JPS5945301A - 多糖類及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は多糖類及びその製造法に関するものであり、更
に詳しくは担子菌類であるフクロタケ由来の多糖類及び
フクロタケからこの多糖類を抽出採取するその製造法に
関するものでちる。

自己を複製し修復しうる生体ｒ、ｌ：その機能維持の／
Ｃめアミノ酸、脂質などの多種類の低分子物質とともに
蛋白質、核酸、多糖類などの高分子物質から成り立って
いる。

従って多糖類は天然に広く存在する。そして食品、医薬
品等として広く用いられている。これらの多糖類のうち
、担子菌類由来の多糖類が近年抗コレステロール薬、免
疫賦活剤などとして注目されている７、この様な多糖類
としてはシイタケよりのレンチナン及びスエヒロタケよ
りのシゾフイランが特によく知られている。

これらはいずれもβ−１，３−グルカン金主鎖とし、β
−ｉ、６−ｆ’ｒ与合でグルコースが分岐していると云
われている。

担子菌声昧（遺１歩→９グクリョウよりのバキマン、ス
クレロチウム属の微生物よりのスクレログルカン等も同
様の構造を持つと云わｔｌている。寸たベスタロチア属
に属する微生物の産生ずる多、糖はβ−１，３−グルカ
ンの主鎖にβ−１、６ｒＸｊｊ’ｊ’ｊ’￥でＤ−グル
コピラノシル基及ヒＩ）−グルコピラノシル−Ｄ−グル
コピラノシル基の側鎖の付いた構造であるとされている
が、その側鎖の数は極めて多く、主鎖１００個当り約５
５ないし約７５個であるとされている（特開昭５６−３
４７０２号公報）。

フクロタケ屈に属する和子菌、ギヌオオフクロタケ、及
びシロフクロタケからｔｉｔ水、低級アルコール、低級
ケトン又はエーテル等の溶媒による抽出で抗腫Ａ性の多
糖が得られることが知られている（ｌ［￥開昭５７−３
８７２３号公報）。しかしその構造、物性等は全く知ら
れていない。

またフクロタケの菌糸体’ｃ６アルカリ溶液で抽出する
ことにより、サンタニン２と１１゛ｒθ、れる血圧降下
−４７４８３月公報′）。しかしこの物質は多糖のみか
ら成る物質ではない。

本発明は本質的に式 ％式％（１） で表わされる第３のくり返し単位（各式中Ｇｔｕはグル
コピラノシル基を、数字は結合位置を表わす）からなり
、第１（式（■））、第２（式（■））及び式３（式（
■））の各くり返し単位の個数の和１００当り、平均で
第３（式（ＩＩＩ）　）のくり返し単位の個数が約４な
いし約１２個で、第２（式（■））及び第３（式（■）
）のくり返し単位の個数の和が同じく約１６ないし約２
３個である多糖Ｏｎ提供するものである。

本発明の多糖力１の物理的、化学的性質は以下の通υで
ある。

（１）溶解性 アルカリ水溶ｌ＋、及びジメヂ・レスルホキシドに可溶
で、メタノール、エタノール、＋１−ブタノール、アセ
トン、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル、プロピレンク
リコール、ピリジン等に実質的に不溶である。乾燥した
本発明の多糖μｍは水に難溶性であるが、超音波処理な
どの操作舎加えることにより、水にｒｉＪ溶化できる。

また１λＮ類水溶液にはわずかに溶ける。アルカリ水溶
液に溶ＩＷ　したのち中和すると溶解し／ヒ捷１で残る
。

（２）旋光度 本発明の多糖類の０．５規定水酸化すトリウム水溶液（
０，５チ）中での比旋光１Φは ２５　。

〔α〕　　、約−１２゜ である。

（３）元素分析値 注意深く充分に乾燥するとＣｎ１ｉｚｎＯｎから計舞さ
れる値に近い値を与えるが、通常小組の水分を含有し、 Ｃ：４３〜４５チ Ｈ：、５．６〜６．４％ Ｎ：定量限界以下 程度の値を与える。ノ・ロゲン及び硫黄は検出されない
。

（４）赤外線吸収分析 ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルを第１図に示
す。８９６　ｃｍ−’　　における吸収はＤ−グルコー
ス残基のβ−結合に特有なものである。。

（５）Ｃ”−ＮＭＩ尤分析 δ値：１０３．６　、８６．８　、７６．９　、７５．
２　、７４．２　。

（ｐｐｍ）　　１３．３　　、７０．７　、６９．０及
び６１．４にビーク金示す１、 （６）発色反応 アンスロン反応　　　　　：陽性 ニンヒドリン反応　　　　：陰性 ディシュのカルバゾール反応：陰性 （７）分子量 濃度ｏ、ｉモル／ｌ、ｐＨ８，６のトリス塩酸塩緩衝液
を移動相とするゲル濾過高速液体クロマトグラフィにお
いて分子開約３０万ないし約８０万の分′画中に溶出す
る。

（８）塩化セチルピリジニウム、との反応水溶液中塩化
セチルピリジニウムと沈ｍｋ生成しない。

（９）構成糖類 本発明の多糖類１Ｆｆ：ｉ規定硫酸水溶液中、１００℃
で加水分解した後、ペーパークロマトグラフィにより、
及びアルジトールアセテートに誘導後、ガスクロマトグ
ラフィにより同定するとグルコ１−スのみが検出される
。

（１，０）結合格式 メチル化分析により、モル比で ２．３，４．６−チトラーＯ−メチルグルコース約０．
３０ないし約０．３５ 及び ２．４−ジーＯ−メチルグルコース 約０．７ないし約１．３ を与える。

エキン型のβ−１，３グルカナーゼを用いて酵素分解す
ると、グルコースとゲンチオビオーズを生成する。

！、たメタ過ヨウ素ナトリウムで充分に酸化し、水素化
ホウ素ナトリウムで還元後、緩和な条件、例えば０．１
なイｊ、０．２規定硫酸で、８０ないし１００℃。

１〜２時間程度加水分解すると側鎖に相当するグルコー
ス基の除去された直鎖状β−１，３−グルカンが得られ
る。このものはメチル化分析で２　、４　、６−トリー
〇−メチルグルコースと、痕跡量の２．３，４゜６−テ
トラ−０−メチルグルコースを与える。この直鎖状β−
１，３−グルカン全エキソ型β−１，３−グ／ｌ／、＋
１７ナーゼで酵素分解するとグルコースのみが生成する
。

従って本発明の多糖類の主鎖は実質上β−１，３−結合
のグルコース残基のみから成る。

このことから本発明の多糖類は連続したβ−１，３−グ
ルコシド結合の主鎖よりなり、β−１，３−結合のグル
コース結合４〜６個に１個の割合で、その６′位にβ−
結合で主として単独のグルコース残基よりなる側鎖を有
するが、＋１１！１市約３個のうち１個はβ−１，６−
結合した２ケのグルコース残基からなるものと認められ
る。それ故、本発明の多糖類の県木構造は前述の一般式
のくり返しｍ位からなるということができる。

これらのことから本発明の多糖は公知のスクレログルカ
ン、シゾフイラン及びキクラゲ子実体から得られる分枝
型β−１，３−グルカンよりも枝分れの頻度が少なくか
つ分枝中にわずかのβ−１，６−結合で２ケ以上連続［
７たグルコース残基からなる分枝をもつ多糖類である。

寸たベスタロチア属の微生物の産生ずる多糖と比べると
枝分れの頻度が著しく小さい。

本発明の多糖類は水で抽出されないからｔ；”ケ開昭５
７−３８７２３号公報で開示された多糖とは別の物質で
ある。同様に本発明の多＾イ、１ル眞１ｒ↓前述したサ
ンターン２とは後者が多量の窒素を含み、ニンビトリン
反応陽性（従ってこのものは糖蛋白質であると推定され
る）であることから明らかに別異の物質である。

本発明の多糖類は免疫賦活作用及び抗腫瘍作用金有し、
抗ウィルス作用なども期待できる。

てこれらは生の状態であっても乾ｌｊｒ品であってもよ
い。抽出にあたシ原利をあらかじめ細断することは抽出
効率をあげるために有効である。

抽出に用いるアルカリ水溶液とじてに１１、例えば水酸
化ナトリウノ・、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸
化物金円いることができる。特に水酸化す１−リウム水
溶液が便利である。

用いるアルカリの濃度は特に限定的ではないが、約０．
１規定ないし約３親定の範囲内で用いるのが好ま１７い
。

抽出に用いるアルカリ水溶液の１，１は仙常１回の↑）
イ出あたり、原料乾燥重量の約５ないし約１００倍量程
度である。この＋Ａ４′は少なすき゛れば抽出効率が悲
く、多すぎれば後処理が面倒である。

この抽出工程においては多糖の分解又は過酸化等の変性
を防ぐため、窒素等の不活性ガスの雰囲気下で抽出を行
うことが好ましい。またさらに水素化ホウ素ナトリウム
智の還元剤の存在下で行つ１もよい１、抽出温度には格
別の限定はないが、約３０℃以下が望ましい。さらに高
温、例えば通常の八′１（アルカリ抽出の湿度条件であ
る６０ないし８０℃程１生で抽出すると、さらに多くの
分岐を有する多糖類が抽出されるからである。抽出操作
はくり返し行ってもよい。

本発明に用いるフクロタケも自己の生命’ｉｌｉ持する
だめの多くの成分をその菌体内に含んでいる。従ってア
ルカリ水溶液でそのまま抽出すれば神々の夾雑物が目的
の多糖類中に含まれてしまう。この抽出液から目的の多
糖類を精製することは可能ではおるが煩雑な工程を必要
とする。本発明の多糖類は水、アルコール等の溶媒では
抽出されないので、アルカリ水溶液で抽出する工程に先
だち、水、熱水、緩衝水溶液、アルコール又はこれらを
組合せた溶媒により、これらの夾雑物を除去しておくこ
とが好ましい。

なおこの様な操作によりアルカリ水溶液抽出の際夾雑物
となる蛋白質、マンガノラクトン、グリコーゲン様多糖
等をあらかじめ可成の程度除去することができる。

本発明の方法に従って抽出を行ったアルカリ水溶液は塩
酸、酢酸等の酸で中和する。通常この状態では目的の多
糖は塩溶液中に溶解している。ついでこの溶液に塩化セ
チルピリジニウムなどの第４級アンモニウム塩會加えて
夾雑する酸性物質を不溶性沈澱として析出させる。この
沈澱はｐ過、遠心分離等の通常の分離手段により除去す
る。こうして得た上清液をそのまま又は濃縮後水で透析
し、透析液を乾燥することによシ目的の多糖類を得るこ
とができる。

第四級アンモニウム塩による処理で得た上清液をそのま
ま又は濃縮した後、これにアルコール、アセトンなどの
沈澱剤を加え、得られた沈澱を所望により水に対して透
析し、乾燥して目的の多糖類を固体として得てもよい。

その際の乾燥方法としては、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧
乾燥等の適当な乾燥手段を用いることができる。

以下本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例１゜ 風乾したフクロタケ子実体１００７をｐＨ，７，０の０
、１　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液１ｔに一夜浸ｌ−だ後、ミ
キサーおよびホモジナイザーで破砕した。さらにこれに
同じリン酸塩緩衝液２ｔ’ｌ−加えて４時間かくはんし
遠心分離した。得られた固形分を同じリン酸塩緩衝液３
ｔに入れホモジナイザーで分散させた後、４時間かくは
ん、遠心分離し沈澱を得た。この沈澱を３ｔの水に分散
させ、オートクレーブ中、１２０℃で３０分間加熱した
。冷却後遠心分離して沈澱２１ｒ−得た３、この熱水抽
出処理をさらに４回くり返し、水溶性両分をほぼ完全に
抽出除去した。

こうして得られた水不溶性画分を、水素化ホウ素ナトリ
ウム５２ｆ：溶解させた１規定水酸化ナトリウム水溶液
３ｔに分散させた。窒素気流下に２５℃で４時間かくは
んした後遠心分離した。この沈澱に対して１規定水酸化
ナトリウム水溶液による抽出操作をくシ返した。雨水酸
化ナトリウム抽出液を合併し、これを濃塩酸で中和し、
ｐＨ６，５に調整した。

こうして得た抽出液に塩化セチルピリジニウム水溶液（
４ｏ１’ｋかくはん下に、その添加によってあらたに沈
澱が生じなくなるまで滴下し、ついで１０．０ＯＯＧで
３０分間遠心分離を行い、生じた沈澱全除去した。この
上清に等容のメタノールを加えてかくはんし、多糖類を
沈澱させた。この沈Ｐを蒸留水５００ｍ１に加えホモミ
キサーで分散後流水中に５日間透析した。

透析内液を凍結乾燥し、目的物１３．Ｏｆを得た。

元素分析値 Ｃ：４４．０３チ Ｈ：６．０５チ Ｎ：定量限界以下 比旋光度 〔α〕′Ｄ５ニー１２°（濃度０．５％、０．５規定水
酸化ナトリウム溶液中） 赤外吸収スペクトル 第１図にＫＢｒ錠剤法による、フエリエ俊換赤外吸収ス
ペクトルを示す。

分子量 ０．１Ｍ、ｐＨ８，６のトリス塩酸塩緩衝液を移動相と
して、東洋背達工業■製Ｇ５０００ＰＷカラムを用いた
ゲル濾過高速液体クロマトグラフィで分子量約６８万の
リテンションタイムの位置に溶出した。

ＣＩｊ−ＮＭＲ分析、発色反応及び塩化セチルピリジニ
ウムとの反応 前−（した物理的、化学的性質と回じであった。

構成糖及び結合様式 得られた多糖をメチル化し、さらに加水分解した。得ら
れたメチル化オ；１ζをアルシト−・ルアセテートに誘
導した。これをガスクロマトグラフィで分析した。イ（
すられたメチル化ＪＪ、・ｌのモル比しよ２　、３　、
４　、６−テトラ−０−メチルグルコース　１２．４．
６−）リーＯ−メチルグルコース　　　　　３．７６２
．３．４−トリー〇−メチルグ、ｎ、コース０．３３２
．４−ジーＯ−メチルグルコース　　　　　　　１．０
１別にこの多糖をエキソ型β−１，３−グルカナーゼで
酵素分解した。グルコースとゲンチオビオースが得られ
た。そのモル比は前者１モルに対して後者０．１７７モ
ルであった。

さらにまたこの多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで充分
に酸化し、水素化ホウ素ナトリウムで還元した。これを
更に０．１規定の硫酸中、１００℃で２ｈ間加水分解し
たところ、側鎖に相当するグルコース基の除去された直
鎖状のグルカンの沈澱が得られた。

この沈澱を同様にしてメチル化分析を行ったところ２．
４．４−）ジ−０−メチルグルコースと痕跡−触の２．
３，４．６−チトラーＯ−メチルグルコース″ＩＣ力え
た。

またこの沈＃をエキソ型β−１，３−グルカナーゼで酵
素分解したところグルコースのみが生成した。

従って得られた多糖ｌｄ前述した式（ｔｌ、ω）及び（
１■）のくシ返し単位からなりその個数の比がこれらの
〈シ返し単位の金側の個数１００個当り、式（ＩＩＩ）
のくり返し単位７個、式（ＩＩ）のくり返し単位と式（
ＩＩＩ）のくり返し単位との個数の和は２１個であった
。

実施例２゜ アルカリ水溶液抽出の前の工程を実施例１と同様にして
行った後、抽出ＷＩ更を２０℃に変えた以外は実施例１
と同様にしてアルカリ水溶液抽出を行った。

得られた抽出液の塩酸でｐ　Ｈ６，５に調整した後、実
施例１と同様にして塩化セチルピリジニウム水溶液（１
０％〕を加え生ずる沈＃を遠心分離により除去した。上
清を２日間流水中に透析した後、透析内液舎３１Ｋまで
４０℃で減圧下に濃縮した。これに等容のメタノールを
加え生じた沈＋１１１１０，０ＯＯＧで３０分間遠心分
離した。この沈澱ｋ　３００　ｍｅのメタノールに加え
約１時間かくはん遠心分離し沈澱を得だ。このメタノー
ルによる洗浄をさらに２度くり返したのち、沈＃全減圧
乾燥し目的物１０．５ｒｅ得た。

こう１て得た多糖について実施例１と同様にして分析を
行なった。

元素分析値 Ｃ：４４．３１％ Ｈ：６．１０チ Ｎ：定量限界以下 分子量 分子量約５５万の位置に溶出した。

メチル化糖のモル比 ２．３，４．６−テトラ−０−メチルグルコース　　１
２．４．６−）ジ−０−メチルグルコース　　　　　４
，２６２．３．４−）ジ−０−メチルグルコース　　　
　　０．３２２．４−ジー０−メチルグルコース　　　
　　　　　１．０１エキン型β−１，３−グルカナーゼ
消化で得られたグルコースとゲンチオビオースとのモル
比１：０．１６０ くり返し単位の割合 合計個数１００個当シ式（ＩＩＩ）の〈シ返し単位６個
で、式（ＩＩ）のくり返し単位と式（＋ｎ）のくシ返し
単位の個数の和は１９個であった。

その他の結果は実施例１の場合と実質的に同一であった
。

本発明の多糖類の抗腫鴻剤としての使用例ＩＣＲＣウマ
ウス群本発明の多糖類のザルコーマ１８０固型腫瘍に対
する効果を試ｊ１，６川〜だ。

ＩＣＲマウス１四につきザルコーマ１８０腹水癌細胞５
×１０“個をそけい部皮下に接種した。実験群ｌｉ６１
２！；あてとした。癌細胞移植後、翌日より１０日２間
、１日１回薬剤全腹腔内に０．１　ｒＭずつ投与した。

試験Ｉｉｒには本発明の多糖類（実施例１で得たもの）
を第１表に示した投与箪になる様、生理食塩水に溶解し
て用い、対照群には生理食塩水のみ全投与した。

腫７．移植後３５日１］に癌を摘出してその重Ｎ４　ｘ
測定した。各群の腫蟲抑制率は次式により算出した。

結果を第１表に示す。

第　１　表 実施例１で　　　１．０　　　０．４３　　　９５　５
／６イｌた多糖　　　　５．０　　　　０．００　　　
１００’６／６対　照　　／４Ｅ　Ｂ１′食Ｊ臨水　８
．５６−Ｈ，２３００／６のみ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の多糖類の赤外吸収スペクトルを示す図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ・（１）本質的に式 ％式％（１ で表わされる第１のくり返し？１つ位、式で表わされる
   第３のくり返し単位（各式中、Ｇ　ｔ　ｕはグルコピラ
   ノシル基を、１だ数字は結合位置を表わす）からなり、
   第１、第２及び第３の各くり返し単位の和１００個当り
   、平均で第３のくり返し単位の個θが約４ないし約１２
   個で、第２のくシ返し単位と第３のくり返し単位の個数
   の第１１が同じく約１６ないし約２３個である多糖類。 （２）　　フクロタケ由来の多糖類である特許請求の範
   囲第１項記載の多糖力１゜ （３）濃度０．１モル／　ｔ、　ｐ　Ｈ８，６のトリス
   塩酸塩緩衝液を移動相とうるゲルｆ過高速液体クロマト
   グラフィにおいて分子量約３０万ないし約８０万を与え
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の多糖類。 （４）　　メチル化分机により、２，３，４．６−テト
   ラ−０−メチルグルコース、２，４，６−）ジ−０メチ
   ルグルコース、２，３．４−）ソー０−メチルグルコー
   ス及び２．４−ジ−ｏ−メチルグルコース全、２，３．
   ４．６−テトラ−０−メチルグルコースを１としたとき
   モル比で２．４．６−トリー〇−メチルグルコース約３
   ．７ないし約５．０．２．３．４−）ソー０−メチルグ
   ルコース約０．３０ないし約０．３５及び２，４−ジー
   Ｏ−メチルグルコース約０７ないし約１．３の割合で与
   える特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項
   記載の多糖類。 ル、アセトン、フロピレングリコ−Ａ１１ベンゼン、ト
   ルエン、ピリジン及び酢酸エチルに実質的に不溶である
   特許請求の範囲第１項ないし第４項記載の多糖類。 （６）７クロタケ全アルカリ水溶液で抽出し７て得たも
   のである特許請求の範囲第１　Ｊ′ｆ４ないし第５項の
   いずれかの項記載の多糖類。 （７）　　フクロタケをアルカリ水溶液で抽出して、本
   質的に式 ％式％（１ で表わされる第３のくり返し単位（各式中、Ｇ　ｔｌｌ
   はグルコピラノシル基金、数字は結合位置全表わす）か
   らなり、第１、第２及び第３の各くり返し単位の個数の
   ；１１１１００個当り、平均で第３のくり返し単位の個
   数が約４ないし約１２個で、第２及び第３のくり返し単
   位の個数のオＩＪが同じく約１６ないし約２３個である
   多糖類を採取することを特徴とする多糖類の製造法。 （８）多糖類が良度（）、１モル／１ＳｐＨ８，６のト
   リス塩酸緩衝液を移動相とするゲルｐ過高速液体クロマ
   トグラフィにおいて分子量約３０万ないし約８０万を与
   えるものである特許請求の範囲第７項記載の製造方法。 （９）多糖類がそのメチル化分析により、２　、３．４
   ゜６−テトラ−０−メチルグルコース、２，４．６−ト
   リー〇−メチルグルコース、２．３．４−トリー〇−メ
   チルグルコース及び２，４−ジー〇−メチルグルコース
   を、２，３，４．６−テトラ−０−メチルグルコースを
   １としたときモル比で２゜４．６−）リーＯ−メチルグ
   ルコース約３．７ないし約５．０．　２　、３　、４−
   ）リーＯ−メチルグルコース約０．３０ないし約０．３
   ５及び２，４−ジーＯメチルグルコース約０．７ないし
   約１８３の割合で与えるものである特許請求の範囲第７
   項または第８項記載の製造法。 （１０）多糖ぬ１がアルカリ水溶液及びジメチルスルホ
   キシドに可溶で、−ヘ　メタノール、ｎ−ブタノールア
   セトン、プロピレングリコール、ベンゼントルエン及び
   酢酸エチルに実ｔｊＩ的に不溶なものであるｔ持Ｉ）請
   求の範囲第７項ないし第９−Ｔｊ’ｌのいずれかの項記
   載の製造法。 （１１）アルカリ水溶液がアルカリ金属水酸化物の水溶
   液である４ｄ＋許請求の範囲第７　Ｊ＋ｉないｌ−第１
   ０項のいずれかの項記載の製造法。 （１２）アルカリ水溶液の濃度が約Ｃ）、１規定ないし
   約５規定である特￥ｆ請求のｆｌｉｉ’ｊ囲第７項ない
   し第１１項のいずれかの項記載の製造法１、 （１３）抽出ヶ還元剤の存在下で行なう特許請求の範囲
   第７項ないし第１２項のいずれかの功記載の製造法。 （１４）抽出を温度約３０℃以下で行なう特許請求の範
   囲第７項ないし第１３項のいずれかの項記載の製造法。