ＰＳＫ処置グループにおＣブる死亡は観察されなかった（グループ３）。同時にＰＳＫ処置グループにおいて死亡率は８１％であった（グループ２）。

ＦＩＧ、３１喪ＦＩＧ、５国際調光報告ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１６４６ＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＬ　ＣＬＡＳＳＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　Ｓ［ＪＢＪＥＣＴ　ＭＡＴＴＥＲ：ＩＮＴ、　ＣＬ４＋　Ｃ０８Ｂ　３７１００；　Ｃｌ２Ｐ　１９１０４［Ｊ、Ｓ、　Ｃｔ、＋　５３６／１．１；　５３６／１７．１；　５３６／１１７ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１６４６ＡＩ−ｔａｃｈｍｅｎＦ−Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒヒ　ＶＬＰＣＴ／ＵＳ８６１０１６４６Ａｔｔａｃｈｍｅｎヒ　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒヒ　Ｖｌ、ｌＴｅ１ｅｐｈｏｎｅ　Ａｐｐｒｏｖａｌ＋５５６０＋００　ｐａｙｍｅｎｔ　ａｐｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　Ｍｒ、Ｌａ５ｌｉａ　Ｍｉｓｒｏｃｋ　ｏｎ３００ｃｔｏｂｅｒ　１９８６　ｆｏｒ　Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉ、工Ｉ、ＨＸ、ＩＶ　ａｎｄ　Ｖ：　Ｃｈａｒｇｅ　ｔ。

ＤｅｐｏｓｉセＡｃｃｏｕｎ辷Ｎｏ、１６−１１５０゜Ｒｅａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｏｌｄｉｒ＋ｇ　１ａｃｋ　ｏｆ　ｕｎｉｔｙ　ｏｆ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｇｒ＋Ｊｕｐ　工ｔ　ｉｓ　ｄｚｒｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃａｎ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆｐｒｅｐａｒａヒｉｏｎ、ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　！：ｈｅ　ｃｏｍ−ｐｏｕｎｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎセｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄｈｕｍａｎｓ、　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａ　ｍａａｓｒｉａｌｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｕｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｔ　ｃｒｏｕｐ　ＩＩ、ｆｏｒ　ヒｒｅａｔｉｎｇ　ｍａｌｉｇｎａｎヒ　ｎｅｏｐｌａｓセＬＣｄｘｓｅａｓｅｓ；Ｇｒｏｕｐｓ　ＩＩＬ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｅｕｋｏｐｅｎｉ耐Ｇｒｏｕｐ　ＩＶ、　ｆｏｒＳヒｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ｖ、　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ａｎｉ−Ｔｈｅ　５ｅａｒｃｈ　ｂｕｒｄｅｎ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｉｎｖｅｎヒｉｏｎ　ｉｓ　ｕｎｄｕｅ、　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　１ｎｓｏｆａｒ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｄｄｉ辷１ｏｎａｌｐａｒｅｎヒ　５ｅａｒｃｈ　１ｎｄｉｃａセａｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｅ　ｃ↓ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ。

ｂｕｔ　ａｌｓｏ　１ｎｓｏｆａｒ　ａｓ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　１ｉｔｅｒａｔｕｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ　ｃｏｖｅｒｉｎｇ　セｈｅ　ｅｎヒｉｒｅ　ｃｌａｓｓｅｓ　ｎｏｔｅｄ　ａｂｏｖｅ。

Ｔｉｍｅ　Ｌ４ｍｉｔ　ｆｏｒ　Ｆｉｌｉｎ　ａ　Ｐｒｏｔｅｓｔ

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）水または水性溶液への溶解能力；（ｂ）非毒性、非免疫抗原性および実質的非発熱性および（ｃ）動物またはヒトにインビボ投与された際に顕著な免疫バイオロジー反応を及ぼす能力を特徴とするリン酸化ポリー［β−（１−３）グルコピラノース］鎖から成る可溶性グルカン。
２．核磁気共鳴スペクトロスコピーで測定された時に実質的に完全な三重らせん鎖がないことをさらに特徴とする請求の範囲第１項に記載の可溶性グルカン。
３．リン酸化度が約１．４％〜約３．４％の範囲であることをさらに特徴とする請求の範囲第１項に記載の可溶性グルカン。
４．分子量が約１０，０００〜約１００，０００ダルトンの範囲であることをさらに特徴とする請求の範囲第１項に記載の可溶性グルカン。
５．分子量が約１００，０００〜約５００，０００ダルトンの範囲であることをさらに特徴とする請求の範囲第１項に記載の可溶性グルカン。
６．可溶性グルカンが微生物源から得られる請求の範囲第１項に記載の可溶性グルカン。
７．微生物源がサッカロミケス・セレビシェ（Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る請求の範囲第６項に記載の可溶性グルカン。
８．微生物源がコリオラスベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から成る請求の範囲第６項に記載の可溶性グルカン。
９．（ａ）水または水性溶液への溶解能力；（ｂ）非毒性、非免疫抗原性および実質的非発熱性および（ｃ）水溶液で動物またはヒトにインビボ投与された際に顕著な免疫バイオロジー反応を及ぼす能力を特徴とするリン酸化ポリー［β−（１−３）グルコピラノース］鎖から成る組成物。
１０．ポリー［β−（１−３）グルコピラノース］鎖は核磁気共鳴スペクトロスコピーで測定された時に実質的に完全な三重らせん鎖を有しないことをさらに特徴とする請求の範囲第９項に記載の組成物。
１１．ポリー［β−（１−３）グルコピラノース］鎖のリン酸化度が約１．４％〜約３．４％の範囲であることをさらに特徴とする請求の範囲第９項に記載の組成物。
１２．ポリー［β−（１−３）グルコピラノース］鎖の分子量が約１０，ＯＯＯ〜約１００，０００ダルトンの範囲であることをさらに特徴とする請求の範囲第９項に記載の組成物。
１３．ポリー［β−（１−３）グルコピラノース］鎖の分子量が約１００，０００〜約５００，０００ダルトンの範囲であることをさらに特徴とする請求の範囲第９項に記載の組成物。
１４．組成物が微生物源から得られる請求の範囲第９項に記載の組成物。
１５．微生物源がサッカロミケス・セレビシェ（Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る請求の範囲第１４項に記載の組成物。
１６．微生物源がコリオラスベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から成る請求の範囲第１４項に記載の組成物。
１７．請求の範囲第１項に記載の治療上または予防上の有効量の可溶性グルカンおよび生理学的に許容可能な担体から成ることを特徴とする動物またはヒトにおける感染の予防または処置用製剤組成物。
１８．感染に対して有効なバイオ活性剤をさらに含有する請求の範囲第１７項に記載の組成物。
１９．請求の範囲第１項に記載の治療上有効量の可溶性グルカンおよび生理学的に許容可能な担体から成ることを特徴とする動物またはヒトにおける悪性新生疾病処置用製剤組成物。
２０．抗癌剤をさらに含有する請求の範囲第１９項に記載の組成物。
２１．抗癌剤がシクロホスフアミドからなる請求の範囲第２０項に記載の組成物。
２２．（ａ）微粒子グルカンまたはグルカンタンパク質複合体を強力オトロピック剤を含む高極性溶媒に溶解し、（ｂ）合成された溶解グルカンをリン酸と反応させて可溶性リン酸化グルカンを形成させ、そして（ｃ）その反応混合物から合成された可溶性リン酸化グルカンを回収することを特徴とする動物またはヒトにインビボ投与された際に顕著な免疫バイオロジー反応を及ぼす非毒性、非免疫抗原性、実質的に非発熱性の可溶性リン酸化グルカンの調製方法。
２３．高極性溶媒がジチメルスルフォキサイドから成る請求の範囲第２２項に記載の方法。
２４．強力オトロピック剤が尿素から成る請求の範囲第２２項に記載の方法。
２５．（ａ）微粒子グルカンまたはグルカンタンパク質複合体を強力オトロピック剤を含有する高極性溶媒に懸濁させて混合物を形成させ、（ｂ）その混合物を約５０〜１５０℃に加熱し、（ｃ）リン酸をその混合物に加え、（ｄ）その混合物を５０〜１５０℃で約１〜１２時間反応させる連続段階からなる方法により微粒子グルカンまたはグルカンタンパク質複合体を溶解させる請求の範囲第２２項に記載の方法。
２６．その混合物を約１００℃に加熱させる請求の範囲第２５項に記載の方法。
２７．その混合物がジメチルスルフォキサイド中に約４〜１２Ｍの尿素を含む請求の範囲第２５項に記載の方法。
２８．合成された可溶性リン酸化グルカンのリン酸化度が実質的に完全なようにグルカンはリン酸と十分な期間反応させられる請求の範囲第２２項に記載の方法。
２９．（ａ）可溶性リン酸化グルカンを沈降させ、（ｂ）十分量の水を加えて沈降可溶性リン酸化グルカンを懸濁させ、そして、（ｃ）約１０，０００ダルトン分子量以下の全成分を除去させることにより可溶性リン酸化グルカンを回収する請求の範囲第２２項に記載の方法。
３０．微粒子グルカンがサッカロミケス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得られる請求の範囲第２２項に記載の方法。
３１．グルカンタンパク質複合体がコリオラスベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られる請求の範囲第２２項に記載の方法。
３２．（ａ）アリコートの菌類細胞を水酸化物水溶液に懸濁させて混合物を形成し、（ｂ）その混合物を約５０〜１５０℃に加熱し、（ｃ）生じた残留物から上澄を除去し、（ｄ）残留物を水酸化物水溶液に懸濁させ、（ｅ）ステップ（ｂ）および（ｃ）を２または３回繰返し、（ｆ）塩酸をステップ（ｅ）の残留物に加えて酸性混合物を形成させ、（ｇ）酸性混合物を加熱し、（ｈ）上澄を除去し、（ｉ）ステップ（ｆ）と（ｇ）を２回繰り返し、（ｊ）残留物を水洗し、（ｋ）残留物を上澄が実質的に無色となるまでエタノールで繰返し洗浄し、そして（ｅ）形成された非可溶性ポリグルコースを単離するステップから成る方法により微粒子グルカンを得る請求の範囲第２２項に記載の方法。
３３．請求の範囲第１項に記載の治療上有効量の可溶性リン酸化グルカンを動物またはヒトに投与することを特徴とする動物またはヒトにおける感染処置方法。
３４．感染が細菌によって起こされる請求の範囲第３３項に記載の方法。
３５．細菌がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコバクテリウム・チューバーコロシス（Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ヘモフイルス・インフルエンゼ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ディプロコッカス・ニューモニエ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ）、バクテリウム・エンテリチス（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、フランシセラ・シラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）およびマイコバクテリスム・レプレ（Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）から成る群から選ばれる請求の範囲第３４項に記載の方法。
３６．感染がウイルスにより起こされる請求の範囲第３３項に記載の方法。
３７．ウイルスが単純性痘疹または肝炎である請求の範囲第３６項に記載の方法。
３８．感染が菌類により起こされる請求の範囲第３３項に記載の方法。
３９．菌類がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　Ａｌｂｉｃａｎｓ）またはスポロトリウム・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｕｍ　ｓｅｃｈｅｎｋｉｉ）から成る請求の範囲第３８項に記載の方法。
４０．感染が寄生体により起こされる請求の範囲第３３項に記載の方法。
４１．寄生体がレイシマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｄｏｎｏｖａｎｉ）またはシストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ）である請求の範囲第４０項に記載の方法。
４２．請求の範囲第１項に記載の治療上有効量の可溶性リン酸化グルカンを動物またはヒトに投与することを特徴とする動物またはヒトにおける感染防止方法。
４３．感染が細菌によって起こされる請求の範囲第４２項に記載の方法。
４４．細菌がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコバクテリウム・チューバーコロシス（Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ディプロコッカス・ニューモニエ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ）、バクテリウム・エンテリチス（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、フランシセラ・シラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）およびマイコバクテリスム・レプレ（Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）から成る群から選ばれる請求の範囲第４３項に記載の方法。
４５．感染がウイルスにより起こされる請求の範囲第４２項に記載の方法。
４６．ウイルスが単純性痘疹または肝炎である請求の範囲第４５項に記載の方法。
４７．感染が菌類により起こされる請求の範囲第４２項に記載の方法。
４８．菌類がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　Ａｌｂｉｃａｎｓ）またはスポロトリウム・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｕｍ　ｓｅｃｈｅｎｋｉｉ）から成る請求の範囲第４７項に記載の方法。
４９．感染が寄生体により起こされる請求の範囲第４２項に記載の方法。
５０．寄生体がレイシマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｄｏｎｏｖａｎｉ）またはシストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ）である請求の範囲第４９項に記載の方法。
５１．グルカンが静脈内、腹膜腔内、皮下、経口、局所的に鼻内層投与または吸収投与される請求の範囲第３３項または４２項に記載の方法。
５２．請求の範囲第１項に記載の可溶性リン酸化グルカンと感染に対し有効なバイオ活性剤を組合せてなる治療上有効量の組成物を動物またはヒトに投与することを特徴とする動物またはヒトにおける感染処置方法。
５３．組成物が静脈内、腹膜腔内、皮下、経口、局所的に鼻内層投与または吸収投与される請求の範囲第５２項に記載の方法。
５４．請求の範囲第１項に記載の予防上または治療上の有効量の可溶性グルカンを免疫抑制動物またはヒトに投与することを特徴とする免疫抑制される動物またはヒトにおける条件的感染の防止または処置方法。
５５．請求の範囲第１項に記載の治療上有効量の可溶性リン酸化グルカンを動物またはヒトに投与することを特徴とする動物およびヒトにおける悪性新生疾病処置方法。
５６．可溶性リン酸化グルカンが静脈内、腹膜腔内、皮下、経口、局所的に鼻内層投与または吸収投与される請求の範囲第５４項または５５項に記載の方法。
５７．請求の範囲第１項に記載の可溶性リン酸化グルカンの治療上の有効量を抗癌剤と組合せて動物またはヒトに投与することを特徴とする動物およびヒトにおける悪性新生疾病の処置方法。
５８．抗癌剤がシクロホスフアミドから成る請求の範囲第５７項に記載の方法。
５９．請求の範囲第１項に記載の治療上の有効量のリン酸化グルカンを抗癌剤と組合せて動物またはヒトに投与することを特徴とする動物およびヒトにおける抗癌剤投与により誘導された白血球減少症の防止方法。
６０．抗癌剤がシクロホスフアミドから成る請求の範囲第５９項に記載の方法。
６１．請求の範囲第９，１７または１８項に記載の組成物を動物またはヒトに投与することを特徴とする動物またはヒトにおける感染の治療上または予防処置方法。
６２．請求の範囲第９，１９，２０または２１項に記載の治療上有効量の組成物を動物またはヒトに投与することを特徴とする動物またはヒトにおける悪性新生疾病処置方法。
６３．請求の範囲第１項に記載の可溶性リン酸化グルカンを動物またはヒトに投与することを特徴とするマクロファージ細胞をインビボで刺激して可溶性細胞毒性／細胞増殖抑制因子を生産および分泌させる方法。
６４．請求の範囲第１項に記載の可溶性リン酸化グルカンを含有する培養培地においてインビトロで動物またはヒトマクロファージ細胞を培養し、培養細胞から得られた上澄を分離し、上澄から可溶性細胞毒性／細胞増殖抑制因子を単離することを特徴とする可溶性細胞毒性／細胞増殖抑制因子のインビトロ生産方法。
６５．請求の範囲第６３項または６４項の記載に従って生産された可溶性細胞毒性／細胞増殖抑制因子。