JP5296531B2 - βグルカン及びマンナンの製造 - Google Patents

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Description

本発明は、β-グルカン/マンナン調製物、及びその製造方法に関する。特に、本発明は、微生物（限定するものではないが酵母を含む）から製造される、β-(1,3/1,6)グルカン及びマンナンを含む調製物に関する。
「グルカン」は、主に又は完全に単糖D-グルコースから構成されるオリゴ糖又は多糖を指す一般名称である。グルカンは天然に広く分布し、特に細菌、酵母及び植物細胞の構造的完全性の維持におけるその役割が重要である。例えば、グルカンは、他の多糖（マンナン及びキチンなど）との組合せにより、細胞壁の形状及び機械的強度に関与する。グルカンは、これらの細胞において、典型的には細胞壁の重量の約40％〜50％を占める。
D-グルコースのポリマーとして、D-グルコース単位は様々な様式で互いに連結することができる。例えば、(1,3)、(1,4)、(1,6)及び(1,2)結合（グルコシド結合）を有するグルカンは全て公知である。グルカンが通常は高度に分岐した化合物であることはこの様々な結合により説明できる。この個々のグルコース単位が結合することができるかなり可変的な様式、及び親分子の全体的な立体形状の結果として多くの形態を生じ得る。一般的なグルカンはβ-(1,3)-結合型グルコピラノース（一般的にβ-グルカンと称する）である。様々な種の細胞壁は、β-(1,6)-結合型グルコピラノースと連結したβ-(1,3)-結合型グルコピラノースを含む。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞壁は、主にβ-(1,3)-結合型グルコース単位の骨格であるβ結合型グルカンからなり、β-(1,6)-結合を介して分岐する分子間及び分子内の少数成分を含む。
これらの化学的特性のため、グルカンは化学、食品及び医薬産業における広範な使用が見出されている。例えば、これらは粘性付与剤、乳化剤、繊維、フィルム、コーティング物質、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル電気泳動用の支持体、細胞培養培地、フィルターパッド、及びセメントに有用であり得る。これらはまた、食品増粘剤及び食物繊維源、並びに医薬製品中の担体及びコーティング剤として広く使用されている。グルカンはヒト及び動物において免疫薬理学的活性を有することが示されている。例えば、病原微生物に対する強力な免疫刺激及び保護が、エビ、魚、家禽、ブタ、ウシ、ウサギ、マウス、ラット及びヒトにおいて証明されている。酵母β-グルカンは、Toll様レセプターDectin-1との相互作用を介して、脊椎動物及び無脊椎動物の先天性（非特異的）免疫応答を刺激することができる。かかる結合は、マクロファージにおいて活性酸素種の産生を刺激し、その食菌作用及び微生物の殺害を増強する。これらの刺激された免疫細胞はまた、動物体内を循環することができ、他の免疫細胞と相互作用して動物の免疫状態を増強できるサイトカインを産生する。
酵母及び他の生物からのβ-グルカンの精製は広く調査されており、多くの方法が知られている。これらの多くは、アルカリ又は有機溶媒にβ-(1,3)-グルカンが不溶性であることを利用する。主な公知の方法は(a)濃縮した水酸化ナトリウムによる高温抽出に続く酸による高温抽出及びエタノールによる沈殿である(例えば、非特許文献１、Jamas, S.ら特許文献1、特許文献2及び特許文献3参照)。これらのプロトコールの多くは、酵母細胞の事前のホモジネーションが必要であり、多くは（b）自己消化又は濃縮フェノール：水(1:1)による酵母の酵素分解から生じる酵母細胞壁調製物の抽出（例えばTruscheit, E.らによる特許文献4参照）、及び(c)有機溶媒（イソプロパノール、エタノール、アセトン又はメタノールなど）を単独で又はアルカリの存在下で用いた抽出（例えば特許文献5参照）、の各抽出ステップの複数回の反復が必要である。酸処理はグルカン材料中のβ-(1,6)-結合数を低減する（その結果、粘性を増加する）ことが知られている。
マンナンはマンノース単位からなるポリマーである。酵母において、マンナンは酵母細胞壁の外表面（セン類（muscigenous）多糖として）、及び内部細胞膜中のタンパク質と結合している。マンナンは一般的に細胞壁の乾燥重量の約20〜50％を占める。マンナンはオリゴマー又はポリマーとしてコアペプチド鎖に結合する。この複合体は約5〜50％のタンパク質を含む。オリゴマーのマンナンはセリン及びトレオニンと直接結合するが、ポリマーのマンナンはN-アセチルグルコサミンを介してアスパラギンと結合する。マンノース-タンパク質複合体において、マンノース単位はα-1,6、α-1,2及びα-1,3-結合によって結合する。
マンナン-オリゴ糖（MOS）は、タンパク質分解作用によって酵母細胞壁から解離させることができる。解離したMOSは、腸管の細菌性病原体に効果的に結合して、腸管にコロニー形成する該病原体の能力をブロックする。例えば大腸菌(E.coli)、サルモネラ・エスピーピー（Salmonella spp.）及びビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）は、その表面（レクチン）上に、MOSのマンノース糖残基と特異的に結合するタンパク質を有する。
米国特許第4,810,646号 米国特許第5,028,703号 米国特許第5,250,436号 米国特許第4,138,479号 ヨーロッパ特許出願公開第515216号 Manners, D. J.ら, Biochem. J. 135 19-30 (1973)
グルカンの多くの応用及び用途を考慮すれば、当該技術分野において、高濃度のアルカリ又は酸の使用、並びに高温の使用を回避し、グルカン及びマンナンの回収を改善し、かつ生物学的に有用な調製物を生じさせる、β-グルカン/マンナンの抽出方法に関する明らかなニーズが存在する。
一実施形態では、本発明は、酵母細胞を自己消化させて酵母細胞壁を解離させるステップと、酵母細胞壁を外因性プロテアーゼと共にインキュベートするステップと、酵母細胞壁をグルカンに富む成分とマンナンに富む成分とに分けるステップと、マンナンに富む成分を限外濾過して濾液と保持液とを生じさせるステップとを用いた、酵母細胞の処理方法を提供する。
別の態様では、本発明は、酵母細胞を40℃〜65℃の温度で自己消化させて酵母細胞壁を解離させるステップと、酵母細胞壁を外因性プロテアーゼと共にpH 9〜10でインキュベートするステップと、プロテアーゼ処理した細胞壁を酵素（アミラーゼ、リパーゼ又はその組合せ等）と共にインキュベートするステップとを用いた、酵母細胞の処理方法を提供する。
別の態様では、本発明はα-マンナンを含む組成物であって、全α-マンナンの少なくとも85％(w/w)が10,000Da以上の分子量を有する、前記組成物を提供する。
本発明の他の実施形態は、本発明の方法によって製造したグルカン又はマンナンを含む動物飼料、食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品を含む。
一実施形態では、本発明はβ(1,3)及びβ(1,6)グルカンに富む不溶性細胞壁調製物と、マンナンに富む可溶性画分とを製造する方法を提供する。本発明による方法は、細胞壁源、例えば酵母（ビール酵母又はパン酵母など）、の自己消化ステップと、その後の酵素消化ステップとを含む。一態様では、酵素消化は高pHプロテアーゼを用いて実施する。別の態様では、酵素消化は酵素の組合せ（高pHプロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ及び/又はリパーゼなど）を用いて実施する。一実施形態では、酵素消化は高pHプロテアーゼと、その後の1以上の他の酵素（アミラーゼ、グルコアミラーゼ及び/又はリパーゼなど）を用いて実施する。
別の実施形態では、本発明はβ(1,3)及びβ(1,6)グルカンに富む細胞壁調製物を提供し、別の実施形態では、マンナンに富む可溶性画分を提供する。
本発明の他の態様は、詳細な説明及び添付の図面を考慮することによって明らかになるだろう。
本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、以下の記載に示されるか又は図面で例示される成分及び成分配合の詳細に制限されないと理解されるべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実行又は実施することができる。また、本明細書で使用される言い回し及び用語は、説明を目的としており、限定とみなすべきではないことも理解されるべきである。本明細書中の「含む(including)」、「含む(comprising)」、又は「有する(having)」及びこれらの変形は、その後に列挙する項目及びその同等物、並びに追加の項目を包含することを指す。
また、本明細書で詳述される任意の数値範囲は、下限値から上限値までの全ての値を含むものと理解される。例えば、濃度範囲が1％〜50％と記述される場合は、2％〜40％、10％〜30％又は1％〜3％などの値が本明細書に明確に示されていることを意図する。これらは具体的に何を意図しているかについての例に過ぎず、列挙された最低値と最高値との間の数値の可能な全ての組み合わせも本願において明確に示されたものとして考慮されるべきである。
特に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件及びその他を表す全ての数は、全ての場合に「約」という用語によって修飾されているものと理解されたい。したがって、それとは反対に示されていない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、特許請求の範囲の同等物の原則の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、慣用の四捨五入技術を適用することによって解釈すべきである。
本発明の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメーターは近似値であるにも関わらず、具体的な実施例で記載された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、その各試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じるいくらかの誤差を本質的に含む。
β-グルカン/マンナン調製物は、わずかに酸性/ほぼ中性のpHで、適度の上昇温度のみで、単純な自己消化処理を用いて微生物（酵母など）から調製することができる。自己消化後、酵素消化を行う。一実施形態では、酵素ステップは高pHプロテアーゼ（例えばGenencore Internationalから入手可能なProtex 6L又はバチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenformis）由来）を、典型的には約0.05〜1重量％、アルカリpH、及び上昇温度で利用する。
β-グルカン/マンナンの供給源として適当な酵母種として、これに限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母株及びビール酵母株を含む）、クルイベロミセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、及びカンディダ（Candida）株（カンディダ・ユティリス（Candida utilis）など）の酵母株、並びにそれらの組合せが挙げられる。β-グルカン/マンナンの適当な供給源である他の酵母株として、これに限定されるものではないが、サッカロミセス・デルブルエキ（Saccharomyces delbruekii）、サッカロミセス・ロゼイ(Saccharomyces rosei)、サッカロミセス・ミクロエルリプソイデス(Saccharomyces microellipsodes)、サッカロミセス・カールスバーゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・ポリスポルス(Kluyveromyces polysporus)、カンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンディダ・クロアカエ(Candida cloacae)、カンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンディダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、ハンセヌラ・ウィンゲイ(Hansenula wingei)、ハンセヌラ・アルニ(Hansenula arni)、ハンセヌラ・ヘンリッキー(Hansenula henricii)、ハンセヌラ・アメリカーナ（Hansenula Americana）及びそれらの組合せが挙げられる。これらの酵母株は、回分発酵又は連続発酵のいずれかによって食品グレードの栄養素中での培養を用いて製造することができる。
これに限定されるものではないが、細菌、真菌及び植物（例えば単細胞藻類）を含む他の多くの微生物種が、β-グルカン/マンナンの供給源として当該技術分野で報告されている。β-グルカン及び/又はマンナンの供給源として本発明に有用であり得る他の微生物として、これに限定されるものではないが、アルカリゲネス属(Alkaligenes)、特にアルカリゲネス・フエカリス・バール・ミクソゲネス(Alkaligenes faecalis Var. mixogenes)(ATCC-21680)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、セルロモナス属(Cellulomonas)（ATCC 21399及びセルロモナス・フラビゲナ(Cellulomonas flavigena)(ATCC 53703)）、及びペスタロチア属(Pestalotia)などの細菌；例えばアウレオバシジウム属(Aureobasidum)(アウレオバシジウム・プルランス(Aureobasidum pullulans)IFO446株及びアウレオバシジウム(Aureobasidum)K-1種(FERM P1289)など)、アガリクス属(Agaricus)、レンティヌス属(Lentinus)、プレウロタス・オストレアタス(Pleurotus ostreatus)、マクロホモプシス属(KOB55株など)などの真菌；ガノデルマ属(Ganoderma)、シゾフィラ属(Schizophylla)、ファチマ・ホエレン(Fachyma hoelen)、ペスタロティア属(Pestalotia)、コリオルス属(Coriolus)、並びにこれらの組み合わせが含まれる。非微生物（植物など）もβ-グルカン及び/又はマンナンの供給源として本発明において有用であり得る。
特に、本発明による処理は、β-(1，3)-及びβ-(1，6)-グルカン含量及びマンナン含量に富む細胞壁調製物の作製に関し、これに限定されるものではないが、酵母を含む微生物から製造される。例示的な実施形態では、この処理は、酵母、例えばビール酵母（典型的には7％〜18％、詳細には10％〜17％、より詳細には8％〜12％又は13％〜16％の固体スラリー）の自己消化の第1ステップを含む。自己消化は少なくとも4、詳細には少なくとも4.5、そしてより詳細には少なくとも5のpHで適切に実施することができる。自己消化は8未満、詳細には7未満、そしてより詳細には6未満のpHで適切に実施することができる。自己消化を実施するための温度は、少なくとも30℃、詳細には少なくとも35℃、より詳細には少なくとも40℃、より詳細には少なくとも45℃が適当であり得る。自己消化を実施するための温度は、55℃未満、詳細には52℃未満、より詳細には50℃未満が適当であり得る。自己消化は、少なくとも10時間、詳細には少なくとも16時間、より詳細には少なくとも24時間実施するのが適当であり得る。自己消化は、100時間未満、詳細には48時間未満、より詳細には36時間未満で実施するのが適当であり得る。次いで、適切には遠心分離によって、酵母を分離して、抽出物及び低β-グルカン含量の細胞壁ストリーム(stream)を製造する。次のステップでは、これに限定されるものではないがプロテアーゼ（例えばアルカリプロテアーゼ）を含む酵素により、少なくとも8.5、詳細には少なくとも9、より詳細には少なくとも9.2のpHで細胞壁ストリームを処理する。pHは10.5未満、詳細には10未満、より詳細には9.8未満が適当であり得る。プロテアーゼ処理は、少なくとも45℃、詳細には少なくとも50℃、より詳細には少なくとも53℃の温度で実施することが適当であり得る。プロテアーゼ処理は、70℃未満、詳細には65℃未満、より詳細には60℃未満、より詳細には57℃の温度で実施することが適当であり得る。プロテアーゼ処理は、少なくとも5時間、詳細には少なくとも8時間、より詳細には少なくとも10時間、より詳細には少なくとも12時間実施することが適当であり得る。プロテアーゼ処理は、48時間未満、詳細には36時間未満、より詳細には24時間未満、より詳細には18時間未満で実施することが適当であり得る。次いで、第2生成物を遠心分離によって分離してマンナン(α-マンナン)に富む抽出物と、β-グルカンに富む細胞壁生成物とを製造する。その後、このβ-(1，3/1,6)細胞壁生成物を乾燥、例えばスプレー乾燥し、この生成物を凝集させて約100〜300ミクロン以上の粒子を製造する。その後、マンナン抽出物を10,000分子量限外濾過に供してマンナンに富む高分子量保持液を産出する。
上記の例示的な処理を、図1のフローチャートに示す。生酵母は、酵母の内因性酵素が一部の酵母マクロ分子を破壊し、可溶化する処理で自己消化に供される。可溶性抽出物は遠心分離によって不溶性酵母細胞壁から分離される。次いで、細胞壁を高pHプロテアーゼで処理して、細胞壁からさらにタンパク質を除去し、その後、細胞壁タンパク質に接着するマンナンをも除去する。β-グルカンに富む細胞壁は、その後、遠心分離によって第2抽出物から分離する。高分子量であるマンナンは、第2抽出物を10,000Da限外濾過装置を通過させることによってさらに精製及び濃縮することができる。
別の実施形態では、この処理は酵母、例えばビール酵母（典型的には8％〜12％の固体スラリー）の自己消化の第1ステップを含む。自己消化は、少なくとも4、詳細には少なくとも4.5、より詳細には少なくとも5のpHで適切に実施する。pHはまた、8未満、詳細には7未満、より詳細には6未満が適当であり得る。自己消化を実施するための温度は、少なくとも30℃、詳細には少なくとも40℃、より詳細には少なくとも45℃が適当であり得る。温度はまた、55℃未満、詳細には53℃未満、より詳細には50℃未満が適当であり得る。自己消化は、少なくとも10時間、詳細には少なくとも16時間、より詳細には少なくとも24時間で適切に実施し得る。自己消化は100時間未満、詳細には48時間未満、より詳細には36時間未満で適切に実施し得る。次いで、適切には遠心分離によって、酵母を分離して、抽出物及び低β-グルカン含量の細胞壁ストリームを製造する。次のステップでは、酵素により細胞壁ストリームを処理する。酵素ステップは、最初に高pHプロテアーゼをアルカリpH、例えば少なくとも8.5、詳細には少なくとも9、より詳細には少なくとも9.2のpHで利用する。pHはまた、10.5未満、詳細には10未満、より詳細には9.8未満が適当であり得る。プロテアーゼ処理は、少なくとも45℃、詳細には少なくとも50℃、より詳細には少なくとも53℃の温度で適切に実施し得る。プロテアーゼ処理は、70℃未満、詳細には65℃未満、より詳細には60℃未満、より詳細には57℃未満の温度で適切に実施し得る。プロテアーゼ処理は、少なくとも5時間、詳細には少なくとも8時間、より詳細には少なくとも10時間、より詳細には少なくとも12時間で適切に実施し得る。プロテアーゼ処理は、48時間未満、詳細には36時間未満、より詳細には24時間未満、より詳細には18時間未満で適切に実施し得る。プロテアーゼ酵素ステップ後、グルコアミラーゼ(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)種由来)、アミラーゼ(例えば、バチルス・サブチリス(Bacillus subtili)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)由来のα-アミラーゼ；アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はリゾプス属(Rhizopus)糸状菌由来のアミログルコシダーゼ)、及び/又はリパーゼ（例えば、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)、カンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)及びムコル・ジャバニクス(Mucor javanicus)由来のリパーゼ；典型的には約0.05〜1重量％）とインキュベートする。グルコアミラーゼ、アミラーゼ及び/又はリパーゼとのインキュベーションは、中性からわずかに酸性のpH及び上昇温度で適切に実施する。例えば、このpHは、少なくとも3.5、詳細には少なくとも4、より詳細には少なくとも4.5以上の範囲が適当であり得る。このpHはまた、7未満、詳細には6未満、より詳細には5.5未満の範囲が適当であり得る。グルコアミラーゼ、アミラーゼ及び/又はリパーゼとのインキュベーションを実施するための温度は、少なくとも40℃、詳細には少なくとも45℃、より詳細には少なくとも50℃、より詳細には少なくとも53℃以上の範囲が適当であり得る。この温度はまた、70℃未満、詳細には65℃未満、より詳細には60℃未満、より詳細には58℃未満の範囲が適当であり得る。特にプロテアーゼ、アミラーゼ又はリパーゼが耐熱性酵素である場合には、少なくとも60℃、少なくとも65℃、少なくとも70℃、少なくとも75℃、少なくとも80℃、少なくとも85℃、又は少なくとも90℃の温度で適切に使用し得る。アルカリプロテアーゼとのインキュベーション後、グルコアミラーゼ及びリパーゼの組合せ、アミラーゼ及びリパーゼの組合せ、又はグルコアミラーゼ、アミラーゼ及びリパーゼの組合せ、とのインキュベーションを実施することができる。
上記の例示的な処理は図2のフローチャートに示される。図2に記載の処理では、生酵母を、酵母の内因性酵素が一部の酵母マクロ分子を破壊し、可溶化する処理で自己消化に供する。自己消化からの細胞壁は、最初に、高pHプロテアーゼにより処理する。高pHプロテアーゼとのインキュベーションは、約10〜16時間、50℃〜65℃の温度で適切に実施する。次いで、細胞壁をアミラーゼ(又は他のグルカナーゼ)又はリパーゼ、或いはアミラーゼとリパーゼの組合せで処理する。アミラーゼ及び/又はリパーゼとのインキュベーションは、約4〜10時間、4〜7のpH及び50℃〜65℃の温度で適切に実施する。アミラーゼは細胞壁に依然として残存し得るグリコーゲンなどの残存のα-グルカンを消化することができる。リパーゼは、脂質及び脂肪に富む細胞壁膜を分解することができる。次いで、細胞壁ストリームを遠心分離によって分離して、マンナンに富む第2抽出物、及びβ-グルカンに富む細胞壁生成物を製造することができる。細胞壁生成物は乾燥、例えばスプレー乾燥することができる。第2マンナン抽出物を、限外濾過装置（10,000Da限外濾過装置、50,000Da限外濾過装置、又は100,000Da限外濾過装置など）を通過させて保持液のマンナン含量を富化することができる。
本発明の調製物は、これに限定されるものではないが、凍結乾燥、ローラードラム乾燥、オーブン乾燥、スプレー乾燥、リング乾燥(ring drying)、及びそれらの組合せ、並びに/又は製膜装置を用いた乾燥を含む、適当な処理のいずれかによって乾燥することができ、更なる処理なく使用してもよいし、又は適当な技術のいずれかを用いて粉砕してもよい。
適切には、高pHプロテアーゼは7を超えるpHで最適なタンパク質分解活性を有することができる。適当なプロテアーゼとして、これに限定されるものではないが、アクチニディア・チネンシス(Actinidia chinensis)、アナナス・コモスス(Ananas comosus)、アスペルギルス・エスピーピー(Aspergillus spp.)(例えばA.ニガー(A. niger)、A.ニガー・バール・アワモリ(A. niger var. awamori)、A.オリザエ(A. oryzae)、A.ソヤ(A. sojae)、A.メレウス(A. melleus))、バチルス・エスピーピー(Bacillus spp.)(例えば、B.サブチリス(B. subtilis)、B.アルカロフィルス(B. alcalophilus)、B.アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.レンツス(B. lentus)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.ステアモサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.サーモプロテオライティクス(B. thermoproteolyticus))、カリカ・パパイヤ(Carica papya)、クリフォネクトリア・パラシティカ(Cryphonectria parasitica)、エンドティア・パラシティカ(Endothia parasitica)、フィクス・グラブラータ(Ficus glabrata)、クリヴェロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ペニシリウム・シトリウム(Penicillum citrinum)、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)、リゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)から取得されるもの、子ウシ、ヤギ、又は雄ウシの胃、或いはブタの膵臓由来のもの、並びにこれらの組合せが挙げられる。適当なプロテアーゼとして、これに限定されるものではないが、サブチリシンCarlsberg、サブチリシンBPN'、サブチリシンNovo、サブチリシン309、サブチリシン147及びサブチリシン168、AlcalaseTM、Savinase TM、Primase TM 、Duralase TM、Durazym TM、Esperase TM及びKannase TM(Novo Nordisk A/Sから入手可); Maxatase TM、Maxacal TM、Maxapem TM、Optimase TM、Properase TM、Purafect TM、Purafect OxP TM、FN2 TM、及びFN3 TM(Genencor International Inc.から入手可);及びValidaseTM AFP、ValidaseTM FP Concentrate、ValidaseTM FP 500、ValidaseTM FP II、ValidaseTM TSP Concentrate、Alkaline Protease Concentrate、Bromelain(Valley Research(South Bend, IN)から入手可)などの市販の酵素、並びにこれらの組合せが挙げられる。
適当なアミラーゼとして、植物、動物、細菌又は真菌起源のもの、及びこれらの組合せが挙げられる。アミラーゼとして、これに限定されるものではないが、バチルス・エスピーピー(例えば、B.リケニホルミス(B. licheniformis)、B.アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.サブチリス(B. subtilis)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus))、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニガー・バール・アワモリ(Aspergillus niger var. awamori)、ミクロバクテリウム・インペリアル(Microbacterium imperiale)、サーモモノスポラ・ビリディス(Thermomonospora viridis)、大麦麦芽(Hordeum spp.)、ブタの膵臓(Sus spp.)から得られるグルコアミラーゼ又はα-アミラーゼ、及びこれらの組合せが挙げられる。有用なアミラーゼの例として、これに限定されるものではないが、Glucoamylase Concentrate、DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM及びBANTM(Novo Nordisk A/Sから入手可); RapidaseTM及びPurastarTM(Genencor International Inc.から入手可);並びにValidaseTM BAA、ValidaseTM HT340L、ValidaseTM FAA、ValidaseTM AGS、ValidaseTM GA、ValidaseTM RGA (Valley Research(South Bend, IN)から入手可)、並びにこれらの組合せが挙げられる。アミラーゼは、少なくとも0.001％、詳細には少なくとも0.01％、より詳細には少なくとも0.02％の終濃度で適切に使用することができる。アミラーゼは、0.1％未満、詳細には0.05％未満、より詳細には0.1％未満の終濃度で適当に使用することができる。
本発明に有用なリパーゼとして、これに限定されるものではないが、ヒュミコラ(Humicola)(サーモマイセス(Thermomyces)と同義)由来（例えばH.ラヌギノーサ(H. lanuginose)(T.ラヌギノーサ(T. lanuginosus))、H.インソレンス(H. insolens)由来）のリパーゼ、シュードモナス(Pseudomonas)のリパーゼ(例えばP.アルカリゲネス(P. alcaligenes)又はP.シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)、P.セパシア(P. cepacia)、P.スタツェリ(P. stutzeri)、P.フルオレセンス(P. fluorescens)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp)SD 705株、P.ウィスコンシネンシス(P. wisconsinensis)由来)、バチルス(Bacillus)のリパーゼ（例えばB.サブチリス(B. subtilis)、B.ステアロサーモフィリス(B. stearothermophilus)又はB.プミルス(B. pumilus)(WO 91/16422)由来）;アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、カンディダ・リポリティカ(Candida lipolytica)、カンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus)、ペニシリウム・ロクエフォルティ(Penicillum roqueforti)、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)、リゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)、リゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)、リゾプス・オリザ(Rhizopus oryzae)、リゾプス・アリツス(Rhizopus arrhizus)由来のリパーゼ、及びこれらの組合せが挙げられる。市販のリパーゼ酵素として、これに限定されるものではないが、LipolaseTM及びLipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)、並びにFungal Lipase 8000及びPancreatic Lipase 250(Valley Research(South Bend, IN)から入手可)が挙げられる。
酵母細胞の自己消化から生じる生成物はまた、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の少なくとも20％、詳細には少なくとも23％、より詳細には少なくとも25％のタンパク質を含む。この生成物はまた、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の45％未満、詳細には40％未満、そしてより詳細には35％未満のタンパク質を含む。酵母細胞の自己消化から生じる生成物は、乾燥固体ベースで総生成物の少なくとも20％、詳細には少なくとも23％、より詳細には少なくとも25％の総グルカンを含む。この生成物はまた、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の45％未満、詳細には40％未満、より詳細には35％未満の総グルカンを含む。
酵母細胞の自己消化により生じる生成物は、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の少なくとも5％、詳細には少なくとも7％、より詳細には少なくとも10％のα-グルカンを含む。この生成物はまた、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の20％未満、詳細には18％未満、より詳細には15％未満のα-グルカンを含む。酵母細胞の自己消化により生じる生成物は、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の少なくとも7％、詳細には少なくとも10％、より詳細には少なくとも12％のβ-グルカンを含む。この生成物はまた、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の22％未満、詳細には20％未満、より詳細には18％未満のβ-グルカンを含む。酵母細胞の自己消化により生じる生成物は、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の少なくとも5％、詳細には少なくとも7％、より詳細には少なくとも10％のマンナンを含む。この生成物はまた、適切には、乾燥固体ベースで総生成物の20％未満、詳細には18％未満、より詳細には15％未満のマンナンを含む。
β-(1,3/1,6)グルカン産物に富む細胞壁生成物は、例えば、20％未満、15％未満又は10％未満のタンパク質含量を含む、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％又は少なくとも65％のβ-(1,3/1,6)グルカンとして特徴付けられる。マンナンに富む生成物(二次マンナン抽出物)は、少なくとも50％、詳細には少なくとも55％、より詳細には少なくとも57％のマンナンを含むものとして特徴付けることができる。マンナンに富む生成物はまた、70％未満、詳細には68％未満、より詳細には65％未満のマンナンを含むものとして特徴付けることもできる。マンナンに富む生成物（二次マンナン抽出物）はまた、少なくとも25％、詳細には少なくとも27％、より詳細には少なくとも29％のタンパク質を含むものとして特徴付けることができる。マンナンに富む生成物はまた、35％未満、詳細には32％未満、より詳細には30％未満のタンパク質を含むものとして特徴付けることもできる。
限外濾過ステップは、本明細書に記載の処理から製造される抽出物（二次マンナン抽出物など）を、圧力下で限外濾過装置に通すことによって実施することができる。適切には、限外濾過装置は1つ以上の半透膜を備える。半透膜又は限外濾過装置は、例えば、少なくとも8,000Da、詳細には少なくとも10,000Da、より詳細には少なくとも25,000Da、より詳細には少なくとも50,000Da、より詳細には少なくとも100,000Da、そしてより詳細には少なくとも150,000Daの分子量カットオフを有することができる。限外濾過装置は本明細書で列挙された分子量の間の任意の値の分子量カットオフ（これに限定されるものではないが、少なくとも15,000 Da、20,000 Da、30,000 Da、40,000 Da、60,000 Da、70,000 Da、80,000 Da、90,000 Da、110,000 Da、120,000 Da、130,000 Da及び140,000 Daの分子量カットオフを含む）を有することができると理解されるべきである。適当な限外濾過膜として、これに限定されるものではないが、A/G Technology Corp(Needham, MA)から入手可能な中空繊維膜が挙げられる。
二次マンナン抽出物のろ過後の保持液中の総二次マンナンの少なくとも80％(w/w)、詳細には少なくとも85％(w/w)、より詳細には少なくとも90％(w/w)は、使用する濾過装置の分子量カットオフを上回る分子量を有することができる。例えば、10,000Daカットオフを二次マンナン抽出物に使用する場合、典型的には、保持液中の総マンナンの少なくとも80％(w/w)、詳細には少なくとも85％(w/w)、より詳細には少なくとも90％(w/w)が10,000Daを上回る分子量を有することができる。50,000Daカットオフを二次マンナン抽出物に使用する場合、典型的には、保持液中の総マンナンの少なくとも80％(w/w)、詳細には少なくとも85％(w/w)、より詳細には少なくとも90％(w/w)が50,000Daを上回る分子量を有することができる。100,000Daカットオフを二次マンナン抽出物に使用する場合には、典型的には、保持液中の総マンナンの少なくとも80％(w/w)、詳細には少なくとも85％(w/w)、より詳細には少なくとも90％(w/w)が100,000Daを上回る分子量を有することができる。150,000Daカットオフを二次マンナン抽出物に使用する場合には、典型的には、保持液中の総マンナンの少なくとも80％(w/w)、詳細には少なくとも85％(w/w)、より詳細には少なくとも90％(w/w)が150,000Daを上回る分子量を有することができる。
限外濾過ステップは、場合により、マンナン抽出物を2以上の異なる分子量カットオフの限外濾過装置を通過させることを含むことができる。最終保持液は、大部分のマンナンが限外濾過装置の分子量カットオフ間の範囲にある分子量を有する、マンナンに富む生成物を含む。この実施形態では、適切には、最終保持液の総マンナンの少なくとも80％(w/w)、詳細には少なくとも85％(w/w)、より詳細には少なくとも90％(w/w)が、限外濾過装置の分子量カットオフ間の分子量を有することができる。
自己消化した細胞壁の酵素処理後のグルカンに富む生成物からの分離により生じる二次マンナン抽出物は、例えば、15％〜50％のマンナン、20％〜30％のタンパク質、及び20％〜25％の他の成分によって特徴付けられる。二次マンナン抽出物を本発明の方法に従って限外濾過するとき、保持液は少なくとも50％、詳細には少なくとも52％、より詳細には少なくとも55％、より詳細には少なくとも60％のマンナンを含むことができる。保持液は、70％未満、詳細には65％未満、より詳細には62％未満のマンナンを含むことができる。保持液はさらに、少なくとも10％、詳細には少なくとも12％、より詳細には少なくとも15％、より詳細には少なくとも17％のタンパク質を含むことができる。保持液はさらに、33％未満、詳細には少なくとも30％未満、より詳細には22％未満のタンパク質を含むことができる。
本発明に基づく調製物は、例えば、食品サプリメント、医薬（例えば免疫応答を改善する）、化粧品、動物飼料及び栄養補助食品において価値のあるものとして考慮される。例えば動物飼料は、適切には、飼料1kg当たり1〜10gの調製物を含むことができる。適切には、この調製物は、重量/重量ベースで、試料の総重量の、少なくとも0.01％、詳細には少なくとも0.02％、より詳細には少なくとも0.05％、より詳細には少なくとも0.1％で、かつ5％未満、詳細には2％未満、より詳細には0.5％未満で含むことができる。適当な動物飼料として、これに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ブタ、家禽、魚（例えば甲殻類、甲殻動物）、トリ及びペット（例えばネコ、イヌ）の飼料が挙げられる。液体組成物は、本発明に基づく調製物の0.1重量％〜1重量％を含むことができる。本発明に基づく調製物は、農業上許容し得る担体、及び場合により農業上許容し得る栄養素、除草剤又は殺虫剤と共に、植物保護組成物において使用することもできる。
例えば、本発明に従って作製したβ-グルカンに富む画分は、適切には、動物及びヒトの食品における免疫刺激剤、医薬又は皮膚軟化剤、コレステロールを低減するための薬剤、並びに食品及び飲料における増粘剤として使用することができる。皮膚軟化剤、ローション又はクリームに添加する場合、及びある症状を治療するために使用する場合は、βグルカンは、適切には、少なくとも0.05％、詳細には少なくとも0.1％、より詳細には少なくとも0.5％で、かつ、10％未満、詳細には5％未満、より詳細には2％未満の濃度（w/w）提供することができる。適切には、本発明に従って作製されるβ-グルカン画分は、例えばクリーム、ローション又は皮膚軟化剤に組み込むことによって、湿疹を治療するために使用することができる。湿疹は、アトピー性皮膚炎（「アトピー性湿疹」）を含む、様々な炎症性の皮膚症状を包含し、これは小児期に世界人口の約10％〜約20％を冒す。湿疹は、身体の免疫系の異常な応答であると考えられる。
本発明に従って作製されるマンナンに富む生成物に関する非常に多くの用途が存在する。例えば、マンナン生成物は動物飼料産業において使用することができ、これは好都合にはマイコトキシン、さらには病原性細菌にも結合する能力を有し、細菌が腸管にコロニー形成することを防止する。
簡単に言うと、本発明は、特に、比較的穏やかな処理条件の処理を利用して、β-グルカン及びマンナンに富む調製物を提供する。
本発明の様々な特徴及び態様を下記の実施例で示す。
実施例１：高pHプロテアーゼを用いた酵母の処理
商業用自己消化ビール酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））からの細胞壁画分31.1kgを、ジャケット付きステンレス製容器中で55℃まで加熱した。全固形分は10.7％であり、該固形分中のタンパク質の全割合は24.5％であった。pHを水酸化ナトリウムで9.5まで上昇させ、0.1％(総重量ベース)のProtex 6L（アルカリプロテアーゼ、Genencor(Palo Alto, CA)から入手可）を添加した。細胞壁を55℃で16時間攪拌した。Protex 6Lを85℃で30分間加熱不活性化し、細胞壁をAlpha Laval Gyroモデルの円筒型遠心分離機により、継続的なデカンティング処理を用いて分離した。不溶性細胞壁画分を除去した抽出物と等量の水で3回洗浄した。洗浄した細胞壁画分を15.4％の固形分まで濃縮し、pHを塩酸で7.0に調整し、画分をスプレー乾燥した。Protex 6L処理からの抽出物（図1に示す2°抽出物に対応する）の一部を28.3％固形分まで濃縮し、pHを7.0に調整し、抽出物をスプレー乾燥した。2°抽出物の残存物をUFP-10-C-6A 10,000 NMWC中空繊維膜（A/G Technology Corp（Needham, MA）から入手可）を用いて限外濾過した。マンナンに富む高分子量の保持液をpH7.0に調整し、スプレー乾燥した。3°抽出物（濾液）をpH7.0に調整し、濃縮し、スプレー乾燥した。
この処理によって生じた生成物の組成は、以下の技術を用いて分析した。即ち、タンパク質は、LECOタンパク質測定機(LECO Corp., St. Joseph, MI)を用いて測定した；全グルカン、α-グルカン及びβ-グルカンはMegazyme International Mushroom及びYeast Beta-glucanキット(Megazyme International（Wicklow, Ireland）から入手可)を用いて測定した；マンナンは、炭水化物の酸加水分解と遊離マンノースについての結合分光学的アッセイ（ヘキソキナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ及びホスホマンノースイソメラーゼを用いる）とによって測定した；脂肪は、Blich, E.G.及びDyer, W.J.（Can. J. Biochem. Physiol. (1959) 37, 911）のメタノール-クロロホルム抽出法を用いて測定した;遊離グルコースは、Yellow Springs Instruments Biochemistry Analyzer (YSI Incorporated（Yellow Springs, OH）から入手可)を用いて測定した。これらの分析結果を表1に示す。
Figure 0005296531
実施例2：高pHプロテアーゼ及びグルコアミラーゼを用いた酵母の処理
ビール酵母抽出物の製造工程からの16,000galの細胞壁クリームを55℃まで加熱し、pHを水酸化ナトリウムで9.5に調整した。Protex 6Lを0.1％(v/v)で添加し、混合物を55℃で14時間保持した。pHをHClでpH5.0まで低下させた。pH5でProtex 6Lは不活化され、添加した酵素は破壊されない。Glucoamylase Concentrate（Valley Research（South Bend, IN）から入手可）を0.0175％（重量：総重量）で添加した。温度を55℃で4時間保持した後、88℃まで上昇させて酵素を不活化した。加熱した物質をWestfalia円筒型分離機（Westfalia Separator, Inc.（Northvale, NJ）から入手可）で分離した。抽出物（図2で2°抽出物として示される）の大部分を濃縮し、スプレー乾燥した。2°抽出物の一部をUFP-10-C-6A 10,000 NMWC 中空繊維膜(A/G Technology Corp(Needham, MA)から入手可)を用いて限外濾過した。保持液及び濾液を濃縮し、スプレー乾燥した。スプレー乾燥した生成物を実施例1に記載の技術に従って分析した。結果を表2に示す。細胞壁画分を遠心分離によって水洗浄し、濃縮し、凍結乾燥した。
Figure 0005296531
実施例2の処理において添加したグルコアミラーゼの有効性は、表1及び2のデータを比較する際に見出すことができる。実施例2の処理では、限外濾過後の保持液及び濾液中でα-グルカンは検出可能ではなかった。また、表2に示すように、実施例2の処理からの2°及び3°抽出物は、表1に示す実施例1の2°及び3°抽出物に比較して、より高いレベルの遊離グルコースを有した。
実施例3：自己消化した酵母細胞壁に異なる順序で添加するグルコアミラーゼ及び高pHプロテアーゼを用いた酵母の処理
2つのジャケット付きステンレス製の各容器に、酵母細胞が自己消化に供された商業工程のビール酵母抽出液からの細胞壁25kgを添加した。固形分は11.8％であった。両容器を55℃まで加熱した。容器1のpHは、5.0に調整し、Glucoamylase Concentrate(Valley Research(South Bend, IN)から入手可)を0.1％（重量：総重量）で添加した。インキュベーションを14時間継続し、その後、pHを9.5まで上昇させた。次いで、0.10％ Protex 6Lを添加し、インキュベーションを4時間継続した。サンプルを様々な時点で取り上げ、グルコアミラーゼの作用によって放出した遊離グルコースについてアッセイした。
開始時の容器2のpHを9.5まで上昇させ、0.1％ Protex 6L（重量：総重量）を添加した。混合液を55℃で14時間インキュベートした。次いで、pHを5.0まで低下させ、0.1％Glucoamylase Concentrateを0.1％で添加した。インキュベーションをさらに4時間継続した。サンプルを様々な時点で取り上げ、グルコアミラーゼの作用によって放出した遊離グルコースについてアッセイした。表3は、様々な時点での両容器における遊離グルコースのレベルを示す。
Figure 0005296531
表3のデータは、容器1のようにグルコアミラーゼをProtex 6Lの前に添加すると、細胞壁がビール酵母の自己消化後に細胞壁の内側に捕捉される大きな分子量のα-グルカン(グリコーゲン)にグルコアミラーゼが接近して、これを消化することが可能であるように十分改変しないことを示す。対照的に、容器2では、グルコアミラーゼの前にプロテアーゼを添加することは、グルコアミラーゼがα-グルカンに接近してこれを消化し、実質的により多くのグルコースの放出を可能にした。これは容器1中のグルコアミラーゼがpH 5.0で作用する時間(14時間)が、容器2のグルコアミラーゼ(4時間)よりも長い場合に限られない。したがって、ビール酵母細胞壁からのグリコーゲン/α-グルカンの最適な除去のために、アルカリプロテアーゼProtex 6Lはグルコアミラーゼの前に添加すべきである。
実施例4：図2に示す処理によるビール酵母及びパン酵母の処理
商業用自己消化初代培養(primary grown)のパン酵母(15％固形分)又はビール酵母(11.8％固形分)からの細胞壁220gを55℃まで加熱し、pHを9.5に調整した。次いで、細胞壁を0.1％(重量：総重量)Protex 6Lで14時間処理した。14時間後、pHを5.0まで低下させ、0.0175％Glucoamylase Concentrateを各容器に添加した。フラスコを55℃でさらに4時間インキュベートした。遊離グルコースをYSI Biochemistry Analyzerでモニターした。結果を表4に示す。
Figure 0005296531
パン酵母の自己消化から生じた細胞壁は、ビール酵母由来の細胞壁よりもグリコーゲンのレベルが低かった。これは有酸素増殖した初代パン酵母が有酸素増殖したビール酵母よりもβ-グルカンを蓄積し難い傾向があるからである。グルコアミラーゼとのインキュベーション後に、パン酵母細胞壁よりもビール酵母細胞壁からより多くのグルコースが放出された。したがって、図2の処理は、ビール酵母細胞壁由来のβ-グルカンの処理に極めて有効である。
実施例5：動物飼料における抽出物の使用
自己消化したビール酵母細胞：実施例2に従って作製した図2の処理からの2°抽出物（すなわち、プロテアーゼ及びアミラーゼ処理後に取得されるマンナン）の50：50(乾燥固体ベース)ブレンドを、該2成分を乾式混合することによって製剤化した。このブレンドを、離乳後28日間、幼ブタの食餌を補充するために使用した。このブレンドはフェーズ1(0〜7日)の間は食餌1トン当たり3 lbsで、フェーズ2（7〜14日）の間は食餌1トン当たり2 lbs、そしてフェーズ3(14〜28日)の間は食餌1トン当たり2 lbsで添加した。対照及び処理食餌はいずれも抗生物質を含んだ。離乳後のブタ（17〜22日齢）は、体重に基づいて対照食餌又は処理食餌に無作為に割り当てた。各食餌につき13個体のブタを含む6つの仕切りがあった。結果を表5に示す。
Figure 0005296531
処理食餌を摂取したブタは14日目で有意に重く、これらのブタは28日間で体重の増加を示す傾向があった。
実施例6：動物飼料における嗜好性増強剤としての酵母抽出物の使用
イヌ用のキブルを油でコーティングした後、実施例2に従って作製した図2に示す処理からの乾燥3°抽出物（すなわち限外濾過後の濾液）1.0％、又は認可されているイヌの嗜好性増強剤1.0％のいずれかを、油でコーティングしたキブルの表面にスプレーした。1000gの各糧食を1パネル20匹のイヌに2日間与えた。皿の位置を毎日逆にすることにより、「左右の」偏りを防止した。
2日間の期間にわたって各イヌによって摂取された食物の量を表6に示す。表6は、実施例2に従って作製した図2の処理の3°抽出物が、少なくとも標準的な増強剤（palatant）と同等、もしかしたらそれ以上で乾燥イヌ食品の嗜好性を増強したことを示す。
Figure 0005296531
実施例7（予測的）：酵母細胞壁-スプレー乾燥粉末の特徴
高度に精製したサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の細胞壁生成物を実施例2に記載される処理に従って製造する。これは高濃度の(β-1,3/1,6)グルカンを有する。この生成物はFDAによってG.R.A.S. (Generally Recognized as Safe)である。この生成物は、良質な(β-1,3/1,6)グルカンの天然源と共に広範な食品において補充するために使用することができる。この生物学的に活性な物質は、広範な動物の免疫系を刺激することが示されている。この生成物の組成及び特徴を表7に示す。
Figure 0005296531
実施例8（予測的）
ビール酵母細胞壁クリームを131°F(55℃)まで加熱する。pHを50％水酸化ナトリウム(細胞壁クリーム1kg当たり約5ml)で9.5まで上昇させる。Protex 6L（Genecore）を0.1％（量：細胞壁クリームの総重量）まで添加する。混合物を131°Fで14時間保持する。pHを28％HCl（塩酸）で5.0まで低下させ、0.0175％（重量：総重量）Glucoamylase Concentrate (Valley Research)を添加する。混合物を55℃で4時間保持し、その後185〜195°Fまで加熱することによって酵素を熱不活性化する。画分を分離する。β-グルカンに富む不溶性画分をスプレー乾燥する前に、pHを6.5に調整する。β-グルカンに富む不溶性画分をスプレー乾燥する。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces Cerevisiae)の高度に精製した酵母細胞壁生成物を製造する。これは高濃度の(β-1,3/1,6)グルカンを有する。この生成物はFDAによってG.R.A.Sである。この生成物は、良質の(β-1,3/1,6)グルカンの天然源と共に様々な食品において補充するために使用することができる。この生物学的に活性な物質は、広範な動物の免疫系を刺激することが示されている。この生成物の組成及び特徴を表7に示す。
実施例9：高pHプロテアーゼ及びリパーゼを用いた酵母の処理
商業用パン酵母自己消化物からの細胞壁220g（15％固形分）をガラスフラスコ中に入れ、攪拌した。温度を55℃まで上昇させ、pHをHClにより9.5まで上昇させた。0.1％ Protex 6Lを添加し、サンプルを14時間インキュベートした。この時点で、30gのアリコートをSorvall SS34遠心機ロータにおける使用に適当な50ml遠心チューブ(Nalgeneから入手可)中に分配した。磁気攪拌バーを各チューブに入れた。以下の添加物A、B又はCを遠心チューブに施した：
A. 0.0175％Glucoamylase Concentrate (Valley Researchから入手可)
B. 0.1％Lipase CR (Valley Researchから入手可能なトリアシルグリセロールリパーゼ)
C. 0.0175％Glucoamylase Concentrate＋0.1％Lipase CR.
各チューブを55℃で4時間攪拌しながらインキュベートした。酵素を85℃で15分間加熱不活化し、細胞壁をSS34ロータを具備するSorvallTM遠心分離機を用いて（12,000r.p.m.で10分間）ペレット化した。次いで、除去した可溶性抽出物の量と等量の水でペレットを3回洗浄した。細胞壁を約15％固形分まで再懸濁し、Buchi Mini Spray Dryer B-191でスプレー乾燥した。乾燥した細胞壁をタンパク質について分析し（窒素源X 6.25; LECO タンパク質測定機、LECO Corp.（St. Joseph, MI）から入手可）、β-グルカンをMegazyme International Mushroom及びYeast Beta-glucanキット(Megazyme International（Wicklow, Ireland）から入手可)を用いて測定した。結果を表8に示す。
Figure 0005296531
実施例10（予測的）：トリ用ブロイラー飼料における実施例2のβ-グルカンに富む生成物の使用
実施例2のβ-グルカンに富む生成物を1g/Kgで含むか、又はβ-グルカンを含まない（対照）標準的なトリ用飼料（抗生物質を含まない）を、ブロイラー鶏に1日齢から毎日摂取させる。7日後、対照及びβ-グルカンを摂取する雛の両方を、トリに病原性であるE.コリ（E.coli）株による呼吸器チャレンジ(respiratory challenge)に供する。雛に各食餌を継続させ、死亡率を1ヶ月間記録する。
β-グルカンを摂取するトリの死亡率は、標準的な食餌を摂取するトリの死亡率よりも有意に低いことが予想される。トリの免疫系のβ-グルカン刺激は、呼吸器感染症に起因する生産量の損失を減少させる点で有益である。
実施例11（予測的）：トリ用ブロイラー飼料における実施例1のマンナンに富む限外濾過保持液の使用
実施例1のマンナンに富む限外濾過保持液を1g/Kgで含むか、又は富化したマンナンを含まない（対照）標準的なトリ用飼料（抗生物質を含まない）をブロイラー鶏に2週間の間毎日摂取させる。次いで、ブロイラー鶏（対照及びマンナン摂取群の両方）をトリに病原性であるサルモネラ（Salmonella）株の経口接種に供する。トリに各食餌を継続させ、死亡率及び罹患率を1ヶ月間モニターする。
マンナンはサルモネラに結合し、マンナン摂取時にサルモネラがトリの腸管に結合することを防止する。これによりマンナンを摂取するトリの死亡率及び罹患率の有意な低減をもたらすことが予想される。
実施例12（予測的）：クルマエビの養殖における実施例1又は2のβ-グルカンに富む生成物の使用
クルマエビ（ペナエウス・モノドン（Penaeus monodon））の一群を富化β-グルカンを含まない溶液（対照群）中に浸漬させる。この群は、研究の経過中、富化β-グルカンを含まない市販のペレットを摂取させる。第2のクルマエビ群は実施例1の富化β-グルカンを0.1％含む溶液中に浸漬させた後、実施例1の富化β-グルカンを0.1％含む市販のペレットを摂取させる。第3のクルマエビ群は、実施例2の富化β-グルカンを0.1％含む溶液中に浸漬させた後、実施例2の富化β-グルカンを0.1％含む市販のペレットを摂取させる。各群の死亡率を数ヶ月にわたってモニターする。
エビの飼育は、歴史的に高い死亡率である。実施例1及び2からの酵母β-1,3-1,6グルカンは、エビをβ-グルカンを含む溶液中に浸漬させるとき、及びエビにその後β-グルカンを含む食餌を摂取させるとき、対照群に比較してエビの免疫応答を刺激することがそれぞれ予想される。酵母β-グルカン食餌に浸漬され、これを摂取するクルマエビ群は、その先天的な免疫系の刺激に起因して、対照群に比較して死亡率が低減されることが予想される。
実施例13（予測的）：湿疹の治療における実施例2のβ-グルカンに富む生成物の使用
現在受けているスキンローション治療に反応性でない湿疹に罹患した児童の選択群を、実施例2のβ-グルカンに富む生成物の1％懸濁液を含むローションで処置する。このローションは1日に2回適用する。皮膚は、皮膚科医により、病変及び痛みの改善について週に一回評価する。β-グルカンローションは、痛みに関連する病変を減少し、病変の治癒を早めることが期待される。
実施例14（予測的）：健康スナック食品の製造における実施例2のβ-グルカンに富む生成物の使用
実施例2の酵母β-グルカン抽出物は、脂肪と一部置き換えて1％（w/w）でアイスクリームに添加する。β-グルカンは、質感に影響を与えることなく、アイスクリームに堅さ及びこくを与える。β-グルカンが補充されたアイスクリームは、β-グルカンを含まないアイスクリームよりもカロリーが少ない。補充したアイスクリームの摂取時に、β-グルカンは腸管の先天性免疫系を刺激し、消費者の免疫状態に利益を与えることが予想される。
実施例2の酵母β-グルカン抽出物は、0.5％(w/w)及び1％(w/w)でクッキー、スナックバー及びパン品目に添加される。β-グルカンが補充されたクッキー、スナックバー及びパン品目は、β-グルカンを含まないクッキー、スナックバー及びパン品目よりもカロリーが少ない。補充したクッキー、スナックバー及びパン品目の摂取時に、β-グルカンが腸管の先天性免疫系を刺激し、消費者の免疫状態に利益を与えることが予想される。
本発明はいくらか具体的に記載されかつ例示されているが、当業者は記載されたことの中でなし得る様々な改変（バリエーション、付加及び省略を含む）を理解するだろう。したがって、これらの改変も本発明に包含され、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に適法に一致し得る最も広い解釈によってのみ限定されることを意図する。
本明細書で引用された全ての特許、刊行物及び参考文献は参照により本明細書に完全に組み入れる。本出願の開示と、組み込まれた特許、刊行物及び参考文献とが抵触する場合、この開示が支配するものとする。
図1は、本発明によるβ-グルカン/マンナン調製物の製造プロセスの一実施形態のフローチャートである。 図2は、本発明によるβ-グルカン/マンナン調製物の製造プロセスの別の実施形態のフローチャートである。

Claims (20)

  1. 以下のステップ(a)〜(d)を含む酵母細胞の処理方法：
    (a) 酵母細胞を自己消化させて酵母細胞壁をpH 4〜8で、かつ24〜36時間解離させるステップ；
    (b) 酵母細胞壁を外因性プロテアーゼと共にpH 9〜10で、かつ50℃〜65℃の温度でインキュベートするステップ；
    (c) 酵母細胞壁をグルカンに富む成分とマンナンに富む成分とに分けるステップ；及び
    (d) ステップ(c)のマンナンに富む成分を限外濾過して濾液と保持液とを生じさせるステップ。
  2. ステップ(b)のプロテアーゼをステップ(c)の前に不活化する、請求項１に記載の方法。
  3. 保持液がマンナンを含み、かつ該マンナンの少なくとも85％(w/w)は少なくとも10,000Daの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
  4. ステップ(a)を35℃〜55℃の温度で実施する、請求項１に記載の方法。
  5. ステップ(c)のグルカンに富む成分を動物飼料に使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  6. ステップ(b)のプロテアーゼ処理した細胞壁を動物飼料に使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. ステップ(d)の濾液を動物飼料に使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. ステップ(c)のグルカンに富む成分を食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品から選択される製品に使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. ステップ(b)のプロテアーゼ処理した細胞壁を食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品から選択される製品に使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. ステップ(c)のグルカンに富む成分を食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品から選択される製品に使用する際に、ステップ(d)の濾液を使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 以下のステップ(a)〜(d)を含む酵母細胞の処理方法：
    (a)酵母細胞を50℃〜65℃の温度で自己消化させて酵母細胞壁を解離させるステップ；
    (b)細胞壁を外因性プロテアーゼと共にpH 9〜10でインキュベートするステップ；
    (c)ステップ(b)のプロテアーゼ処理した細胞壁を、アミラーゼ、リパーゼ及びそれらの組合せの少なくとも1つを含む酵素と共にpH 4〜6でインキュベートするステップ;及び
    (d)ステップ(c)の酵素処理した細胞壁をグルカンに富む成分とマンナンに富む成分とに分けるステップ。
  12. 酵母細胞がビール酵母細胞を含む請求項１１に記載の方法。
  13. ステップ(c)の酵素で処理した細胞壁を動物飼料に使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  14. ステップ(c)の酵素で処理した細胞壁を、食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品から選択される製品に使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  15. ステップ(d)のグルカンに富む成分を動物飼料に使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  16. ステップ(d)のグルカンに富む成分を、食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品から選択される製品に使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  17. ステップ(d)のマンナンに富む成分を限外濾過して濾液と保持液とを生じさせるステップ(e)をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  18. 保持液はマンナンを含み、かつ該マンナンの少なくとも85％（w/w）は少なくとも10,000Daの分子量を有する、請求項１７に記載の方法。
  19. ステップ(e)の濾液を動物飼料において使用することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  20. ステップ(e)の濾液を、食品サプリメント、医薬、化粧品及び栄養補助食品から選択される製品に使用することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
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