DE2452303A1 - Extraktionsprodukte aus hefezellwandbestandteile enthaltendem material, ein verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel - Google Patents
Extraktionsprodukte aus hefezellwandbestandteile enthaltendem material, ein verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittelInfo
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Description
509 Leverkusen. Bayerwerk
L 4. NOV. 1974 $
Extraktionsprodukte aus Hefezellwandbestandteile enthaltendem Material, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre
Verwendung als Arzneimittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Extraktionsprodukte aus Hefezellwandbestandteile enthaltendem Material, ein Verfahren
zu ihrer Herstellung durch Isolierung aus Hefezellwandbestandteile enthaltendem Material unter Anwendung der Phenol-Wasser-Extraktion
sowie ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Immunpotentiatoren welche sich beispielsweise in
einer wachstumshemmenden Wirkung auf maligne Tumoren auszeichnen.
Es ist bereits bekannt geworden, daß das sogenannte "Zymosan",
welches durch Autolyse oder Proteolyse (zoBo Trypsin-Behandlung)
von Bäckerhefe als wasserunlöslicher Rückstand anfällt, eine wachstumshemmende Wirkung auf maligne Tumoren aufweist, welche
durch eine Stimulierung des immunologischen Abwehrapparats bedingt wird.
(Literatur bezüglich "Zymosan" siehe z.B. J· Nagy et al. Archivo Italiano di Patologia e Climica dei Tumori Vol. XIV, Fase 3-4-1971,
So 29-35 und die Monographie von F.W. Fitzpatrick und F.I.
Di Carlo: Zymosan, Ann. New York Acad„ Sei. 118 (4), 233-262
(1964)).
Beim sogenannten "Zymosan" handelt es sich um mehr oder weniger
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modifiziertes Hefezellwandmaterial, über dessen chemische Struktur bisher wenig bekannt geworden ist.
Die erfindungsgemäßen Extraktionsprodukte aus Hefezellwandbestandteile
enthaltendem Material sind jedoch wesentlich stärker tumorhemmend als die sogenannten Zymosanpräparationen, die
uns unter anderem als Ausgangsmaterialien für die erfindungsgemäße Extraktion dienten.
Es wurde gefunden, daß die neuen Extraktionsprodukte aus Hefezellwandbestandteile
enthaltendem Material, welche durch Isolierung aus Hefezellwandbestandteile enthaltendem Material
unter Anwendung der Phenol-Wasser ^Extraktion hergestellt wurden, eine starke immunpotenzierunde und speziell tumorhemmende
Wirkung aufweisen.
Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Phenol-Wasser-Extraktsaus
Hefezellwandbestandteile enthaltendem Material eine stärkere tumorhemmende Wirksamkeit als die aus dem
Stand der Technik bekannten Zymosan-Präparationen.
Die erfindungsgemäßen neuen Phenol-Wasser-Extrakte aus Hefezellwandbestandteile
enthaltendem Material stellen eine Bereicherung der Pharmazie dar.
Als biologische Ausgangsmaterialien kommen beim erfindungsgemäßen Verfahren alle Hefezellwandbestandteile enthaltenden
Materialien in Frage.
Vorzugsweise dienen beim erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterialien
komplette Hefezellen sowie durch proteolytischen (z.B. mit Trypsin) oder autolytischen Abbau hergestellte Hefezellwandbestandteile
enthaltende Präparationen, sogenannte
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"Zymosane", weiterhin Hefezeilwände, proteolytisch (z.B. mit
Trypsin) abgebaute Hefezeilwände, d.h. sogenannte "Hefezellwandzymosane"
oder auch Polysaccharid-Protein-Komplexe aus Hefezeilwänden, beispielsweise Glucomannan-Proteine oder
Glucan-Proteine.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können praktisch alle Hefearten
eingesetzt werden. Man kann dafür z.B. käufliche Bäckerhefe verwenden oder spezielle Hefestämme, die entweder käuflich
zu erwerben sind, oder als einheitliche Stämme aus käuflicher Hefe isoliert und kultiviert werden können.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kommen Hefestämme der folgenden
Familien ' in Frage:
1. Saccharomycetaceae (Subfamilien: Saccharomycetoideae, Schizosaccharomycetoideae,
Eremascoideae, Endomycetoideae, Lipomycetoideae, Nematosporoideae),
2. Sporobolomycetaceae und
3. Cryptococcaceae (Subfamilien: Cryptococcoideae, Trichosporoideae,
Rhodotoruloideae).
Vorzugsweise kommen zu den Saccharomyceteae gehörende Gattungen der Subfamilie Saccharomycetoideae und Gattungen der Subfamilie
Cryptococcoideae in Betracht. Beispielhaft seien die Gattungen Saccharomyces (mit individuellen Saccharomyces-cerevisiae-Stämmen),
Candida (mit dem individuellen Stamm Candida utilis) und Kloeckera genannt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die sogenannte Phenol-Wasser-Extraktion angewendet, welche im Prinzip
bei O.Westphal, O.Lüderitz und F.Bister: Z. Naturforsch. 7b,
148 (1952) beschrieben wird. Das erfindungsgemäße Verfahren
stellt eine leichte Abwandlung des vorgenannten Verfahrens dar.
*>Klassifizierung siehe J. Lodder et al. in A.H. Cook (Ed.),
The Chemistry and Biology of Yeasts, Academic Press New York 1958, S. 1 ff sowie P.A.J. Gorin u. J.E.T. Spencer in
D. Perlman (Ed.), Advances in Applied Microbiology Vol. 13, Academic Press New York, 1970, S. 25 ff.
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Im allgemeinen wird das Hefezellausgangsmaterial mit der 10-Ms
1OO"-fachen? vorzugsweise 30- bis 40-fachen Menge eines aus
etwa gleichen Volumteilen bestehenden Phenol-Wasser-Gemisches für kurze Zeit (vorzugsweise 10-30 Minuten lang) auf Temperaturen
zwischen 40 und 100°Cs vorzugsweise 55 bis 75°C erhitzt
und anschließend bei Temperaturen zwischen 0 und 35 C zentrifugiert.
Vorteilhaft kann so vorgegangen werden, daß das Ausgangsmaterial zunächst in der 5- bis 50-fachen, vorzugsweise
15- bis 20-fachen9 Menge Wasser suspendiert wird und danach die
Suspension mit etwa dem gleichen Volumen vorzugsweise 90 %igem Phenol nach Erhitzen auf 68 C etwa 15 Minuten bei dieser Temperatur
gerührt wird,, Nach dem Zentrifugieren werden von den 3
erhaltenen Phasen die Phenolphase und die feste Phase vereinigt und mit dem gleichen Volumen Wasser, wie es bei der ersten
Phenol-Wasser-Extraktion verwendet wurde, erneut kurzzeitig auf
die gleiche Temperatur wie vorher erhitzt. Nach erneuter Zentrifugation
wird die erhaltene wäßrige Phase zusammen mit der nach der ersten Extraktion erhaltenen weiter aufgearbeitet.
Bei der Phenol-Wasser-Behandlung der Hefezellbestandteile (z.B.
von Zymosan und Hefe) ergibt sich nach dem Zentrifugieren eine Auftrennung in jeweils drei Phasen, nämlich eine wäßrige, eine
feste und eine phenolische Phase wobei nach der Phenol-Wasser-Behandlung von Zymosan die feste Phase sich zwischen der HpO-Phase
und der Phenol-Phase befindetP während sich nach der
Phenol-Wasser-Behandlung von Hefe feste .Anteile im oberen und
unteren Teil der Phenol-Phase befinden»
.Die herbei anfallenden festen Phasen sind von Phenol durchsetzt
und somit integralerP wenn auch abtrennbarer-Bestandteil der
Phenol-Phase«
Sin mögliches Schema der Phenol-Wasser-Extraktion mit nachfolgender
Weiterverarbeitung ist der folgenden Fließkarte zu entnehmen. Die darin enthaltenen Operationen sollen nur beispielhaft
aufgeführt werden und nicht einschränkend wirken.
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Hefezellmaterial (z.B.Zymosan)
1) Phenol-HoO-Behandlung
(15 ysn.1 630C) ■
2) Zentrifugieren "bei 3ooo UpM
H20-Phase I H20-Phase
1) + H2o/l5 Kin., 6S0C
2} Zentrifugieren bei 3ooo UcM
Feste Phase II ?her.cl-?hasa CII)
vereinigen
Dialyse (3 Tage, +4 C) 1 Waschen ~eis~ens VerVcr
•n. C2H5 OH ~er- oder
2)Trocknen .
Retentat
Dialysat verworfen
1)Einengen auf 1/10
2)Zentrifugieren
bei 3000 UpM Rückstand
(=Feste fhase,gewaschen)
(=Feste fhase,gewaschen)
I)+K2O
7 ο h, Rausteaip.
2)Zentrifugieren
"b.cooo
H?0-Phase v Phenol-Phase
Sediment
Überstand verworfen
Dialyse
Retentat
1)+H20
2)Lyophilisieren
Lyophilisieren -'-1) Einengen
2)Extrahieren
mit Äther
mit Äther
3)Lyophilisieren
■Dialysat verworfen
Lyophilisat Le A 16
Lyophilisat Lyophilisat
609 8^070905
BAD
VJie aus dem Fließschema zu ersehen ist, werden jeweils die
wässerigen Phasen aufgearbeitet, wobei für einige Tage (vorzugsweise 2-5 Tage) bei Temperaturen zwischen O0 und 5O°C,
zweckmäßig bei 3-35°C dialysiert wird und das jeweilige Retentat wie folgt weiter verarbeitet wird.
Das Retentat aus der Dialyse wird auf 5 bis 20 vorzugsweise auf 8-15 Prozent seines ursprünglichen Volumens eingeengt und
anschließend zentrifugiert, wobei ein Sediment und ein Überstand entsteht und beide lyophilisiert werden, wobei das Sediment
vor dem Lyophilisieren jeweils in Wasser aufgenommen wird.
Unter Umständen - z.B. bei kompletten Saccharomyces-Cerevisiae-Zellen
als Ausgangsmaterial - wird bei dem Einengen des Retentates
aus der Dialyse der wäßrigen Phase kein Sediment erhalten, Hier wird das Konzentrat direkt lyophilisiert»
Außer dem oben im Detail angegebenen Aufarbeitungsschema können
natürlich noch andere Wege eingeschlagen werden.
So können beispielsweise aus den wäßrigen Phasen außer durch Dialyse die unerwünschten niedermolekularen Bestandteile durch
Gelfiltration, Ultrafiltration oder durch Kombination einzelner
oder aller der vorgenannten Methoden einschließlich Dialyse abgetrennt werden. Im Falle der Dialyse wird anschließend wie
oben beschrieben verfahren.
Die erfindungsgemäßen Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte wurden im Tumor-Immun-Screening Test aus Sarkom 180 auf Swiss-Mäusen
getestet. Bei der Stammhaltung der Swiss-Mäuse wurden jeweils am 7.Tag nach der letzten Transplantation des Tumors 1x10
Asciteszellen des Sarkoms 180 in 0,5 ml 0,9%iger NaGl-Lösung
intraperetoneal auf 20 bis 22g schwere Swiss-Mäuse (Koloniezucht) verimpft. Screening-Teste wurden wie oben beschrieben
5 vorbereitet, jedoch wurden hierbei Tumorzellen von 5 x 10
Asciteszellen in jeweils 0,3 ml subkutan verimpft. Le A 16 014 - 6 -
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Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen wäßrigen Präparatlösungen
bzw. Suspensionen geschah wahlweise durch einmalige i.p., s.c, i.m. oder i.v. Injektion der Präparatlösungen bzw.
Suspension, entweder am 7.Tag vor der Tumortransplantation oder am 7.Tag nach der Tumortransplantation.
Die Versuche dauerten jeweils 28 Tage, dann wurden die Tiere abgetötet und die Tumore präpariert.
Als Auswertungsparameter diente die Hemmung des Tumorwachstums, Sie wurde quantitativ ermittelt durch Erreichung des Tumorgewichtsindex
(TG-Index) nach der Formel
TG-Index - durchschnittl. Tumorgew, der behänd. Tiergruppe
durchschnittl. Tumorgew, der unbeh. Kontrollgruppe
Die Testergebnisse sind wie folgt zu beurteilen:
TG Index 1,0 - 0,8 = keine Wirkung
0,7 - 0,6 = Wirkungsandeutung 0,5 - 0,4 = deutliche Wirkung 0,3 - 0,2 = gute Wirkung
0,1 - 0,0 = sehr gute Wirkung Rezidivfreiheit = Dauerheilung
nach 3 Monaten
nach 3 Monaten
Die Nebenwirkungen wurden wie folgt registriert:
Im Versuchsverlauf wurden die Tierverluste festgestellt, der Allgemeinzustand der Tiere wurde beurteilt, außerdem die
Körpergewichtsveränderungen, die Änderung der Leukocytenzahlen im peripheren Blut und die makroskopischen Veränderungen
an den Organen festgestellt.
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| Zymosan | Optimale | Behand | i | -7 | I | Tumor | Tierverlü | |
| Getestetes | gemäß Bsp.A.A) | Dosis | lungs- | +7 | gewichts- | tot/einge | ||
| Material ] | Phenol-Wasser- | mg/kg | tag | Index | ||||
| I | Extrakt | 1 χ i.p. j | -7 | -7 | 0,5 | 0/6 | ||
| (von Zymosan) | 20 | +7 | + 7 | 0,5 | 0/6 | |||
| gemäß Bsp. A2 a) | 20 | |||||||
| Phenol-Wasser | -7 | 0,02 | 0/6 | |||||
| Extrakt | 200 | +7 | 0,1 | 0/6 | ||||
| (aus Hefe) | 100 | |||||||
| gemäß Bsp.BI) | ||||||||
| Hefezellwände gemäß Bsp, C1) |
||||||||
| Phenol-Wasser | _y | 0,4 | 0/6 | |||||
| Extrakt | 100 | +7 | 0,7 | 0/6 | ||||
| (aus Hefezellw.) | 100 | |||||||
| gemäß Bsp, C2a) | _y +7 |
0,9 0,7 |
0/8 1/8 |
|||||
| Hefe ζ e1!wand- | 100 100 |
|||||||
| zymosan gemäß Bsp, C3) |
-7 | 0,3 | 0/10 | |||||
| Phenol-Wasβ?r- '7U-J ,^ Ir-'- |
100 | +7 | 0,4 | 0/10 | ||||
| iL-JL Ui B.lJL L. 'aus Hefezellwand- |
100 | 0/10 | ||||||
| zymcsan) | —7 | 1,1 | 0/10 | |||||
| g-3mäß Bspa C 4a) | 250 | +7 | 1,3 | 0/10 | ||||
| Gluoan-Proteln | 250 | -7 | 0,3 | 0/8 | ||||
| gemäß Bsp .C 5c | 50 | 0,1 | ||||||
| Pheno1-Wa s s er- | 50 | |||||||
| Extrakt (aus | 0/10 | |||||||
| Glucan Protein) | 0,5 | 0/10 | ||||||
| gemäß Bsp.C5c6t | 250 | 0,4 | ||||||
| 250 | 1/10 | |||||||
| 0,2 | ||||||||
| 250 | 0s2 | 0/10 | ||||||
| 250 | ||||||||
| I | ||||||||
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Für die erfindungsgemäßen Phenol-Wasser-Extrakte aus Hefezellwandbestandteile
haltigem Material kommen vorzugsweise folgende Applikationen infrage: intramuskuläre,intraperetoneale,
intravenöse, subkutane oder lokale Applikation.
Die neuen erfindungsgemäßen Phenol-Wasser-Extrakte aus Hefezellwandbestandteile
haltigem Material können entweder als solche oder aber in Kombination mit nichttoxischen, inerten
pharmazeutisch annehmbaren Trägern zur Anwendung gelangen. Als Darreichungsformen in Kombination mit verschiedenen
inerten Trägern kommen wässerige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, nichtwässerige Emulsionen und Suspensionen,
Pellets und dergleichen in Betracht. Derartige Träger umfassen feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, ein wässeriges
Medium sowie verschiedenen nichttoxische organischen Verdünnungsmittel und dergleichen. Die therapeutisch wirksame
Präparation soll im vorgenannten Fall in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 90 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden
sein.
Die Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Verstrecken der Wirkstoffe mit Verdünnungsmitteln
und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von
Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln.
Als Träger- bzw. Hilfsstoffe seien beispielhaft aufgeführt:
Wasser, nichttoxische organische Lösungsmittel bzw. Verdünnungsmittel,
pflanzliche Öle (z.B. Erdnuß-/Sesam-Öl), Alkohole (z.B. Äthylalkohol, Glycerin), Glykole (z.B.
Propylenglykol, Polyäthylenglykol) und Wasser; feste Trägerstoffe,
Zucker (z.B. Roh-, Milch- und Traubenzucker); Salze (z.B. NaCl); Emulgiermittel, wie nichtionogene und
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anionische Emulgatoren (z.B. Polyoxyäthylen-Fettsäure-Ester,
Polyoxyäthylen-Fettalkohol-Äther, Alkylsulfonate und Arylsulfonate),
Dispergiermittel (z.B. Lignin, Methylcellulose, Stärke und Polyvinylpyrrolidon).
Die Wirkstoffe können in Ampullen usw. auch in Form von Dosierungseinheiten enthalten sein, wobei jede Dosierungseinheit so angepaßt ist, daß sie eine einzelne Dosis des
aktiven Bestandteiles liefert.
Die neuen erfindungsgemäßen Phenol-Wasser-Extrakte aus Hefezellwandbestandteile haltigem Material können in den
Formulierungen auch in Mischungen mit anderen bekannten Wirkstoffen vorliegen. Z.B. im Gemisch mit spezifischen
Antigenen in Form von Vakzinen.
Im allgemeinen ist es vorteilhaft, beim Menschen Mengen von etwa 10 mg - 50 mg/kg Körpergewicht pro
Tag zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Beim Tier kommt gegebenenfalls ein höherer Dosierungsspielraum
infrage. Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich
sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikationsweges, aber auch aufgrund deren individuellem und dem
spezifischen Verhalten gegenüber dem Medikament bzw. der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw. Intervall,
zu welchem die Verabreichung erfolgt.
Im Fall der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, sie in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Für die Applikation in der Human- und Veterinärmedizin ist der gleiche Dosierungsspielraum vorgesehen.
Sinngemäß gelten auch die weiteren obigen Ausführungen.
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A. Zymosan und Zymosanfraktionen aus Saccharomyces cerevisiae
1) Zymosan
Von unter sterilen Bedingungen im 2.000 1 Maßstab angezüchteter Hefe (Saccharomyces cerevisiae spec, ein Isolat
aus käuflicher Bäckerhefe) werden 12 kg (nach Zentrifugieren der Kultur erhaltenes Sediment pastenartiger Konsistenz)
in einem 50 1 Rundkolben mit Rühraufsatz und Einfülltubus mit 48 1 0,5 M Dinatriumhydrogenphosphat-Puffer (pH 8,9)
versetzt. Die vollkommen geschlossene Apparatur wird nun zur Sterilisation 4 Std. auf loo°C im Autoklaven erhitzt.
Nach langsamem Abkühlenlassen auf +370C werden ca. 5oo ml
Toluol und anschlie3send eine sterilfiltrierte Lösung von 5 g Trypsin in 5o ml phosphatgepufferter
o,9 ^iger Natriumchloridlöoung (pH 7,2) zugesetzt.
Die Reaktionszeit beträgt insgesamt 16 Tage bei 370G
(thersostatisiertes Wasserbad; Umwälzpumpe). Der Kolbeninhalt wird täglich etwa 3o Min. lang gut durchgerührt.
Danach wird unter sterilen Bedingungen eine Probe zur ?H-3eStimmung entnommen. Erforderlichenfalls, was erfahrungsgemäss
nur sehr selten notwendig ist, wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von konz. Natriumhydroxidlösung
auf pH 8,o-8,2 eingestellt. Am 3., 6. und Io. Tag wird jeweils die bereits beschriebene
sterilfiltrierte Trypsinlösung (5 g/5o ml) zugesetzt.
Der nächste Aufarbeitungsschritt dauert etwa 2 Tage. Zunächst wird der Kolbeninhalt mit Hilfe einer Durchlaufzentrifuge
bei 19.000 UpM zentrifugiert. Das Sediment wird in ca. 50 Ltr. kaltem (ca. 12°C) Leitungswasser,
dem ca. 20 ml Toluol zugesetzt worden waren, 1 Stunde kräftig gerührt. Die Suspension wird wieder wie
in modifizierter Form nach PILLEMER et al I.exp.Med.
103, 1-13 (1956)
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oben angegeben zentrifugiert, und das Sediment wird wiederum in cae 50 Ltr«, kaltem Leitungswasser
suspendiert und die Suspension unter kräftiges Rühren ca. 1 Std. auf °9o°C erhitzt. Das Gemisch
wird auf Raumtemperatur abgekühlt und wieder wie oben angegeben
zentrifugiert. Mit des, erhaltenen Sediment wird
dieser Vorgang wiederholt und das hierbei gewonnene Sedixer.t in ca. 5o Ltr. dest, Wasser, dem etwa 2o ml Toluol
zugesetzt worden waren, suspendiert und die.Suspension über Nacht bei +40C belassen. Danach wird das Gemisch unter
Kühren 1 Std. auf 9o°C erhitzt,, auf Raumtemperatur
abgekühlt und in gleicher Weise wie bereits beschrieben zentrifugierte Das Sediment wird in ca. 8o Ltr. denaturiertem
Äthanol (sog, Trockensprit9 ca. 99?8 #ig) 1 Std.
bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Die Suspension wird abgenutscht und der Filterkuchen in 4o Ltr. denaturiertes
Äthanol (s.o.) wieder 1 Std„ kraftig gerührt. Diese
Suspension wird abgenutscht und der Filterkuchen auf der Nutsche mit ca. 5 Ltr. Äthanol (S0=Oo) gewaschen. Danach
wird der !Filterkuchen auf dem Troekenbleeh im Vakuumtrokkensckrank
bei Raumtemperatur 24 Std» getrocknet. Das getrocknete
Produkt wird mit β Ltr=, Äthanol (s.o.) 3 Std» unter Rühren am Rückflusskühler zum Sieden erhitzt. Das
Gemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und abgenutscht,
Der !Filterkuchen wird auf der lutsche mit Äthanol gewaschen
und wiederum .24 Stdο im Yakuumtroekensehrank bei Raumtemperatur
getrocknet.
Die Ausbeute beträgt 450~500g Zymosan (=ca. 4% bzw. 14-15%,
bezogen auf lyophilisierte
Hefe)
2) Hi_enolj-¥asser°Extrakte aus Zymosan nach 1)
a) HiSisi55§„§uS=^£?_!}5c^ der^Dial.yse der wässrigen Phase
erhaltenen Retentat
?co g Zymosan werden bei Raumtemperatur in 3,5 Ltr.
desto Wasser suspendiert; danach werden unter Rühren
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3,5 Ltr.· 9ο ?iiges Phenol zugesetzt, und das Gemisch
wird dann unter Rühren 15 Min. auf -68 C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf +150C wird die so erhaltene Emulsion
"bei 3ooo UpM und +lo°C zentrifugiert. Man erhält 3 Phasen:
1) eine wässrige Phase (o"ben)
2) eine fe3te Phase (Mitte: Zyraosan-Rückstand +
Phenol + Wasser)
3) eine flüssige phenolische Phase (unten)
Die wässrige Phase wird vorsichtig abgeheuert. Die "beiden folgenden Phasen werden mit 3,5 Ltr. dest. Wasser
unter Rühren 15 Min. auf 680C erhitzt. Nach dem
Abkühlen auf +150C wird der oben beschriebene Vorgang wiederholt. Wiederum werden drei Phasen gebildet. Die
hierbei erhaltene mit der zuerst gewonnenen (s.o.) vereinigte wässrige Phase wird dr-ei Tage bei 40C gegen
dest. Wasser dialysiert. Das«Retentat wird im Rotationsverdampfer
unter vermindertem Druck bei 35-4o C auf l/lo des Ausgangsvolumens eingeengt, wobei ein ?räzipitat
gebildet wird, das bei +lo°C abzentrifugiert wird (3ooo UpM). Der Überstand wird lyophllisiert.
Ausbeute: 7-8 g. ^es Phenol-Wasser-Extraktes
b) P£äzip_itat_aus dem_nach_der Dialyse der wässrigen Pha-
-- £Ξ-§1ί£525: ^üientat
Das oben beschriebene Sediment wird in ca. loo ml dest. Wasser aufgenommen und die so erhaltene Suspension
lyophilisiert.
Ausbeute: 4-6 g. des Phenol-Wasser-Extraktes
Ausbeute: 4-6 g. des Phenol-Wasser-Extraktes
c) Feste ?hase_j_ gewaschen
Nach dem Abhebern der wässrigen Phase wird die auf der Phenol-Phase aufliegende feste Phase mit einer umgekehrten
Pipette durchstochen und die darunter befind-
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liehe Phenol-Phase vorsichtig abgesaugt. Danach wird
die feste Phase in 6-8 Ltr. denat. Äthanol (s.o.) suspendiert und 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Nach
den- Abrutschen (normales Filter) wird der Filterkuchen
zweimal mit je 3 Ltr. Äthanol (s.o.) gewaschen. Der
gut abgesaugte Filterkuchen wird im Vakuumtrockenschrank bei 5o°C 24 Std. getrocknet.
Ausbeute: ca. 18o g
Ausbeute: ca. 18o g
Der so gewonnene Rückstand kann wie Zymosan nochmals einer Phenol-Wasser-Behandlung unterworfen werden. Man
erhalt dabei ca. 2g Rückstand aus dem nach der Dialyse der wässrigen Phase erhaltenen Retentat und ca. 1 g
Präzipitat aus dem oben angegebenen Retentat.
Eine weitere Phenol-Wasser-Extraktion der bei diesem Verfahrensschritt angefallenen und wie oben beschrieben
aufgearbeiteten festen Phase ergibt etwa 5oo mg Überstand bzw. 2oo mg Präzipitat.
d) ?hencl-Fhasei_aufgearbeitet
Die Phenol-Phase wird mit 3 ltr. dest. Wasser ca. 70 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die erhaltene
Emulsion bei 8000 UpM, +40C 2o Min. zentrifugiert. Die phenolische untere Phase wird verworfen, die wässrige
Phase bei +40C drei Tage gegen dest. Wasser dlalysiert.
Das Retentat wird im Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck bei ca. 4o°C etwa auf l/lo des Ausgangsvolumens
eingeengt und das Konzentrat nach dem Abkühlen fünfmal mit je 5oo ml Äther ausgeschüttelt."
Die wässrige Phase wird zur Entfernung des Äthers unter vermindertem Druck leicht im Rundkolben geschwenkt
und danach lyophilisiert. Es werden ca. 25o mg eines
hygroskopischen Rückstandes erhalten
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B. »Phenol-Wasser-Extrakte aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae)
Als Ausgangsmaterial wurde sowohl käufliche Bäckerhefe als auch eine daraus isolierte und unter sterilen Bedingungen
angezüchtete Hefe verwendet.
Phase s^haltenesReteritat
2oc g gefriergetrocknete käufliche Bäckerhefe werden in
gleicher V/eise vie unter A. 2a) "beschrieben mit Phenol-V.'asser
behandelt und aufgearbeitet. Auch hier erhält r.an nach dem Zentrifugieren drei Phasen, die allerdings im
Zentrifugenbecher anders angeordnet sind als bei der Pheriol-V.rasser-E:ctraktion
von Zymosan:
?.„· eine wässrige Phase (oben)
?.„· eine wässrige Phase (oben)
b) zwei feste Phasen (Mitte: Hoferückstand + Phenol + V<'as-
ser; schleimige Beschaffenheit
unten: HeferückPtand als relativ fe-■
stes )
c) eine flüssige phenolische Phase (über dein festen Sediment
)
Die Aufarbeitung der wässrigen Phase erfolgt in gleicher
Weise wie unter A.2a) angegeben. Ausgehend von käuflicher
Hefe erhält taan beim Einengen des Retentats in Rotationsverdampfer
unter verhindertem Druck kein Präzipitat (im
Gegensatz zu den: entsprechenden Verfahrenscchritt ausgehend
von Zymosan oder von unter sterilen bedingungen fer-
-.er.tierter Hefe). Hier v;ird also das gesagte eingeengte
Äetentat lyophilisiert.
von 2oc g gefriergetrockneter steril fernen- „
tier-er Hefe erhält man nach Abzentrifugieren des Präzipitats
und Lyophilisierea des Überstandes 5-6 Z eines Phenol-Wasser-Extraktes
,. der im Gegensatz zu der entsprechenden Präparation
aus Zymosan oder zu dem ausgehend von kaufIi- '
eher Hefe gewonnenen Lyophilisat hygroskopisch ist.
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2) P^äzi2itat_auG_rtein_nach
ίΕ--±1'1ι:2ϊ: ^2i£i}iSi !"wird nur erhalten, wenn man von
steril fermentierter Hefe ausgeht)
Zur Actr-'rinunrj des bei diesem Ausgangsciaterial angefallener.
Präzipitats ist es erforderlich, dass das nach der
Dialyse der wässrigen Phase erhaltene und anschliessend eingeengte Retentat 3o Kin. "bei 2o.ooo UpM und +Io C
zentrifugiert wird. Das Sediment wird in ca. loo ml dest.
Wasser aufgenommen und die so erhaltene Suspension lyophilisiert.
Ausbeute: ca. 1,5 g Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: ca. 1,5 g Phenol-Wasser-Extrakt
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C. Heie-Zellwand-Präparationen aus Saccharamyces cerevisiae
Die oben beschriebene feuchte Heienasse1 pastenartiger
Konsistenz wird lyophilisiert, wobei aus 1 kg ca. 27o g Trockennasse erhalten werden.
2oo g des Lyophilisats werden mit 600 ml o,9 #iger Natriumchloridlösung
zu einer breiartigen Masse verrührt und 2 Std. mit 97o g Glasperlen (o,4-o,5 mm Durchmesser)
in einer sog. "Farbenmühle" bei
+40C zerkleinert. Das glasperlenfreie Homogenat wird abgelassen,
die in der Mühle verbliebenen Glasperlen werien
11 it 1 Ltr. o,9 i-iger Natriu'.'.chloridlösun^ gewaschen,
rlonc-er.at und iTatriumchiorid-V/aschlosung werden vereinigt.
Die so gewonnene Suspension wird im Durchflu^srotor
einer Kühlzentrifuge bei 12.000 UpM und +40G zentrifugiert. Das Sediment aus sechs derartigen
Ansätzen, die tiefgekühlt (-2o°C) gelagert worden waren (insgesamt 1,2 kg), wird in 2o Ltr. o,9 ^iger Natriumchloridlösung
suspendiert und die Suspension 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Die Zellwände werden wie oben beschrieben
abzentrifugiert und in 2o Ltr. o,9 ^iger Natriumchloridlösung
resuspendiert. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Suspension wie oben beschrieben
erneut zentrifugiert und das Sediment in lovLtr. dest.
V/asser 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Die Zellwände werden nunmehr ein letztes Mal wie oben beschrieben abzentrifugiert
und in 5 Ltr. denat. Äthanol (s.o.) 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann abgenutscht. Der Filterkuchen
wird mit ca. 5 Ltr. denat. Äthanol auf der Nutsche gewaschen und in Vakuumtrockenschrank 24 Std. bei 5o°C
getrocknet.
Ausbeute: 254g Hefezellwand-Präparation ( = ca. 21%, bezogen
auf lyophilisierte Hefe oder = 6%, bezogen auf feuchte Hefemasse) .
1 unter sterilen Bedingungen angezüchtet (vgl. A 1)).
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erhaltenen_Retentat
2oo g aus steril angezüchteter Hefe gewonnene Hefe-Zellwände werden wie unter A.2a) angegeben mit Phenol-Wasser
behandelt und aufgearbeitet.
Ausbeute: ca. Io g phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: ca. Io g phenol-Wasser-Extrakt
^) ?iaz^-2i^ai aus_dem nach der Dialyse der wässrigen Phase
erhaltenen_Reteritat
Es wird in gleicher V/eise wie unter A.2a+b) verfahren. Ausbeute: 3-6 g Phenol-Wasser-Extrakt
3) Hefe-Zellwand-Zymosan
694 g aus unter sterilen Bedingungen angezüchteter Hefe-Zellwände (entsprechen 12 kg feuchter Hefe) werden in gleicher
Weise wie unter A.l) angegeben 16 Tage mit Trypsin umgesetzt.
Da die Aufarbeitung in diesem Fall weniger aufwendig ist, wird sie wie folgt durchgeführt:
Nach Zentrifugieren des Kolbeninhalts (Durchlaufzentrifuge siehe unter A.l)) wird das Sediment in ca. 2o Ltr. kaltem
dest. Wasser 1 Std. kräftig gerührt. Die Suspension wird nunmehr in einer Becherzentrifuge 3o Min. bei 3ooo UpM
zentrifugiert, und das Sediment wird in gleicher Weise wie beschrieben dreimal mit dest. Wasser gewaschen. Das Sediment
wird dann in 2o Ltr. Äthanol suspendiert und 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abnutschen wird der
Filterkuchen 24 Std. im Vakuumtrockenschrank bei 5o°C getrocknet.
Das getrocknete Produkt wird mit 6 Ltr. Äthanol 3 Std. unter Rühren zum Sieden erhitzt. Das Gemisch wird
auf Raumtemperatur abgekühlt, der Filterkuchen auf der Nutsche mit Äthanol gewaschen und wiederum 24 Std. im Vakuumtrockenschrank
getrocknet. Die Ausbeute beträgt 258 g (ca. 37 fS).
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4) -^enol-Wasser-Sxtrakte aus Hefe-Zellwand-äymosan
2 £ der_wässrigen_Pha-
2oo g Hefe-Zellwand-Zymosan werden wie unter A.2a)
angegeben mit Phenol-Wasser behandelt und aufgearbeitet.
Ausbeute: 5oo mg Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: 5oo mg Phenol-Wasser-Extrakt
b) P-äzioitat_aus dem nach der Dialyse der wässrigen Pha
Die Aufarbeitung erfolgt wie unter A.2+b) angegeben. Ausbeute: 4,9 g Phenol-Wasser-Extrakt
c) Feste PhaseJL_gewaschen
Die Aufarbeitung erfolgt wie unter A.2c) angegeben.
Ausbeute: 184,5 g
5) ^olvsaccharid-Protein-Kotsglexpaus Hefe-Zellwänden
Nach KESSLER und NICKEHSON * wurden aus Hefe-Zellwänden
(aus steril fermentierter Hefe) ein Glueomannan-Protein
hergestellt. Die Präparationen wurden weiterhin einer Phenol-Wasser-Extraktion unterworfen.
Kessler u. Nickerson
z2
2o g Hefe-Zellwand-Präparation werden wie bei^ ' angegeben
durch Behandlung mit Alkohol + Äther und anschliessend mit Chloroform von Lipiden befreit und
danach mit 1 N Kaliumhydroxid-Lösung extrahiert. Die Ammoniumsulfatfällung ergibt nach Dialyse und Ge^
friertrocknung 6,5 g Glucomannan-Protein I.
Phenol-Wasser Extrakte
5o g Glucomannan-Protein I werden wie unter A.2a)
angegeben in 85o ml dest. V/asser suspendiert und die Suspension nach Zusatz von 85o ml Phenol 15 Min.
* GoKessler u. W.J.Nickerson
J.biol.Chem.254,2283-2285(1959)
J.biol.Chem.254,2283-2285(1959)
Le A 16 014 60
auf 6S0C erhitzt. In gleicher Weise wie bei A.2a)
erhält man drei Phasen. Die Reextraktion der festen und der Phenol-Phase erfolgt, mit 85o ml dest. Wasser.
Ausbeute: 2,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: 2,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
B) f^äzipitat aus_Retentat
Das beim Einengen des unter α) erhaltenen Retentats
angefallene Präzipitat wird wie üblich abzentrifugiert und das Sediment in ca. loo ml dest. Wasser
aufgenommen und lyophilisiert.
Ausbeute: 4,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: 4,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
γ) Feste Phase,_gewaschen
Die bei der Phenol-Wasser-Behandlung angefallene feste Phase wird in der gleichen Weise wie unter
A. 2c), angegeben mi c 3 Ltr. de,nat. Äthanol suspendiert
und nach einstündigem Rühren der Suspension bei Raumtemperatur abgenutscht. Der Filterkuchen
wird zweimal mit je 5oo ml Äthanol gewaschen und im Sxsikkator bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid
getrocknet.
Ausbeute: 24,9 g
Ausbeute: 24,9 g
b) Glucomannan-Protein^II
Der bei der Herstellung von Glucomannan-Protein I angefallene
Überstand wird wie bei Kessler u. Nickerson angegeben dialysiert, eingeengt und lyophilisiert.
Ausbeute: 2-3 g Gluccmannan-Protein II
α) 18,6 g Glucomannan-Protein II werden wie unter A.2a)
angegeben in 347 ml dest. Wasser suspendiert. Die Suspension wird nach Zusatz von 347 ml Phenol 15 Mn,
auf 680G erhitzt. Man erhält wie bei A.2a) angege-
G.Kessler u. W.J. Nickerson J.biol.Chem. 234, 2281-2285
Le A 16 014 - 20 - (1959)
6098 2 0/0906
"ben drei Phasen, die sich allerdings schwerer trennen
lassen. Die Saulsion wird daher 1 Std. bei
12.000 UpM und +lo°C zentrifugiert. Wieder werden die feste Phase und die Phenol-Phase vereinigt
und mit 347 ml Wasser reextrahiert. Die Trennung der Phasen wird wie oben beschrieben durchgeführt.
Die aus beiden Verfahrensschritten erhaltenenwässrigen
Phasen werden vereinigt und drei Tage gegen dest. Wasser bei +40C dialysiert.
Ausbeute: 9,5 g Phenol-Wasser-Extrakt
β) P£äzipitat §us_Retentat
Das beiT. 3inengen des unter α) erhaltenen Retentats angefallene Präzipitat wird wie üblich abzentrifugiert,
das Sediment in ca. loo ml dest. Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
Ausbeute: 1,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: 1,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
Da nur sehr geringe Mengen einer relativ.schmierigen
festen Phase anfallen, 'wird diese verworfen.
Der bei der Herstellung der G-lucomannan-Proteine I + II
angefallene Rückstand wird mit.
dest. Wasser neutral gewaschen, anschliessend mit denat. Äthanol behandelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 4,5 g G-lucan-Protein
dest. Wasser neutral gewaschen, anschliessend mit denat. Äthanol behandelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 4,5 g G-lucan-Protein
Phenol-Wasser-3xtrakte
α) überstand aus_Retentat
Jo g Glucan-Protein werden wie unter A".2a) angegeben
in 5oo ml dest. Wasser suspendiert. Die Suspension wird nach Zusatz von 5oo ml Phenol 15 Min. auf
630C erhitzt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie
bei A.2a) angegeben.
Ausbeute: 2,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: 2,8 g Phenol-Wasser-Extrakt
Le A 16 014 - 21 -
609820/0906
β) Präzipitat aus Retentat
Das beim Einengen des unter <* ) erhaltenen Retentats
angefallene Präzipitat wird wie üblich aufgearbeitet.
Ausbeute: 2,2 g Phenol-Wasser-Extrakt
Ausbeute: 2,2 g Phenol-Wasser-Extrakt
) Feste Phase, gewaschen
Die Aufarbeitung der festen Phase erfolgt in gleicher Weise wie unter D.5a,y) (Glucommanan-Protein i)
angegeben.
Ausbeute: 18,2 g
Ausbeute: 18,2 g
A. Z.ymosan und Zymosan-ffraktionen aus Candida utilis
1) Zymosan
Ahnlich wie in Beispiel 1 A.l) beschrieben, werden
2oo g Trockenhefe (Candida utilis, bei niedriger Temperatur getrocknet) mit 4,8 Ltr. o,5 M Dinatriumhydrogenphosphat-Puffer
(pH 8,5) versetzt. Nach Erhitzen der geschlossenen Apparatur im Autoklaven (4 Std.
loo 0C) lässt man den Kolbeninhalt langsam auf +370C
abkühlen, versetzt ihn mit ca. 5o ml Toluol und anschliessend mit o,5 g Trypsin in 5 ml phosphatgepufferter
o,9 ^igen Natriumchloridlösung (pH 7,2). Die
Reaktionszeit beträgt insgesamt 4 Tage bei 370C (Brutraum;
der Kolbeninhalt wird von Zeit zu Zeit gerührt). 2 Tage nach Beginn der enzymatischen Reaktion (Trypsin)
wird wiederum eine sterilfiltrierte Trypsinlösung (o,5 g/5 ml; s.o.) zugesetzt. Der pH-Wert des Kolbeninhalts
wird täglich kontrolliert. Erforderlichenfalls wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe
von konz. Natriumhydroxid-Lösung auf pH 8,o-8,2 eingestellt.
Le A 16 014 - 22 -
609820/0905
Die Aufarteitung erfolgt wie in Beispiel 1 A.l) angegeben,
mit dem Unterschied, dass einmal die Reaktion bereits nach 4 Tagen abgebrochen wurde und zum anderen
etwa l/lo der in Beispiel 1 angegebenen Lösungsmittelmengen
(Wasser, Äthanol) verwendet wurde. Ebenfalls wurde auch entsprechend weniger Toluol eingesetzt.
Ausbeute: 6o g
2) Phenol-Wasser-Extrakte aus Zymosan nach 1
a) Uberstand_aus dem_nach_der_Dial2se_der_wässrigen
Phase_erhaltenen_Retentat
5o g Gandida-utilis-Zymosan werden wie in Beispiel 1
2a) angegeben mit 875 ml Wasser und 875 ml 9o /cigem Phenol behandelt. Die Aufarbeitung des Ansatzes
erfolgt entsprechend den Angaben des Beispiels 1. Ausbeute: o,5 g Phenol-Wasser-Extrakt (Überstand
des Retentats)
b) Präzipitat_aus_dem_nach_der_Dial2se_der_wässrigen
Das bei der unter a) beschriebenen Aufarbeitung angefallene Präzipitat wird in ca. loo ml dest. Wasser
aufgenommen und die so erhaltene Suspension lyophilisiert.
Ausbeute: o,4 g des Phenol-Wasser-Extraktes (Präzipitat aus Retentat)
c) feste Phase, gewaschen
Entsprechend den Angaben des Beispiels 1 A.Ic) wird die bei der Phenol-Wasser-Extraktion erhaltene feste
Phase aufgearbeitet.
Ausbeute: 43 g
Ausbeute: 43 g
Le A 16 014 - 23 -
609820/090B
Analysenwerte von erfindungsgemaßen Phenol-Wasser-Extraktions-■produkten
| Beispiel Nr. |
C | H | N |
| A 2a | 48,6 % | 7,6 % | 1,3 |
| C 2a | 44,9 % | 6,7 % | 4,4 |
| C 2b | 44,3 % |
f\ Ά o£
OjJ /Q |
3,7 |
| C 4a | 41,2 % | A Δ Η | 1,0 |
| C 4b | 44,7 % | C. Q Of | 0,6 |
| C 5ao£ | 35,3 % | 5,9 % | 3,4 |
| C 5aß | 38,6 % | 6,3 % | 1,2 |
Im sauren Hydrolysat von erfindungsgemäßen Phenol-Wasser-
Extraktionsprodukten wurden folgende Zucker nachgewiesen
Glucose Mannose Xylose
| Beispiel Nr. |
2a |
| A | 2a |
| C | 2b |
| C | 4a |
| C | 4b |
| C | 5btet |
| C | 5bß |
| C |
-r
+ + (wenig)
+ + (wenig)
C 5cß
Le A 16 014 - 24 -
609820/0905
Claims (16)
- Patentansprücheη) Verfahren zur Herstellung von Extraktionsprodukten aus Hefezellwandbestandteile snthaltendem Material, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hefezellwandbestandteile enthaltende Material einer Phenol-Wasser-Extraktion unterwirft .
- 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezellwandbestandteile enthaltendes Material komplette Hefezellen eingesetzt werden.
- 3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezellwandbestandteile enthaltendes Material proteolytische Abbauprodukte kompletter Hefezellen (sog. "Zymosane") eingesetzt werden.
- 4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezellwandbestandteile enthaltendes Material Hefezellwände eingesetzt werden.
- 5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezellwandbestandteile enthaltendes Material proteolytische Abbauprodukte von Hefezellwänden (sog. "Hefezellwandzymosane") eingesetzt werden.
- 6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezellwandbestandteile enthaltendes Material Glucomannan-Proteine eingesetzt werden.
- 7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezellwandbestandteile enthaltendes Material Glucan-Proteine eingesetzt werden.Le A 16 014 - 25 -609820/0905
- 8) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus Hefezellwandbestandteile enthaltendem Material.
- 9) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus kompletten Hefezellen.
- 10) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus proteolytischen Abbauprodukten von Hefezellen ("Zymosanen").
- 11) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus Hefezellwänden.
- 12) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus proteolytischen Abbauprodukten von Hefezellwänden ("Hefezellwandzymosanen").
- 13) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus Glucomannan-Proteinen.
- 14) Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte aus Glucan-Proteinen,
- 15) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Phenol-Wasser-Extraktionsprodukten gemäß Anspruch 8).
- 16) Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln mit immunpotenzierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man Phenol-Wasser-Extraktionsprodukte gemäß Anspruch 8) mit inerten nichttoxischen pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen vermischt.durch
dukte gemäßgekennzeichnetLe A 16 014- 26 -609820/0905
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| DE19742452303 DE2452303A1 (de) | 1974-11-05 | 1974-11-05 | Extraktionsprodukte aus hefezellwandbestandteile enthaltendem material, ein verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel |
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| JP50131562A JPS5170809A (ja) | 1974-11-05 | 1975-11-04 | Kobosaibohekiseibunganjubutsushitsukarano chushutsuseiseibutsunoseizohoho |
| FR7533837A FR2290218A1 (fr) | 1974-11-05 | 1975-11-05 | Nouveaux produits d'extraction d'une matiere contenant des constituants de la membrane de cellules de levure, leur procede de preparation et medicament les contenant |
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|---|---|---|---|
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| DE2452303A1 true DE2452303A1 (de) | 1976-05-13 |
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Family Applications (1)
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| DE (1) | DE2452303A1 (de) |
| FR (1) | FR2290218A1 (de) |
| GB (1) | GB1502902A (de) |
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1975
- 1975-10-13 GB GB4182275A patent/GB1502902A/en not_active Expired
- 1975-11-04 JP JP50131562A patent/JPS5170809A/ja active Pending
- 1975-11-05 FR FR7533837A patent/FR2290218A1/fr active Granted
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| OHN | Withdrawal |