JPH05503952A - 可溶性グルカン類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性グルカン類の製造方法 背景 グルカン類は一般にグルコースの重合体として記載されており、酵母、細菌類、 真菌類および植物類から誘導される。

β（１−３）一連結グルコピラノース骨格を有するグルカン類は、生物学的活性 を持っていることが長年にわたって知られており、具体的に述べれば、これらの 化合物は免疫系を活性化することが判明している。

しかしながら、中性のβ（１−３）グルカン重合体は、生理的媒体に容易には溶 解しないため、非経口医薬として適用するには制限がある（ディルジオ（ＤｉＬ ｕｚｉｏ）の米国特許第４゜７３９、０４６号およびウィリアムス（ＷｉＬＬｉ ａ＋＋＋ｓ）らの米国特許第４゜７６１、４０２号参照）。β（１−３）グルカ ン類が本質的に不溶性である主な理由は、水和作用に抵抗する、しっかりと結合 した三重らせんフィブリル（ｆｉｂｒｉｌｓ）を形成する傾向があるからである 。この理由のため、可溶性β（１−３）グルカン類を開発する試みは、例えばリ ン酸基（米国特許第４．７３９．０４６号：同第４．７６１．４０２号）アミン 基（米国特許第４．７０７．４７１号）またはその他の官能基（例えば硫酸基） のような電荷を有する基で化学的に置換することに依存しているが、この方法で はグルカン分子の天然の立体配置を変化させてその生物学的特性と薬物動力学的 性能に影響を与えることになる。

発明の要約 本発明は可溶性グルカン（ＰＧＧとも呼称する）の製剤の製造方法に関する。本 発明の方法では、不溶性グルカン類が、独特の一連の酸処理とアルカリ処理で加 工されて可溶性グルカンが製造される。得られた可溶性グルカン類は、次にアル カリ性ｐＨ下、臨界濃度以下で精製され、ヒトおよび動物に対して、非経口投与 （例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内投与）、局所投与、経口投与または鼻腔 内投与を行うのに適切な可溶性グルカン製剤が得られる。本発明の方法に従って 製造される可溶性グルカンは、中和してｐＨ７とし、薬学的に許容される担体内 で平衡化させることによって、透明な溶液として保持することができる。本発明 の方法によって製造されるグルカンは、個体に投与した場合、安全で強力な免疫 系エンハンサ−である。本発明の可溶性グルカン重合体の安全で有効な製剤は、 ヒトおよび動物の治療法および／または予防治療法に用いてヒトおよび動物の免 疫応答を強化する図１は、ニス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ ４由来の可溶性改質グルカン（ｓｏｌｕｂｌｅ、　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｇｌｕｃ ａｎ）による、単球のザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）摂取に対する阻害作用の投 与量依存性を、酵母抽出（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ；　ＹＥ）グルカンと比 較して示すグラフである。

図２は、ＰＧＧをマウスに単回静脈投与（５■／マウス）した後の、マウスの末 梢血白血球（ＷＢＣ）の総数と各成分の数を示すグラフである。

図３は、ＰＧＧを皮下に多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）投与（５ｍｇ／ｖウス／日× ４日間）した後の末梢血白血球（ＷＢＣ）の総数と各成分の数を示すグラフであ る。

図４は、マウスのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）による敗血症モデルに対するＰＧ Ｇグルカン類の効力を示すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明の可溶性グルカン製剤は不溶性グルカン粒子から製造される。また可溶性 グルカンは、本願ではＰＧＧ　（ポリ−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシル −（１−３）−β−Ｄ−グルコビラノース）と呼称する。酵母生物由来の不溶性 グルカン類（マンナーズ（Ｍａｎｎｅｒｓ）ら、Ｂｉｏｌ、　Ｊ、、１３５．１ ９−３０、　（１９７３））参照）を用いることが好ましい。本発明において、 出発物質として特に有用なグルカン粒子は全グルカン粒子てあり、これはジャマ ス（Ｊａｍａｓ）らの米国特許第４．８１０．６４６号、ジャマス（Ｊａｍａｓ ）らが１９８９年１月１７日に出願した同時係属中の米国特許出願第０７／２９ ７．９８２号と同０７／２９７．７５２号、およびジャマス（Ｊａｍａｓ）らか １９８９年４月５日に出願した同時係属中の米国特許出願第０７／３３３．６３ ０号に記載されている。前記のすべての文書の教示事項は本願に援用するものと する。

全グルカン粒子の起源としては、広範囲にわたる、細胞壁にβ−グルカン類を含 有するグルカン含有真菌生物か知られている。ジャマス（Ｊａｍａｓ）らの同時 係属中の米国特許出願第０７／３３３．６３０号中に記載されている、サツカロ ミセス・セレビシＩＲＪ株（ｔｈｅ　５ｔｒａｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｒ４）　（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５９０３）から得られ る全グルカン粒子が特に有用である。本願において以後“改質グルカン類（ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ　ｇｌｕｃａｎｓ）”と呼称される、ニス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｒ４由来の、その構造が改質されたグルカン類は、ニス・ ニス・ジャマス（Ｓ、　Ｓ、　Ｊａｍａｓ）、ディー・ディー・イーソン・ジュ ニア（Ｄ、　Ｄ、　Ｅａｓｓｏｎ、　Ｊｒ、）およびジー・オストロフ（Ｇ、　 ０ｓｔｒｏｆｆ）が１９８９年９月８日に出願した同時係属中の米国特許出願第 ０７／４０４．７６５号（代理人参照番号ＡＢＹ８９−０１）に記載されている ように、強力な免疫系活性化物質であり、この出願の教示事項は本願に援用する ものとする。

本発明で利用される全グルカン粒子は、米国特許第４．８１０゜６４６および同 時係属中の米国特許出願第ｏ７／２９７．９８２号、同第０７／２９７．７５２ 号および同第０７／３３３．６３０号にジャマス（Ｊａｍａｓ）らが記載してい るような乾燥粉末の形感であってもよい。本発明の目的を達成するためには、ジ ャマス（Ｊａｍａｓ）らの記載により最終的に行われる、有機溶媒による抽出と 洗浄の工程を行う必要はない。

本発明の方法では、全グルカン粒子を、グルカンの酸に対し可溶性の部分を溶解 するのに充分な条件下で、酸溶液中に懸濁させる。はとんどのグルカン類に対し て、ｐＨが約１〜約５で温度が約２０°Ｃ〜約１００°Ｃの酸溶液で充分である 。

使用される酸としては、グルカンの酸に対し可溶性の部分を溶解することができ る有機酸が好ましい。約０．１Ｍ〜約５Ｍの濃度の酢酸、または約５０％〜９８ ％（Ｗ／Ｖ）の濃度のギ酸が上記の目的を達成するのに有用である。その処理時 間は、酸の濃度、温度および全グルカン粒子の起源によって、約１０分から約２ ０時間まで変動する。例えば、天然すなわち野性型のグルカン類よりもβ（１− ６）分枝が多い改質グルカン類は、より厳重な条件、すなわち一層長い処理時間 と高い温度を必要とする。この酸処理工程は、類似のまたは各種の条件下で繰り 返してもよい。本発明の方法の１つの実施態様では、天然由来のグルカン類より も高いレベルであり、β（１−６）分枝を育するニス・セレビシェ２４株（ｔｈ ｅｓｔｒａｉｎ、　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｒ４）由来の改質（ｍｏｄｉ ｆ　１ｅｄ）全グルカン粒子が用いられ、処理は、９０重量％のギ酸を用いて、 ２０°Ｃで約２０分間、次いで８５°Ｃで約３０分間行われる。

次いで、酸に不溶性のグルカン粒子を、適切な分離法、例えば遠心分離または濾 過によって溶液から分離する。得られたスラリーのｐＨを、水酸化ナトリウムの ようなアルカリ性化合物で、ｐＨを約７〜約１４に調節する。次にこのスラリー を、グルカン重合体を可溶化するのに充分な濃度と温度を有する熱アルカリに再 懸濁させる。この工程で使用てきるアルカリ性化合物としては、濃度が約０．１ Ｎ〜約１ＯＮの水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムのようなアルカリ金属 もしくはアルカリ土類金属の水酸化物が含まれる。この工程は約４°Ｃ〜約１２ ビＣの温度て行うことがてき、約２０°Ｃ〜約１００″Ｃが好ましい。本発明の 方法の一実施態様におし１て、利用される条件は、水酸化ナトリウムのＩＮ溶液 を用いて温度が約８０°Ｃ〜１００°Ｃで接触時間が約１〜２時間という条件で ある。得られた混合物は、可溶化されたグルカン分子と粒状のグルカン残渣を含 有し、一般に、汚染しているタンパク質および糖の酸化が原因して黒褐色を呈し ている。粒状の残渣は、適切な分離法、例えば遠心分離および／または濾過によ って混合物から分離される。本発明の他の実施態様では、酸に可溶性のグルカン 類に、先に酸加水分解反応を行った後、約１．５倍容積のエタノールを添加する ことによって沈澱させる。得られた混合物を２時間約４°Ｃに冷却し、生成した 沈澱を遠心分離もしくは濾過によって収集して水で洗浄する。得られたペレット を次に水中に再懸濁させ、次いで約２０℃〜１００°Ｃの温度で３〜１２時間攪 拌する。この時点で、水酸化ナトリウムのような塩基を用いてｐＨを約ｌＯ〜１ ３に調節する。

得られた溶液は可溶性グルカン分子を含有している。この溶液は、任意に濃縮を 行うことが可能であり、可溶性グルカンの前記の濃縮画分の５〜１０倍の濃縮を 行うことにより約１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の可溶性グルカンを得ること ができる。この工程は、適切な濃縮法、例えば、見掛けの分子量レベル（ＮＭＷ Ｌ）もしくは約１，０００〜１００゜０００ダルトンの範囲をカットオフする膜 を用いて限外濾過法にて実施することができる。グルカン重合体が徐々に凝集し て沈澱するのを防止するために、この工程用に好ましい膜は約１００．０００ダ ルトンの見掛けの分子量をカットオフするものであることが見出された。

この工程終了後に得られる濃縮画分には、可溶性で生物学的活性を有するグルカ ンＰＧＧが豊富に含有されている。薬学的に許容される溶液を得るために、前記 のグルカン濃縮物を、例えば１０，０００ダルトンの膜を用いるダイアフィルト レージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を用いてさらに精製をおこなう。

本発明の方法の１つの実施態様において、ダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆ ｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法は、ｐＨが約１１〜１３で、約１０倍容積のアルカリ液 を用いて行われる。この工程の終了後の可溶性グルカンの好ましい濃度は、約２ 〜約１０ｍｇ／ｍｌである。この溶液のｐＨは、例えば塩酸のような酸によって 約７〜１２の範囲に調節される。なおも含有されているタンパク質性物質と脂質 物質は、得られた溶液を、ＤＥＡＥ−セルロース、ＱＡＥ−セルロース、Ｑ−セ ファロースまたは疎水性の相互作用をもつ樹脂といった正電荷の媒体（ｐｏｓｉ ｔｉｖｅｌｙ　ｃｈａｒｇｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）と接触させることによって除去 することができる。タンパク質性物質は、グルカン製品の品質を損い、溶液の変 色を起こし得るもので、ゲル網目構造の生成を促進して、グルカン重合体の溶解 性を制限するものである。この工程の終了により透明な溶液が得られるが、この 溶液を、塩酸を用いてｐＨ７に中和する。

この高純度に精製された透明なグルカン溶液は、例えば非経口投与に適切な薬学 的に許容可能な媒体（例えば注射用の滅菌水、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）　、 等張食塩液、デキストロース）を用いるダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆｉ ｌｔｒａｔｉ−ｏｎ）法でさらに精製される。このダイアフィルトレージョン（ ｄｉａｆｉ　１ｔｒａｔｉｏｎ）工程用に好ましい膜は、見掛けの分子量カット オフが約１０，０００ダルトンのものである。グルカン溶液の最終濃度を、約０ ．５〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲に調節する。非経口投与用製剤についての医薬製造 基準にしたがって、溶液は、０．２２μｍのフィルターを通過させて濾過するこ とによって最終的に滅菌することができる。上記の方法で得られた可溶性グルカ ン製剤は、減菌されており非抗原性で本質的に発熱物質を含有していないので、 室温で長期間、分解することなく貯蔵することができる。この方法は、非経口投 与に適切で下記の処方に適合する免疫学的に活性なグルカンの中性水溶液が得ら れる点で特異的である。

エンドトキシン　＜３．ＯＥＵ／ｍｇ パイオバーデン（Ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）　ＯＣＦ　ＩＪ／ｍ　１グルコース　〉 ９８重量％ タンパク質　く０．５重量％ グリコーゲン　く０．５重量％ キチン　く０．５重量％ 脂質　＜０．１重量％ 本発明の目的を達成するため、本発明の方法で得られるグルカン類を記載するの に、本願に使用されている“可溶性の”という用語は、濃度が約１０ｍｇ／ｍｌ まで室温（約２０〜２５°Ｃ）にて、水、ＰＢＳ、等張食塩液、またはｐＨか中 性（例えば約５〜約７．５のｐＨ）のデキストロース溶液のような水性媒体よっ て肉眼でみて透明な溶液をつくることができることを意味する。“水性媒体”と いう用語は、水相および水を多量に含有する相、特に、ＰＢＳ、食塩液およびデ キストロース溶液を含む薬学的に許容可能な水性液体を意味する。

この方法の重要な利点は可溶性グルカン重合体の乾燥または再構成を工程のどこ にも必要としないということである。

得られた溶液は、実質的にタンパク質による汚染がなく、非抗原性および非発熱 原性てあり、ならびに動物とヒトに非経口投与するのに医薬として許容可能であ る。しかし所望により、可溶性グルカンは、凍結乾燥のような適当な乾燥法によ って乾燥して乾燥形態で貯蔵することかできる。乾燥されたグルカンは、約０． １〜０．４Ｎ　ＮａＯＨのようなアルカリ溶液を添加することによって使用前に 再構成し、この工程から出発してすぐに前記のような有機酸を接触させて再処理 する工程に進むことができる。

本発明の方法で製造される可溶性グルカン類は、その由来となる生物と処理条件 とによって変動する比率でβ（ｌ−３）結合とβ（１−６）結合を含有するＰＧ Ｇと呼称されるグルコースの分枝重合体である。ＰＧＧはサツカロミセス・セレ ビシ−ｒ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ４から製 造するのか好ましく、このように製造すると高いβ（＋、　−６）　／β（ｌ− ３）比が得られる。これらのグルカン類は、先に引用した同時係属中の米国特許 出願第０７／４０４．７６５号に記載されているように、優れた免疫特性を示す 。ＰＧＧグルカン製剤はグルカン類を含有しているが、そのグルカン類は官能基 （例えば電荷を有する基）による置換または他の共育結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ　 ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ）による実質的な改質はなされていない。ＰＧＧグルカ ンの生物学的活性は、ジャマス（Ｊａｍａｓ）らが米国特許第４，８１０，６４ ６号と同時係属中の米国特許出願第０７／２９７，９８２号、同第０７／２９７ ，７５２号および同第０７／３３３，６３０号に記載しているように、平均分子 量とβ（１−６）／β（１−３）比を変えることによって制御することができる 。本発明の方法で製造される可溶性グルカン類の平均分子量は、一般に約１０， ０００〜約５００，０００ダルトンであり、好ましくは約３０，０００〜約ｓｏ 、ｏｏｏダルトンである。

本発明の可溶性グルカンの製剤は、安全で有効な治療剤および／または予防治療 剤として、単独もしくはアジュバントとして使用してヒトおよび動物の免疫応答 を強化することが・できる。本発明の方法で製造される可溶性グルカン類は、免 疫系を強化もしくは充実（ｐｒｉｍｅ）させ、免疫応答が一層速くかつ大きくな る。本発明の可溶性グルカンの組成物は、栄養失調症の患者、手術を受けている 患者、化学療法もしくは放射線療法を受けている患者、好中球減少症の患者、Ｈ ＩＶに感染した患者、外傷を受けた患者、火傷の患者および老人（これらのヒト はすべて免疫系が弱っている）の感染症の予防もしくは治療に用いることができ る。免疫無防備状Ｑ（ｉｍｍ−ｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）の患者をグルカ ン類で治療する方法は、先に引用したジャマス（Ｊａｍａｓ）らの出願係属中の 米国特許願第０７／４０４，７６５号に詳細に記載されている。

本発明の組成物は、一般に、免疫系を強化するのに充分な量で動物もしくはヒト に投与される。本発明の製剤は、注射により、例えば皮下、静脈内、筋肉内、腹 腔内、皮下、局所、経口もしくは鼻腔内に投与することができる。可溶性グルカ ン類は、濃度が約１ｍｇ／ｍ１〜約１０ｍｇ／ｍｌの透明溶液として投与するこ とができる。その溶媒は生理的に許容できる水性媒体、例えば水、食塩液、ＰＢ Ｓまたは５％のデキストロース溶液であってもよい。免疫系の強化を促すのに必 要な量は、固体別に変化し、少なくとも幾分は個体の大きさ、症状の重篤さおよ び要求される結果に基づいて変化するＰＧＧは、特に、免疫機能が正常もしくは 減退した患者において、感染症に対する身体の自然防御を強化もしくは充実（ｐ ｒｉｍｅ）させて、その結果、正常な免疫応答を一層速く、かつ増大させる非毒 性で非抗原性のグルカン製剤である。ＰＧＧが非経口投与されると、サイトカイ ン類の適切な量と比率による、バランスのとれた内因性の放出が強化されて、感 染症誘発に対し自然の生理的応答が引きおこされる。ＰＧＧは、広範囲の、細菌 、真菌、ウィルスおよび原生動物の病原体によって生じる感染症の予防と治療に 用いることができる。

患者に対して手術を受ける前、手術直前、手術中および／または手術後にＰＧＧ を予防用に投与すれば、通常の患者と危険度の高い患者の両方に、手術後の感染 症の発現と重症度が低下する。例えば汚染されているかまたは潜在的に汚染され ているとして分類されている外科手術（例えば胃腸の手術、子宮摘出手術、帝王 切開手術、経尿道前立腺切除手術）を受けている患者、および手術部位の感染症 が発生する危険か高い患者（例えば補てつ関節形成手術、心臓血管の手術）には 、適当な抗菌剤と本発明のＰＧＧ製剤による初期の同時治療を行うと、感染性合 併症の発現と重症度が低下する。

疾病（例えば癌、エイズ）のみならず、化学療法および／または放射線療法を行 っているために免疫を抑制されている患者に、ＰＧＧを予防用に投与すると、多 くの異例の細菌、真菌およびウィルスを含む広範囲の日和見性病原体によって起 こる感染症の発現が減少する。ＰＧＧを使う治療法は、マクロファージの機能と 再生の促進および長期化をうながして、その結果微生物の侵入と感染に対する抵 抗性を強化するＰＧＧの性能によって有意な放射線防御作用を示す。

危険度の高い患者（例えば６５歳以上の患者、糖尿病患者、癌、栄養失調症、腎 臓病、気腫、脱水症および運動制限等を有する患者）では、入院するとこれに伴 い重篤な院内感染症が発現することが多い。ＰＧＧグルカンによる治療は、カテ ーテル法、人工呼吸器、排液管、集中治療装置なとを使用する前、長期間の入院 を行う前に経験的に開始してよ（、これにより通常これらの処置に付随して起こ る感染症の防止に役立つ。抗菌剤とＰＧＧとによる同時治療法は、慢性で重篤な 、治癒しにくく、複雑でかつ治療が困難な感染症を治療するのに必要である。

本発明の方法で製造されるグルカンは、咄乳類の単核球細胞の非特異的防御性を 強化し、かつ感染症の誘発に対して応答する上記の細胞の性能を有意に増大する 。グルカンのマクロファージを活性化する独得の特性は、宿主を防御する多くの 非特異的刺激剤について報告されているような体温の上昇（すなわち発熱）を起 こさないということである。グルカンのこの重要な利点は、グルカンが白血球内 で仲介する応答の天然のプロフィルにある。本発明の可溶性ＰＧＧグルカンの独 得の機構は、正常なヒト白血球をイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒ。

）でＰＧＧによって前治療すると、次に内毒素または他の感染性作因（ｉｎｆｅ ｃｔｉｏｕｓ　ａｇｅｎｔｓ）て刺激した場合にのみ、単核球細胞に高レベルの モノカイン類（ＴＮＦ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−１、ＩＬ−６）を放 出させるらしいとし）うことである。それ故に本発明の可溶性ＰＧＧグルカンは 、他のグルカン製剤（例えばレンチナン、フレシン）とは異なり、単核球細胞か らのＩＬ−１とＴＮＦの放出を直接刺激しないという点て免疫刺激剤である。こ のことは非常に有利であると考えられる。というのは、モノカイン類は、感染性 作因（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｇｅｎｔｓ）に暴露されるまで全身的に放出さ れないからである。このように本発明は、動物またはヒトに対し、非経口、局所 、鼻腔内、または経口で投与して免疫系を強化することができる可溶性グルカン と、その可溶性グルカンの製造方法を提供するものである。

下記実施例によって、本発明をさらに例証する。

乾燥全グルカン粒子からのＰＧＧの製造全グルカン粒子はジャマス（Ｊａｍａｓ ）らの米国特許第４．８１０゜６４６号の方法に従い、乾燥状態のべ一カーの酵 母（Ｂａｋｅｒ’　５Ｙｅａｓｔ：　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｆｏｏｄｓ、　Ｗり から製造した。得られた乾燥全グルカン粒子１００ｇを９０％ギ酸３リツトルに 再び浮遊させ、室温で１時間攪拌した。この混合物を次いで８０°Ｃに加熱し、 急激な粘性の低下が観察されるまで攪拌した。この時点で混合物に、エタノール ９リツトルを加え沈澱物を形成させた。この沈澱物を遠心分離により回収した。

次いで沈澱物を０．４Ｍの水酸化ナトリウム（Ｎａ０Ｈ）に溶解し、溶液を遠心 分離して不溶の沈澱物を除去した。上清を３０．０００ダルトンの見掛けの分子 量レベル（ＮＭＷＬ）をカットオフする　Ｉｍｍｅｒｓｉｂｌｅ−Ｃｘ−３０Ｕ ｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ 。

ＭＡ）を用いて限外濾過によって濃縮した。濃縮された画分を同じ装置で１０倍 量の水を用いダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）にかけた。得られた溶液 を濃縮し、ダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって 滅菌等張食塩水中で平衡化した。この画分（＞　３０．０００ダルトン）の最終 収量は１．９ｇであった。

１０、０００〜３０．０００の画分を得るために、最初の限外濾過から得られた 濾液をＩｍｍｅｒｓｉｂｌｅ−Ｃｘ−１０Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ　（λ１ｉｌ ｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ、　）を用いてｉｏ、　ｏｏｏダルトンが通過する膜によ る限外濾過によって濃縮した。濃縮液画分を次いで１０倍量の水でダイアフィル ター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）　Ｌ／、次いで滅菌等張食塩水で平衡化した。この 画分の最終収量は２．７ｇであった。

Ｒ４（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５９０３）をＭＰＰ−８０モービル・パイロット・プラ ント培養器（Ｍｏｂｉｌｅ　Ｐｉｌｏｔ　Ｐｌａｎｔ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）　 （Ｎｅｗ　ＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　ＮＪ）中で６０リツト ルの限定された生育培地（リン酸二水素カリウム４．４５ｇ／ｌ、硫酸アンモニ ウム３．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物１．１ｇ／ｌ　、塩酸リジン１ ．８ｇ／ｌ、チロシン０．９ｇ／ｌ　、アデニン０．０１２ｇ／ｌ　、ウラシル ０．０１２ｇ／ｌ、カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）５．０ｇ／ｌ、 ヒスチジン０．４５ｇ／ｌおよびグルコース４．０ｇ／ｌ）中で培養した。培地 の光学的濃度（００，６００ｎｍ）が３０になったところで、５Ｍ水酸化ナトリ ウムでｐＨを１２として培養を中止した。総細胞量は乾燥細胞量でおよそ１．８ ｋｇであった。この細胞をウエストファリア・ノズル・ボウル・セパレーター（ Ｗｅｓｔｆａｌｉａ　Ｎｏｚｚｌｅ　ＢｏｗｌＳｅｐａｒａｔｏｒ　）　（Ｍｏ ｄｅｌ　５ＫＯＧ−２０５，Ｇｅｎｔｒｉｃｏ、　ＮＪ）を用いて遠心分離によ り回収し、水で洗浄した。この濃縮細胞懸濁液をステンレス製の攪拌容器に移し 、ＩＭ水酸化ナトリウムｌＯリットルに再び懸濁し、２５°Ｃで２０時間攪拌し た。この混合物を次いで９０°Ｃまで加熱し、さらに１時間攪拌した。不溶粒子 を遠心分離により回収し、水で洗浄した。濃縮されたスラリーをｌＯリットルと なるように１Ｍ水酸化ナトリウムに再び懸濁し、９０°Ｃて３時間攪拌した。こ の抽出段階を更に９０°Ｃで１時間繰り返した。不溶物を遠心分離で集め水で洗 浄した。濃縮されたスラリーを次いでｌＯリットルの水に再び懸濁し、塩酸でｐ Ｈを４．５に調整し、９０°Ｃて１時間攪拌し、次いで遠心分離し、洗浄した。

濃縮されたスラリーを次いで０．５Ｍ酢酸５リツトルに再び懸濁し、９０°Ｃて ３時間攪拌した。不溶物を遠心分離で集めた。グルカン粒子の収量はこの段階で 正味型！２、８ｋｇであった。

不溶性グルカン粒子１００ｇを０．５Ｍ酢酸５００ｍ１に再懸濁し、９０°Ｃで ２０時間抽出した。懸濁液を次いで水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和し、不溶性 グリカン粒子を遠心分離により回収した。該グルカンをＩＭ水酸化ナトリウム２ ００ｍ１に再懸濁した後、９０°Ｃで１時間加熱を行い、該グルカンを溶解した 。この混合物を冷却し、遠心分離を行い粒子層を除去した。上清溶液を０．４Ｍ 水酸化ナトリウム水て希釈し、０．５μｍμｍポリプロピレンデプスフィルター ｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｄｅｐｔｈ　ｆｉｌｔｅｒ）を通して濾過した。得 られた溶液をミニタンＨＲＴＦシステム（Ｍｉｎｉｔａｎ　ＨＲＴＦ　Ｓｙｓｔ ｅｍ　Ｘλ１ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、）を用いる１０．０００ダルトンの ＮＭＷＬ膜を通して限外濾過を行い、４倍に濃縮を行った。

濃縮画分を次いで同上の装置を用いて１０倍量の０．４Ｍ水酸化ナトリウムでダ イアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）にかけた。溶液を希釈し０．２２５Ｍ水 酸化ナトリウム中にグルカン２　ｍｇ／ｍｌ存在する溶液を得た。この溶液を塩 酸でｐＨ９に調整し、ミニタンシステム（旧ｎ１ｔａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用い て滅菌等張食塩水に対してダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）を行った。

次いで、この溶液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。この方法 では２２５．０００ダルトンの重量平均分子量を有する滅菌ＰＧＧグルカン１． １ｇを得た。

実施例３ 単球β−グルカンレセプターに対する改質グルカン類（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｇｌ ｕｃａｎｓ）の親和性単球のβ−グルカンレセプターを認識し、結合するという グルカン分子の能力は、グルカン分子の生物学的活性として臨界的なものである 。突然変異株Ｒ４（ＷＧＰ−Ｒ４）から誘導された改質全グルカンは、ベーカー の酵母（Ｂａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ）から自然発生するグルカンと比較した場 合に単球のグルカンレセプターへの親和性が増加したことが証明されている（ジ ャヌズ（Ｊａｎｕｓｚ）ら、Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３７：　３２７０ −３２７６　（１９８６））。

水溶性改質グルカン（ＰＧＧ）は実施例２に概説した方法に従ってＷにＰ−Ｒ４ より製造した。

ヒト単球は種々濃度のＰＧＧとともに１５分間インキュベートした後、洗浄をお こない未結合グルカンを除去し、次いでザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）とともに ３０分間インキュベートした。

この単層を固定化して染色した後、ザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）を摂取した単 球のパーセンテージを決定した。グルカン製剤のβ−グルカンレセプターに対す るアフィニティーは、競合してレセプターを捕らえ、単球によるザイモサン（Ｚ ｙｍｏｓａｎ）の摂取を阻害するという、該製剤の持つ能力に従って測定された 。各試料は、ザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）の摂取の阻害率が５０％となるとき のグルカンの濃度で比較された。

ＷＧＰ−Ｒ４由来の可溶性ＰＧＧグルカンがレセプターに対する顕著な高いアフ ィニティーを示すことは、ザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）の摂取の阻害率が５０ ％となるときの濃度の低さから明らかである。結果は図１に示されるが、ＷＧＰ −Ｒ４と表示されたＰＧＧグルカンは、ベーカーの酵母（Ｂａｋｅｒ’　５ｙｅ ａｓｔ）抽出物由来の可溶性グルカン（ＹＥグルカン）のアフィニティー（３， ５μｇ／ｍｌ）に比べて非常により高いアフィニティー（０，ｌμｇ／ｍｌ）を もって単球のβ−グルカンレセプターと結合し、活性においては３５倍の増加を 示Ｒ４由来ＰＧＧの２種の分子量の画分を実施例２に概説した方法に従って調製 した。このＰＧＧ調製物は、次いで実施例３て述べたザイモサン（Ｚｙｍｏｓａ ｎ）寅食作用の阻害を測定することによる、単球のβ−グルカンレセプターに対 するアフィニティーにより分析がなされた。その結果を表１に示したが、ＰＧＧ 製剤の分子量がβ−グルカンレセプターに対するアフィニティーに影響を与える こと、従って、それらのイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）における免疫学的活性に 影響を与えるであろうことが示された。

表ル レセプターとの結合性に対するＰＧＧ分子量の影響バーレー（Ｂａｒｌｅｙ）β −グルカン　”　６５　１末梢血白息球（Ｗｈｉｔｅ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ、 ＷＢｃ）の数に対する改質グルカン類のイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）投与にお ける影響を、マウスにおいて評価した。２４株由来の改質グルカンのＰＧＧ製剤 は、実施例２に概説した方法に従って調製し、雄性ＣＤ−１マウスに静脈投与（ ＩＶ）および皮下投与（Ｓ　Ｃ）を行った。総数および各成分（ｄｉｆｆｅｒｅ ｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌ）の数は一定時間毎に測定された。

ＷＢＣ（末梢血白血球）の総数は、ＰＧＧの単回静脈投与（ＩＶ）において特に 著しい増加が見られた。図２および図３の結果を要約すると、ＷＢＣ（末梢血白 血球）の総数は急激に（６時間以内）増幅され、最も顕著な増加は単球および顆 粒球で各々見られた（１２倍および６倍）。これは、ヒト単球上に高いアフィニ ティーのβ−グルカンレセプターが存−ターと一致している。複数の皮下投与（ ＳＣ）により（図３）　、ＷＢＣの総数は治療開始後４８時間で増加し始め、１ ４４時間後にピークを示した。総数の増加と末梢血単球数の増加とは、この期間 中一致した。平均単球数は、０時間での３２０　／ｍｍ’から、１４４時間後は 約８．　０００／ｍｍ３に増加し、２４倍の増加となった。

重症の感染症、例えば腹部の手術後に通常発症するもの、に対し免疫学的に損傷 のない宿主（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　１ｎｔａｃｔｈｏｓｔ）を保護 することにおいて、改質グルカン類の効力の評価を行うために、敗血症モデルを マウスで作成した。ＷＧＰ−Ｒ４由来のＰＧＧは、実施例２に概説した方法に従 って調（約１０”ＣＦＵ／ｍｌ）の懸濁液０，１ｍｌをマウス腹腔内にチャレン ジし、その２４時間後に、トランスゾーラシック・カーブイアツク・パンクチャ ー（ｔｒａｎｓｔｈｏｒａｃｉｃｃａｒｄｉａｃ　ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を用いて ＰＧＧの単回静注（ｓｉｎｇｌｅｂｏｌｕｓ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）によりＩＶ 投与を行った。マウスをケージに戻して食料と水を自由（ａｄ　ｌｉｂｉｔｕｍ ）に与えた。１０匹の対照群のマウスにはＰＧＧの投与時に殺菌した食塩水０． １ｍｌを注射した。チャレンジ４８時間後に治療群と食塩水による対照群の死亡 率を記録した。結果を図４に示すか、改質グルカンから得られたＰＧＧ、ＷＧＰ −Ｒ４は、食塩水による対照群と比較して０．０１ｍｇ／マウス（０、５Ｂ／ｋ ｇ体重）という低用量で有意な死亡率の低下を示した（Ｐ＜０．０５）。

均等物 当業者であれば、さらなるルーティンな実験を行うことなくここで特に記載した 特定の発明の実施悪様に対して多くの均等物を認識し、確認することができるで あろう。これらの均等物も以下のクレームの範噴に含有されるものである。

１雇（Ｐｇ／ｍｌ　） ＰＧＧ４’＆！ｈ４動。特Ｆａ’ｌ　（時間）’ＰＧＧギしシ１綴の１１聞　（ 時間）ＰＧＧ嶺♀ｔ（ｒｒ＋ｑ／マリス） 国際調査報告 ＋−＋−−−９＋−−−＋Ａｅｍニーｕ−Ｎ−，ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０５０４ １＋−＋１．、−＝＋−−−１ａ、ｍ＋−ａｗＮａ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０ ５０４１国際調査報告

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の工程からなる、可溶性グルカンの製造方法。 ａグルカン粒子を酸溶液と接触させ、 ｂ（ａ）工程の酸処理を行った粒子を、アルカリ可溶性のグルカンを充分に溶解 できる条件下でアルカリ溶液と接触させ、 ｃ（ｂ）工程の溶液からアルカリ不溶性の粒子およびグルカン重合体を分離し、 および ｄ（ｃ）工程により得られたグルカン溶液を中和する。
2. ２．グルカン粒子が酵母由来の全グルカン粒子である、請求項１記載の方法。
3. ３．酵母がエス・セレビシエの株（ｓｔｒａｉｎｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）からなる請求項２記載の方法。
4. ４．エス・セレビシエの株（ｓｔｒａｉｎｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がＲ ４（ＮＲＲＬＹ−１５９０３）株である請求項３記載の方法。
5. ５．（ａ）工程の酸溶液が有機酸の溶液である請求項１記載の方法。
6. ６．有機酸が約０．１Ｍから約５Ｍの濃度の酢酸である請求項５記載の方法。
7. ７．有機酸が約５０％から９８％（Ｗ／Ｖ）の濃度のギ酸である請求項５記載の 方法。
8. ８．（ａ）工程が、約２０℃から約１００℃の温度において、約２０分から約２ ０時間の間行われる、請求項１記載の方法。
9. ９．（ｂ）工程のアルカリ溶液が、約０．０１から１０．０Ｎの濃度でｐＨ約７ から約１４のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物である、請求項１ 記載の方法。
10. １０．アルカリ溶液が、約０．１Ｎの水酸化ナトリウムである請求項９記載の方 法。
11. １１．（ｂ）工程が、約４℃から約１２１℃の温度において、約１から３時間の 間行われる、請求項１記載の方法。
12. １２．（ｂ）工程の後に得られた溶液を、ＤＥＡＥ−セルロース、ＱＡＥ−セル ロース、Ｑ−セファロースからなる群から選ばれた、正電荷の媒体（ｐｏｓｉｔ ｉｖｅｌｙ−ｃｈａｒｇｅｄｍｅｄｉｕｍ）と接触させる付加工程からなる、請 求項１記載の方法。
13. １３．（ｂ）工程の後に得られた溶液を、疎水性の相互作用をもつ媒体と接触さ せる付加工程からなる、請求項１記載の方法。
14. １４．（ｃ）工程が粒状および重合しているグルカン類を除去するものである請 求項１記載の方法。
15. １５．（ｃ）工程が約１００，０００ダルトンの分子量をカットオフする膜を用 いたｐＨがアルカリ状態における限外濾過により行われる、請求項１記載の方法 。
16. １６．１０，０００ダルトンを超える分子量をもち、水性媒体に対し可溶性で非 抗原性、非発熱原性である、請求項１記載の方法により製造される可溶性グルカ ン。
17. １７．９８重量％を超えるグルコース、０．５重量％未満のタンパク、グリコー ゲンおよびキチン、および０．１重量％未満の脂質を含有する、請求項１６記載 の可溶性グルカン。
18. １８．以下の工程からなる、動物またはヒトに対し非経口投与を目的とする、精 製可溶性グルカンの製造方法。 ａ　　全グルカン粒子を酸溶液と接触させ、ｂ　　（ａ）工程の酸処理を行った 粒子を、アルカリ可溶性のグルカンを充分に溶解できる条件下でアルカリ溶液と 接触させ、 ｃ（ｂ）工程の溶液からアルカリ不溶性の粒子およびグルカン重合体を分離し、 ｄ（ｃ）工程により得られた溶液を中和し、およびｅ（ｄ）工程により得られた 溶液を、薬学的に許容し得る媒体を用いたダイアフィルトレーション（ｄｉａｆ ｉｌｔｒａ−ｔｉｏｎ）によりさらに精製して、精製された中性グルカン溶液を 製造する。
19. １９．全グルカン粒子が酵母由来である、請求項１８記載の方法。
20. ２０．酵母がエス・セレビシエの株（ｓｔｒａｉｎｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）からなる請求項１９記載の方法。
21. ２１．エス・セレビシエの株が（ｓｔｒａｉｎｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｒ４（ＮＲＲＬＹ−１５９０３）株である請求項２０記載の方法。
22. ２２．（ａ）工程の酸溶液が有機酸の溶液である請求項１６記載の方法。
23. ２３．有機酸が酢酸またはギ酸である請求項２２記載の方法。
24. ２４．（ａ）工程が、約２０℃から約１００℃の温度において、約２０分から約 ２０時間の間行われる、請求項１８記載の方法。
25. ２５．（ｃ）工程のアルカリ溶液が、約０．０１から１０．０Ｎの濃度でｐＨ約 ７から約１４のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物である、請求項 １８記載の方法。
26. ２６．アルカリ溶液が、１Ｎの水酸化ナトリウムである請求項２５記載の方法。
27. ２７．（ｂ）工程が、約４℃から約１２１℃の温度において、約１から３時間の 間行われる、請求項１８記載の方法。
28. ２８．（ｃ）工程が、ｐＨ約１１から約１４のアルカリ溶液を用いたダイアフィ ルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により行われる、請求項１８記 載の方法。
29. ２９．（ｅ）工程が、薬学的に許容し得る媒体を用いたダイアフィルトレーショ ン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により行われる、請求項１８記載の方法。
30. ３０．薬学的に許容し得る媒体が、水、ＰＢＳ、等張食塩液およびデキストロー スからなる群から選ばれる、請求項２９記載の方法。
31. ３１．（ｂ）工程の後に得られた溶液を、ＤＥＡＥ−セルロース、ＱＡＥ−セル ロース、Ｑ−セファロースまたは疎水性の相互作用をもつ媒体と接触させる工程 をさらに有する、請求項１８記載の方法。
32. ３２．請求項１８記載の方法により製造された可溶性グルカン。
33. ３３．９８重量％を超えるグルコース、０．５重量％未満のタンパク、グリコー ゲンおよびキチン、および０．１重量％未満の脂質を含有する請求項３２記載の 可溶性グルカン。
34. ３４．請求項１８の方法により製造された可溶性グルカン溶液。
35. ３５．薬学的に許容し得る媒体中に、約０．５から約１０ｍｇ／ｍｌのグルカン を含有する請求項３４記載の溶液。
36. ３６．薬学的に許容し得る媒体が、水、ＰＢＳ、等張食塩液およびデキストロー スからなる群から選ばれる、請求項３５記載の溶液。
37. ３７．平均分子量が約１０，０００から約５００，０００ダルトンである、水溶 性かつ非誘導的（ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）なグルカン。
38. ３８．エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ４（ＮＲＲＬ　Ｙ−１ ５９０３）由来の、請求項３７記載の水溶性かつ非誘導的（ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖ ａｔｉｚｅｄ）なグルカン。
39. ３９．平均分子量が約３０，０００から約２００，０００ダルトンである、請求 項３８記載の水溶性かつ非誘導的（ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）なグルカ ン。
40. ４０．少なくとも９８重量％のグルコース、０．５重量％未満のタンパク、グリ コーゲンおよびキチン、および０．１重量％未満の脂質を含有する請求項３９記 載の水溶性かつ非誘導的（ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）なグルカン。
41. ４１．薬学的に許容し得る媒体中に、平均分子量が約１０，０００から約５００ ，０００ダルトンである、水溶性かつ非誘導的（ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ ｄ）なグルカンよりなる、ヒトまたは動物に対し非経口投与を目的とする溶液。
42. ４２．該グルカンの濃度が、約０．５から約１０．０ｍｇ／ｍｌである請求項４ １記載の溶液。
43. ４３．該グルカンの平均分子量が約３０，０００から約２００，０００ダルトン である請求項４２記載の溶液。
44. ４４．薬学的に許容し得る媒体が、水、ＰＢＳ、等張食塩液およびデキストロー スからなる群から選ばれる、請求項４２記載の溶液。
45. ４５．動物またはヒトに対し免疫応答を刺激するのに充分な量の請求項３７記載 の水溶性グルカンを、該動物またはヒトに対し投与することよりなる、動物また はヒトの免疫応答を刺激する方法。
46. ４６．免疫障害をもつヒトまたは動物の免疫応答を刺激するのに充分な量の請求 項３８記載の水溶性グルカンを、該ヒトまたは動物に対し投与することよりなる 、免疫障害をもつヒトまたは動物の治療方法。